转基因人HT基因抗异种移植物免疫排斥的研究

一、转人HT基因在抗异种移植免疫排斥的研究（论文文献综述）

刘琪帅,李小平,王可品,葛维凯,赖良学^[1]（2018）在《异种移植相关功能蛋白人源化基因修饰猪模型的建立》文中研究表明随着临床上器官衰竭及功能缺陷等疾病的日益增多,器官移植一直是医生及科学家们努力尝试解决的问题,包括肝脏、肾脏、心脏等重要器官的移植和重建,因此合适的移植供体就显得尤为重要。由于人与人之间移植供体资源匮乏,且找到同型合适匹配的脏器来源更为稀缺,异种器官移植就成为解决供体来源最重要的方法。由于猪的器官大小、解剖结构、生理代谢和免疫系统等与人类非常相似,因此被认为是最理想的异种器官移植供体。相比

王建锋^[2]（2013）在《猪主动脉内皮细胞株的建立和鉴定》文中指出异种移植是解决临床器官供体短缺的重要思路。目前认为猪是异种移植较为合适的供体，而急性血管排斥反应是异种移植的主要障碍。异种移植物的血管内皮细胞是免疫排斥反应首先攻击的对象，内皮细胞损伤是介导和放大免疫排斥和凝血功能紊乱的关键环节。为研究异种移植中猪动脉内皮细胞损伤、活化机制以及在异种移植中的作用，为保护和延长异种移植物存活时间必需获得猪的动脉内皮细胞，而我国目前尚无成熟的猪动脉内皮细胞株，因此该实验通过胶原酶消化法获取了猪原代主动脉内皮细胞，用携带SV40LT基因的慢病毒转染猪原代主动脉内皮细胞，通过形态学、表面标志物、管状成形能力和免疫学功能对细胞株进行了鉴定，并与原代细胞进行比较，建立了可长期传代且表型稳定的猪主动脉内皮细胞株，该细胞株保持了原代细胞的基本特征，具备一般在体血管内皮细胞的绝大部分功能，为异种移植研究提供了细胞水平研究平台。目的建立猪主动脉内皮细胞株，为以猪为供体的异种移植研究提供必要的细胞水平研究平台。方法1.原代内皮细胞的提取和细胞株的建立：用胶原酶消化法分离猪主动脉内皮细胞，并用携带SV40LT基因的慢病毒转染原代细胞，建立细胞株。2.细胞基本特征鉴定：在形态学上，通过倒置显微镜和电子显微镜分别观察了原代细胞和细胞株的大体形态结构和超微结构；通过MTT法测定了两类细胞的生长曲线；RT-PCR检测了两类细胞中SV40LT基因表达情况；免疫细胞荧光化学法检测了两类细胞表达vWF因子的能力；荧光显微镜下观察了两类细胞吞噬DiI-Ac-LDL的能力；检测了两类细胞在Matrigel基质胶中的管状成形能力。3.免疫学特性检测：RT-PCR测定了两类细胞中α-1,3-GT基因的表达情况；流式细胞术检测了两类细胞中α-1,3-Gal抗原表达情况；两类细胞与人血清共培养后，MTT法检测了人血清对细胞增殖能力的影响；流式细胞术检测了人血清对内皮细胞凋亡率的影响；免疫细胞化学法检测内皮细胞结合人IgG抗体和补体C3、C5b-9的能力。结果1.成功分离和培养了原代猪主动脉内皮细胞，通过倒置显微镜观察细胞呈单层生长，细胞为梭形、椭圆形或不规则形；电镜下细胞表面有绒毛凸起和W-P小体；内皮细胞表达vWF因子并可吞噬DiI-Ac-LDL；内皮细胞具有管状成形能力。2.用携带SV40LT慢病毒成功转染了原代细胞，转染后细胞株高表达SV40LT基因；原代细胞倍增时间约为21h，而细胞株倍增时间约18h；细胞株在形态学、表面标志物、吞噬DiI-Ac-LDL能力以及管状成形能力与原代内皮细胞相似。3.在免疫学特性上，α-1,3-GT基因和α-1,3-Gal抗原在两类细胞内表达无差异（荧光强度分别为（498.2士3.5）和（500.6士3.2），P>0.05），且均高于人脐静脉内皮细胞（P <0.05）。与人血清共培养时，随血清浓度升高，两类内皮细胞的增殖能力下降、细胞凋亡率增加，并均可结合人IgG抗体和补体C3和C5b-（9P>0.05）。结论实验提取的原代猪主动脉内皮细胞具有一般血管内皮细胞的基本形态结构、表型以及功能特征，通过原代动脉内皮细胞转染慢病毒建立的猪主动脉内皮细胞株较好的保持了原代血管内皮细胞的各种特征，并具有和人血清发生免疫反应的能力，具备在体血管内皮细胞的绝大部分功能，可用于异种移植细胞研究。

曹际森^[3]（2011）在《miRNA在异种移植免疫排斥中作用的体外实验研究》文中研究说明目的：体外研究异种移植免疫排斥过程中miRNA表达的变化,以及相关免疫排斥效应蛋白Gala（1,3）Gal和NF-κB的表达,从而为有效控制异种移植排斥反应奠定实验基础。方法：①培养小鼠血管瘤内皮细胞系（EOMA）,分别加入异种血清,构建异种移植体外模拟实验。实验分组包括大鼠血清组、豚鼠血清组、人血清组,并以PBS作为对照组。②分别于相应时间点收获细胞,采用荧光实时定量PCR技术对各组免疫排斥过程中niR-146a和miR-155的表达变化进行相对定量研究,通过TaqMan miRNA Assays技术对样本进行检测。③并进一步通过实时定量PCR技术检测免疫排斥过程中α（1,3）GT mRNA的表达变化,通过流式细胞术检测Gala（1,3）Gal的表达变化及Western blot技术检测NF-κB （p65）的表达。结果：①大鼠血清组、豚鼠血清组、人血清组niR-146a、miR-155表达水平高于PBS对照组,差异有统计学意义（P<0.05）；豚鼠血清组和人血清组miR-146a表达水平低于大鼠血清组,差异有统计学意义（P<0.05）；豚鼠血清组和人血清组miR-155表达水平高于大鼠血清组,差异有统计学意义（P<0.05）；豚鼠血清组和人血清组组间1niR-146a、miR-155表达水平无统计学差异（P>0.05）。②豚鼠血清组和人血清组α1,3GT mRNA水平高于PBS对照组,差异有统计学意义（P<0.05）；豚鼠血清组和人血清组组间α1,3GT mRNA水平无统计学差异（p>0.05）；而大鼠血清组与PBS对照组之间α1,3GT mRNA水平无统计学差异p>0.05)。③大鼠血清组、豚鼠血清组和人血清组Gala（1,3）Gal的表达水平较PBS对照组均无统计学差异p>0.05)。④大鼠血清组、豚鼠血清组、人血清组的NF-κB（p65）的表达水平均高于PBS对照组,差异有统计学意义（P<0.05）,而三组组间NF-κB （p65）的表达水平无统计学差异（P>0.05）。结论：异种排斥早期出现miR-146a和miR-155的异常上调,参与了异种排斥的多种免疫应答过程。在小鼠与大鼠间的协调性异种排斥中,高水平的miR-146a可能更多的参与了急性血管排斥反应,引起NF-κB （p65）参与的一系列炎症过程。而在小鼠与豚鼠、小鼠与人的非协调性异种排斥中,高水平的miR-155可能更多的参与超急性排斥反应过程,其靶效应包括引起α1,3GT mRNA的升高。

张名媛,蒋钦杨,范晶,陈宝剑,覃永长,吴丹,杨柳,郭亚芬,兰干球,蒋和生^[4]（2010）在《异种器官移植克服HAR的研究进展》文中研究表明异种器官移植是解决供体器官严重短缺的一种途径,而异种移植成功的最大障碍是异种免疫排斥反应,其中最严重的是超急性排斥反应（HAR）。本文就异种器官移植HAR的发生机理、克服免疫屏障的方法和发展趋势以及小型猪作为供体的研究等方面国内外的研究进展进行综述和讨论。

郭战军^[5]（2010）在《以纳米材料作载体改进精子介导法建立异种移植供体模型的研究》文中研究说明精子介导基因转移（Sperm-mediated gene transfer, SMGT）是目前最简单的转基因动物生产技术,但该方法重复性差、实验结果不稳定。本研究对SMGT的几个关键环节进行了研究,以期建立稳定、高效的技术体系,同时利用该技术体系制备hHT/hDAF双基因转移小鼠模型,为进一步开展异种器官移植奠定基础。第一部分基于树枝状聚合物建立小鼠精子介导基因转移技术的研究目的研究外源DNA与精子相互作用后的定位及内化率是精子载体法制备转基因动物的关键环节,为建立小鼠精子介导基因转移技术奠定基础。方法以标记的DNA片段为示踪材料,就精子与树枝状聚合物（Dendrimers）共孵育后同外源DNA相互作用的基本特征及影响因素进行研究。结果小鼠精子同树枝状聚合物共孵育后可自发性结合外源DNA,外源DNA最初结合于顶体后区质膜外表面,随后部分内化进入细胞内。精子对外源DNA的结合和内化能力随供体的不同而差异明显,在35只小鼠中,结合率（DNase Ⅰ消化前）波动于4.6%～62.4%,内化率（DNase Ⅰ消化后）波动于2.1%-53.8%,个体间差异显着（P<0.01）。对于同一供体的精子而言,阻止DNA结合的最主要因素是精浆,与射出的原精液相比,洗涤后精子的结合率和内化率分别提高了3倍和5倍；其次精子获能也将导致结合率和内化率降低（P<0.01）。死精子不能完成外源DNA的内化过程,但反复冻融导致质膜破裂的死精子具有更高的结合率,而且阳性率与动物个体无关。上述结果提示,筛选合适的精子供体,采用优化的转染处理方法是提高精子载体方法效率的前提和保证。第二部分EGTA等影响SMGT效率的研究目的研究EGTA、核酶抑制剂ATA和蛋白酶抑制剂PMSF对精子活力和体外存活时间、精子顶体反应发生率、精子结合外源DNA能力以及内化DNA降解的影响,提高SMGT效率。方法以DIG标记DNA,以免疫组织化学法研究EGTA、核酶抑制剂ATA和蛋白酶抑制剂PMSF对SMGT效率的影响。结果核酶抑制剂ATA提高精子活力和体外存活时间,增强精子结合外源DNA能力,但ATA添加组精子结合的外源DNA在细胞内几乎全部被降解；EGTA和蛋白酶抑制剂PMSF对内化进入精细胞的外源DNA有良好的保护作用,然而二者阻止精子发生顶体反应；此外,PMSF提高精子对外源DNA结合能力,增强精子运动活性,而EGTA与此正好相反；同时在培养液中添加EGTA和ATA,精子活力、顶体反应发生率和外源DNA结合能力都较EGTA单独加入组有所改善,而且内化DNA的降解效应也被明显抑制。对于精子介导基因转移过程中,在培养液中同时加入EGTA和ATA,既有利于外源DNA结合以及内化DNA的完整性,又保证了精子的受精能力。第三部分hHT/GFP融合基因表达载体的构建及在小鼠成纤维细胞中的表达目的构建α2-1,2岩藻糖苷转移酶（hHT）基因与绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）基因融合表达载体pEGFP-C1-hHT,并在小鼠成纤维细胞表达,验证其有效性。方法提取人总RNA,反转录后以cDNA为模板PCR扩增hHHT基因,连接至pMD18-T载体后进行hindⅢ kpn Ⅰ双酶切,回收酶切片段后插入pEGFP-C1,构建融合表达载体后转染小成纤维细胞。结果成功克隆了hHT基因并构建了融合表达载体pEGFP-C1-hHT。采用脂质体法转染小鼠成纤维细胞48h后观察到GFP阳性细胞。对GFP阳性小鼠成纤维细胞进行PCR及Western blot,检测hHHT基因的整合及表达情况。PCR结果表明hHT基因整合入小鼠基因组。Western blot检测到了hHT基因的表达。上述结果表明,成功构建了融合表达载体pEGFP-C1-hHT,并可应用于进一步转基因研究。第四部分hDAF/RFP融合基因表达载体的构建及在小鼠成纤维细胞中的表达目的构建衰变加速因子（hDAF）基因与红色荧光蛋白（red fluorescent protein,RFP）基因融合表达载体pDsRed2-C1-hDAF的并在小鼠成纤维细胞表达的研究以验证其有效性。方法提取人总RNA,反转录后以cDNA为模板PCR扩增hDAF基因,连接至pMD18-T载体后进行EcoR Ⅰ、 Sma Ⅰ双酶切,回收酶切片段后插入pDsRed2-C1,构建融合表达载体后转染小鼠成纤维细胞。结果结果表明成功克隆了hDAF基因并构建了融合表达载体pDsRed2-C1-hDAF。采用脂质体法转染小鼠成纤维细胞48h后观察到RFP阳性细胞。对RFP阳性小鼠成纤维细胞进行PCR及Western blot,检测DAF基因的整合及表达情况。PCR结果表明hDAF基因整合入小鼠基因组。Western blot检测到了hDAF基因的表达。表明成功构建了融合表达载体pDsRed2-C1-hDAF,并可应用于进一步转基因研究。第五部分利用精子介导法建立hHT/hDAF双基因转移小鼠模型目的建立hHT/hDAF双基因转移小鼠模型,为探讨超急排斥反应（hyperacute rejection, HAR）及延迟性异种排斥反应（delayed xenograft rejection, DXR）的分子调控机制奠定基础。方法采用优化的精子介导法（Sperm-mediated gene transfer, SMGT）制备转基因胚胎,进行胚胎移植后建立hHT/hDAF双基因转移小鼠模型并进行分子生物学检验。结果结果表明应用树枝状聚合物（Dendrimers）优化SMGT后,2细胞胚GFP+RFP的阳性率达到4.51%,同对照组相比差异极显着（P<0.01）。选取标记基因GFP+RFP双阳性的胚胎进行移植后获得36只仔鼠,PCR及Southern blot检测结果表明,17只小鼠PCR结果呈hHT+hDAF双阳性,其中5只小鼠Southern blot结果呈]hHT+hDAF双阳性。上述结果证实成功建立了hHT/hDAF双基因转移小鼠模型。

刘秉乾,武玉东,魏金星,李沛寰,李光三,张立霞,李胜芝,张志宏,马腾骧^[6]（2009）在《人α1,2-岩藻糖苷转移酶和衰变加速因子基因转移克服异种移植急性血管排斥反应的研究》文中提出目的观察人α1,2-岩藻糖苷转移酶（HT）和衰变加速因子（DAF）基因转移对抑制血管内皮细胞激活从而克服异种移植急性血管排斥反应的能力。方法通过显微注射建立转基因小鼠动物模型,Southern印迹杂交和流式细胞计数筛选出人HT和/或DAF基因整合与表达阳性的子代转基因小鼠。研究表达不同目的基因的转基因小鼠血管内皮细胞与15%人血清孵育后溶破细胞的百分数,免疫细胞化学染色检测细胞核因子（NF）-κB的激活,流式细胞计数检测细胞表面血管细胞黏附分子（VCAM）-1的表达。结果子代小鼠血管内皮细胞人HT/DAF共基因表达7只,人HT与DAF单基因表达分别为6只和8只。与15%人血清孵育后,人HT/DAF共表达组细胞的溶破细胞百分数（4±2）%低于人HT表达组细胞（25±10）%、人DAF表达组细胞（31±11）%及正常组细胞（76±24）%（P均<0.05）。转双基因抑制细胞NF-κB激活的能力强于转人HT或DAF单基因,且转双基因细胞表面VCAM-1的表达较转单基因细胞显着降低,差异有统计学意义（P<0.05）。结论人HT/DAF基因联合转移具有部分抑制血管内皮细胞激活从而克服异种移植急性血管排斥反应的能力。

刘秉乾,程传宇,武玉东,魏金星,李光三,马腾骧^[7]（2008）在《表达人α-1,2-岩藻糖苷转移酶、衰变加速因子和CD59基因的转基因小鼠的建立及其抗异种移植排斥反应的研究》文中指出在进行非协调性异种器官移植时,目前已经证实表达人α-1,2-岩藻糖苷转移酶（HT）或者补体调节蛋白的供体动物器官均可以部分克服超急性排斥反应.本文的研究目的是探讨是否共表达人HT和补体调节蛋白（衰变加速因子与CD59）的转基因小鼠的外周血单核细胞能更有效的克服异种移植排斥反应.利用受精卵显微注射技术建立转人HT,DAF和/或CD59基因的小鼠动物模型,流式细胞技术筛选表达不同基因的转基因小鼠.将小鼠的外周血单核细胞与15%的人血清共孵育,检测细胞表面天然抗体的沉积、补体的激活以及黏附分子的表达等.三种目的基因均可以在转基因小鼠体内表达,并且HT基因的表达显着减少了引起异种移植排斥反应的主要抗原半乳糖α-1,3-半乳糖（α-Gal）的表达.功能实验表明,与单一目的基因表达的转基因小鼠相比,共表达HT/DAF或HT/CD59的转基因小鼠的外周血单核细胞对抗人血清介导溶破细胞的能力显着增强.而且三基因共表达的外周血单核细胞对抗人血清介导溶破细胞的能力最强,可以克服超急性排斥反应并且可以减少黏附分子的表达.高水平表达人HT,DAF和CD59基因的转基因小鼠可以完全克服异种器官移植超急性排斥反应并且可以部分克服急性血管排斥反应.本研究表明,表达三种基因的转基因小鼠的器官异种移植时存活时间可以显着延长,对异种移植来说也许是更合适的选择.

杨惠祥^[8]（2007）在《以生殖细胞为外源基因载体建立异种移植转基因供体动物的研究》文中进行了进一步梳理建立转基因动物是异种移植研究中极为重要的工作基础。我们采用以生殖细胞（卵细胞和精子细胞）为外源基因载体的新型转基因技术建立转基因动物，以简化操作、降低成本、提高外源基因整合和表达的效率。第一部分卵巢注射法建立hCD59、hCD55、HT单基因转移小鼠的研究目的探讨卵巢注射法建立异种移植用转基因动物的可行性。方法采用注射法将hC955、HT、hCD59基因重组质粒分别导入雌鼠卵巢内，交配后产下原代（G0代）小鼠。提取G0代小鼠基因组DNA，采用PCR方法对目的基因整合进行初筛。对PCR出现特异条带的小鼠基因组DNA进行Southern印迹杂交，进一步证实目的基因整合。抽取目的基因整合阳性小鼠的外周血，用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和流式细胞术（FCM）检测目的基因表达。对FCM表达阳性的转基因小鼠肝脏和肾脏进行免疫组织化学染色，观察目的基因在器官中的表达分布情况。对表达目的基因的G0代小鼠进行交配生产F1代小鼠，同法检测F1代目的基因的整合与表达。分离3种转基因小鼠的脾脏淋巴细胞，进行人血清溶破实验。结果对15只雌性小鼠进行卵巢注射，共产生G0代鼠130只。其中，注射HT基因重组质粒的小鼠产仔62只，注射hCD59基因重组质粒的小鼠产仔42只，注射hCD55基因重组质粒的小鼠产仔26只。经PCR初筛后，Southern印迹杂交证实染色体中整合HT、hCD55、hCD59基因的小鼠分别有21只、4只、9只，总整合率为26.2％，高于受精卵显微注射法的整合率。经RT-PCR检测共20只G0代小鼠阳性，包括3只hCD55小鼠、14只HT小鼠、3只hCD59小鼠。FCM检测发现外周血单核细胞表达人H抗原、hCD55、hCD59的小鼠分别有9只、2只、2只，蛋白表达的效率为10.0％，高于受精卵显微注射法的表达率。免疫组化检测显示，在转基因小鼠的肝脏、肾脏等组织中均有相应外源基因的表达。G0代小鼠交配后产下F1代小鼠37只，PCR检测hCD55、HT、hCD59基因整合的小鼠分别为7只、6只、3只，FCM检测表达的分别为0只、1只、1只。与对照组比较，三种转基因小鼠的脾脏淋巴细胞耐受人血清溶破的能力均有所增强。结论采用卵巢注射法可以使针对异种移植的基因在小鼠体内整合，并可实现RNA水平和蛋白质水平的表达，其整合与表达的效率要高于受精卵显微注射法。三种转基因构件均可遗传给后代（F1代），并在蛋白质水平表达。人血清溶破实验证实，通过卵巢注射法制备的三种转基因动物可以发挥抗异种排斥的作用。第二部分卵巢内共注射建立hCD59／HT双基因和hCD55／hCD59／HT三基因转移小鼠的初步研究目的探讨卵巢内多基因共注射建立多基因转移动物的可行性。方法采用hCD59／HT双基因重组质粒和hCD59／hCD55／HT三基因重组质粒共同注射卵巢的方法，得到原代小鼠。PCR和Southern印迹杂交法检测原代小鼠目的基因整合，FCM检测目的基因表达。结果双基因重组质粒共同注射4只雌鼠，获得G0代鼠31只。Southern印迹杂交证实仅出现hCD59／HT双基因阳性鼠2只，无单基因整合鼠，仅1只鼠出现hCD59／HT共表达阳性，另1只鼠表达阴性。三基因重组质粒共同注射5只雌鼠，3胎共产生G0代鼠137只，Southern印迹杂交证实仅出现hCD59／HT双基因阳性鼠2只，无其它整合情况，表达均为阴性。结论多基因共注射卵巢法可以得到相应的转基因动物，该方法确实可靠且周期较短。但多基因共注射后，基因之间会互相影响，整合与表达的效率比单基因注射者明显降低，提示其中有更复杂的机制参与，需要深入研究。第三部分PAMAM-D对hCD55基因转染猪精子细胞介导作用的研究目的探讨新型纳米材料PAMAM-D对hCD55基因转染猪精子细胞的介导作用。方法将新型纳米材料PAMAM-D（G5）和线状hCD55 DNA按照不同氮磷比（电荷比）制备PAMAM-D／hCD55复合物。取部分复合物酶切电泳。将复合物与处理后的1×106猪精子细胞共孵育2h，原位杂交法检测hCD55对猪精子细胞的转染效率，经精子质量检测工作站检测孵育后的精子活力和精子畸形率。结果对PAMAM-D／DNA复合物进行酶切消化后，其中的DNA分子不被限制性内切酶降解。经原位杂交法检测，加入PAMAM-D后可以明显提高各组猪精子细胞的转染效率，且基本上随着氮磷比的增加转染效率也随之增高。最高者（400ng，氮磷比20：1）可达对照组的167％（47.5％±3.5％vs 28.5％±1.5％）。经精子质量检测工作站检测PAMAM-D对精子细胞活力和精子细胞畸形率没有明显影响（p＞0.05）。结论PAMAM-D作为载体可以提高目的基因对猪精子细胞的转染效率，其对猪精子细胞无明显毒性，增强了精子载体法的实用性，为生产异种移植用转基因猪提供一种可供参考的方法。

马志方,李胜芝,刘秉乾,张明,王广有,马腾骧^[9]（2006）在《转人α1,2岩藻糖苷转移酶基因猪动脉内皮细胞抗人血清溶破实验》文中认为目的研究转入α1,2岩藻糖苷转移酶（HT）基因克服异种移植超急排斥反应（HAR）的作用。方法构建pcDNA3-HTcDNA重组质粒,体外培养猪动脉内皮细胞（PAEC）,脂质体转染法将pcDNA3-HTcDNA转染PAEC,新霉素（G418）筛选具有抗性的细胞克隆,PCR检测重组基因的整合,流式细胞术（FCM）检测转染细胞H抗原和异种抗原α—Gal表达。分别以未转染的PAEC和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）作对照。将转染细胞和正常细胞分别以20％、40％和60％人血清孵育2 h,比较溶破细胞百分数。结果重组质粒转染PAEC经筛选得到抗性细胞克隆,PCR扩增出人HT基因片段,FCM检测正常PAEC与转染PAEC,α-Gal平均荧光强度由1346．81降至194．44,H抗原平均荧光强度由9．10增至215．93;α—Gal M2区由99．98％降至37．180A,H抗原M2区由13．80％升至78．54％。转染细胞以人血清孵育后溶破细胞百分数较正常细胞降低,分别由（32．32±2．37）％、（59．54±4．56）％和（71．46±5．94）％降至（15．78±2．69）％、（30．16±1．46）％和（40．48±3．77）％,差异均有统计学意义（P值均<0．05）。结论转人HT基因PAECα—Gal表达明显降低,H抗原表达升高,对人血清溶破的耐受性增强。转人HT基因可以一定程度抑制HAR。

刘秉乾^[10]（2006）在《人HT、DAF和CD59基因联合转基因小鼠的制备及其抗异种器官移植免疫排斥反应的研究》文中研究指明目前认为从多个环节干预异种移植排斥反应才有可能使动物器官应用于临床。本实验采用受精卵显微注射技术将本室构建的人α1,2-岩藻糖苷转移酶（HT）基因、人衰变加速因子（DAY）和人膜反应性溶解抑制物（CD59）基因构件导入到小鼠的受精卵的雄原核中,通过受精卵移植建立表达多基因的转基因小鼠,观察这些基因转移小鼠抗异种移植超急性排斥反应（HAR）的效果,并对其抗急性血管排斥反应（AVR）的机制进行初步研究。 第一部分人衰变加速因子重组质粒的构建 目的 构建含杂合增强子UI的人DAF重组基因,应用于转基因动物克服异种器官移植排斥反应的研究。方法 Clal/EcoRI双酶切质粒pSP73得到UI增强子插入片段（0.3Kb）,将其插入pBluescriptⅡSK+克隆载体的相应酶切位点之间;XbaI/BamHI双酶切质粒pGEM-7zf-DAF,得到含人ICAM-2启动子及DAF cDNA序列的插入片段（3.7Kb）,将其也插入到pBluescriptⅡSK+克隆载体的相应酶切位点之间。随后转化细菌,阳性转化菌落质粒抽提及酶切鉴定。设计引物行PCR特异扩增检验。结果 特异性3组酶切重组载体均产生了符合要求的相应条带;PCR扩增出特异的330bp及321bp的片断,符合设计要求。结论 含杂合增强子UI的人DAF重组基因构建成功。 第二部分人HT/CD59及DAF基因转移与转基因鼠的制备 目的 制备转移人HT/CD59双基因和人DAF单基因的首代转基因小鼠。方法 限制性内切酶NotI/PvuI双酶切人HT基因重组质粒得到2.85kb的转基因

二、转人HT基因在抗异种移植免疫排斥的研究（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、转人HT基因在抗异种移植免疫排斥的研究（论文提纲范文）

（1）异种移植相关功能蛋白人源化基因修饰猪模型的建立（论文提纲范文）

（2）猪主动脉内皮细胞株的建立和鉴定（论文提纲范文）

（3）miRNA在异种移植免疫排斥中作用的体外实验研究（论文提纲范文）

（5）以纳米材料作载体改进精子介导法建立异种移植供体模型的研究（论文提纲范文）

（7）表达人α-1,2-岩藻糖苷转移酶、衰变加速因子和CD59基因的转基因小鼠的建立及其抗异种移植排斥反应的研究（论文提纲范文）

（8）以生殖细胞为外源基因载体建立异种移植转基因供体动物的研究（论文提纲范文）

（9）转人α1,2岩藻糖苷转移酶基因猪动脉内皮细胞抗人血清溶破实验（论文提纲范文）

（10）人HT、DAF和CD59基因联合转基因小鼠的制备及其抗异种器官移植免疫排斥反应的研究（论文提纲范文）

四、转人HT基因在抗异种移植免疫排斥的研究（论文参考文献）

• [1]异种移植相关功能蛋白人源化基因修饰猪模型的建立[J]. 刘琪帅,李小平,王可品,葛维凯,赖良学. 实用器官移植电子杂志, 2018(05)
• [2]猪主动脉内皮细胞株的建立和鉴定[D]. 王建锋. 第四军医大学, 2013(03)
• [3]miRNA在异种移植免疫排斥中作用的体外实验研究[D]. 曹际森. 天津医科大学, 2011(03)
• [4]异种器官移植克服HAR的研究进展[A]. 张名媛,蒋钦杨,范晶,陈宝剑,覃永长,吴丹,杨柳,郭亚芬,兰干球,蒋和生. 中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集（下册）, 2010
• [5]以纳米材料作载体改进精子介导法建立异种移植供体模型的研究[D]. 郭战军. 天津医科大学, 2010(12)
• [6]人α1,2-岩藻糖苷转移酶和衰变加速因子基因转移克服异种移植急性血管排斥反应的研究[J]. 刘秉乾,武玉东,魏金星,李沛寰,李光三,张立霞,李胜芝,张志宏,马腾骧. 中华实验外科杂志, 2009(06)
• [7]表达人α-1,2-岩藻糖苷转移酶、衰变加速因子和CD59基因的转基因小鼠的建立及其抗异种移植排斥反应的研究[J]. 刘秉乾,程传宇,武玉东,魏金星,李光三,马腾骧. 中国科学（C辑:生命科学）, 2008(03)
• [8]以生殖细胞为外源基因载体建立异种移植转基因供体动物的研究[D]. 杨惠祥. 天津医科大学, 2007(06)
• [9]转人α1,2岩藻糖苷转移酶基因猪动脉内皮细胞抗人血清溶破实验[J]. 马志方,李胜芝,刘秉乾,张明,王广有,马腾骧. 中华泌尿外科杂志, 2006(08)
• [10]人HT、DAF和CD59基因联合转基因小鼠的制备及其抗异种器官移植免疫排斥反应的研究[D]. 刘秉乾. 天津医科大学, 2006(09)

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