一、结核分枝杆菌组合DNA疫苗的免疫效果（论文文献综述）
张真[1]（2020）在《结核分枝杆菌新型疫苗的制备及其免疫效果研究》文中指出第一部分:结核分枝杆菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6融合基因DNA疫苗株的构建及免疫原性研究目的构建结核分枝杆菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗,并对其在体外真核细胞及C57BL/6小鼠中表达,初步探究这两种DNA疫苗的免疫原性。方法从Gen Bank中获取M.tuberculosis H37Rv的Ag85B、ESAT6和Hsp65基因序列送生工合成。然后经PCR、酶切、连接与真核表达载体PVAX1重组,测序鉴定正确后应用TIANGEN试剂盒大量纯化无内毒素的质粒DNA。体外转染验证其表达后,免疫C57BL/6小鼠,检测特异性细胞免疫应答,流式检测升高细胞因子所属细胞亚型。结果Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗在体内外均能表达。体外Western Blot检测显示,DNA疫苗体外转染293T细胞24h可以检测到蛋白Hsp65、Ag85B、ESAT6的表达,48h时细胞内蛋白表达量达最高。C57BL/6小鼠中Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗激起了很好的免疫反应,可诱导机体产生分泌高水平TNF-α的Th型免疫应答。结论Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6DNA疫苗都具有较强的免疫原性,呈Th型细胞介导的免疫应答;Hsp65-Ag85B DNA疫苗的保护效力比Hsp65-ESAT6 DNA疫苗强,有待进一步研究其应用价值。第二部分:卡介苗ure C基因缺失株的构建及筛选目的在MTB中ure C产生的氮被认为是碱化MTB生存微环境的重要来源,不仅可以预防吞噬体的酸化,还可阻止吞噬体和溶酶体的融合,进一步逃脱免疫监视和免疫反应。运用Cre/Lox P同源重组方法对卡介苗进行遗传操作,缺失卡介苗中氮源基因ure C,打破MTB在体内原有适宜生存的微环境,促进吞噬-溶酶体成熟,筛选并获得卡介苗ure C基因缺失株,为后续在此缺失株添加有效的MTB免疫抗原提供基础。方法采用Cre/Lox P同源重组的方法,将含有重组酶的p SL002质粒电转至卡介苗中,涂板,长出单菌落后以此菌落做感受态。利用speⅠ和NsiⅠ双酶切本实验室前期构建的含有ure C基因左右同源臂及gfp荧光蛋白的重组质粒p SL001,获得目的片段,并将其电转至上述含有p SL002质粒的卡介苗,涂板后挑取单克隆,通过菌液PCR进行鉴定、筛选出卡介苗中双交换目的片段并缺失ure C基因的菌株,从而获得卡介苗ure C基因缺失株。结果电转至含有p SL002质粒卡介苗的目的片段,因为存在gfp蛋白,在蓝光手电筒下发绿色荧光,包括单交换与双交换两种,对发绿色荧光单菌落进行菌液PCR,琼脂糖凝胶鉴定,单交换菌落在1734bp处出现条带,双交换菌落因片段过大在3498bp处隐约有条带或不出现条带。挑取双交换菌落涂板传代,成功筛选出了卡介苗ure C基因缺失株,形态正确,并能够稳定传代。结论利用Cre/Lox P同源重组方法在卡介苗中进行遗传操作,能够对卡介苗的基因进行无缝敲除,并且获得的突变株能够稳定传代。研究表明,在此过程中采用Cre/Lox P同源重组系统可大大提高了MTB的重组效率并缩短了重组时间,为重组卡介苗的研究提供了便利。
包艳红[2]（2019）在《牛分枝杆菌cfp10-esat6-cfp7融合基因重组乳酸菌的构建及免疫原性研究》文中研究指明牛结核病是由牛分枝杆菌引起的广泛存在于人类与牲畜间的疾病。该病的宿主范围比较广,可感染大多数温血脊椎动物,人可通过接触患病动物及食用污染的牛奶制品等多种途径感染结核病,所以,牛结核病的传播严重影响人和动物的健康,每年都造成巨大的经济损失。目前,结核病主要以预防为主,卡介苗是唯一可用的预防性疫苗,但对成人其免疫效果不确定,对牛又影响常规检疫,所以,研发出有效的疫苗势在必行。细菌分泌的抗原由于具有激活免疫反应的能力而被重视,CFP-10、ESAT-6和CFP-7是牛结核分枝杆菌早期分泌蛋白,免疫蛋白ESAT-6和CFP-10的编码区仅存在于结核分枝杆菌基因组的RD-1区,而在BCG菌株中不存在。因此,将CFP-10、ESAT-6和CFP-7蛋白基因融合,以期能够产生更为有效的免疫效果,这对于研发牛结核病新型疫苗有着重要意义。乳酸乳球菌NZ3900作为天然的递呈外源抗原的载体,是食品级的安全微生物,且筛选时无添加抗生素,已广泛用于生物制药、疫苗研发等领域。因此,本试验以pNZ8149为载体,在NZ3900乳酸菌中表达牛分枝杆菌融合基因cfp10-esat6-cfp7,并对构建的重组乳酸菌在小鼠模型中进行免疫原性分析,为研制牛结核病新型疫苗奠定基础。本研究以pUC-cfp10-esat6-cfp7质粒作为模板,对目的融合基因cfp10-esat6-cfp7进行PCR扩增,然后与pMD18-T Simple Vector进行连接,构建重组克隆质粒pMD18-T（S）-cfp10-esat6-cfp7。利用Kpn I和Nco I限制性内切酶对pMD18-T（S）-cfp10-esat6-cfp7和pNZ8149进行双酶切,并切胶回收纯化。将纯化融合基因cfp10-esat-6-cfp7和表达载体pNZ8149进行连接,构建pNZ8149-cfp10-esat6-cfp7重组表达质粒。将重组菌电转入宿主菌NZ3900中,构建pNZ8149-cfp10-esat6-cfp7/NZ3900,从而获得携带目的基因cfp10-esat6-cfp7的重组乳酸菌。经过Nisin诱导,SDS-PAGE及间接免疫荧光鉴定实验,成功表达鉴定融合基因cfp10-esat6-cfp7的表达。之后,利用pNZ8149-cfp10-esat6-cfp7/NZ3900重组乳酸菌免疫小鼠,利用流式细胞技术检测免疫小鼠脾细胞中T细胞亚群和产生IL-2、IFN-γ和TNF-α等细胞因子的淋巴细胞比例,以及利用间接酶联免疫吸附实验（ELISA）检测免疫小鼠血清中IgG水平。本研究成功地扩增了牛分枝杆菌融合基因cfp10-esat6-cfp7,与pMD18-T Simple Vector连接,成功地构建了克隆质粒pMD18-T-cfp10-esat6-cfp7。纯化的融合基因cfp10-esat-6-cfp7和表达载体pNZ8149连接,成功地构建了重组乳酸菌pNZ8149-cfp10-esat6-cfp7/NZ3900。重组乳酸菌pNZ8149-cfp10-esat6-cfp7/NZ3900经过Nisin诱导,并利用SDS-PAGE及间接免疫荧光试验,证明融合基因cfp10-esat6-cfp7在NZ3900中表达了33 kDa的外源蛋白。免疫小鼠后,流式检测结果显示,重组乳酸菌pNZ8149-cfp10-esat6-cfp7/NZ3900免疫组脾细胞中CD4+T细胞的比例较pNZ8149/NZ3900组、PBS组和BCG组均略高,但无统计学差异（P>0.05）;CD8+T细胞的比例较pNZ8149/NZ3900组略高,较PBS组和BCG组明显增高,但未能达到差异显着性水平（P>0.05）;产生IL-2的细胞比例较pNZ8149/NZ3900组略高,较PBS组和BCG组明显增高,但差异仍不显着（P>0.05）;产生IFN-γ的细胞比例较PBS组和pNZ8149/NZ3900组略高,但远不及BCG组,差异显着（P<0.05）;产生TNF-α的细胞比例与BCG组、pNZ8149/NZ3900组基本一致,没有差异（P>0.05）。利用酶联免疫吸附实验检测得到重组乳酸菌pNZ8149-cfp10-esat6-cfp7/NZ3900组小鼠血清中的IgG抗体水平略高于PBS组和pNZ8149组,低于BCG组,且差异均不显着（p>0.05）。可见,重组乳酸菌pNZ8149-cfp10-esat6-cfp7/NZ3900仅能诱导小鼠体内产生一定水平的细胞免疫,为牛结核病新型疫苗的研制提供了依据。
胡瞬[3]（2019）在《菊糖在结核分枝杆菌和寨卡病毒亚单位疫苗中的佐剂作用研究》文中研究表明佐剂已经成为亚单位疫苗不可或缺的重要组成部分,同时也是制约亚单位疫苗发展的重要因素。目前临床使用的佐剂数量有限,而且还存在不同程度的不良反应,因此,亟待开发更加安全有效的亚单位疫苗佐剂。菊糖（Inulin）是由D-果糖经β-1,2糖苷键连接而成的一种天然果糖聚合物,其来源广泛、价格低廉、安全性高、生物相容性好,而且具有免疫调节功能。因此,菊糖具有作为亚单位蛋白疫苗佐剂的良好潜力。为了研究菊糖对亚单位蛋白疫苗的佐剂效果,制备了基于菊糖化学修饰的结核分枝杆菌疫苗和寨卡病毒疫苗,通过研究两种疫苗的免疫原性,分别评价菊糖在细菌性疫苗和病毒疫苗中的佐剂作用。目前疫苗佐剂的递送主要利用物理混合的方法,根据静电吸附或微球包裹的原理加载抗原。但由于菊糖呈电中性,因此不能直接吸附抗原,而使用额外的添加材料包裹菊糖和抗原,可能会引起机体非特异性免疫应答,并造成一定的安全性问题。为了弥补上述传统方法带来的缺陷,采用化学修饰的方法,将抗原和佐剂共价结合,使得抗原与佐剂同时到达抗原提呈细胞（APCs）,从而增强细胞对抗原的摄取,刺激机体产生更强的免疫应答。菊糖与蛋白抗原共价结合成为一种新型的抗原递送系统,可以形成半衰期较长的亚单位疫苗。通过探讨菊糖与免疫系统的相互作用机制,研究菊糖对疫苗的佐剂作用。全文的主要研究结果如下:（1）菊糖在结核分枝杆菌亚单位蛋白疫苗中具有良好的佐剂效果首先,表达并纯化得到一种结核分枝杆菌抗原融合蛋白,即CFP10-TB10.4融合蛋白（CT）。菊糖与载体蛋白CRM197共价结合成CRM-inu。然后将结合物（CRM-inu）与CT结合形成亚单位疫苗CT-CRM-inu,研究此亚单位疫苗的免疫原性和药代动力学特性。在BALB/c小鼠的体内试验表明,CRM-inu修饰使CT特异性IgG抗体滴度显着升高。与CT组相比,CT-CRM-inu组的CT特异性IgG滴度在第14天、21天、28天分别增加了11.0倍（P<0.05）、8.6倍（P<0.05）、20.6倍（P<0.05）;与此同时,CT-CRM-inu组Th1型细胞因子IFN-γ和TNF-α在脾脏淋巴细胞中的表达分别增强了24.1（P<0.05）和2.4倍（P<0.05）;Th2型细胞因子IL-5和IL-10在脾脏淋巴细胞中的表达分别增强了7.8倍（P<0.05）和3.5倍（P<0.05）,这表明CRM-inu共价修饰能够提高机体CT蛋白特异性的体液免疫和细胞免疫应答。此外,重要的是研究证明小鼠血清样本中未检测出抗菊糖抗体,菊糖佐剂自身免疫原性极低,具有良好佐剂潜力。菊糖修饰的CT蛋白对小鼠心、肝和肾功能没有明显影响,具有良好的安全性。为了进一步研究菊糖的佐剂作用机制,测定了菊糖佐剂修饰的疫苗在SD大鼠体内的药代动力学特征。结果表明,通过CRM-inu修饰,与CT组相比,CT-CRM-inu组的血浆半衰期7.0±0.2 h延长至26.4±0.1 h,药时曲线下面积AUC0-144 h由1228.5±323.5μg mL-1h-1增加至7284.4±535.1μg mL-1h-1,生物利用度的清除率Cl/F由0.32±0.02μg/μg mL-1h-1下降至0.15±0.02μg/μg mL-1h-1。由此可知,CRM-inu修饰可显着延长CT在免疫系统中的暴露时间,提高疫苗的吸收利用程度,降低CT在血清中的清除速率,达到诱导机体产生更强烈的CT特异性免疫应答的目的。（2）菊糖作为寨卡病毒亚单位蛋白疫苗E蛋白佐剂具有良好的效果首先表达并纯化得到作为抗原的寨卡病毒包膜蛋白（E蛋白）。为了提高E蛋白的免疫原性,选用TLR7受体激动剂洛索立宾（Loxoribine,Lox）,与菊糖共同修饰E蛋白,制备了一系列集免疫刺激分子、递送系统以及抗原为一体的新型E蛋白亚单位疫苗Lox-E-inu。疫苗的免疫原性和免疫机理研究结果表明:菊糖协同洛索立宾作为E蛋白的佐剂,可诱导E蛋白的特异性IgG抗体产生以及T细胞反应。与单独的E蛋白组相比,Lox-E-I1组在第7天、第14天和第21天的特异性IgG滴度分别增加了4.0倍（P<0.05）、9.5倍（P<0.05）和25.0倍（P<0.05）。Lox-E-inu组Th1型细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2以及Th2型细胞因子IL-10的脾淋巴细胞数目分别增加了2.8倍（P<0.05）、1.5倍（P<0.05）、1.9倍（P<0.05）和1.8倍（P<0.05）;提高了CD4+T亚群细胞（P<0.05）和CD8+T亚群细胞（P<0.05）的数量,而CD4+T和CD8+T细胞数的比值并没有显着的变化（P>0.05）。此外,血清样本中没有检测出抗菊糖抗体,表明菊糖自身的免疫原性极低,具有良好的佐剂潜力。为进一步探讨菊糖和Lox的佐剂作用机理,采用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪对DC细胞的荧光强度进行分析发现,Lox-E-inu组树突状细胞（imDC细胞）摄取FITC标记疫苗的比率（56.97%）要显着高于单独E蛋白组（11.81%）,平均荧光强度（94.82）高于单独E蛋白组（12.26）,证实菊糖协同Lox佐剂能促进imDC细胞对抗原的高效摄取。此外,疫苗Lox-E-inu接种对小鼠心、肝和肾功能没有明显影响。上述研究结果表明,菊糖和Lox偶联递送E蛋白是增强体液免疫和细胞免疫的有效策略,其主要机制是通过提高imDC细胞对抗原的摄取,促进imDC细胞的分化与成熟,有利于提高DC细胞对抗原的递呈效率。
石耀林[4]（2019）在《非极性脂质佐剂的制备及对结核病疫苗免疫效果的影响》文中研究指明本研究在前期培养BCG-pasteur、△BCG 3112、△BCG 3113三种菌株,测定其生长速度以及统一菌液浓度的基础上,通过优化脂质萃取方法萃取出三种菌株的非极性脂质,再用薄层色谱法分析三种菌株脂质成分,然后通过对比挑选BCG-pasteur和△BCG 3112菌株的非极性脂质制成佐剂。为研究非极性脂质佐剂对结核病疫苗的效价影响,用BCG、BCG+BCG非极性脂质和BCG+△BCG 3112非极性脂质分别免疫小鼠,用流式细胞术和ELISpot法检测各组小鼠产生IFN-γ的脾淋巴细胞个数,同时采用ELISA方法检测小鼠的Ig G和Ig M抗体浓度,最后用H37Rv菌攻毒免疫小鼠,4w后观察各组小鼠病理切片,以研究非极性脂质佐剂对结核病疫苗免疫的效果。薄层色谱法结果显示,三种菌株的非极性脂质成分可能包括为三酰甘油、甲硫酚二角酰亚胺、家族蛋白PAT、甘油二酯、游离脂肪酸、游离分枝菌酸、鞘糖脂、硫脂I类、硫脂III类、肉豆蔻酸甘油酯和海藻糖二霉菌酸酯。通过非极性脂质阴影相对值比较发现△BCG 3112菌株的三酰甘油含量显着高于BCG-pasteur（P<0.05）,因此选用△BCG 3112菌株非极性脂质作为佐剂研究,同时对比BCG非极性脂质佐剂的作用效果。疫苗免疫小鼠后,通过流式细胞仪检测产生IFN-γCD4和CD8的T淋巴细胞数,结果显示,空白对照组、BCG组、BCG+BCG非极性脂质组和BCG+△BCG3112非极性脂质组之间的CD4、CD8和CD4/CD8比值没有显着性差异（P>0.05）;通过PMA刺激,BCG组、BCG+BCG非极性脂质组和BCG+△BCG 3112非极性脂质组产生IFN-γ的CD8与CD4 T淋巴细胞数显着性高于空白对照组（P<0.05）,BCG+BCG非极性脂质组和BCG+△BCG 3112非极性脂质组的CD8、CD4 T淋巴细胞数与BCG组比较没有显着性差异（P>0.05）。通过PPD刺激,BCG+BCG非极性脂质组和BCG+△BCG 3112非极性脂质组产生IFN-γ的CD8与CD4 T淋巴细胞数显着高于BCG组和空白对照组（P<0.05）,而BCG组与空白对照组相比没有显着性差异（P﹥0.05）。ELISpot实验表明,与BCG组比较,BCG+BCG非极性脂质组和BCG+△BCG3112非极性脂质组的斑点数显着增加（P<0.05）,BCG+BCG非极性脂质组和BCG+△BCG 3112非极性脂质组之间没有显着性差异,但BCG+△BCG 3112非极性脂质组产生IFN-γ的T淋巴细胞高于BCG+BCG非极性脂质组。结果提示,BCG和△BCG 3112菌株的非极性脂质都具有提高BCG疫苗免疫效果的作用,且△BCG 3112菌株非极性脂质的作用效果更好。血清Ig G抗体水平检测结果显示,与空白对照组比较,BCG组、BCG+BCG非极性脂质组和BCG+△BCG 3112非极性脂质组均显着增加（P<0.05）。另外,BCG+BCG非极性脂质组和BCG+△BCG 3112非极性脂质组小鼠Ig G抗体水平显着高于BCG组（P<0.05）,但BCG非极性脂质组和BCG+△BCG 3112非极性脂质组之间的Ig G抗体浓度没有显着性差异。Ig M抗体水平检测结果显示,BCG组、BCG+BCG非极性脂质组和BCG+△BCG 3112非极性脂质组显着高于空白对照组（P<0.05）;而BCG组、BCG+BCG非极性脂质组和BCG+△BCG 3112非极性脂质组三组之间的Ig M抗体水平没有显着性差异（P﹥0.05）。以上结果提示,BCG和△BCG 3112菌株的非极性脂质均能提高提高BCG疫苗抗体效价,进而提高动物的体液免疫功能,而△BCG 3112菌株非极性脂质的作用效果更好。小鼠病理切片结果显示,BCG组、BCG+BCG非极性脂质组和BCG+△BCG3112非极性脂质组与攻毒组比较,小鼠肺脏出血明显减少,组织内红细胞较少;BCG组和BCG+BCG非极性脂质组肺组织有大量淋巴细胞浸润,且肺泡间距和上皮样结节的病变未有改善;而BCG+△BCG 3112非极性脂质组肺组织内淋巴细胞浸润减少和肺泡间距缩小情况有所改善,另外肺内未见上皮样结节形成。结果提示,BCG+△BCG 3112非极性脂质组对攻毒小鼠肺的保护作用效果最好。
沈洪波,陈维政[5]（2014）在《结核病疫苗研究进展》文中研究指明随着对抗结核免疫机制的深入研究,新型结核疫苗的研发也更加理性和成熟。近期研究表明,CD4 T细胞多功能至关重要,人类CD8和γδT细胞也有抗结核免疫保护作用,是新型疫苗设计有潜力的T细胞靶点。系统的"组学"技术大规模筛选有可能发现更多强免疫原性的抗原。不同表达时期的多抗原组成的多价疫苗对不同感染时期的结核都有预防作用。针对潜伏感染或已经感染个体配合化学药物使用的新型治疗性疫苗,有望促进清除残留的结核分枝杆菌。
张云峰,刘福元,蔡宏,呼西旦,宋振忠,徐雪萍[6]（2011）在《结核分枝杆菌三价DNA疫苗的体液免疫与细胞免疫应答》文中进行了进一步梳理为研究结核分枝杆菌Ag85B、MPT64和MPT83抗原DNA疫苗在奶牛体内诱导的免疫应答,以PJW4303为载体,构建了上述3种抗原基因的三价DNA疫苗。采用阴离子交换色谱方法提取3种质粒,混合后添加佐剂DDA免疫3月龄荷斯坦奶牛3次,采用ELISA法检测免疫奶牛的特异性抗体效价。利用双抗夹心ELISA定量测定免疫奶牛各月的IFN-γ浓度。结果显示,纯化后的DNA疫苗经质量检验达到动物免疫试验的要求;免疫前奶牛体内特异性抗体为阴性;三免后第30天MPT83、Ag85B和MPT64特异性抗体效价达到最高,均值分别为1∶3 200、1∶2 560和1∶2 880;同时免疫奶牛MPT83、Ag85B、MPT64三种蛋白诱导产生的IFN-γ在三免后第30天达到最高,分别为（630.25±94.45）、（341.65±76.75）、（51.38±9.80）pg/mL,阴性对照组PBS的IFN-γ浓度为（6.48±20.88）pg/mL。每个月的阴性对照与3种抗原相比,差异均极显着（P<0.01）。证实该三价核酸疫苗能同时诱导机体产生细胞免疫应答和体液免疫应答,可能有利于增强疫苗对结核病的抗性。
张云峰,刘福元,蔡宏,呼西旦,徐雪萍[7]（2011）在《结核分枝杆菌三价DNA疫苗在奶牛体内诱导的免疫应答》文中研究表明【目的】研究结核分枝杆菌Ag85B、MPB64和MPT83抗原DNA疫苗在奶牛体内诱导的免疫应答。【方法】以PJW4303为载体,构建上述3种抗原基因的三价DNA疫苗,免疫6月龄荷斯坦奶牛3次。ELISA法检测免疫奶牛的特异性抗体滴度。利用双抗夹心ELISA定量测定免疫奶牛各月IFN-γ浓度。【结果】免疫前奶牛体内特异性抗体为阴性,1免2、免后抗体效价上升较缓,3免后抗体效价上升快。MPT83特异性抗体上升最快,抗体效价1∶3 200持续6个月;Ag85B特异性抗体效价1∶3 200持续2个月;MPT64特异性抗体效价较低。免疫奶牛中MPT83、Ag85B、MPT64三种蛋白诱导产生IFN-γ在3免后6个月到达最高,浓度分别为（1 098.95±165.03）（、711.45±110.43）（、355.06±72.76）pg/mL,阴性对照组PBS刺激IFN-γ浓度为（114.5±27.46）pg/mL。阴性对照与三种抗原相比,差异均极显着（P<0.01）。【结论】多价核酸疫苗能同时诱导机体产生细胞免疫应答和体液免疫应答,可能有利于增强疫苗对抗结核病的抗性。
刘磊[8]（2011）在《牛分枝杆菌mpb51-63-83-85b基因的原核表达及产物的应用研究》文中认为牛结核病（Bovine tuberculosis）主要是由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起的一种人和动物共患的慢性消耗性传染病,被我国列为二类动物疫病。近年来,该病不仅没有得到有效控制,而且流行情况呈上升趋势,严重地威胁和危害着畜牧业的发展以及人类的健康。MPB51、MPB63、MPB83和Ag85B都是结核分枝杆菌的主要保护性抗原。都在牛结核病血清学诊断中具有很大的潜力,是作为牛结核病亚单位疫苗及核酸疫苗很好的候选抗原。1.牛分枝杆菌mpb51-63-83-85b融合基因的获得以重组质粒pMD-18-T-51-63和pGEM-T-83、pGEM-T-85b为模板采用PCR技术扩增mpb51-63、mpb83和ag85b目的基因片段。以mpb83和ag85b基因片段为模板,采用重叠延伸剪接技术（splicing by overlapping extension polymerase chain reaction,SOE PCR）扩增mpb83-85b融合基因。再以mpb51-63和mpb83-85b为模板,通过SOE PCR（?）mpb51-63和mpb83-85b基因融合,获得了融合基因mpb51-63-83-85b。2.牛分枝杆菌mpb51-63-83-85b融合基因的表达将mpb51-63-83-85b基因片段和表达载体pET30a（+）进行NcoⅠ和EcoRⅠ双酶切,回收纯化酶切产物,并用T4 DNA连接酶连接,成功地构建了原核表达重组质粒pET30a-51-63-83-85b。将该重组表达质粒转化到感受态细胞E.coli BL21（DE3）中,经过IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约100 kDa的外源蛋白表达,Western blotting分析发现,融合蛋白MPB51-MPB63-MPB83-Ag85B具有牛分枝杆菌抗原反应性。该融合蛋白通过离子交换层析得到了纯化。为进一步研究融合基因mpb51-63-83-85b及其表达产物作为核酸疫苗、亚单位疫苗和新型的诊断抗原,以及建立牛结核病特异、敏感的诊断方法奠定了基础。3.融合蛋白MPB51-MPB63-MPB83-Ag85B在牛结核病ELISA检测中的初步应用以纯化的融合蛋白MPB51-MPB63-MPB83-Ag85B为诊断抗原,以94份健康牛血清的检测结果确定阴、阳性临界值,从而建立了牛结核病间接ELISA检测方法。通过对牛结核阴性、阳性血清及副结核阳性血清的检测结果表明,该方法具有良好的敏感性和特异性。通过283份待检血清检测结果显示,融合蛋白MPB51-MPB63-MPB83-Ag85B的阳性检出率为5.30%（15/283）,PPD的阳性检出率为6.36%（18/283）,两者的阳性符合率为83.33%。初步研究结果表明,融合蛋白MPB51-MPB63-MPB83-Ag85B作为牛结核病ELISA诊断抗原具有较好的敏感性和特异性。
李冰洁[9]（2011）在《牛分枝杆菌mpb51-63-83-85b融合基因对实验动物的免疫研究》文中指出牛结核病（Bovine tuberculosis）主要是由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起的一种人和动物共患的传染病,被我国列为二类动物疫病。该病的流行与传播不仅严重威胁着畜牧业的发展,而且也危害着人类的生命和健康。近年来,人结核病的发生在世界范围的大幅度回升,据世界卫生组织估计,目前占世界人口1/3的人处于感染该病病原的潜伏期,现在患有结核病患者人数约2000万,每年新发病例约1800万例,由该病造成的死亡人数达300万左右,超过了艾滋病、疟疾、腹泻等死亡人数的总和。我国目前每年约有15万人死于该病,居世界第二位,是全球的结核病高负担国家之一。牛结核病检测和预防的手段都有其各自的优缺点。首先,虽然国际兽医局（OIE）将牛结核菌素（PPD）皮内变态反应试验确立为牛结核病诊断的唯一方法,但其自身也存在许多不足,如特异性低,不能区分各种分枝杆菌,只能进行活体试验,而不能对保存的样品进行回顾性分析,更不适用于野生动物和边远山区的牛结核病普查。其次,γ-干扰素试验以其较高的特异性和敏感性已经被澳大利亚等国家确定为最新的牛结核病诊断方法,但其操作成本较高且容易受到抗原交叉反应的影响。另外,ELISA方法操作简便、易行、快速、无需特殊精密仪器,所以在结核病血清学诊断方面研究最多、应用最广,但在敏感性和特异性方面仍存在不足。最后,自从卡介苗（BCG）发现以来,对牛结核病的预防起到了不可小视的作用,极大的延缓了该病的发生与流行。然而,BCG也存在许多自身的缺陷,如不同地区和不同机体接种后的免疫效果很不稳定,同时影响该病的PPD变态反应检测,使得很难区分是自然感染牛还是人工接种牛,给日常检疫工作带来许多不变。因此,研发牛结核病的新型诊断和预防制剂已成为重中之重。MPB51.MPB63.Ag85复合物、MPB83蛋白是结核分枝杆菌培养滤液中的主要分泌蛋白,其表达量在分泌蛋白中也居主要地位,且与感染结核杆菌的豚鼠阳性血清产生强烈的免疫反应,是结核分枝杆菌的主要保护性抗原,可以作为诊断抗原、亚单位疫苗及核酸疫苗的候选抗原。且已有研究表明,多基因融合表达的蛋白免疫原性明显高于单个基因。为了提高单一抗原的免疫原性,本研究在已获得牛分枝杆菌mpb51-63-83-85b融合基因的基础上,构建牛分枝杆菌pVAX1-51-63-83-85b真核表达载体,并在哺乳动物细胞中表达,然后将重组真核表达质粒直接注射到实验动物体内,使外源基因在动物体内表达,产生的抗原刺激机体的免疫系统,引发免疫应答。为制备安全、可靠的新型结核DNA疫苗打下坚实的基础。
陆云芝[10]（2010）在《重组卡介苗rBCG::Ag85B-ESAT6-Rv2608与rBCG::Ag85B-ESAT6-Rv3620c的免疫原性研究》文中指出结核病（Tuberculosis, TB）是一种古老而漫长的感染性疾病,是长期危害人类健康的严重疾病之一。目前,全球大约有三分之一的人口感染了结核杆菌,每年约有300万人死于结核病,平均每天死亡超过8000人。近年来,由于HIV和结核分枝杆菌双重感染,以及耐药结核分枝杆菌的流行,导致结核病的发病率和死亡率大幅度上升,形势更加严峻。联合国已将结核病列为21世纪重点控制的三大疾病之一。卡介苗（BCG）作为唯一的能够预防结核病的疫苗,虽然已在全球广泛使用,但近期发现其保护效果不稳定（0-80%）,对成人几乎无效,对已感染患者更是没有治疗作用,因此研制新型的抗结核疫苗刻不容缓。预防性疫苗和治疗性疫苗是新型抗结核疫苗的两个主要发展策略,其中预防性疫苗研究得较多,包括DNA疫苗、蛋自疫苗、重组BCG疫苗、营养缺陷型疫苗、病毒载体疫苗等。本实验针对重组BCG进行研究,通过将一些重要的结核杆菌抗原基因导入BCG,让BCG大量表达保护性抗原,以期诱导比BCG强大而又持久的免疫保护力。Ag85B和ESAT-6作为重要的抗结核保护性抗原已得到各国科学家公认,研究表明重组入Ag85B-EAST6的BCG （rBCG::Ag85B-EAST6）提高了抗结核保护作用。此外,重组多价抗原疫苗往往能够比单一抗原疫苗激发更强的免疫反应,因此本实验在选择了保护性抗原Ag85B-EAST6融合抗原的基础上又选择了另外两种保护性抗原,PPE蛋白Rv2608（PPE42）和Esx家族成员Rv3620c （EsxW）,分别与Ag85B-ESAT6融合抗原联合,以大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒pMV261为载体,构建了两株重组BCG菌株rBCG::Ag85B-ESAT6-Rv2608与rBCG::Ag85B-ESAT6-Rv3620c,均为国内外首次报道。将两株重组BCG和传统BCG疫苗分别免疫C57BL/6小鼠,通过ELISA检测了抗体IgG水平IgG2b/IgG1水平和细胞因子（IFN-γ、 IL-2、IL-10等）分泌水平,用ELISPOT检测了TNF-α阳性淋巴细胞水平,并用流式细胞仪检测了CD4+T细胞亚群和CD8+T细胞亚群水平,分析比较各菌株的免疫原性。结果表明,与传统BCG相比较,两株重组BCG均可增强小鼠脾淋巴细胞在特异性抗原Ag85B和PPD刺激下细胞因子TNF-α和IL-2分泌水平,降低细胞因子IL-10分泌水平,显示出更强的细胞免疫应答。同时,与传统BCG相比较,rBCG::Ag85B-ESAT6-Rv3620c诱导小鼠脾淋巴细胞产生更多的细胞因子IFN-γ,进一步增强Thl型细胞免疫反应。流式检测结果表明,两株重组BCG均可引起小鼠脾淋巴细胞特异性抗原Ag85B和PPD刺激下CD4+T细胞亚群和CD8+T细胞亚群分化水平提高,而CD4/CD8比值减小,显示重组BCG能通过增强细胞毒作用提高机体的抗结核免疫保护作用。此外,两株重组BCG均可引起抗原Ag85B特异性的体液免疫反应,与传统BCG相比较,表现为Ag85B特异性IgG水平的升高,并测得IgG2b/IgG1水平也升高,显示Thl型免疫应答增强,与细胞免疫反应结果一致。因此,初步研究表明这两株重组BCG有望开发成为有效的新型抗结核疫苗用于结核病的预防,为进一步的动物保护实验等奠定了基础。
二、结核分枝杆菌组合DNA疫苗的免疫效果（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、结核分枝杆菌组合DNA疫苗的免疫效果（论文提纲范文）
（1）结核分枝杆菌新型疫苗的制备及其免疫效果研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 第一部分 结核分枝杆菌 Ag85B-Hsp65、ESAT6-Hsp65 融合基因DNA 疫苗株的构建及免疫效果评价 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第二部分 卡介苗 ure C 基因缺失株的构建及筛选 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 结核病与结核疫苗 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（2）牛分枝杆菌cfp10-esat6-cfp7融合基因重组乳酸菌的构建及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 牛结核病概述 |
| 1.1 牛结核病简介及现状 |
| 1.2 牛结核病疫苗研究进展 |
| 1.3 牛结核病诊断技术 |
| 第二章 乳酸菌载体研究进展 |
| 2.1 乳酸菌 |
| 2.2 乳酸乳球菌表达系统 |
| 2.3 乳酸菌疫苗的应用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 牛分枝杆菌cfp10-esat6-cfp7 融合蛋白基因的克隆 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.3 试验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 牛分枝杆菌cfp10-esat6-cfp7 融合基因重组乳酸菌的构建及表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 牛分枝杆菌cfp10-esat6-cfp7 融合基因重组乳酸菌的免疫原性研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 仪器试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）菊糖在结核分枝杆菌和寨卡病毒亚单位疫苗中的佐剂作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1 概述 |
| 2 菊糖的研究进展 |
| 2.1 菊糖的结构 |
| 2.2 菊糖的理化性质 |
| 2.3 影响菊糖结构和含量的天然因素 |
| 2.4 菊糖的天然来源及提取 |
| 2.5 菊糖在植物中的功能 |
| 2.6 菊糖在功能食品中的应用 |
| 2.7 菊糖在药物中的应用 |
| 2.8 菊糖的免疫调节功能 |
| 2.9 菊糖的佐剂作用 |
| 3 亚单位疫苗佐剂研究进展 |
| 3.1 亚单位疫苗佐剂的重要性及其作用机制 |
| 3.2 亚单位疫苗佐剂的分类 |
| 3.3 亚单位疫苗递送系统 |
| 3.4 目前被批准使用的佐剂 |
| 3.5 目前佐剂的安全性及局限性 |
| 3.6 高效佐剂的策略 |
| 4 结核病及结核分枝杆菌疫苗 |
| 4.1 结核病流行现状 |
| 4.2 结核分枝杆菌简介 |
| 4.3 结核分枝杆菌疫苗卡介苗 |
| 4.4 新型结核病疫苗研制策略 |
| 5 寨卡病毒流行病学特征及疫苗进展 |
| 5.1 寨卡病毒生物学特征 |
| 5.2 寨卡病毒致病机制 |
| 5.3 寨卡病毒免疫应答特征 |
| 5.4 寨卡疫苗研究进展 |
| 5.5 寨卡疫苗研究挑战 |
| 6 本论文研究的目的意义及主要研究内容 |
| 6.1 本论文研究的目的意义 |
| 6.2 本论文研究的主要内容 |
| 第二章 菊糖修饰的结核分枝杆菌亚单位疫苗的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要材料与试剂 |
| 1.2 主要仪器与设备 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 融合蛋白CFP10-TB10.4的表达、纯化和鉴定 |
| 2.2 分子排阻色谱纯化 CFP10-TB10.4 融合蛋白疫苗 |
| 2.3 CFP10-TB10.4蛋白疫苗的质量控制 |
| 2.4 分子排阻色谱分析纯化后的CFP10-TB10.4融合蛋白疫苗 |
| 2.5 动态光散射分析佐剂修饰后的CFP10-TB10.4融合蛋白水化半径 |
| 2.6 圆二色光谱检测佐剂对CFP10-TB10.4融合蛋白二级结构的影响 |
| 2.7 内源荧光光谱检测佐剂对CFP10-TB10.4融合蛋白三级级结构的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 菊糖修饰的结核分枝杆菌亚单位疫苗免疫原性及药代动力学研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂和仪器 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 佐剂对CFP10-TB10.4 特异性抗体IgG滴度的影响 |
| 2.2 佐剂特异性IgG抗体滴度测定 |
| 2.3 血清中抗体的CFP10-TB10.4融合蛋白特异性检测 |
| 2.4 佐剂对脾淋巴细胞增殖水平的影响 |
| 2.5 佐剂对小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子水平的影响 |
| 2.6 佐剂对抗原在小鼠体内代谢动力学的影响 |
| 2.7 CT 样品药代动力学分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 结核分枝杆菌感染的免疫应答特征 |
| 3.2 菊糖与CRM_(197)协同使用对CFP10-TB10.4 蛋白免疫原性的影响 |
| 3.3 佐剂的免疫原性及安全性 |
| 3.4 菊糖协同CRM197作为佐剂的作用机制 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 菊糖修饰的寨卡病毒E蛋白亚单位疫苗的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂、质粒和仪器 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 E蛋白的表达,纯化和表征 |
| 2.2 寨卡E蛋白亚单位疫苗的纯化 |
| 2.3 圆二色光谱检测佐剂对E蛋白二级结构的影响 |
| 2.4 内源荧光光谱检测佐剂对E蛋白二级结构的影响 |
| 2.5 佐剂修饰后的寨卡E蛋白分子排阻色谱分析 |
| 2.6 动态光散射检测佐剂对的寨卡E蛋白分子半径的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第五章 菊糖修饰的ZIKV亚单位疫苗免疫原性及佐剂作用机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 佐剂对小鼠IgG抗体滴度的影响 |
| 2.2 抗菊糖佐剂特异性抗体的检测 |
| 2.3 佐剂对小鼠脾淋巴细胞的转化率的影响 |
| 2.4 流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞CD4~+T和 CD8~+T亚群分布 |
| 2.5 流式细胞术检测脾淋巴细胞的胞内细胞因子 |
| 2.6 菊糖佐剂修饰对抗原提呈细胞摄取抗原E蛋白的影响 |
| 2.7 菊糖修饰的E亚单位疫苗安全性初步研究 |
| 3 讨论 |
| 3.1 ZIKV引起的免疫应答特征 |
| 3.2 菊糖和洛索立宾对E蛋白免疫原性的影响 |
| 3.3 菊糖和洛索立宾协同作用的机制 |
| 4 本章小结 |
| 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）非极性脂质佐剂的制备及对结核病疫苗免疫效果的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 本论文常用缩写词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 结核病流行病学 |
| 1.2 结核分枝杆菌生物学特性 |
| 1.3 临床症状与病理变化 |
| 1.4 结核病疫苗研究现状 |
| 1.4.1 卡介苗研究进展 |
| 1.4.2 亚单位疫苗 |
| 1.4.3 DNA疫苗 |
| 1.4.4 重组疫苗 |
| 1.4.5 减毒活疫苗 |
| 1.5 非极性脂质佐剂理论基础和作用 |
| 1.6 缺失菌株背景 |
| 1.7 薄层色谱法研究进展 |
| 1.8 本课题研究的内容、目的和意义 |
| 第二章 非极性脂质佐剂的制备 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.2.4 相关溶液配制 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 菌株培养 |
| 2.3.2 BCG-pasteur、△BCG3112 和△BCG3113 菌株生长曲线的测定 |
| 2.3.3 菌株脂质萃取 |
| 2.3.4 薄层色谱法分析菌株脂质成分 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 菌株生长曲线 |
| 2.4.2 薄层色谱法分析菌株脂质成分 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 BCG-pasteur、△BCG3112 和△BCG3113 生长情况 |
| 2.5.2 萃取剂和展开剂系统的选用 |
| 2.5.3 薄层色谱法分析三种菌株非极性脂质成分 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 非极性脂质佐剂对结核病疫苗免疫效果的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 小鼠 |
| 3.2.3 相关溶液配制 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 疫苗免疫小鼠 |
| 3.3.2 流式细胞术检测小鼠脾脏中表达IFN-γ的T淋巴细胞 |
| 3.3.3 ELISpot法检测免疫小鼠分泌IFN-γ的脾淋巴细胞 |
| 3.3.4 小鼠血清免疫球蛋白G(IgG)的检测 |
| 3.3.5 小鼠血清免疫球蛋白M(IgM)的检测 |
| 3.3.6 H37Rv菌对免疫小鼠的攻毒实验 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 流式细胞术对PMA刺激的表达IFN-γ小鼠脾T淋巴细胞的检测结果 |
| 3.4.2 流式细胞术对PPD刺激的表达IFN-γ小鼠T脾淋巴细胞的检测结果 |
| 3.4.3 ELISpot法检测免疫小鼠分泌IFN-γ的脾淋巴细胞 |
| 3.4.4 小鼠血清免疫球蛋白G(IgG)水平检测结果 |
| 3.4.5 小鼠血清免疫球蛋白M(IgM)水平检测结果 |
| 3.4.6 H37Rv菌对免疫小鼠的攻毒实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 非极性脂质佐剂对PMA和 PPD刺激的表达IFN-γ小鼠脾T淋巴细胞数的影响 |
| 3.5.2 ELISpot法检测免疫小鼠分泌IFN-γ的脾淋巴细胞 |
| 3.5.3 非极性脂质佐剂对免疫小鼠Ig G和 Ig M抗体水平的影响 |
| 3.5.4 结合脂质佐剂疫苗对H37Rv菌攻毒小鼠的保护作用 |
| 3.6 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（5）结核病疫苗研究进展（论文提纲范文）
| 1 结核病免疫机制研究进展 |
| 2 新型结核抗原的筛选及应用 |
| 2.1 发现新抗原 |
| 2.2 抗原在疫苗中的应用 |
| 3 临床期试验的新型结核疫苗 |
| 3.1 重组卡介苗 |
| 3.2 蛋白多肽疫苗 |
| 3.3 DNA疫苗 |
| 3.4 其他结核疫苗 |
| 4 展望 |
（7）结核分枝杆菌三价DNA疫苗在奶牛体内诱导的免疫应答（论文提纲范文）
| 0 引 言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材 料 |
| 1.2 方 法 |
| 1.2.1 结核杆菌重组蛋白的制备与鉴定 |
| 1.2.2 真核表达载体的大量制备 |
| 1.2.3 动物免疫试验 |
| 1.2.4 奶牛抗原特异性抗体检测 |
| 1.2.5 奶牛IFN-γ检测 |
| 1.2.6 结果统计 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 三种重组蛋白的原核表达与鉴定 |
| 2.2 三种抗原特异性抗体在免疫奶牛体内的变化 |
| 2.3 免疫奶牛血清中特异性细胞因子IFN-γ水平分析 |
| 3 讨 论 |
| 4 结 论 |
（8）牛分枝杆菌mpb51-63-83-85b基因的原核表达及产物的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 综述 |
| 1 结核病的危害 |
| 2 病原 |
| 3 流行病学 |
| 4 致病机理 |
| 5 免疫机理 |
| 6 牛结核病诊断技术研究进展 |
| 7 牛分枝杆菌主要保护性抗原研究进展 |
| 8 牛结核DNA疫苗的研究现状 |
| 9 本研究的目的和意义 |
| 第二部分 实验内容 |
| 实验一 牛分枝杆菌MPB51-MPB63-MPB83-Ag85b融合蛋白的表达及纯化 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 目的基因的PCR扩增产物 |
| 3.2 原核表达质粒的构建 |
| 3.3 重组表达质粒的鉴定 |
| 3.4 目的基因的序列测定与分析 |
| 3.5 SDS-PAGE分析 |
| 3.6 Western blot分析 |
| 3.7 重组蛋白的纯化结果分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 目的基因的选择 |
| 4.2 关于融合基因的构建 |
| 4.3 原核表的系统的选择 |
| 4.4 融合蛋白的反应性 |
| 4.5 关于融合蛋白的纯化 |
| 5 小结 |
| 实验二 MPB51-MPB63-MPB83-Ag85B在牛结核病ELISA检测中的初步应用 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 MPB51-MPB63-MPB83-Ag85B融合蛋白最适包被浓度和血清最适稀释浓度的确定 |
| 3.2 酶标抗体的工作浓度的确定 |
| 3.3 ELISA判定标准的确定 |
| 3.4 特异性检测结果 |
| 3.5 敏感性检测结果 |
| 3.6 待测血清检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）牛分枝杆菌mpb51-63-83-85b融合基因对实验动物的免疫研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 综述 |
| 1 结核病的危害 |
| 2 结核病的病原学研究 |
| 3 牛结核病的流行病学研究 |
| 4 结核病的免疫机理 |
| 5 牛分枝杆菌主要保护性抗原 |
| 6 牛结核病DNA疫苗的研究 |
| 7 牛结核病的诊断方法 |
| 第二部分 实验内容 |
| 实验一 牛分枝杆菌融合基因MPB51-63-83-85B真核表达载体的构建与表达 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 实验二 牛分枝杆菌MPB51-63-83-85B融合基因对实验动物的免疫研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）重组卡介苗rBCG::Ag85B-ESAT6-Rv2608与rBCG::Ag85B-ESAT6-Rv3620c的免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 综述 |
| 第一节 结核杆菌与结核病 |
| 第二节 机体抗结核免疫机制 |
| 第三节 结核疫苗研究状况和进展 |
| 参考文献 |
| 第二章 重组卡介苗rBCG::Ag85B-ESAT6-Rv2608的研究 |
| 第一节 材料与方法 |
| 第二节 实验结果 |
| 第三节 分析与讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 重组卡介苗rBCG::Ag85B-ESAT6-Rv3620c的研究 |
| 第一节 材料与方法 |
| 第二节 实验结果 |
| 第三节 分析与讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结与展望 |
| 附录 |
| 硕士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
四、结核分枝杆菌组合DNA疫苗的免疫效果（论文参考文献）
- [1]结核分枝杆菌新型疫苗的制备及其免疫效果研究[D]. 张真. 内蒙古医科大学, 2020(03)
- [2]牛分枝杆菌cfp10-esat6-cfp7融合基因重组乳酸菌的构建及免疫原性研究[D]. 包艳红. 吉林农业大学, 2019(03)
- [3]菊糖在结核分枝杆菌和寨卡病毒亚单位疫苗中的佐剂作用研究[D]. 胡瞬. 湖南农业大学, 2019(01)
- [4]非极性脂质佐剂的制备及对结核病疫苗免疫效果的影响[D]. 石耀林. 佛山科学技术学院, 2019(02)
- [5]结核病疫苗研究进展[J]. 沈洪波,陈维政. 生命的化学, 2014(01)
- [6]结核分枝杆菌三价DNA疫苗的体液免疫与细胞免疫应答[J]. 张云峰,刘福元,蔡宏,呼西旦,宋振忠,徐雪萍. 中国兽医科学, 2011(11)
- [7]结核分枝杆菌三价DNA疫苗在奶牛体内诱导的免疫应答[J]. 张云峰,刘福元,蔡宏,呼西旦,徐雪萍. 新疆农业科学, 2011(07)
- [8]牛分枝杆菌mpb51-63-83-85b基因的原核表达及产物的应用研究[D]. 刘磊. 吉林农业大学, 2011(11)
- [9]牛分枝杆菌mpb51-63-83-85b融合基因对实验动物的免疫研究[D]. 李冰洁. 吉林农业大学, 2011(12)
- [10]重组卡介苗rBCG::Ag85B-ESAT6-Rv2608与rBCG::Ag85B-ESAT6-Rv3620c的免疫原性研究[D]. 陆云芝. 复旦大学, 2010(07)