一、外源NF-IL6高表达增强巨噬细胞的细胞毒效应（论文文献综述）
沙洲[1]（2021）在《松花粉多糖对鸡肠道黏膜免疫的影响及巨噬细胞的免疫调节作用》文中研究表明松花粉作为传统医学中的膳食补充剂已有数百年历史,而具有广泛生物学活性的多糖（Polysaccharides,PS）是松花粉的关键活性成分之一,已经被运用到改善和调节免疫功能等方面。黏膜免疫系统是动物（尤其是家禽）整个免疫网络的重要组成部分,也是抵抗外源抗原感染的第一道防线。肠道黏膜是食物消化和营养吸收的关键部位,其中存在的肠道微生物和大量免疫细胞共同形成坚固的防御屏障,而作为免疫细胞的巨噬细胞（Macrophages,m（?））具有趋化性运动、吞噬、分泌和抗原呈递等功能,在抗感染、抗肿瘤、免疫调节等过程中扮演积极角色。本论文以从山东省泰安市的松花粉中分离纯化的松花粉多糖（Pine pollen Polysaccharides,PPPS）作为研究对象,运用分子生物学等技术在体内探究PPPS对肠道黏膜免疫的影响;通过16S高通量测序分析PPPS对肠道内菌群结构丰度的作用;在体外以鸡巨噬细胞（HD11）作为靶细胞,揭示PPPS对其的免疫调节作用并初步探究作用机制。本研究旨在为研制对黏膜免疫具有免疫增强作用的新型免疫增强制剂提供实验基础和理论依据。主要研究内容和结果如下:1、PPPS对黏膜免疫的影响本试验首先选取120只1日龄的SPF鸡,随机分为PBS组、PPPS低剂量组（LPPPS组）、PPPS中剂量组（MPPPS组）、PPPS高剂量组（HPPPS组）,分别口服PBS和3种不同剂量的PPPS（10 mg/m L,20 mg/m L和40 mg/m L）,0.2 m L/只,持续21天。在试验的第7、14和21天分别收集各组鸡的肠道组织、粪便及血液样品。通过ELISA方法、流式细胞术、CCK-8试剂、实时荧光定量PCR（q PCR）等技术分别检测免疫学相关指标,主要包括:SIg A和Ig G抗体水平、CD4+、CD8+T淋巴细胞水平、T淋巴细胞转化率、细胞因子（白介素2、白介素4、干扰素γ）、黏膜免疫相关分子基因（CD80、CD86、MHC-I、MHC-II）。结果表明PPPS显着提高鸡的黏膜抗体SIg A和血清抗体Ig G水平,并有效促进细胞因子分泌及T淋巴细胞水平,上调黏膜免疫相关基因m RNA水平。通过HE染色观察PPPS对小肠绒毛结构的影响,分别采集PBS组及PPPS组鸡的小肠不同部位组织制成石蜡切片,测量并统计分析各组鸡的十二指肠、空肠和回肠绒毛长度、宽度、隐窝深度及V/C值（长度/深度）的变化。结果表明,PPPS能有效改善小肠绒毛发育以增强肠道黏膜抵御病原体的物理屏障。为了探究PPPS对肠道黏膜的保护作用,试验的第21天,分别对每组鸡滴鼻100μL106TCID50新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）病毒液,记录攻毒后体重变化及死亡率,并取各段小肠及肺脏采用HE染色观察病理变化,通过q PCR检测肠黏膜病毒载量。结果表明,MPPPS、HPPPS组与LPPPS、PBS组相比,显着减轻由NDV引起的体重降低、病理损伤、病毒载量及死亡率。另外通过感染H9N2病毒探究口服PPPS对呼吸道黏膜的保护作用,在口服40 mg/m L的PPPS剂量7天后,PBS组及PPPS组选取5只鸡分别滴鼻100μL 104TCID50H9N2病毒液,在攻毒后第3、5和7天采集肺脏组织HE染色,通过q PCR检测肺脏病毒量,采用免疫荧光对病毒进行定位并分析荧光强度。结果表明PPPS显着降低肺脏中病毒量,减轻肺脏病理变化。证明PPPS不仅能有效保护肠道黏膜损伤,同样对呼吸道黏膜也具有保护作用。2、PPPS对肠道菌群的影响为了探究PPPS对鸡肠道菌群的影响,在口服PPPS的第21天,收集PBS组及HPPPS组（40 mg/m L）鸡粪便样本,通过16S高通量测序对鸡肠道菌群组成、多样性等方面进行分析研究。结果表明,PBS组与PPPS组的肠道菌群组成存在较大差异,通过Venn图结果表明,PPPS组OTU值显着升高。在门水平上分析,PPPS组的Firmicutes（厚壁菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Proteobacteria（变形菌门）与PBS组相比均有较大变化。在科水平上分析,Lactobacillaceae（乳杆菌科）、Bacteroidaceae（拟杆菌科）、Lachnospiraceae（毛螺菌科）、Rikenellaceae（理研菌科）变化较为明显。在属水平上分析,PPPS组与PBS组相比,诸如Enterococcus（肠球菌）、Bacteroides（拟杆菌属）、Alistipes（别样杆菌属）、Helicobacter（螺杆菌属）、Intestinimonas（瘤胃菌属）等均丰度上升。在种水平上分析,Lactobacillus＿reuteri（罗伊氏乳杆菌）,Enterococcus＿cecorum（盲肠链球菌）、Bacteroides＿uniformis、Bacteroides＿thetaiotaomicro（拟杆菌）,Lachnospiraceae＿bacterium＿615、Lachnospiraceae＿bacterium＿M18-1（毛螺菌）,Clostridium＿sp＿AUH-JLC140（梭状杆菌）,Alistipes＿finegoldii（别样杆菌）等丰度上升。在α多样性及UPGMA聚类树等分析发现,PPPS组的菌群物种多样性显着高于PBS组。因此说明PPPS能够改善肠道菌群结构及丰富度。3、PPPS对巨噬细胞的免疫调节作用为了探究PPPS对巨噬细胞HD11的免疫调节作用,首先用CCK-8试剂检测不同浓度的PPPS对HD11细胞的增殖作用,通过中性红及FITC-葡聚糖分析PPPS对HD11细胞的吞噬活性的影响,Griess试剂检测PPPS处理HD11细胞后分泌一氧化氮（NO）水平,荧光探针法测定活性氧（ROS）,ELISA法检测HD11细胞培养液上清液中白介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）含量。通过q PCR法检测诱导型一氧化氮合酶（i NOS）、IL-1β和TNF-α的m RNA水平变化。结果表明,当PPPS浓度高于800μg/m L时,PPPS对HD11细胞增殖具有一定的抑制作用,而在低于400μg/m L时能显着促进增殖效果。因此选用50-400μg/m L浓度范围的PPPS进行后续试验。中性红及FITC-葡聚糖试验显示PPPS均能显着提高HD11细胞吞噬活性,但各浓度间的作用效果无显着差异。PPPS以剂量依赖性方式促进HD11细胞分泌NO、IL-1β、TNF-α,且上调i NOS、IL-1β、TNF-αm RNA水平。通过高通量测序技术,对以200μg/m L PPPS处理24 h的HD11细胞与PBS组细胞进行转录组测序,分析比较差异表达m RNA、mi RNA及信号通路。结果表明,PPPS组有2358个上调表达基因和2028个下调表达基因,其中富集分析与免疫相关主要通路为内吞作用、黏附连接、内质网蛋白质加工、细胞因子-细胞因子受体相互作用、转运蛋白、Toll样受体、MAPK、Notch、C型凝集素受体、NOD样受体、RIG-I样受体等信号通路。mi RNA结果显示10个mi RNA在PPPS组中高表达,21个mi RNA下调表达。KEGG通路富集分析主要通路为内吞作用、紧密连接、溶酶体、黏合连接、细胞粘附分子、内质网蛋白加工、Notch等信号通路。为了探究PPPS作用的HD11细胞的受体以及免疫调节的信号通路,根据转录组结果,我们选择分析验证Toll样受体、MAPK、NF-κB分子对HD11细胞的影响。在PPPS处理HD11细胞后,通过q PCR方法检测Toll样受体2、4（TLR 2、4）、甘露糖受体（MR）和NF-κB分子m RNA水平。TLR4、MAPK三种亚基（p38、JNK、ERK1/2）和NF-κB抑制剂预处理细胞后,Griess法检测NO水平、ELISA法检测IL-1β和TNF-α的分泌量。结果表明,PPPS在不同时间点均上调细胞表面受体TLR4和NF-κB的m RNA水平,证明TLR4是PPPS激活HD11细胞的重要受体,NF-κB是PPPS促进HD11细胞活化的关键核因子。TLR4、MAPK、NF-κB抑制剂均能显着降低HD11细胞NO、IL-1β和TNF-α的分泌量,说明TLR4、MAPK、NF-κB均参与PPPS对HD11细胞的免疫增强作用。结果表明PPPS通过TLR4/MAPK/NF-κB信号通路激活HD11细胞产生免疫应答。综上所述,PPPS显着促进肠道黏膜免疫功能及小肠绒毛发育,有效减轻由NDV和H9N2引发的肠道及肺脏组织病理损伤,改善肠道菌群丰度且通过TLR4/MAPK/NF-κB信号通路激活HD11细胞。本课题不仅探究PPPS对鸡黏膜免疫及肠道菌群的影响,而且揭示了对巨噬细胞的免疫调节作用。因此,PPPS作为天然免疫增强剂具有良好的开发潜力和应用前景。
汪姣[2]（2021）在《胎盘间充质干细胞对糖尿病肾脏疾病免疫炎症损伤的修复作用及机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景与目的:糖尿病肾脏疾病（DKD）是由糖尿病引起的以肾小球硬化和蛋白尿为主要特征的代谢性疾病,是糖尿病最严重的微血管并发症之一,目前已成为导致终末期肾病的主要原因之一。现有治疗方法包括严格控制血糖和血压、限制蛋白质摄入、减少尿蛋白排泄、使用RAS系统阻断剂和SGLT-2抑制剂等,疗效仍有限,很难阻止DKD的发生与进展。鉴于免疫炎症反应是DKD持续发展的驱动因素,本研究立足于免疫炎症视角探寻DKD的防治新策略,具有较为重要的研究意义。近年来,以干细胞治疗为基础的再生医学在防治DKD中具有良好的应用前景,尤其是间充质干细胞（MSCs）因其免疫原性低、强大的免疫调节性能、来源丰富以及不受伦理束缚等优点而备受青睐。已有研究证据显示,MSCs可通过减轻氧化应激、旁分泌营养因子、调节系统或肾脏局部免疫微环境等促进DKD损伤的修复。然而,大多数研究集中在MSCs与固有免疫细胞的交互作用上,其能否通过调节适应性免疫细胞如Th17/Treg细胞平衡对DKD发挥治疗作用,目前尚缺少相关文献报道。基于以上研究背景,本项目拟研究P-MSCs对DKD免疫炎症损伤的修复作用及可能的分子机制。研究方法:本研究首先从GEO数据库筛选出DKD患者肾组织表达芯片数据集,并应用CIBERSORT及单样本基因集富集得分（ss GSEA）算法进行免疫浸润分析。应用主成分分析（PCA）确定免疫浸润特征对DKD患者与正常对照组的聚类能力,并采用R“psych”软件包分析各类免疫细胞在DKD微环境中的相互关系。随后,选取本院DKD及对照肾脏蜡块标本进行病理染色及多标记全景分析DKD微环境差异表达的免疫细胞浸润模式及程序性死亡受体-1（PD1）表达水平。接着,分离并鉴定P-MSCs,构建链脲佐菌素（STZ）诱导的1型糖尿病（T1DM）肾损伤模型并随机分为2组:DKD模型组、P-MSCs治疗组,以正常大鼠作为对照组。STZ注射后8周,尾静脉注射P-MSCs细胞悬液（1×106/细胞,每周1次,共3次）或等量的生理盐水。P-MSCs首次输注后8周,收集每只大鼠尿液、血清及肾脏等组织样本进行后续分析。应用全自动生化分析仪检测血清肌酐、尿素氮、血糖水平,ELISA法检测血清胱抑素C水平和尿液微量白蛋白水平,苦味酸法检测尿液肌酐水平。应用透射电镜、HE染色及PAS染色评估各组肾脏组织病理改变。应用免疫荧光法进行P-MSCs示踪检测,流式细胞术检测外周血Th17/Treg细胞比例,液相芯片技术检测血清及肾脏组织细胞因子（IL-17A、IL-6、IL-10）水平。另外,利用DKD模型组与P-MSCs治疗组肾脏组织m RNA转录组测序分析显着富集的通路。最后,分离大鼠脾脏淋巴细胞并构建与P-MSCs共培养体系,分为4组:空白对照组、IL-2（10 ng/m L）+PHA（10ug/m L）刺激淋巴细胞组、淋巴细胞与P-MSCs直接接触（按4:1比例加入）组、淋巴细胞与P-MSCs间接接触（上室为淋巴细胞,下室为P-MSCs）组。应用流式细胞术检测Th17/Treg细胞比例和PD1在淋巴细胞中的表达水平,从而分析P-MSCs调节Th17/Treg细胞平衡的可能途径。而且,应用PD-L1 si RNA序列下调P-MSCs上PD-L1表达,通过q RT-PCR验证干扰效率,并应用流式细胞术检测Th17/Treg细胞比例,从而验证P-MSCs是否通过PD1/PD-L1通路调控Th17/Treg细胞平衡。研究结果:本研究从GEO数据库中筛选出25例对照与19例DKD样本进行免疫浸润分析,研究结果显示在DKD组织中细胞毒性T细胞、Th2、Tfh、黏膜相关T细胞、单核细胞、巨噬细胞浸润水平显着升高;Treg细胞、NK细胞、中性粒细胞浸润水平显着降低;Th1和Th17细胞在DKD组织中浸润水平呈升高趋势。此外,PCA与相关性分析结果提示免疫细胞浸润特征能将DKD与对照样本很好地区分开,且各类免疫细胞在DKD肾脏微环境中呈网络式调控关系。在本院收集的6例DKD与6例对照样本验证结果显示,巨噬细胞和Treg细胞浸润水平与预测结果一致,但几乎未观察到Th2细胞的浸润;而且PD-1在DKD肾脏微环境中表达显着升高。分离的P-MSCs在细胞形态上呈纺锤状成纤维样,其细胞表面高表达CD73、CD90、CD105、低表达CD19、CD31、CD34、CD45、CD11b、HLA-DR,而且P-MSCs细胞能向脂肪、软骨、骨组织分化,因而符合MSCs的鉴定标准。P-MSCs体内示踪结果表明,其主要归巢于胸腺及脾脏等免疫器官,而在胰腺及肾脏局部组织中定植数量很少。P-MSCs治疗能有效改善DKD模型大鼠血糖、肌酐、尿素氮、尿白蛋白/肌酐比值、肾脏肥大指数以及肾脏病理损伤;P-MSCs治疗明显降低Th17细胞比例和升高Treg细胞比例,同时降低促炎因子IL-17A、IL-6水平以及升高抗炎因子IL-10水平。而且,肾脏转录组学分析结果显示,适应性免疫通路、细胞因子通路（IL-17信号通路与TNF-α信号通路）在P-MSCs治疗组显着富集,从而佐证了MSCs通过调节免疫炎症保护DKD的作用机制。P-MSCs与T淋巴细胞共培养结果显示,PHA刺激组Th17细胞比例显着升高、Treg细胞比例显着降低;与PHA刺激组相比,P-MSCs直接接触组Th17细胞比例显着降低、Treg细胞比例显着升高,同时诱导T淋巴细胞PD1表达的上调;而P-MSCs间接接触组Th17及Treg细胞比例未见显着变化;以上结果提示P-MSCs以直接接触方式能显着改善Th17/Treg细胞平衡。而且,与si RNA对照组相比,si RNA PD-L1转染P-MSCs组Th17细胞比例显着升高、Treg细胞比例显着降低,从而提示P-MSCs可能部分通过PD1/PD-L1通路调控Th17/Treg细胞平衡。研究结论:本研究结果表明,P-MSCs通过调节免疫炎症促进DKD损伤的修复,而且PD-1/PD-L1通路可能是介导P-MSCs调控Th17/Treg平衡的分子机制,从而为MSCs应用于DKD防治提供新的实验数据。
冯科[3]（2021）在《D-Nap-GFFY水凝胶增强LXR配体抗肿瘤作用的研究》文中研究表明背景和目标:肺癌是在全球范围内发病率和死亡率最高的癌症,肺腺癌是肺癌最常见的类型。尽管近年在研究和治疗中取得了巨大进步,但是治疗效果仍有待提高。研究表明,肝X受体（liver X receptor,LXR）被其配体T0901317（T317）激活后,能促进干扰素γ（interferonγ,IFNγ）表达,发挥抗肿瘤作用。然而,LXR同时激活脂质合成基因表达,导致肝脏脂质过度合成和积累,造成脂肪肝及高甘油三酯血症,这些严重副作用限制了LXR激动剂的临床应用。D-Nap-GFFY水凝胶是萘乙酸修饰的D构型氨基酸组成的多肽,能被树突细胞、巨噬细胞等抗原呈递细胞（antigen presenting cell,APC）特异性吞噬,增强免疫反应,具有作为药物载体的优势和潜力。在此项研究中,我们采用D-Nap-GFFY包裹法构建T317的载药系统（D-Nap-GFFY-T317）,通过小鼠皮下注射方式给药,探究D-Nap-GFFY-T317抑制肺腺癌的作用和机制,以及该载药系统能否避免肝脏脂质积累等副作用。方法:用PBS配制D-Nap-GFFY形成水凝胶后,探究D-Nap-GFFY的物理性质,评估D-Nap-GFFY-T317在体内和体外条件下降解和T317释放水平;选用C57BL/6J背景的野生型和IFNγ敲除小鼠,分别以皮下注射小鼠肺腺癌肿瘤细胞LLC1的方式构建移植瘤模型,或者腹腔注射乌拉坦的诱导方式构建原位肺癌模型;分别给予各模型小鼠口服给药T317、皮下注射D-Nap-GFFY-T317的治疗,探究皮下注射D-Nap-GFFY-T317的治疗方式对肿瘤生长以及肝脏脂质合成的影响。结果:D-Nap-GFFY-T317能形成稳定胶体,T317均匀地分散在胶体中。T317的释放依赖于细胞内蛋白酶对D-Nap-GFFY的降解。皮下注射D-Nap-GFFY-T317后,小鼠血液中T317维持较低水平。在肺癌模型小鼠中,与口服T317相比,皮下注射D-Nap-GFFY-T317具有更好的抗癌效果。机制上,D-Nap-GFFY-T317能够激活APC、表达IFNγ,并且以IFNγ依赖的方式增加肿瘤中M1型巨噬细胞数量,减少M2型巨噬细胞数量。此外,D-Nap-GFFY-T317促进树突细胞的成熟和浸润;增加肿瘤中CD3+CD8+T细胞的数量;以依赖IFNγ的方式抑制肿瘤中血管的生成。与口服T317相比,皮下注射D-Nap-GFFY-T317抑制肝脏中脂质合成基因的过度表达,从而消除了T317引起的脂肪肝、高甘油三酯血症等副作用。机制上确认D-Nap-GFFY-T317可被巨噬细胞通过SR-A受体特异性吞噬,从而避免激活肝细胞内LXR。结论:皮下注射D-Nap-GFFY-T317能够特异性地被DC和巨噬细胞吞噬,激活IFNγ表达,抑制肺腺癌发生发展,同时对肝脏没有副作用。这表明水凝胶D-Nap-GFFY包裹T317的新型载药系统有望成为治疗肿瘤的新策略。
韩杰[4]（2021）在《免疫检查点LAG-3在胶质母细胞瘤中的表达及意义》文中研究表明目的:研究LAG-3在胶质母细胞瘤中的表达情况、潜在功能、预后及临床意义。方法:首先,通过检索GEPIA数据库、Oncomine数据库和UALCAN数据库分析LAG-3在GBM与正常脑组织、以及人种、性别、年龄的表达信息及表达差异,并进一步进行生存分析;通过免疫组化法进LAG-3在GBM中的表达验证;在Oncomine数据库检索出与LAG-3共表达的15个基因,使用Omicshare在线软件对基因集进行GO功能与KEGG通路富集分析,并通过Gene MANIA数据库预测这组基因集潜在的主要作用关系及功能。最后通过TIMER数据库分析LAG-3在GBM中表达与免疫浸润之间的关系。结果:EPIA数据库和Oncomine数据库显示在GBM中LAG-3的表达显着高于正常脑组织（p<0.05）,LAG-3在GBM中高表达组与低表达组对GBM总生存率无明显影响（P>0.05）。除黄种人外,白种人,黑种人GBM组织中LAG-3的表达水平显着高于正常组织,虽然亚裔人种中LAG-3差异性表达不明显,但结果的差异性可能与数据库亚裔人种样本量少有关。同时GBM中LAG-3在不同性别中的表达差异无统计学意义。在21-80岁这3组中LAG-3的表达水平显着高于正常脑组织,在80岁以上的组别中无统计学差异;GEPIA数据库分析预后提示LAG-3基因表达与GBM的预后无关。免疫组化法验证了其在GBM中的高表达,有统计学意义。通过GO与KEGG通路富集分析以及Gene MANIA预测其功能与细胞及机体对外源性刺激的反应,外源性代谢过程等有关。通过TIMER数据库分析表明,LAG-3基因的表达与免疫细胞的浸润整体呈弱相关,LAG-3在肿瘤组织中的表达水平越高,免疫细胞浸润程度对应越低。结论:1.LAG-3在胶质母细胞瘤组织中呈高表达,LAG-3基因表达水平与GBM预后无统计学相关性,目前LAG-3不可作为判断GBM患者预后的独立因子。2.GBM中LAG-3的表达与免疫细胞的浸润有相关性,介导了免疫系统的负性调控,深入研究LAG-3分子在肿瘤中的功能、通路及作用机制,对开展以其为靶点的新型治疗方法具有十分深远的意义。
李金泽[5]（2021）在《机械牵张预处理骨髓间充质干细胞对ARDS肺微血管内皮细胞修复的影响》文中提出第一部分机械牵张预处理对骨髓间充质干细胞影响的研究目的:研究机械牵张（MS）对骨髓间充质干细胞（MSCs）形态和功能的影响。方法:将MSCs种植在胶原I包被的牵张板上,放置于细胞培养箱中培养,再采用应力加载系统对MSCs予以机械牵张干预,机械牵张幅度分别为10%和20%,机械牵张时间分别为24h和48h。实验分组:（1）未机械牵张组（Un-MS）,（2）10%机械牵张24h组（MS-10%-24h）,（3）10%机械牵张48h组（MS-10%-48h）,（4）20%机械牵张24h组（MS-20%-24h）,（5）20%机械牵张48h组（MS-20%-48h）。处理后留取细胞和上清液,检测方法与指标:（1）Wright-Giemsa染色观察MSCs形态;（2）流式细胞术检测MSCs细胞表面相关分子（CD90、CD29和CD45）表达;（3）ELISA检测MSCs细胞上清液中炎症因子（TNF-a,IL-6和IL-10）水平;（4）CCK-8法检测MSCs的增殖水平。结果:（1）Wright-Giemsa染色表明:与未机械牵张组相比,机械牵张组MSCs细胞形态扁平、纤细,细胞质物质减少,细胞膜皱褶和细胞浆萎缩。（2）流式细胞术检测表明:牵张组和未牵张组MSCs细胞表面均表达CD90和CD29,阳性率≥99%,无统计学差异（P>0.05）;同时CD44阳性率均≤5%,各组间无统计学差异（P>0.05）。（3）ELISA检测表明:与未机械牵张组相比,机械牵张组MSCs细胞上清液中TNF-a和IL-6水平明显升高（P<0.05）;但IL-10水平无明显差异（P>0.05）。（4）CCK-8法检测表明:与未牵张组相比,牵张组MSCs的细胞增殖显着增加（P<0.05）。结论:机械牵张明显改变MSCs细胞形态、增殖水平及细胞炎症因子的释放。第二部分机械牵张预处理骨髓间充质干细胞对ARDS肺微血管内皮细胞屏障的修复作用目的:研究MS预处理的MSCs对ARDS肺微血管内皮细胞屏障的修复作用。方法:采用应力加载系统对MSCs予以机械牵张干预,实验分组:（1）未机械牵张组（Untreated）,（2）10%机械牵张24h组（MS-10%-24h）,（3）10%机械牵张48h组（MS-10%-48h）,（4）20%机械牵张24h组（MS-20%-24h）,（5）20%机械牵张48h组（MS-20%-48h）。将人肺微血管内皮细胞（ECs）种植到Transwell小室上层,机械牵张预处理的MSCs种植到Transwell小室下层,与ECs共培养,脂多糖（LPS）加入小室上层,刺激6h。检测方法与指标:（1）FITC-葡聚糖法检测ECs细胞屏障通透性;（2）流式细胞术检测ECs凋亡水平;（3）Western blot法检测ECs细胞间黏附蛋白（VE-cadherin）和细胞间隙连接蛋白（Connexin43）的表达;（4）免疫荧光共聚焦法检测ECs细胞间黏附蛋白（VE-cadherin）的表达。结果:（1）LPS对ECs细胞屏障通透性的影响:与ECs组相比,LPS明显增加ECs细胞屏障通透性（P<0.05）,且LPS浓度越高,ECs细胞屏障通透性升高越明显（P<0.05）;（2）MSCs细胞浓度对ECs细胞屏障通透性的影响:与MSCs组相比,MSCs能明显改善LPS损伤的ECs细胞屏障通透性（P<0.05）;MSCs细胞浓度越高,对ECs细胞屏障通透性的改善作用越明显（P<0.05）;（3）机械牵张预处理MSCs对ECs细胞屏障通透性的影响:与LPS干预组相比,MS-20%-24h组MSCs对ECs细胞屏障通透性具有显着改善作用（P<0.05）;（4）机械牵张预处理MSCs对ECs凋亡的影响:与LPS干预组相比,MS-20%-24h组MSCs对ECs的凋亡具有显着改善作用（P<0.05）;（5）机械牵张预处理MSCs对ECs细胞间连接蛋白的影响:与LPS干预组相比,MS-20%-24h组MSCs能显着增加VE-Cadherin和Connexin43蛋白的表达（P<0.05）。结论:机械牵张预处理的MSCs改善ARDS肺微血管内皮细胞屏障通透性,减少肺微血管内皮细胞凋亡,增加ECs细胞间连接蛋白的表达。
贾梦莹[6]（2021）在《NLRP3/Caspase-1焦亡经典途径在异常咬合导致颞下颌关节软骨退变中的作用》文中提出目的:颞下颌关节骨关节炎（Temporomandibular Joint Osteoarthritis,TMJOA）是影响口颌功能的颌面部高发病,髁突软骨缺损难以自愈,其退变分子机制不明。力学刺激直接作用软骨,炎症反应广泛参与髁突软骨破坏。细胞焦亡以释放炎性因子白细胞介素1β（Interleukin-1β）,IL-18为主要特征,参与慢性炎症,而细胞焦亡在TMJOA软骨细胞中的研究甚少。为此本研究旨在探索异常力学刺激下NLRP3/Caspase-1焦亡经典途径在软骨细胞的表达情况,为TMJOA的靶向治疗提供线索。方法:第一部分:（1）临床研究,收集就诊于新疆医科大学第一附属医院颞下颌关节紊乱病患者颞下颌关节滑液,根据CBCT或MRI检查分为伴髁突骨质破坏的TMJOA患者组与不伴髁突骨质破坏的颞下颌关节结构紊乱病（Temporomandibular Joint internal derangement,TMJID）组,分析临床基线资料。（2）酶联免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）分析焦亡相关炎性介质IL-1β,IL-18,Caspase-1,NLRP3在两组的表达差异。第二部分:（1）组织水平,通过SD大鼠单侧前牙反牙合（Unilateral anterior crossbite,UAC）干预4周,8周,12周,建立TMJOA模型,通过体式显微镜观察软骨形态结构,Micro-CT扫描软骨下骨,Mimics 20.0系统分析骨体积分数BV/TV,骨表面积与骨体积比BS/TV,骨小梁厚度Tb.Th及骨小梁个数Tb.N,评价软骨下骨改建情况,组织病理学检查及评分系统评价软骨病损特征。（2）使用免疫组织化学技术检测焦亡经典途径关键分子IL-1β,IL-18,NLRP3,ASC,Caspase-1,GSDMD在正常组与UAC诱导组颞下颌关节组织的表达及分布,实时聚合酶链式反应（Real time polymerase chain reaction,RT-PCR）以及蛋白印迹法（Western blot,WB）检测焦亡关键基因及蛋白在UAC诱导组与对照组的表达情况。第三部分:（1）分子水平,分离培养SD大鼠软骨细胞,分别采用0 dyn/cm2,4 dyn/cm2,12dyn/cm2,16 dyn/cm2的流体剪切力（Fluid Flow Shear Stress,FFSS）干预软骨细胞1h;采用12 dyn/cm2的FFSS干预软骨细胞1h,2h,4h,通过ELISA技术比较软骨细胞培养基上清液中IL-18,IL-1β的表达差异。（2）通过AO-EB染色比较细胞破膜死亡在各组的表达情况。（3）通过WB技术比较焦亡关键蛋白IL-1β,IL-18,NLRP3,ASC,Caspase-1,GSDMD在各组的表达差异。结果:第一部分:（1）伴髁突骨质破坏的TMJOA患者与不伴有髁突骨质破坏的TMJID患者好于发中青年女性,均有颞下颌关节疼痛及功能紊乱症状,TMJOA组功能紊乱人数占比较大。（2）颞下颌关节滑液焦亡相关炎性介质IL-1β,IL-18,Caspase-1,NLRP3的表达比较分析,证明了伴髁突骨质破坏的TMJOA患者IL-1β,IL-18,Caspase-1,NLRP3的浓度较高（P<0.05）。第二部分:（1）UAC可诱导TMJOA样表现,体式显微镜可见软骨形变,随UAC作用时间延长,较同时间正常对照组病损加重,Micro-CT显示BV/TV较同时间正常对照组降低,软骨下骨丧失明显,UAC诱导4周出现BS/BV增高（P<0.05）,短期骨改建,UAC诱导8周及12周,差异无统计学意义（P<0.05）,Tb.Th在UAC诱导12周减小,Tb.N在UAC诱导4周,8周减小（P<0.05）。UAC诱导组较同时间正常对照组组织病理学评分增加。（2）免疫组化显示UAC组焦亡关键蛋白IL-1β,IL-18,NLRP3,ASC,Caspase-1,GSDMD高表达于软骨层,RT-PCR及WB亦检测到UAC诱导组较同时间正常对照组表达高水平的焦亡相关基因及蛋白（P<0.05）。第三部分:（1）ELISA结果表明软骨均接受1h FFSS干预时,4 dyn/cm2,12 dyn/cm2,16 dyn/cm2FFSS干预组较0 dyn/cm2FFSS对照组比较,培养基上清炎性因子IL-1β,IL-18的表达水平增高（P<0.05）。在12dyn/cm2FFSS作用下,随FFSS干预时间延长,软骨细胞焦亡关键分子表达增高（P<0.05）。（2）AO-EB染色表明随FFSS载荷的增加以及作用时间的延长,破膜死亡细胞数增多。（3）WB显示软骨细胞焦亡关键蛋白IL-1β,IL-18,NLRP3,ASC,Caspase-1,GSDMD的表达也随FFSS载荷增加以及作用时间的延长而上调（P<0.05）。结论:（1）TMJOA患者滑液中可表达高浓度的焦亡相关炎性介质。（2）单侧前牙反牙合可诱导TMJOA病损,焦亡关键蛋白可表达于髁突软骨层,随OA病损程度加重,焦亡关键分子基因及蛋白的表达量增加。（3）软骨细胞存在细胞焦亡,随FFSS作用软骨细胞强度及时间的增加,软骨细胞焦亡现象加重。
汪岩[7]（2020）在《大气颗粒物诱导多重细胞器功能紊乱导致血管内皮损伤的机制研究》文中指出研究目的:本研究旨在从亚细胞结构层面探讨城市大气颗粒物对血管内皮造成的损伤及毒作用机制。以多重经典细胞器（内质网、线粒体和溶酶体）为切入点,结合细胞程序性死亡方式（细胞凋亡与细胞自噬）讨论大气颗粒物诱导血管内皮细胞毒性的潜在机制,以及体内血管组织损伤的相关作用模式。研究方法:（1）以美国国家标准技术研究所（National Institute of Standards and Technology,NIST）出品的城市大气颗粒物标准物质（编号1648a,PM SRM1648a）为研究对象,初步对颗粒物的成分、水合粒径和表面电位进行分析,并进行颗粒物内毒素含量的检测。选用人脐静脉血管内皮细胞系EA.hy926和HUVECs为体外实验模型,运用共聚焦显微镜观察法以及流式细胞仪侧向光检测值衡量血管内皮细胞对城市大气颗粒物PM SRM1648a的摄取情况。在细胞毒性层面,运用MTT和CCK8法检测细胞存活率并作为体外实验剂量筛选的依据;结合GSH/GSSG、MDA、NADP+/NADPH 和 C11-BODIPY581/591 等指标评估血管内皮细胞在大气颗粒物PM SRM1648a刺激下的氧化应激状态。在亚细胞结构层面,运用免疫荧光法检测γ-H2AX荧光灶点数以衡量DNA损伤;利用透射电子显微镜（透射电镜,Transmission Electron Microscope,TEM）观察血管内皮细胞对颗粒物的摄取以及细胞内超微结构的变化;（2）以内质网（Endoplasmic reticulum,ER）为核心,讨论大气颗粒物PM SRM1648a 触发血管内皮细胞内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ER stress）在自噬小体累积和细胞凋亡中的作用:TEM观察结果提示内质网结构出现撕裂扩张样改变,进一步运用ER-Tracker Blue-White DPX探针标记内质网,观察内质网荧光着色变化;运用DCFH-DA探针检测活性氧（Reactive oxygen species,ROS）;FITC-Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡率;通过透射电镜法结合免疫荧光法观察自噬小体数量和LC3B的表达情况;运用western blot蛋白免疫印迹实验讨论颗粒物引起的内质网应激相关标志性蛋白GRP78/BIP、CHOP和caspase12,自噬标志性蛋白Beclin 1、LC3Ⅱ/Ⅰ和p62,以及凋亡相关蛋白caspase9、caspase3、BCL-2和BAX的表达变化。进一步运用氧化应激抑制剂谷胱甘肽乙酯（Glutathione monoethy1 ester,GSH-MEE）和内质网应激广谱抑制剂4-苯基丁酸（4-Phenylbutyric acid,4-PBA）探讨 ROS/ER stress 信号轴在颗粒物诱导血管内皮细胞自噬和凋亡中的作用;此外,运用自噬不同阶段调节剂3-Methyladenine（3-MA）、Rapamycin 和 Bafilomycin A1,探讨颗粒物暴露下,细胞自噬和内质网应激的相互关系,以及细胞自噬在细胞凋亡中发挥的作用;（3）以溶酶体损伤为核心,探讨颗粒物引起血管内皮细胞自噬小体累积与细胞毒性的具体原因:聚焦自噬动态过程,运用mRFP-GFP-LC3腺病毒载体检测颗粒物暴露下,EA.hy926和HUVECs血管内皮细胞中自噬流的通畅性;并在饱和浓度Bafilomycin A1的剂量下讨论颗粒物引起血管内皮细胞自噬小体累积的具体原因;LysoSensorTM Green DND-189探针法标记溶酶体并运用荧光半定量法检测溶酶体相对酸碱度pH;免疫荧光双标法（LAMP-2与LC3B）衡量溶酶体与自噬小体的共定位（即自噬溶酶体）;结合酶活性实验和蛋白表达量实验确定酸性磷酸酶（Acid phosphatase,ACP）以及溶酶体水解酶（Cathepsin B,CTSB）的活性和表达改变;（4）以线粒体动力学为核心,讨论颗粒物暴露扰乱血管内皮细胞线粒体分裂-融合平衡,进而引起炎症反应:检测线粒体功能学指标ATP、mtROS、线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）等;运用 MitoTracker（?）Red CMXRos线粒体红色荧光探针观察线粒体形态学改变;qRT-PCR和western blot法分别检测线粒体动力学相关分子的表达情况;ELISA法检测细胞培养上清液中细胞因子的含量,如TNF-α、IL-1β等;Hoechst33258/PI双染法结合细胞上清液乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）的含量检测,初步判断细胞膜的损伤情况;运用流式细胞仪通过FLICA Caspase-1 Reagent FAM-YVAD-FMK/PI双染法检测细胞焦亡率和caspase1活性;运用caspase1特异性抑制剂Z-YVAD-FMK评估caspase1在颗粒物诱导血管内皮细胞炎症级联反应中的作用;以及运用si RNA慢病毒转染敲降技术敲低EA.hy926细胞中线粒体分裂调控基因DNM1L（DRP1）,在蛋白水平验证DRP1的表达量,重复上述相关实验指标评判线粒体分裂、caspase1酶活性、细胞炎症反应等,反向讨论颗粒物暴露经DRP1/caspase1/IL-1β信号通路扰乱血管内皮细胞线粒体分裂-融合平衡,进而触发炎症反应;（5）运用BALB/c小鼠模型,结合WHO建议的发展中国家第一阶段PM2.5过渡值（年均PM2.5浓度35μg/m3）、现实人群暴露情况、小鼠生理解剖结构以及外推系数等,设置低中高暴露剂量组,分别为1.28、5.5和11 mg/kg·bw/w。经过急性（7天）和亚急性（28天）暴露后,取肺泡灌洗液、血液标本以及肺、主动脉和心脏组织进行后续实验;Hematoxylin and eosin stain（H&E）、von kossa和Masson染色观察各组织样本的病理改变、钙离子沉积以及胶原蛋白沉积等;运用ELISA法检测肺泡灌洗液和血液样本中炎性因子以及氧化应激相关指标;BCA法检测肺泡灌洗液中总蛋白含量;流式抗体染色结合流式细胞仪侧向散射光数值检测肺泡灌洗液中总细胞数、单核细胞数、淋巴细胞数以及中性粒细胞数,进一步运用F4-80/CD11b/CD86/CD206流式抗体检测M1和M2型巨噬细胞比例;qRT-PCR法检测主动脉组织中炎性因子和氧化应激相关标志物基因层面的表达量;qRT-PCR法检测主动脉组织中亚细胞结构功能相关指标的表达改变,如内质网应激相关分子hspa5和ddit3,线粒体动力学相关分子dnm1l、fis1、mff、mfn1、mfn2和oopa1,以及溶酶体膜蛋白相关分子lamp1和lamp2;免疫组化、免疫荧光和western blot法检测主动脉组织中亚细胞结构功能相关指标蛋白水平的表达情况,如BIP、CHOP、DRP1、LAMP1和LAMP2;TUNEL法检测主动脉组织细胞凋亡率。综上方法,试图从体内水平初步揭示大气颗粒物引起细胞器功能紊乱参与血管组织损伤。研究结果:（1）体外细胞实验结果显示,大气颗粒物PM SRM1648a暴露下,血管内皮细胞比肺泡上皮细胞更为敏感。暴露于颗粒物24小时后,PM SRM1648a在相对低剂量下（10和20 μg/cm2;相当于32和64 μg/mL）,分别引起EA.hy926（P<0.05）和HUVECs（P<0.05）血管内皮细胞毒性,而未引起肺泡上皮细胞生存率降低。血管内皮细胞具有颗粒物摄取能力,并且颗粒物摄取先于细胞毒性的出现。同为人血管静脉内皮细胞株,PM SRM1648a对EA.hy926比HUVECs的细胞毒性更为显着,可能是因为EA.hy926细胞比HUVECs具有更强的颗粒物摄取能力。除了细胞毒性层面,PM SRM1648a可诱导DNA损伤,以及多重细胞器结构改变等;（2）PM SRM1648a引起血管内皮细胞胞内ROS过量释放和氧化应激,进一步损伤亚细胞结构功能,如内质网应激和结构损伤,从而影响血管内皮细胞自噬小体累积与凋亡。正常的自噬诱导可以保护PM SRM1648a引起的血管内皮细胞凋亡,抑制自噬或者破坏自噬降解过程会加剧颗粒物引起的内皮细胞损伤。内质网应激和自噬之间的相互对话表明内质网应激与LC3Ⅱ表达上调有关,而自噬过程对PM SRM1648a引起的内质网损伤并无显着影响。一定程度上探讨了内质网应激下,自噬诱导是颗粒物导致血管内皮细胞损伤的保护性因素;ROS/内质网应激通路和自噬降解功能障碍促进PM SRM1648a引起的血管内皮细胞凋亡;（3）20 μg/cm2（64 μg/mL）PM SRM1648a 导致 EA.hy926 血管内皮细胞内自噬小体累积、LC3Ⅱ高表达。在不同时间点LC3Ⅱ上调的具体原因不尽相同。短时间6小时内,自噬活性有所提高导致LC3Ⅱ的快速转化,参与自噬小体膜的合成;而随着暴露时间延长至24小时,LC3Ⅱ的增高归结于溶酶体降解清除能力受阻引起的缺陷型自噬。类似地,20μg/cm2（64μg/mL）剂量下,颗粒物暴露24小时后造成HUVECs内自噬小体累积,其原因归结于溶酶体损伤引起的缺陷型自噬。同时,20 μg/cm2 PM SRM1648a在暴露于EA.hy926细胞24小时后,ACP和CTSB溶酶体水解酶活性出现显着性降低（P<0.05,P<0.05）;在HUVECs中,ACP和CTSB活性检测同样显示类似的结果,于20μg/cm2剂量下暴露24小时后开始显着性降低。颗粒物引起的溶酶体损伤以及水解酶活性降低是引起自噬流阻断和降解清除能力削弱的关键因素。而氧化应激的恢复并不能缓解自噬流障碍和自噬溶酶体的减少,但可以缓解LC3Ⅱ的表达以及溶酶体膜蛋白LAMP-2的表达。PM SRM1648a经非氧化应激依赖型途径引起溶酶体水解酶失活,进而导致血管内皮细胞自噬流紊乱及后续降解异常,促进血管内皮细胞损伤甚至死亡;（4）线粒体是PM SRM1648a攻击人类血管内皮细胞的亚细胞结构靶标。大气颗粒物的摄入会破坏线粒体功能,包括mtROS增高、MMP减少和ATP消耗。同时,PGC-1α的降低表明PM SRM1648a损害线粒体生物发生。此外,20μg/cm2（64μg/mL）剂量暴露24小时后,PM SRM1648a导致线粒体形态呈现分裂样改变,分裂相关分子DRP1等异常上调;PM SRM1648a激活caspase1酶活性和炎症级联反应,caspase1抑制剂Z-YVAD-FMK可以显着降低颗粒物引起的caspase1激活及IL-1β炎性因子的释放;汇集DRP1介导的线粒体分裂通路以及caspase1介导的炎性通路发现,在PM SRM1648a的刺激下,si DNM1L（DRP1）慢病毒转染的EA.hy926细胞相对于空载病毒转染组细胞,线粒体形态有所恢复,caspase1酶活性（P<0.05）以及IL-1β含量（P<0.05）出现显着性降低,提示DRP1/caspase1/IL-1β信号轴参与颗粒物引起的血管内皮细胞线粒体分裂和炎性损伤。同等剂量20 μg/cm2暴露24小时后,EA.hy926细胞中凋亡率为23.43 ±1.76%（P<0.001）,焦亡率为 0.38±0.08%（P>0.05）;HUVECs 中凋亡率为17.30±1.61%（P<0.01）,焦亡率为0.41±0.07%（P>0.05）,同时结合细胞形态学、超微电镜结构以及流式细胞仪衡量细胞大小的前向散射光Forward Scatter,FSC值分析,细胞焦亡不是PM SRM1648a引起血管内皮细胞程序性死亡的主要作用模式;（5）急性（7天）和亚急性（28天）口咽吸入法暴露于不同浓度的PM SRM1648a（1.28、5.5 和 11 mg/kg·bw/w）,正常饲养环境的 BALB/c 雄性和雌性小鼠中出现局部和全身的氧化应激以及炎性反应,未见明显的主动脉脂质累积或斑块样沉积。亚急性组出现主动脉壁增宽以及主动脉根部胶原蛋白出现增多趋势。虽然未见显着性病理学损伤,亚急性暴露后,亚细胞结构层面分子表达出现改变,以内质网和线粒体相关分子改变为主,并且主动脉组织细胞凋亡率增高,以上结果均发生于雄性和雌性BALB/c小鼠中,无性别特异性。结论:亚细胞结构,如内质网、线粒体和溶酶体是PM SRM1648a损伤血管内皮细胞的重要靶点。颗粒物的暴露可以通过损害亚细胞结构功能进而导致血管内皮细胞炎症反应和细胞死亡。在探讨了内质网、溶酶体和线粒体结构功能紊乱后,亚细胞层面靶向毒性评估有助于更全面地了解大气颗粒物引起的血管内皮毒性。在进行环境颗粒物人群健康效应研究时,应综合考虑细胞毒性和亚细胞毒性,关注于早期的检查点,为全面掌握安全性评价信息及更好地实施危险度管理提供合理的基础资料。
李楠[8]（2020）在《趋化因子CXCL5在H1N1感染中的作用及其对iBALT结构的影响》文中指出目的:流感病毒是引起人类呼吸道疾病的主要原因,世界卫生组织也将流感病毒感染确定为全球重大公共卫生问题之一。近年来,随着天然免疫细胞“记忆”功能的发现,天然免疫和获得性免疫在病原体感染炎症中的作用机制成为宿主抗感染领域的热点。作为承接天然免疫和获得性免疫的关键衔接点,趋化因子在炎症部位淋巴细胞的转运和招募中有着重要的作用,尤其是CXCL5在中性粒细胞募集到炎症部位的过程中起关键作用,因此筛选流感感染介导的急性肺损伤相关的关键蛋白分子或细胞调控因子,揭示甲型流感病毒感染导致肺损伤的具体分子机制,将为流感治疗提供潜在创新药物靶点,这不仅具有临床治疗意义,也将为今后小蛋白分子在抗感染中的研究提供重要指示。方法:在本课题中,我们以野生型WT小鼠和趋化因子CXCL5敲除小鼠作为研究对象,麻醉后以滴鼻的方式感染H1N1流感毒株,通过临床症状的观察、免疫组化实验以及ELISA实验来探索趋化因子CXCL5在H1N1感染中的作用;继而使用质谱流式技术筛选到趋化因子CXCL5敲除小鼠肺组织中突出的免疫细胞亚群;通过免疫荧光实验和病理切片分析H1N1感染后的WT和CXCL5敲除小鼠肺组织滞留B细胞的积聚特征;最后我们通过二代测序技术对CXCL5敲除小鼠肺组织中形成iBALT结构的因素进行分析,鉴定CXCL5缺陷小鼠体内对iBALT结构形成和维持有促进作用的差异基因,为进一步了解iBALT结构的形成和维持奠定基础。结果:流感病毒H1N1感染后,CXCL5敲除小鼠肺组织中性粒细胞募集显着下降,作为免疫细胞的“先头兵”,中性粒细胞是解决原发性甲型流感病毒感染的关键。本课题趋化因子CXCL5的敲除虽然减少了中性粒细胞的募集,但是缺陷小鼠肺组织病毒颗粒的清除能力不降反增,我们猜测它可能是通过调控IL-6的表达来抵抗流感病毒的感染;同时我们发现CXCL5敲除小鼠肺组织中肺滞留B细胞显着增多,且主要聚集在支气管上皮的基部或肺血管周围,形成有明显T细胞和B细胞分区的三级淋巴结构-iBALT。在验证中发现趋化因子CXCL5的缺失,导致肺组织中很多调控因子如B细胞趋化因子CXCL13的表达量大幅升高,促进B细胞在肺组织中的积聚,进而创造了一个更易于形成iBALT结构的良好微环境,并且在数量、面积和完整性上不同于WT小鼠组,而CXCL5敲除小鼠肺组织形成的iBALT结构在流感感染后能够快速启动局部肺免疫应答从而抵抗流感的感染。结论:趋化因子CXCL5在H1N1感染起着重要的的作用,而H1N1的感染导致CXCL5敲除小鼠的肺组织中易于形成一种能够快速启动的三级淋巴组织iBALT结构,iBALT结构在机体内抗流感感染过程中发挥重要作用。创新:我们发现趋化因子CXCL5的敲除导致炎性细胞的积聚减少,伴随着趋化因子CXCL13的高表达;CXCL13是B细胞的关键驱动因子,促进B细胞在缺陷小鼠肺组织中大量积聚,形成一种可先于获得性免疫系统抗病毒反应的免疫应答结构-诱导性支气管相关淋巴组织（iBALT）,由此设想趋化因子CXCL5的敲除很可能创造了一种易于形成iBALT结构的微环境,这种结构能够在流感感染过程中快速被启动用以保护机体。但是目前对于肺部感染或慢性炎症诱导形成iBALT结构的机制以及维持iBALT存在的关键因素尚不明朗。
宋世斌[9]（2020）在《藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表达及产物活性鉴定》文中指出干扰素（Interferon,IFN）是机体细胞受到病毒等生物诱导剂刺激而产生的一类分泌型糖蛋白类细胞因子,而白细胞介素18（Interleukin-18,IL-18）是一种具有促炎作用的细胞因子,由机体活化的单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等产生,能诱导IFN-γ等细胞因子的分泌,具有促进T细胞增殖、增强Th1型细胞、NK细胞及CTL细胞的细胞毒效应,与临床自身免疫性疾病及心血管系统疾病等多种疾病的发生发展呈现相关性,IFN和IL-18都具有抗病毒、抗寄生虫和细菌感染、抗肿瘤、免疫调节等多种生物学功能。因此,本实验开展藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18的相关研究,采用分子克隆和基因工程等技术获得了3个基因,体外制备了藏獒犬3个基因的重组蛋白,验证了其生物学活性,并开展了临床相关实验,丰富了犬细胞因子的知识,对犬疾病的检测和防控以及保障人类健康有着重要的意义,在犬疾病的防控上有着广阔的应用前景。第一,从藏獒犬血液中分离淋巴细胞,利用脂多糖（LPS）与植物血凝素（PHA）联合刺激淋巴细胞后提取RNA,经RT-PCR扩增IFN-γ、IFN-α和IL-18基因全长片段,将扩增到的基因分别克隆到pGEM-T-easy载体,经酶切、测序鉴定,结果表明:所克隆的IFN-γ基因与GenBank上登载的犬核苷酸序列同源性达99.6%,开放阅读框为501 bp,编码166个氨基酸（AA）,N端23个AA为信号肽,成熟蛋白编码143个AA,分子量为17.2 kD;克隆的IFN-α基因与GenBank上登载的犬核苷酸序列同源性达96.0%,其开放阅读框为564 bp,N端23个AA为信号肽,成熟蛋白编码164个AA,推测的分子量为19.0 kD;克隆的IL-18基因与GenBank上登载的犬核苷酸序列同源性达100%,其开放阅读框为582 bp,编码193个AA,N端36个AA为信号肽,成熟蛋白编码157个AA,推测的分子量为18.1 kD。第二,根据克隆的藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18基因阅读框序列,设计3个基因去掉信号肽的表达引物,克隆去信号肽后的目的片段,构建原核表达质粒pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18,转化大肠杆菌后诱导表达。经优化诱导条件后,3个重组菌都能够在温度为37℃,浓度为0.5 mM IPTG的诱导条件下成功的表达,3个重组菌在诱导后主要以包涵体形式表达,其中pET-30a-IFN-γ重组蛋白在上清中也有一定量的表达;经SDS-PAGE分析,pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18表达的蛋白分别约为23 kD、25kD和24 kD,表达的蛋白大约占菌体蛋白30%35%。第三,用镍琼脂糖凝胶纯化层析柱纯化pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18重组蛋白,纯度达到90%以上,通过梯度透析复性法复性蛋白。利用抑制病毒噬斑法测定重组藏獒犬IFN-γ和IFN-α的生物学活性,二者都具有抗病毒的活性,而且IFN-α抑制VSV的作用强于IFN-γ,二者的抗病毒活性在一定的浓度范围内有作用,在高于或低于这个浓度范围时发挥的效果一般;利用MTS法检测重组藏獒犬IL-18重组蛋白的生物学活性,纯化的重组IL-18具有诱导淋巴细胞增殖的能力,说明表达的蛋白具有生物学活性。第四,通过对总数为128只犬病毒性传染病病例（包括犬细小病毒病、犬冠状病毒病及犬瘟热3类宠物常见病）的IFN治疗组和对照治疗组的比较分析结果显示:IFN治疗组中3类疾病总计67只,治愈45只,平均治愈率67.2%,对照治疗组中3类疾病总计61只,治愈34只,平均治愈率55.7%,使用本实验获得的IFN-α重组蛋白治疗宠物犬病毒性传染病,能显着提高治愈率,有较好的临床治疗病毒性疾病的效果。本研究克隆了藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18基因,并应用分子生物学软件对序列进行生物信息学分析;首次成功的表达了3个基因,纯化、复性了重组蛋白,发现IFN-γ、IFN-α和IL-18基因具有较高的生物学活性,可以开发利用;通过藏獒犬IFN-α重组蛋白的临床病毒性犬病的治疗,验证了藏獒犬IFN的抗病毒活性。藏獒犬是中国特有的大型犬种,本研究为犬基因工程生物制品的进一步开发和相关疾病的检测及防治奠定了理论基础。
李萍[10]（2020）在《NLRC5对神经元中经典MHCⅠ类分子表达调控及神经元发育的影响》文中研究说明主要组织相容性复合体Ⅰ（MHCⅠ）类分子是一类细胞表面受体,广泛表达于有核细胞表面,在调节适应性细胞免疫反应中起关键作用。近年来研究证明MHCⅠ类分子表达于发育中和成年哺乳动物的大脑皮层、海马和小脑等多个部位,参与突触形成、突触可塑性以及运动、学习记忆等重要事件,发挥完全不同于免疫系统的作用。中枢神经系统（CNS）中经典MHCⅠ类分子的表达模式发育期为时空特异性组成型表达,在突触可塑性及其依赖的运动、学习等过程发挥生理功能,当突触可塑性完成后基本关闭表达;但在脑卒中等疾病状态下则出现诱导型表达,发挥不利于预后的病理作用。经典MHCⅠ类分子在CNS中的主要功能已经被证实,但是其在CNS中的表达调控机制仍不清楚。NLRC5是NLR蛋白家族中最大的成员,体外和体内研究均表明,NLRC5是免疫系统中MHCⅠ类分子表达的关键调节因子且调控具有细胞特异性。而NLRC5在神经元中是否表达、调控MHCⅠ类分子以及在神经元发育中的作用未见报道。本研究检测了NLRC5在海马神经元中的表达和定位;并从体外和体内探究NLRC5对神经元中经典MHCⅠ类分子的表达调控机制;另外,初步探究了NLRC5对神经元发育的影响。获得研究结果如下:1.小鼠出生后至成年（P0至P60）时期海马组织中经典MHCⅠ类分子的m RNA和蛋白的表达趋势不一致。P0至P60时期经典MHCⅠ类分子（H2-K和H2-D）m RNA的表达逐渐升高,而蛋白表达在P0至P15时期逐渐升高,P8至P15时期达到高峰,随后逐渐下降。P0至P15时期经典MHCⅠ类分子m RNA和蛋白的表达趋势一致,提示在此时期主要受转录水平的调控。RT-q PCR和Western blot均检测到NLRC5在海马组织中的表达,并且在P0至P15时期NLRC5的表达趋势与经典MHCⅠ类分子类似。进一步的组织免疫荧光结果显示NLRC5广泛表达于海马组织中,在海马神经元的细胞质和细胞核中都有明显表达,并且与经典MHCⅠ类分子共标。这些结果提示神经元中NLRC5很可能参与调控海马发育过程中经典MHCⅠ类分子的表达。2.体外过表达NLRC5导致经典MHCⅠ类分子的表达水平显着增加,MHCⅠ类分子轻链β2m和抗原递呈相关分子（Tap1、Tap2、Lmp2、Lmp7、Lmp10和Tapasin）的表达也都有不同程度的增加。Nlrc5-/-小鼠出生后海马发育过程中经典MHCⅠ类分子H2-K和H2-D以及轻链分子β2m的表达明显受损,而其他抗原递呈相关分子的表达未受明显影响。这些结果提示NLRC5在神经元中经典MHCⅠ类分子的组成型表达发挥重要作用。3.荧光素酶报告基因实验结果显示NLRC5的表达显着诱导Neuro-2a细胞中H2-D和H2-K基因的转录活性。当H2-D基因启动子区缺失W/S、X或Y元件后,显着减弱NLRC5对其转录活性的调控。另外,X元件上结合的RFX复合物（RFX5、RFXAP和RFXANK）和CREB1的外源性表达均能明显增强NLRC5诱导的H2-D启动子区转录激活;进一步敲低这些转录因子的表达则抑制NLRC5诱导的H2-D转录活性。这些结果表明X元件对NLRC5诱导的神经元中经典MHCⅠ类分子的转录至关重要。此外,免疫沉淀结果显示RFX5和RFXANK均与NLRC5具有相互作用,提示RFX5、RFXANK可能在神经元中招募NLRC5,并与NLRC5形成蛋白复合物进而诱导经典MHCⅠ类基因的转录。4.免疫荧光结果显示NLRC5表达于早期原代培养的海马神经元的胞体、树突和树突生长锥部位。进一步统计野生型和Nlrc5-/-小鼠原代培养3DIV、8DIV和15DIV的海马神经元树突分支,Sholl分析结果显示Nlrc5-/-小鼠在各时期树突分支复杂性明显增加。另外,RT-q PCR结果显示与野生型小鼠相比,Nlrc5-/-小鼠原代海马神经元中经典MHCⅠ类分子H2-K和H2-D的表达明显受损。利用FUGW-H2-D慢病毒挽救Nlrc5-/-小鼠原代海马神经元中H2-D的表达后,可以明显改善树突分支发育异常的表型。这些结果提示NLRC5可能通过经典MHCⅠ类分子调控树突分支发育。以上研究结果显示NLRC5广泛表达于小鼠海马神经元中,调控神经元中经典MHCⅠ类分子的表达。NLRC5通过W/S-X-Y元件诱导MHCⅠ类基因的转录激活,其中X元件上的转录因子RFX复合物和CREB1对NLRC5介导MHCⅠ类基因的转录激活至关重要,RFX复合物中的RFX5和RFXANK负责招募NLRC5到MHCⅠ类基因启动子区。除此之外,我们发现NLRC5表达于神经元的树突和树突生长锥部位,并且通过经典MHCⅠ类分子调控体外海马神经元树突分支发育。本研究解析了海马神经元中经典MHCⅠ类分子上调表达的重要调控因子及调控机制,并且初步探究了免疫分子NLRC5在中枢神经系统中的新功能,为深入了解神经元发育机制及神经—免疫机制提供重要的实验基础。
二、外源NF-IL6高表达增强巨噬细胞的细胞毒效应（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、外源NF-IL6高表达增强巨噬细胞的细胞毒效应（论文提纲范文）
（1）松花粉多糖对鸡肠道黏膜免疫的影响及巨噬细胞的免疫调节作用（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 松花粉及多糖概述 |
| 2 多糖的生物活性 |
| 2.1 多糖的免疫调节活性 |
| 2.2 多糖的抗病毒活性 |
| 2.3 多糖的抗肿瘤活性 |
| 2.4 多糖的其他生物学活性 |
| 3 黏膜免疫 |
| 3.1 肠道黏膜免疫屏障 |
| 3.2 多糖对肠道黏膜免疫的影响 |
| 4 肠道菌群 |
| 4.1 肠道菌群高通量测序 |
| 4.2 多糖对肠道菌群的影响 |
| 5 巨噬细胞 |
| 5.1 多糖对巨噬细胞的免疫调节活性 |
| 5.2 巨噬细胞表面受体 |
| 5.3 多糖对巨噬细胞的免疫调节信号转导途径 |
| 6 研究目的与意义 |
| 第二章 松花粉多糖对黏膜免疫的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 多糖 |
| 1.1.2 实验动物及毒株 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.1.5 多糖溶液配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 实验动物分组及处理 |
| 1.2.2 体重及免疫器官称重 |
| 1.2.3 外周血淋巴细胞转化率测定 |
| 1.2.4 外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞含量检测 |
| 1.2.5 SIg A含量测定 |
| 1.2.6 血清中IgG含量的检测 |
| 1.2.7 qPCR检测肠道黏膜细胞因子 |
| 1.2.8 qPCR检测肠道黏膜免疫相关分子 |
| 1.2.9 PPPS对肠绒毛结构的影响 |
| 1.2.10 PPPS的攻毒保护作用 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 PPPS对体重及免疫器官的影响 |
| 2.2 PPPS对外周血淋巴细胞转化率的影响 |
| 2.3 PPPS对外周血CD4+、CD8+T 淋巴细胞含量变化的影响 |
| 2.4 PPPS对肠道黏膜SIgA和血清IgG的影响 |
| 2.5 PPPS对肠道黏膜细胞因子的影响 |
| 2.6 PPPS对肠道黏膜免疫相关分子mRNA的影响 |
| 2.7 PPPS对肠绒毛结构的影响 |
| 2.7.1 PPPS对十二指肠绒毛长度、宽度、隐窝深度及V/C值的影响 |
| 2.7.2 PPPS对空肠绒毛长度、宽度、隐窝深度及V/C值的影响 |
| 2.7.3 PPPS对回肠绒毛长度、宽度、隐窝深度及V/C值的影响 |
| 2.8 PPPS对肠绒毛形态的影响 |
| 2.8.1 口服PPPS7 天对肠绒毛形态的影响 |
| 2.8.2 口服PPPS14 天对肠绒毛形态的影响 |
| 2.8.3 口服PPPS21 天对肠绒毛形态的影响 |
| 2.9 PPPS对 NDV攻毒保护作用 |
| 2.9.1 攻毒后PPPS对体重及存活率的影响 |
| 2.9.2 攻毒后PPPS对肠道黏膜中病毒载量的影响 |
| 2.9.3 攻毒后肠道黏膜及肺脏组织学观察 |
| 2.10 PPPS对 H9N2 攻毒保护作用 |
| 2.10.1 攻毒后PPPS对肺脏病理变化影响 |
| 2.10.2 攻毒后PPPS对肺脏中病毒载量的影响 |
| 3 分析与讨论 |
| 第三章 松花粉多糖对鸡肠道菌群的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 多糖及溶液配制 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 样品采集 |
| 1.2.2 样本DNA提取 |
| 1.2.3 PCR扩增与产物纯化 |
| 1.2.4 生物信息学和统计分析 |
| 1.2.5 测序数据质量优化 |
| 1.2.6 OTU聚类及Venn图绘制 |
| 1.2.7 物种相对丰度图及热图 |
| 1.2.8 α多样性及UPGMA聚类树分析 |
| 1.2.9 qPCR验证测序结果 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 数据质量分析 |
| 2.2 基于OTU的 Venn图 |
| 2.3 物种相对丰度图 |
| 2.4 α多样性指数分析 |
| 2.5 等级聚类曲线 |
| 2.6 稀释曲线 |
| 2.7 UPGMA聚类树 |
| 2.8 qPCR验证 |
| 3 分析与讨论 |
| 第四章 松花粉多糖对巨噬细胞的免疫调节作用 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 多糖及溶液配制 |
| 1.1.2 细胞 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 巨噬细胞的复苏与培养 |
| 1.2.2 PPPS对 HD11 细胞增殖的影响 |
| 1.2.3 PPPS对 HD11 细胞吞噬作用的影响 |
| 1.2.4 PPPS对 HD11 细胞活性氧水平的影响 |
| 1.2.5 PPPS对 HD11 细胞分泌NO的影响 |
| 1.2.6 PPPS对 HD11 细胞分泌IL-1β和TNF-α的影响 |
| 1.2.7 细胞总RNA提取及质量检测 |
| 1.2.8 mRNA测序及数据分析 |
| 1.2.9 miRNA测序及数据分析 |
| 1.2.10 PPPS对 HD11 细胞受体的影响 |
| 1.2.11 MAPK抑制剂对HD11 细胞分泌NO、TNF-α和IL-1β的影响 |
| 1.2.12 PPPS对 HD11 细胞NF-κB分子的影响 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 PPPS对 HD11 细胞的免疫增强作用 |
| 2.1.1 PPPS对 HD11 细胞增殖作用 |
| 2.1.2 PPPS对 HD11 细胞吞噬作用的影响 |
| 2.1.3 PPPS对 HD11 细胞释放ROS的影响 |
| 2.1.4 PPPS对 HD11 细胞释放NO和 i NOS mRNA水平的影响 |
| 2.1.5 PPPS对 HD11 细胞分泌细胞因子的影响 |
| 2.2 PPPS对 HD11 细胞免疫调节作用转录组分析 |
| 2.2.1 测序数据与参考序列比对结果 |
| 2.2.2 皮尔逊相关系数和PCA分析结果 |
| 2.2.3 DEGs的鉴定和分析 |
| 2.2.4 DEGs的 GO和 KEGG通路富集分析 |
| 2.2.5 差异表达mRNA qPCR验证 |
| 2.2.6 miRNA测序分析及测序数据质量 |
| 2.2.7 miRNA差异表达鉴定和分析 |
| 2.2.8 miRNA靶基因的GO和 KEGG通路富集分析 |
| 2.2.9 差异表达miRNA的 qPCR验证 |
| 2.3 PPPS对 HD11 细胞受体的影响 |
| 2.3.1 PPPS对 HD11 细胞受体TLR2、4、MR的影响 |
| 2.3.2 TLR4 抑制剂抑制HD11 细胞分泌IL-1β、TNF-α、NO |
| 2.4 MAPK抑制剂抑制PPPS诱导HD11 细胞分泌IL-1β、TNF-α、NO |
| 2.5 PPPS对 HD11 细胞NF-κB分子的影响 |
| 2.5.1 PPPS上调HD11 细胞NF-κB分子mRNA水平 |
| 2.5.2 NF-κB抑制剂抑制HD11 细胞分泌IL-1β、TNF-α、NO |
| 3 分析与讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）胎盘间充质干细胞对糖尿病肾脏疾病免疫炎症损伤的修复作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 DKD的流行状况 |
| 1.2 DKD的发病机制 |
| 1.3 DKD的治疗现状 |
| 1.3.1 新型降糖药 |
| 1.3.2 RAAS系统抑制剂 |
| 1.3.3 内皮素受体拮抗剂 |
| 1.3.4 其他药物 |
| 1.4 间充质干细胞概述 |
| 1.4.1 MSCs的多向分化潜能 |
| 1.4.2 MSCs的旁分泌功能 |
| 1.5 MSCs在糖尿病及DKD治疗中的应用 |
| 1.5.1 MSCs在糖尿病治疗中的临床应用 |
| 1.5.2 MSCs在 DKD治疗中的应用 |
| 1.6 本研究目的与内容 |
| 第2章 糖尿病肾脏疾病免疫细胞的浸润模式分析 |
| 2.1 资料与方法 |
| 2.1.1 数据下载与预处理 |
| 2.1.2 应用CIBERSORT反卷积算法进行免疫浸润分析 |
| 2.1.3 主成分分析(principal component analysis,PCA) |
| 2.1.4 应用ss GSEA算法进行免疫浸润分析 |
| 2.1.5 免疫细胞浸润丰度的相关性分析 |
| 2.1.6 DKD标本获取 |
| 2.1.7 PAS与 Masson染色分析 |
| 2.1.8 多标记全景分析 |
| 2.1.9 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 纳入样本的基本临床特征 |
| 2.2.2 DKD与对照样本22 种免疫细胞浸润比例分析 |
| 2.2.3 DKD与对照样本22 种免疫细胞聚类分析 |
| 2.2.4 DKD与对照样本22 种免疫细胞PCA分析 |
| 2.2.5 免疫细胞在DKD和对照样本中的比例差异 |
| 2.2.6 DKD样本中24 种免疫细胞的相关性分析 |
| 2.2.7 DKD和对照组PAS与 Masson染色结果分析 |
| 2.2.8 DKD和对照组差异表达的免疫细胞验证分析 |
| 2.2.9 DKD和对照组PD-1 的表达水平 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 间充质干细胞对 DKD 模型大鼠免疫炎症损伤的修修复作用研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 主要试剂的配置 |
| 3.1.3 实验设备与仪器 |
| 3.1.4 P-MSCs的获取与分离 |
| 3.1.5 P-MSCs的鉴定 |
| 3.1.6 P-MSCs的培养技术 |
| 3.1.7 P-MSCs的体外标记 |
| 3.1.8 实验动物与分组 |
| 3.1.9 标本采集 |
| 3.1.10 生理生化指标的检测 |
| 3.1.11 肾脏病理指标的检测 |
| 3.1.12 流式细胞术检测外周血Th17/Treg细胞比例 |
| 3.1.13 利用Luminex技术检测细胞因子水平 |
| 3.1.14 肾脏组织m RNA转录组测序分析 |
| 3.1.15 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 P-MSCs细胞形态 |
| 3.2.2 P-MSCs细胞表面标志物 |
| 3.2.3 P-MSCs细胞多系分化潜能 |
| 3.2.4 P-MSCs标记和体内示踪 |
| 3.2.5 P-MSCs对 DKD模型大鼠理化指标的影响 |
| 3.2.6 P-MSCs对 DKD模型大鼠肾脏病理学改变的作用 |
| 3.2.7 P-MSCs对 DKD模型大鼠外周血Th17/Treg细胞平衡的作用 |
| 3.2.8 P-MSCs对 DKD模型大鼠系统及肾脏局部炎症因子的作用 |
| 3.2.9 P-MSCs对 DKD模型大鼠肾脏组织转录组分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 PD-1/PD-L1通路在P-MSCs调控 Th17/Treg 平衡中的作用研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验试剂 |
| 4.1.2 实验设备与仪器 |
| 4.1.3 P-MSCs的培养技术 |
| 4.1.4 分离大鼠脾脏淋巴细胞 |
| 4.1.5 q RT-PCR法测定si RNA PD-L1 干扰效率 |
| 4.1.6 P-MSCs与淋巴细胞共培养及分组情况 |
| 4.1.7 流式检测PD1 在淋巴细胞中的表达水平 |
| 4.1.8 流式检测Th17/Treg细胞比例 |
| 4.1.9 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 P-MSCs对 Th17 细胞的影响 |
| 4.2.2 P-MSCs对 Treg细胞的影响 |
| 4.2.3 P-MSCs对 PD1 表达水平的影响 |
| 4.2.4 si RNA序列的选择 |
| 4.2.5 下调P-MSCs上 PD-L1 表达对Th17 细胞的影响 |
| 4.2.6 下调P-MSCs上 PD-L1 表达对Treg细胞的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 全文总结 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 攻读博士期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（3）D-Nap-GFFY水凝胶增强LXR配体抗肿瘤作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 第一节 肺腺癌的研究进展 |
| 1.1.1 肺癌的分类 |
| 1.1.2 肺腺癌的发生因素 |
| 1.1.2.1 基因突变、融合导致的肺腺癌 |
| 1.1.2.2 病毒感染导致的肺腺癌 |
| 1.1.3 肺腺癌的检测方式 |
| 1.1.3.1 影像学检测 |
| 1.1.3.2 分子生物学检测 |
| 1.1.4 肺癌的治疗 |
| 1.1.5 小鼠肺癌模型 |
| 1.1.5.1 基因工程鼠肺癌模型 |
| 1.1.5.2 化学成分诱导模型 |
| 1.1.5.3 肺癌细胞系诱导模型 |
| 1.1.5.4 体外模型 |
| 第二节 LXR研究进展 |
| 1.2.1 LXR与脂质代谢 |
| 1.2.1.1 LXR与胆固醇代谢 |
| 1.2.1.2 LXR与脂肪酸代谢 |
| 1.2.2 LXR与免疫系统 |
| 1.2.2.1 LXR与巨噬细胞 |
| 1.2.2.2 LXR与淋巴细胞 |
| 1.2.2.3 LXR与树突细胞 |
| 1.2.3 LXR与肿瘤 |
| 1.2.3.1 LXR与肺癌治疗的研究进展 |
| 1.2.3.2 LXR与其他癌症治疗的研究进展 |
| 第三节 IFNγ研究进展 |
| 1.3.1 IFNs简介 |
| 1.3.2 IFNγ的功能 |
| 1.3.2.1 抗原处理和递呈 |
| 1.3.2.2 抗病毒 |
| 1.3.2.3 激活杀菌效应 |
| 1.3.2.4 抗肿瘤与免疫逃逸 |
| 第四节 免疫细胞与肿瘤的研究进展 |
| 1.4.1 巨噬细胞与肿瘤 |
| 1.4.1.1 巨噬细胞的极化 |
| 1.4.1.2 肿瘤相关巨噬细胞 |
| 1.4.1.3 靶向巨噬细胞的抗肿瘤治疗 |
| 1.4.2 树突细胞 |
| 1.4.2.1 树突细胞参与的抗肿瘤作用 |
| 1.4.2.2 树突细胞抗肿瘤的阻力 |
| 1.4.2.3 通过树突细胞抗肿瘤治疗的方式 |
| 第五节 水凝胶抗肿瘤研究进展 |
| 1.5.1 宏观水凝胶 |
| 1.5.1.1 在局部肿瘤化疗中的应用 |
| 1.5.1.2 在肿瘤免疫治疗中的应用 |
| 1.5.1.3 微针贴片 |
| 1.5.2 微凝胶 |
| 1.5.2.1 口服给药 |
| 1.5.2.2 肺部输送 |
| 1.5.2.3 经动脉栓塞化疗 |
| 1.5.3 纳米凝胶 |
| 第六节 选题依据 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 第一节 实验材料、试剂与仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.1.1 细胞株 |
| 2.1.1.2 实验动物 |
| 2.1.1.3 实验耗材 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.2.1 细胞培养相关 |
| 2.1.2.2 药物 |
| 2.1.2.3 抗体 |
| 2.1.2.4 试剂盒 |
| 2.1.2.5 其他试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.3.1 细胞培养相关 |
| 2.1.3.2 免疫印迹和基因克隆相关 |
| 2.1.3.3 其他仪器 |
| 第二节 实验方法 |
| 2.2.1 细胞实验相关 |
| 2.2.1.1 细胞传代 |
| 2.2.1.2 细胞冻存 |
| 2.2.1.3 细胞复苏 |
| 2.2.2 动物实验相关 |
| 2.2.2.1 小鼠喂养 |
| 2.2.2.2 小鼠造模 |
| 2.2.2.3 小鼠组织收集和处理 |
| 2.2.3 小鼠骨髓来源树突细胞的提取和诱导 |
| 2.2.4 夹心ELISA |
| 2.2.5 肝脏脂质提取 |
| 2.2.6 切片制备 |
| 2.2.6.1 石蜡切片 |
| 2.2.6.2 冰冻切片 |
| 2.2.7 免疫组织化学染色(immunohistochemical staining,IHC) |
| 2.2.8 免疫荧光染色(immunofluorescent staining,IF) |
| 2.2.8.1 冰冻切片免疫荧光 |
| 2.2.8.2 石蜡切片免疫荧光 |
| 2.2.9 苏木素伊红染色(hematoxylin and eosin staining,HE) |
| 2.2.10 油红O染色(Oil red O staining,ORO) |
| 2.2.11 蛋白免疫印迹 |
| 2.2.11.1 蛋白提取 |
| 2.2.11.2 BCA法蛋白浓度定量 |
| 2.2.11.3 凝胶电泳 |
| 2.2.11.4 转膜 |
| 2.2.11.5 杂交 |
| 2.2.11.6 显色曝光 |
| 2.2.11.7 Strip |
| 2.2.12 实时定量荧光PCR |
| 2.2.12.1 细胞总RNA提取 |
| 2.2.12.2 cDNA文库构建 |
| 2.2.12.3 Real-time qPCR |
| 2.2.13 实验相关材料 |
| 2.2.13.1 水凝胶的制备 |
| 2.2.13.2 流变力学检测 |
| 2.2.13.3 核磁 |
| 2.2.13.4 透射电镜 |
| 2.2.13.5 水凝胶的体内外降解 |
| 2.2.13.6 T317 的体内外释放 |
| 2.2.14 流式 |
| 2.2.15 细胞毒性实验 |
| 2.2.16 siRNA |
| 2.2.17 数据统计和分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 第一节 D-Nap-GFFY和 D-Nap-GFFY-T317 的特征分析 |
| 3.1.1 D-Nap-GFFY的核磁分析 |
| 3.1.2 D-Nap-GFFY和 D-Nap-GFFY-T317 制备 |
| 3.1.3 D-Nap-GFFY和 D-Nap-GFFY-T317 的流变力学检测 |
| 3.1.4 D-Nap-GFFY的降解检测 |
| 3.1.5 从D-Nap-GFFY-T317 中释放的T317 检测 |
| 第二节 D-Nap-GFFY-T317对Lewis肺癌移植瘤生长的抑制作用 |
| 3.2.1 D-Nap-GFFY-T317 降低LLC1 细胞的活力 |
| 3.2.2 D-Nap-GFFY-T317 提高荷瘤小鼠生存率 |
| 3.2.3 皮下注射D-Nap-GFFY-T317 能抑制肿瘤生长 |
| 3.2.4 D-Nap-GFFY-T317 能够激活IFNγ的表达和免疫细胞的浸润 |
| 第三节 D-Nap-GFFY-T317 抑制LLC1 肿瘤生长的机制探究 |
| 3.3.1 D-Nap-GFFY-T317 激活抗原呈递细胞中IFNγ表达 |
| 3.3.2 D-Nap-GFFY-T317 调控巨噬细胞极化 |
| 3.3.3 D-Nap-GFFY-T317 调控树突细胞的成熟和浸润 |
| 3.3.4 D-Nap-GFFY-T317 促进T细胞的浸润 |
| 3.3.5 D-Nap-GFFY-T317 抑制肿瘤中血管的生成 |
| 第四节 D-Nap-GFFY-T317 避免诱导荷瘤小鼠的肝脏脂质积累 |
| 3.4.1 D-Nap-GFFY-T317 处理不影响小鼠肝脏功能 |
| 3.4.2 D-Nap-GFFY-T317 处理不影响小鼠肝脏中脂质合成基因的表达 |
| 第五节 D-Nap-GFFY-T317 对乌拉坦诱发肺癌的抑制作用 |
| 3.5.1 D-Nap-GFFY-T317 抑制乌拉坦诱导的肺腺癌的发生发展 |
| 3.5.2 D-Nap-GFFY-T317 抑制乌拉坦诱导的肺腺癌中的炎症 |
| 3.5.3 D-Nap-GFFY-T317 通过促进IFNγ表达抑制乌拉坦诱导的肺腺癌 |
| 第六节 长期施用D-Nap-GFFY-T317 不影响乌拉坦诱导小鼠的肝脏脂肪生成和血脂水平 |
| 第七节 巨噬细胞以清道夫受体SR-A依赖的方式吞噬D-Nap-GFFY-T317 |
| 第四章 讨论 |
| 第一节 避免LXR副作用的研究现状 |
| 4.1.1 使用组织特异性LXR激动剂 |
| 4.1.2 使用LXRβ特异性激动剂 |
| 4.1.3 使用纳米颗粒特异性输送LXR激动剂 |
| 第二节 IFNγ抗肿瘤的研究现状 |
| 第三节 给药方式的探究 |
| 第四节 水凝胶包裹T317 抗肿瘤的机制 |
| 第五章 结论 |
| 第一节 课题结果总结 |
| 第二节 论文创新 |
| 第三节 进一步需要做的工作 |
| 附录 复方丹参滴丸抑制阿霉素诱导的心脏毒性 |
| 研究背景 |
| 研究结果 |
| 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表论文及所获奖励 |
（4）免疫检查点LAG-3在胶质母细胞瘤中的表达及意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 免疫检查点LAG-3在肿瘤免疫中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）机械牵张预处理骨髓间充质干细胞对ARDS肺微血管内皮细胞修复的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 本论文专用缩略词表(Abbreviations) |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 间充质干细胞治疗ARDS的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 组织工程干预对干细胞的影响 |
| 参考文献 |
| 主要实验材料、仪器与试剂 |
| 第一部分 机械牵张预处理对骨髓间充质干细胞的影响 |
| 前言 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 机械牵张预处理对骨髓间充质干细胞修复ARDS损伤肺微血管内皮细胞屏障修复的影响 |
| 前言 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 已发表论文 |
| 参加学术会议情况 |
| 资金资助 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（6）NLRP3/Caspase-1焦亡经典途径在异常咬合导致颞下颌关节软骨退变中的作用（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 TMJOA患者与TMJID患者颞下颌关节滑液焦亡相关炎性介质的表达研究 |
| 1 研究内容及方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 NLRP3/Caspase-1焦亡经典途径在大鼠TMJOA组织的表达研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象及材料 |
| 1.2 研究内容 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 流体剪切力干预对软骨细胞焦亡的作用研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象及分组 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 靶向NLRP3炎性小体治疗炎症疾病 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文 导师评阅表 |
（7）大气颗粒物诱导多重细胞器功能紊乱导致血管内皮损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1. 研究背景和进展 |
| 1.1 大气颗粒物相关血管疾病的人群研究 |
| 1.2 大气颗粒物引起血管损伤的体内外实验研究 |
| 2. 研究拟解决的关键科学问题及主要思路 |
| 3. 研究的主要内容 |
| 4. 研究的创新点 |
| 5. 技术路线图 |
| 第二章 城市大气颗粒物PM SRM1648a的细胞毒性和亚细胞毒效应 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 主要材料、试剂与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 颗粒物水合粒径与电位分析 |
| 2.2.2 内毒素检测 |
| 2.2.3 细胞培养 |
| 2.2.4 细胞生存率(MTT法与CCK8法) |
| 2.2.5 细胞形态学观察 |
| 2.2.6 氧化应激指标GSH/GSSG和NADP~+/NADPH检测 |
| 2.2.7 脂质过氧化丙二醛MDA及C11-BODIPY~(581/591)探针检测 |
| 2.2.8 颗粒物摄取实验 |
| 2.2.9 亚细胞结构超微电镜 |
| 2.2.10 免疫荧光 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 城市大气颗粒物PM SRM1648a的成分分析、水合粒径和内毒素含量检测 |
| 3.1.1 PM SRM1648a的成分分析 |
| 3.1.2 PM SRM1648a的水合粒径分析 |
| 3.1.3 PM SRM1648a的内毒素检测 |
| 3.2 PM SRM1648a的细胞毒性 |
| 3.2.1 PM SRM1648a影响细胞生存率 |
| 3.2.2 PM SRM1648a导致血管内皮细胞形态学改变 |
| 3.2.3 PM SRM1648a诱导血管内皮细胞氧化应激及脂质过氧化 |
| 3.3 颗粒物的摄取先于血管内皮细胞毒性的产生 |
| 3.3.1 血管内皮细胞具有摄取PM SRM1648a颗粒物的能力 |
| 3.3.2 颗粒物的摄取可能导致血管内皮细胞存活率的降低 |
| 3.4 PM SRM1648a引起血管内皮细胞亚细胞结构损伤 |
| 3.4.1 PM SRM1648a诱发血管内皮细胞γ-H2AX灶点的表达量改变 |
| 3.4.2 PM SRM1648a引起血管内皮细胞细胞器结构变化 |
| 4. 讨论 |
| 5. 本章小结 |
| 第三章 PM SRM1648a触发内质网应激引起血管内皮细胞自噬小体累积和凋亡 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 主要材料、试剂与设备 |
| 2.1.1 主要材料与仪器设备 |
| 2.1.2 Western blot及免疫荧光实验抗体信息 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 内质网染色 |
| 2.2.2 细胞凋亡率 |
| 2.2.3 活性氧(Reactive oxygen species, ROS) |
| 2.2.4 亚细胞结构超微电镜 |
| 2.2.5 免疫荧光 |
| 2.2.6 Western blot |
| 2.3 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 PM SRM1648a触发血管内皮细胞内质网应激 |
| 3.1.1 PM SRM1648a引起血管内皮细胞内质网结构损伤 |
| 3.1.2 PM SRM1648a改变血管内皮细胞内质网应激标志性蛋白表达 |
| 3.2 PM SRM1648a引起血管内皮细胞内自噬小体累积与细胞凋亡 |
| 3.2.1 PM SRM1648a引发血管内皮细胞内自噬小体累积 |
| 3.2.2 PM SRM1648a触发内皮细胞内自噬小体标志蛋白表达改变 |
| 3.2.3 PM SRM1648a引起血管内皮细胞凋亡及刺激凋亡相关标志蛋白表达变化 |
| 3.3 ROS/内质网应激信号轴在PM SRM1648a诱导血管内皮细胞凋亡中的作用 |
| 3.3.1 ROS参与PM SRM1648a诱导的血管内皮细胞内质网应激和细胞凋亡 |
| 3.3.2 内质网应激抑制剂4-PBA有效缓解PM SRM1648a引起的内质网损伤和细胞凋亡 |
| 3.4 PM SRM1648a暴露下,内质网应激和自噬的相互关系 |
| 3.4.1 内质网应激参与PM SRM1648a诱导的血管内皮细胞自噬小体累积 |
| 3.4.2 细胞自噬对PM SRM1648a诱导的血管内皮内质网应激无显着影响 |
| 4. 讨论 |
| 5. 本章小结 |
| 第四章 溶酶体损伤参与PM SRM1648a引发的血管内皮细胞缺陷型自噬 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 主要材料、试剂与设备 |
| 2.1.1 主要材料与仪器 |
| 2.1.2 Western blot及免疫荧光实验抗体信息 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 mRFP/GFP-LC3腺病毒装载观察自噬流 |
| 2.2.2 溶酶体探针染色 |
| 2.2.3 LAMP-2/LC3B免疫荧光 |
| 2.2.4 酸性磷酸酶及组织蛋白酶B检测 |
| 2.2.5 Western blot |
| 2.3 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 PM SRM1648a扰乱EA.hy926血管内皮细胞自噬流 |
| 3.1.1 暴露PM SRM1648a不同时间后,EA.hy926细胞内自噬标志性蛋白表达变化 |
| 3.1.2 不同时间点,颗粒物造成EA.hy926内皮细胞内自噬小体累积的原因不同 |
| 3.1.3 PM SRM1648a导致EA.hy926血管内皮细胞自噬流异常 |
| 3.2 PM SRM1648a破坏EA.hy926细胞溶酶体,诱导缺陷型自噬 |
| 3.2.1 PM SRM1648a导致EA.hy926细胞溶酶体碱性化 |
| 3.2.2 PM SRM1648a显着性降低溶酶体膜蛋白LAMP-2的表达水平 |
| 3.2.3 PM SRM1648a引起溶酶体水解酶失活 |
| 3.3 氧化应激在颗粒物影响EA.hy926细胞自噬过程中的作用 |
| 3.3.1 氧化应激参与PM SRM1648a引起的LC3Ⅱ上调/自噬小体累积 |
| 3.3.2 氧化应激不是PM SRM1648a引起自噬流紊乱的关键因素 |
| 3.3.3 PM SRM1648a破坏EA.hy926细胞溶酶体结构功能,扰乱自噬流 |
| 3.4 PM SRM1648a破坏溶酶体完整性,诱导血管内皮细胞自噬流紊乱 |
| 3.4.1 PM SRM1648a引发HUVECs自噬流异常 |
| 3.4.2 颗粒物损伤溶酶体导致自噬流紊乱,即缺陷型自噬 |
| 4. 讨论 |
| 5. 本章小结 |
| 第五章 线粒体动力学分裂-融合失衡在PM SRM1648a致血管内皮细胞炎性损伤中的作用 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 主要材料、试剂与设备 |
| 2.1.1 主要材料与仪器 |
| 2.1.2 Western blot实验抗体信息 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 线粒体活性氧(Mitochondrial reactive oxygen species, mtROS) |
| 2.2.2 线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential, MMP) |
| 2.2.3 ATP及ATP相关酶 |
| 2.2.4 线粒体形态学观察 |
| 2.2.5 乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH) |
| 2.2.6 Hoechst 33258/PI |
| 2.2.7 Caspase1~+/PI~+细胞焦亡率检测 |
| 2.2.8 细胞炎性因子ELISA |
| 2.2.9 qRT-PCR |
| 2.2.10 LV-DNM1L-RNAi慢病毒转染 |
| 2.2.11 Western blot |
| 2.3 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 PM SRM1648a诱导EA.hy926内皮细胞线粒体功能紊乱 |
| 3.1.1 PM SRM1648a削弱线粒体活性并促进线粒体活性氧簇(mtROS)释放 |
| 3.1.2 PM SRM1648a损伤线粒体膜电位(ΔΨm,MMP) |
| 3.1.3 PM SRM1648a抑制EA.hy926细胞ATP及ATP酶合成 |
| 3.2 PM SRM1648a破坏血管内皮细胞线粒体分裂-融合动态平衡 |
| 3.2.1 血管内皮细胞摄取PM SRM1648a诱导线粒体结构改变 |
| 3.2.2 PM SRM1648a引起血管内皮细胞线粒体动力学平衡紊乱 |
| 3.2.3 PM SRM1648a引起线粒体动力学相关基因表达改变 |
| 3.2.4 PM SRM1648a经DRP-1磷酸化影响线粒体分裂-融合动态平衡 |
| 3.3 PM SRM1648a经线粒体分裂异常触发血管内皮细胞炎症反应 |
| 3.3.1 PM SRM1648a破坏EA.hy926细胞膜并激活caspase1酶活性 |
| 3.3.2 PM SRM1648a诱导EA.hy926血管内皮细胞炎症反应 |
| 3.2.3 PM SRM1648a诱导HUVECs血管内皮细胞caspase1激活及炎性反应 |
| 3.3.4 DRP1介导的线粒体异常分裂参与颗粒物诱导的EA.hy926细胞炎性反应 |
| 4. 讨论 |
| 5. 本章小结 |
| 第六章 急性亚急性暴露PM SRM1648a致BALB/c小鼠主动脉血管组织损伤 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 主要材料与试剂 |
| 2.1.1 qRT-PCR引物序列 |
| 2.1.2 Western blot及免疫组化实验抗体信息 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 BALB/c小鼠分组与暴露 |
| 2.2.2 H&E和Masson染色病理观察 |
| 2.2.3 肺泡灌洗液的提取与检测 |
| 2.2.4 BALF细胞分类计数以及巨噬细胞极化 |
| 2.2.5 血液基础相关指标检测 |
| 2.2.6 炎性因子ELISA检测 |
| 2.2.7 主动脉大体油红实验 |
| 2.2.8 qRT-PCR与Western blot |
| 2.2.9 组织TUNEL法凋亡率 |
| 2.2.10 免疫组化 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 PM SRM1648a致BALB/c小鼠血液学细胞计数参数改变 |
| 3.2 亚急性暴露导致BALB/c小鼠主动脉病理改变 |
| 3.3 PM SRM1648a诱导BALB/c小鼠局部及全身氧化应激 |
| 3.3.1 急性亚急性颗粒物暴露后引起小鼠肺部氧化应激 |
| 3.3.2 急性亚急性暴露引起小鼠血液学氧化应激相关指标改变 |
| 3.3.3 急性亚急性暴露引起小鼠主动脉氧化应激相关分子表达改变 |
| 3.4 PM SRM1648a颗粒物刺激小鼠肺部、主动脉及循环炎症反应 |
| 3.4.1 颗粒物刺激BALB/c小鼠肺部炎症反应 |
| 3.4.2 急性亚急性暴露导致小鼠血液炎性因子含量升高 |
| 3.4.3 急性亚急性暴露引起小鼠主动脉组织炎性相关因子mRNA表达改变 |
| 3.5 亚急性暴露PM SRM1648a致BALB/c小鼠主动脉亚细胞结构功能紊乱 |
| 3.6 亚急性暴露PM SRM1648a致BALB/c小鼠主动脉细胞凋亡 |
| 4. 讨论 |
| 5. 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 大气颗粒物对血管损伤的研究进展一基于体内大小鼠实验 |
| 1 背景及简介 |
| 2 大气颗粒物诱导大小鼠血管损伤 |
| 2.1 血管损伤与血压升高 |
| 2.2 脂质沉积与动脉粥样硬化 |
| 2.3 血栓与脑部血管疾病 |
| 3 大气颗粒物诱导血管损伤与疾病的潜在机理 |
| 3.1 ROS与氧化应激 |
| 3.2 炎症反应 |
| 3.3 NOX/eNOS/NO系统紊乱失衡 |
| 4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（8）趋化因子CXCL5在H1N1感染中的作用及其对iBALT结构的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略语 |
| 前言 |
| 1 威胁人类健康的呼吸道病毒 |
| 1.1 呼吸道病毒感染大事件 |
| 2 流感,一个现存的公共卫生问题 |
| 2.1 流感大流行的发生 |
| 2.2 季节性流感的困顿 |
| 2.3 流感病毒的分子结构 |
| 2.4 流感病毒感染机制 |
| 2.5 流感病毒感染的预防与治疗 |
| 3 小蛋白分子在抗病毒感染中的重要作用 |
| 3.1 细胞因子的概念 |
| 3.2 趋化因子的结构、分类 |
| 3.3 趋化因子与炎症相关疾病的关系 |
| 4 天然免疫和获得性免疫在抗病毒感染中扮演着重要的角色 |
| 4.1 抗流感感染的“先锋部队”之天然免疫反应 |
| 4.1.1 先天性免疫识别病毒感染 |
| 4.1.2 NK细胞在抗病毒感染中的功能 |
| 4.1.3 肺泡巨噬细胞在流感病毒感染中的作用 |
| 4.2 抗流感感染的“后续堡垒”之获得性免疫反应 |
| 4.2.1 CD4+T细胞在流感病毒感染中的作用 |
| 4.2.2 CD8+T细胞在流感病毒感染中的作用 |
| 5 诱导支气管相关淋巴组织在呼吸道病毒流感感染免疫中的作用 |
| 5.1 支气管相关淋巴组织(BALT)的发现 |
| 5.2 诱导支气管相关淋巴组织(iBALT)的进展 |
| 5.3 诱导的支气管相关淋巴组织在肺部疾病中的保护和病理作用 |
| 5.3.1 保护性iBALT对免疫应答的影响 |
| 5.3.2 致病性iBALT在疾病中的反作用 |
| 5.4 诱导支气管相关淋巴组织与肺部相关疾病的关系 |
| 6 本课题的研究意义、目的和基本策略 |
| 材料与方法 |
| 甲型H1N1 PR8/H3N2流感病毒的培养、收集和浓缩 |
| 1 MDCK细胞培养 |
| 2 MDCK细胞分离纯化流感病毒 |
| 3 流感病毒的浓缩 |
| 甲型H1N1 PR8/H3N2流感病毒血凝单位及50%培养组织感染剂量(TCID50)的测定 |
| 1 1%鸡红细胞悬液制备 |
| 2 流感病毒的组织细胞半数致死量(TCID50)的测定 |
| 野生型小鼠和趋化因子CXCL5敲除小鼠在H1N1 PR8流感病毒感染急性肺损伤中相关信号通路实验 |
| 1 实验动物 |
| 2 IVC系统组成 |
| 3 纯合CXCL5-/-基因敲除小鼠基因型鉴定 |
| 4 小鼠解剖取材实验 |
| 4.1 小鼠肺灌洗液收集 |
| 4.2 快速瑞姬氏染色 |
| 4.3 ELISA实验 |
| 4.4 小鼠脾脏分离 |
| 4.5 小鼠肺/脾脏/淋巴结的流式细胞术实验 |
| 4.6 小鼠肺组织病毒载量实验 |
| 4.7 小鼠肺组织石蜡包埋切片实验 |
| 4.8 小鼠肺组织荧光切片实验 |
| 5 利用单细胞质谱流式技术检测WT小鼠、CXCL5敲除小鼠攻毒肺组织免疫图谱变化检测(普罗亭生物公司分析) |
| 5.1 检测抗体配备 |
| 5.2 样品制备 |
| 5.3 实验流程 |
| 6 利用二代测序分析( RNA-seq)技术对WT小鼠、CXCL5敲除小鼠攻毒肺组织转录组分析(海普洛斯公司测序分析) |
| 6.1 样品制备 |
| 6.2 实验流程 |
| 结果与讨论 |
| Part1 趋化因子CXCL5在H1N1流感病毒感染中的作用 |
| 1.1 流感病毒H1N1感染WT/CXCL5敲除小鼠的临床症状 |
| 1.2 趋化因子CXCL5在H1N1感染WT/CXCL5敲除小鼠肺组织中的表达 |
| 1.3 流感病毒H1N1在WT/CXCL5敲除小鼠肺组织中的存活 |
| 1.4 H1N1感染WT/CXCL5敲除小鼠致使其肺组织炎症损伤 |
| 1.5 WT/CXCL5敲除小鼠在H1N1感染中的免疫反应 |
| 1.5.1 H1N1感染WT/CXCL5敲除小鼠肺灌洗液实验 |
| 1.5.2 H1N1感染WT/CXCL5敲除小鼠肺组织中固有免疫细胞群 |
| 1.5.3 H1N1感染WT/CXCL5敲除小鼠肺组织中获得性免疫细胞群 |
| Part2 趋化因子CXCL5在肺组织和血液中的不同释放途径 |
| 2.1 骨髓重塑小鼠的构建 |
| 2.2 H1N1感染骨髓重塑小鼠的基础免疫学分析 |
| 2.3 H1N1感染骨髓重塑小鼠肺组织的病理分析 |
| 2.4 H1N1感染骨髓重塑小鼠全血和肺灌洗液中的免疫细胞群 |
| 小结: 趋化因子CXCL5在H1N1感染中的作用 |
| Part3 H1N1感染后CXCL5敲除小鼠肺部的“杰出”细胞群 |
| 3.1 通过质谱流式技术对WT/CXCL5小鼠全肺组织免疫细胞群鉴定分类 |
| 3.2 H1N1介导的WT/CXCL5敲除小鼠肺部免疫细胞群 |
| 3.2.1 感病毒介导的WT /CXCL5敲除小鼠肺部固有免疫细胞群图谱 |
| 3.2.2 感病毒介导的WT/CXCL5敲除小鼠肺部获得性免疫细胞群图谱 |
| 3.2.3 流感病毒介导的WT/ CXCL5敲除小鼠肺部免疫细胞群百分比 |
| 3.3 肺滞留B细胞在H1N1感染WT/CXCL5敲除小鼠肺部的突出表现 |
| 3.4 流式分析iBALT结构相关细胞群在肺组织中的表现 |
| Part4 H1N1感染WT/CXCL5敲除小鼠肺部诱导iBALT结构的形成 |
| 4.1 免疫荧光分析H1N1感染的WT/CXCL5敲除小鼠iBALT的结构 |
| 4.2 病理图分析H1N1感染的WT/CXCL5敲除小鼠iBALT的结构 |
| 4.3 iBALT结构形成和维持相关趋化因子CXCL5和细胞因子IL-6表现 |
| Part5 趋化因子CXCL5的敲除给肺组织iBALT形成提供优越的条件 |
| 5.1 二代测序样品的相关性和可实性 |
| 5.2 H1N1感染下WT/CXCL5敲除小鼠的差异基因 |
| 5.3 H1N1感染下WT和CXCL5敲除小鼠差异基因功能富集 |
| Part6 H1N1感染WT和CXCL5敲除小鼠肺组织中iBALT结构诱导形成模式图 |
| 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表达及产物活性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略语表 |
| 第一章 犬干扰素研究进展 |
| 1 IFN概述 |
| 1.1 IFN分类 |
| 1.2 犬IFN理化特性及基因组成 |
| 1.3 IFN的空间结构及受体研究 |
| 1.4 IFN生物学活性及作用机制 |
| 2 犬IFN基因工程研究 |
| 2.1 犬Ⅰ型IFN基因工程研究 |
| 2.2 犬Ⅱ型IFN基因工程研究 |
| 2.3 犬Ⅲ型IFN基因工程研究 |
| 2.4 犬长效IFN研究 |
| 3 犬IFN临床应用 |
| 3.1 治疗犬病毒性传染病 |
| 3.2 治疗犬皮肤性疾病 |
| 3.3 治疗眼科及其他疾病 |
| 4 犬IFN应用展望 |
| 第二章 白细胞介素18研究进展 |
| 1 IL-18概述 |
| 1.1 IL-18的发现、结构、特性 |
| 1.2 IL-18受体及信号传导途径 |
| 1.3 IL-18结合蛋白 |
| 2 IL-18生物学作用 |
| 2.1 IL-18抗肿瘤作用 |
| 2.2 IL-18抗感染作用 |
| 2.3 IL-18免疫调节作用 |
| 3 IL-18与临床疾病的关系 |
| 3.1 IL-18与自身免疫性疾病 |
| 3.2 IL-18与心血管系统疾病的关系 |
| 3.3 IL-18与神经系统疾病的关系 |
| 3.4 IL-18与肿瘤疾病的关系 |
| 3.5 IL-18与糖尿病等其他疾病的关系 |
| 4 IL-18应用展望 |
| 5 本研究的目的及意义 |
| 第三章 藏獒犬IFN-γ和 IFN-α基因克隆与序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 淋巴细胞的体外刺激活化 |
| 2.2 RT-PCR扩增藏獒犬IFN-γcDNA |
| 2.3 重组质粒的酶切及PCR鉴定 |
| 2.4 藏獒犬IFN-γ序列测定及分析 |
| 2.5 藏獒犬IFN-α序列测定及分析 |
| 3 讨论 |
| 第四章 藏獒犬IFN-γ和 IFN-α基因的表达、纯化及活性鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重组表达质粒的鉴定 |
| 2.2 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重组蛋白Western bloting分析 |
| 2.3 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重组蛋白纯化分析 |
| 2.4 藏獒犬IFN-γ抗病毒活性检测 |
| 2.5 藏獒犬IFN-α抗病毒活性检测 |
| 2.6 藏獒犬IFN-α抗病毒临床应用 |
| 3 讨论 |
| 第五章 藏獒犬IL-18基因克隆、表达及生物学活性鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 藏獒犬IL-18基因的克隆 |
| 2.2 藏獒犬IL-18基因序列测定及分析 |
| 2.3 藏獒犬IL-18基因比较分析及进化分析 |
| 2.4 pET-30a-IL-18 重组质粒的鉴定 |
| 2.5 pET-30a-IL-18 重组蛋白表达及Western bloting分析 |
| 2.6 pET-30a-IL-18 重组蛋白纯化结果 |
| 2.7 藏獒犬IL-18基因生物学活性鉴定 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 导师简介1 |
| 导师简介2 |
（10）NLRC5对神经元中经典MHCⅠ类分子表达调控及神经元发育的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 NLRC5 在免疫调节中的作用 |
| 1 NLRC5 的结构和表达 |
| 2 NLRC5 对免疫系统中MHCⅠ类分子表达的调控 |
| 3 NLRC5 在先天免疫应答中的作用 |
| 4 NLRC5 在肿瘤免疫监视中的作用 |
| 5 小结 |
| 第二章 NLRC5 在海马神经元发育过程中的表达模式及其与经典MHCⅠ类分子的相关性 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 NLRC5 调控海马发育中经典MHCⅠ类分子的表达 |
| 第一节 NLRC5 诱导神经元中经典MHCⅠ类分子及相关分子的表达 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节 NLRC5 调控神经元中经典MHCⅠ类分子表达的机制 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 NLRC5 调控海马神经元树突分支发育 |
| 第一节 NLRC5 对海马神经元树突分支发育的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节 NLRC5 通过经典MHCⅠ类分子调控海马神经元树突分支发育 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
四、外源NF-IL6高表达增强巨噬细胞的细胞毒效应（论文参考文献）
- [1]松花粉多糖对鸡肠道黏膜免疫的影响及巨噬细胞的免疫调节作用[D]. 沙洲. 山东农业大学, 2021
- [2]胎盘间充质干细胞对糖尿病肾脏疾病免疫炎症损伤的修复作用及机制研究[D]. 汪姣. 南昌大学, 2021(01)
- [3]D-Nap-GFFY水凝胶增强LXR配体抗肿瘤作用的研究[D]. 冯科. 南开大学, 2021(02)
- [4]免疫检查点LAG-3在胶质母细胞瘤中的表达及意义[D]. 韩杰. 山西医科大学, 2021(01)
- [5]机械牵张预处理骨髓间充质干细胞对ARDS肺微血管内皮细胞修复的影响[D]. 李金泽. 东南大学, 2021(02)
- [6]NLRP3/Caspase-1焦亡经典途径在异常咬合导致颞下颌关节软骨退变中的作用[D]. 贾梦莹. 新疆医科大学, 2021(08)
- [7]大气颗粒物诱导多重细胞器功能紊乱导致血管内皮损伤的机制研究[D]. 汪岩. 东南大学, 2020
- [8]趋化因子CXCL5在H1N1感染中的作用及其对iBALT结构的影响[D]. 李楠. 北京协和医学院, 2020(05)
- [9]藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表达及产物活性鉴定[D]. 宋世斌. 甘肃农业大学, 2020(01)
- [10]NLRC5对神经元中经典MHCⅠ类分子表达调控及神经元发育的影响[D]. 李萍. 东南大学, 2020(01)