一、人类PKNOX_1基因一种新剪接型全长cDNA的克隆与表达分析（论文文献综述）
张美玲[1]（2018）在《水稻纹枯病菌中2个双分体病毒的基因组结构与功能研究》文中认为由水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani Kühn AG-1 IA）引起的水稻纹枯病（rice sheath blight）是水稻（Oryza sativa L.）最重要的病害之一。近年来随着真菌病毒研究的开展,水稻纹枯病菌中的真菌病毒也逐渐被发现和研究。已报道的水稻纹枯病菌中的真菌病毒主要为双链RNA（double-stranded RNA,ds RNA）病毒,包括双分体病毒、内源病毒和暂未分类的真菌病毒等。已有研究表明,有的真菌病毒对寄主真菌的生物学性状有一定的影响。而目前,关于水稻纹枯病菌中的真菌病毒对原始寄主真菌的影响的研究甚少。为发现更多的新的真菌病毒,并明确某些真菌病毒对寄主真菌的影响,本研究以实验室保存的13个已知含有真菌病毒的水稻纹枯病菌为研究对象,进行了新真菌病毒的筛选、真菌病毒的基因组结构与功能分析以及真菌病毒对寄主真菌的影响等一系列研究工作。现将主要研究结果报道如下:1.用反转录PCR（RT-PCR）的方法对本实验室前期初步筛选出的13个含有真菌病毒的水稻纹枯病菌株进行新真菌病毒的筛选,结果发现:B240和B261菌株中存在水稻纹枯病菌ds RNA病毒1（Rhizoctonia solani ds RNA virus 1,Rs V1）,菌株A111中只存在病毒Rs V1的片段1,说明了病毒Rs V1的片段1的单独侵染性。水稻纹枯病菌双分体病毒2（Rhizoctonia solani partitivirus 2,Rs PV2）存在于A5和B261菌株中。而A82、A102、A105、A106、A154、A182、D122、D168和Y1等9个菌株中含有与Rs V1和Rs PV2不同的真菌病毒。根据这9个菌株中病毒核酸的琼脂糖凝胶电泳条带,挑选A105和D122两个菌株为本研究的深入研究对象。2.从水稻纹枯病菌A105菌株中分离到一个新的真菌病毒,命名为水稻纹枯病菌ds RNA病毒3（Rhizoctonia solani ds RNA virus 3,RsRV3）。RsRV3基因组含有两个ds RNA片段（ds RNA1和ds RNA2）,大小分别为1890 bp和1811 bp,各含有一个开放阅读框（open reading frame,ORF）,分别编码病毒的RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,Rd Rp）和外壳蛋白（coat protein,CP）。对病毒粒子进行负染观察,发现该病毒具有等轴的病毒粒子,直径约为20 nm。系统发育分析表明,RsRV3与双分体病毒科（Partitiviridae）的a-双分体病毒属（Alphapartitivirus）成员具有较高的相似性。因此确定真菌病毒RsRV3是隶属于双分体病毒科（Partitiviridae）、a-双分体病毒属（Alphapartitivirus）的一个新的ds RNA真菌病毒。3.从水稻纹枯病菌D122菌株中分离到另一个新的真菌病毒,命名为水稻纹枯病菌ds RNA病毒5（Rhizoctonia solani ds RNA virus 5,RsRV5）。RsRV5基因组含有两个ds RNA片段（ds RNA1和ds RNA2）,大小分别为1894 bp和1755 bp,各含有一个开放阅读框（open reading frame,ORF）,分别编码病毒的RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,Rd Rp）和外壳蛋白（coat protein,CP）。对病毒粒子进行负染观察,发现该病毒具有等轴的病毒粒子,直径约为20 nm。系统发育分析表明,RsRV5与双分体病毒科（Partitiviridae）的γ-双分体病毒属（Gamapartitivirus）成员具有较高的相似性。因此确定病毒RsRV3是隶属于双分体病毒科（Partitiviridae）、γ-双分体病毒属（Gamapartitivirus）的一个新的ds RNA真菌病毒。4.病毒脱除方法主要有菌丝尖端法、菌丝尖端与病毒抑制剂结合法、菌丝碎段法和原生质体再生法等。为了获得带毒和不带毒的等基因系菌株,以便建立真菌病毒与寄主真菌的互作体系,本研究利用原生质体再生法成功地把病毒RsRV5从寄主中脱除。对等基因系带毒菌株D122和脱毒菌株D122-P的生物学性状进行比较,病毒RsRV5对寄主的生长速率没有明显影响,但在7 d时间内能提高寄主真菌产色素能力,使寄主真菌产菌核量变少,致病力稍有降低。5.对等基因系的水稻纹枯病菌野生型带毒（RsRV5）菌株D122和不带毒菌株D122-P样本进行转录组测序和生物信息学分析,比较两种样本在转录水平上的差异,旨在了解真菌病毒对寄主真菌转录组的影响。结果表明:测序数据的有效比对序列数为127380018,能够比对到参考基因组的序列数为96371422,比对百分比都达到了70%以上。鉴定出可变剪接事件65535个,其中内含子滞留所占比例最大,外显子跳跃次之。差异基因表达分析表明,病毒RsRV5脱除后,基因rna6273和rna6673表达显着上调,基因rna9529表达显着下调,其中rna6273和rna9529编码未知功能的蛋白,rna6273编码蛋白激酶抑制剂（PKI）功能域蛋白（domain-containing protein）。综上所述,本研究阐明了2种新发现的双分体病毒（RsRV3和RsRV5）的基因组结构与功能的关系,并初步阐明了真菌病毒RsRV5对寄主真菌生物学性状和转录组的影响。
周翠姬[2]（2017）在《BrYV与PEMV2协生互作的生物学、转录组学和小RNA表达谱研究》文中认为病毒协生互作是指两种不相关的病毒复合侵染同一寄主植物,使寄主植物出现更加严重的症状或者其中一种或两种病毒的积累量增加。马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus）是最具有经济重要性的植物病毒属之一,该属病毒常与幽影病毒属病毒（umbraviruses）复合侵染,引起严重的植物病害。然而,马铃薯卷叶病毒属病毒与幽影病毒属病毒协生互作的机制尚不十分清楚。本论文以马铃薯卷叶病毒属的芸薹黄化病毒（Brassica yellows virus,BrYV）以及幽影病毒属的豌豆耳突花叶病毒2号（Pea enation mosaic virus 2,PEMV 2）为主要研究材料,对BrYV与PEMV 2在本生烟（Nicotiana bentaamiana）协生互作的生物学、转录组学和小RNA表达谱进行研究。与BrYV或PEMV 2单独侵染本生烟时相比,BrYV与PEMV 2复合侵染本生烟导致:（1）本生烟植株产生严重的症状;（2）BrYV的积累量明显升高;（3）BrYV能够进行摩擦接种;（4）BrYV突破韧皮部局限。BrYV P0突变体病毒BrYV-APO和BrYV-P0H10Q/T11P并不能与PEMV 2在本生烟上协生互作。而缺失了通读结构域（Read-through domain,RTD）的BrYV病毒突变体（BrARTD）能与PEMV 2在本生烟上协生互作。通过农杆菌介导的叶盘转化方法获得了能稳定表达BrYV P0-6×Myc或PEMV 2 ORF4-3×Flag的转基因本生烟植株,为后续研究提供重要的实验材料。以上结果表明BrYV与PEMV 2在本生烟上存在协生互作并引起一系列的协同效应。转录组高通量测序结果表明与BrYV或PEMV 2单独侵染本生烟时相比,BrYV与PEMV 2复合侵染本生烟引起更多的基因表达发生变化,有1778个基因的表达在病毒复合侵染时发生特异性的上调或下调,这些基因主要包括光合作用相关基因、乙烯相关基因、植物防御相关基因、RNA沉默相关基因、转录因子和蛋白翻译相关基因。推测在BrYV与PEMV 2协生互作时发生特异性变化的基因为潜在的与病毒协生互作相关的寄主因子。小RNA高通量测序结果说明BrYV与PEMV 2协生互作主要对来源于BrYV病毒的小干扰RNA（Virus-derived small interfering RNAs,vsiRNAs）产生影响,表现为:（1）显着提高了 BrYV vsiRNAs的积累量;（2）改变了 BrYV vsiRNAs的正负义链的比例;（3）明显地改变了 BrYV vsiRNAs在BrYV基因组上的分布以及相对积累量。BrYV与PEMV 2复合侵染本生烟特异性地引起14个本生烟miRNAs表达水平的变化,其中6个为显着上调,8个为显着下调。以上结果解析了病毒协生互作对病毒vsiRNAs以及寄主miRNAs的影响。同时,对Polerovirus新病毒进行了分子鉴定与序列分析。从豌豆和蚕豆样品中发现并鉴定了一种新的马铃薯卷叶病毒属病毒,暂命名为豌豆温和褪绿病毒（Pea mild chlorosis virus,PMCV）。另外,从甜菜样品中发现了甜菜西方黄化病毒（Beet western yellows virus,BWYV）的一种新株系并获得了其全长基因组序列,该株系存在两种基因型,即BWYV-BJA和BWYV-BJB。这两种基因型全长序列一致性为93.0%,序列差异主要位于基因组的5’端区域,其它区域则相对保守。系统发育进化树分析和重组分析表明BWYV-BJA和BWYV-BJB可能是重组病毒。
李小薇[3]（2015）在《胃癌细胞中抑癌基因CDH1、hMLH1 pre-mRNA选择性剪接的遗传结构与表观遗传修饰机制研究》文中认为胃癌（Gastric cancer,GC）是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一,其发病是一个多因素、多步骤、多基因参与的复杂病理过程。已经知道,抑癌基因CDH1胚系突变构成部分家族性胃癌的遗传学基础,而散发性胃癌的肿瘤细胞中CDH1基因编码蛋白E-cadherin的表达多明显下调或缺如。人类错配修复基因hMLH1胚系突变是遗传性非息肉性结直肠癌的重要病因,而在胃癌高发的东亚人群,部分家族性胃癌的发病亦与hMLH1基因功能异常相关。本课题组前期在胃癌遗传与表观遗传学的研究中做了大量工作。在中国人胃癌患者中检出多种CDHI及hMLH1基因新的胚系突变,并深入分析了基因多种体细胞的甲基化状态。然而,在部分胃癌患者,我们未发现CDH1及hMLH1基因胚系或体细胞的病理性突变,也未检出基因启动子区高度甲基化变异,但检测靶基因在胃癌组织中表达缺如,其调控机制不清。pre-mRNA选择性剪接是真核生物基因转录后表达调控的关键环节之一,构成蛋白质多样性的一个主要来源,也是生物细胞功能平衡系统调控的重要组成部分。选择性剪接产物的自然平衡维持细胞的正常功能,剪接过程的异常可导致这种功能平衡的破坏,细胞某些关键基因的功能性蛋白表达模式改变,与肿瘤等多种人类疾病的发病风险增高相关联。最近研究揭示,除传统RNA序列元件及其相关剪接因子之外,DNA甲基化及组蛋白修饰等表观遗传修饰也可对pre-mRNA剪接发挥重要作用。鉴于此,我们在课题组前期胃癌患者基因突变分析工作的基础上,深入探讨胃癌发病相关的重要抑癌基因CDH1及hMLH1 pre-mRNA选择性剪接调控机制,涉及DNA结构、RNA序列元件及基因的表观遗传修饰作用等,以期为胃癌的发生及演变基因学基础研究提供新的思路。本研究由两部分组成:第一部分:CDH1基因突变及表观修饰异常与胃癌细胞CDH1 pre-mRNA选择性剪接的关系研究我们在282例胃癌患者和425例正常对照外周血细胞DNA样本中筛查CDH1基因胚系突变,并分析胃癌组织及其同源正常组织cDNA样本中CDH1 pre-mRNA选择性剪接状态,深入探讨遗传结构变异与表观修饰异常对CDH1 pre-mRNA选择性剪接的可能影响。结果如下:1.我们在胃癌患者中首报CDH1外显子9（Exon 9）的胚系突变c.1296C>G（N432K）和c.1297G>A（D433N）,而在后续425例正常对照中未检出这两种突变。我们采用RT-PCR技术分析携带突变患者胃组织细胞cDNA,并切胶测序确定,CDH1c.1296C>G影响其pre-mRNA剪接而导致CDH1 Exon 9的跳跃,应为病理性突变;而CDH1 c.1297G>A未影响其mRNA表达产物的长度。2.RT-PCR分析还提示,胃癌患者CDH1基因Exon 8近下游剪切位点还存在缺失83bp（CDH1 1054del83）的异常剪接产物。这种异常剪接的mRNA产物,与正常转录剪接的mRNA共同存在。我们进而针对50例胃癌患者的组织样本cDNA,Taqman探针实时定量PCR技术分析CDH1该区域剪接状态。结果显示,超过一半的患者检出CDH1 1054del83异常剪接,提示这种选择性剪接是一种普遍现象,并在多株体外培养胃癌及胃组织细胞的检测中得到验证,且该异常剪接产物的量在癌细胞中显着增加。3.我们前期的突变筛查并未发现CDH1 Exon 8及附近内含子（Intron）序列的结构变异,寻找CDH1 Exon 8选择性剪接的其它影响因素引起我们的兴趣。多方面的证据显示,基因转录与剪接可能同时进行并紧密耦联。因此,pre-mRNA选择性剪接的调节可能受到基因表观遗传修饰的影响。我们首先检测了 CDH1基因Exon 7-9 DNA序列的甲基化状态,分析其与Exon 8选择性剪接的关系。结果表明,胃粘膜细胞与三种胃癌细胞中CDH1 Exon 8及其周围序列均存在DNA高甲基化。采用DNA甲基化转移酶抑制剂AZA处理并未影响CDH1 1054del83异常剪接产物的丰度。提示,分析序列的DNA甲基化不构成CDH1选择性剪接的影响因素。4.染色质免疫共沉淀结果显示,胃癌细胞株SGC-7901及BGC-823中,CDH1 Exon 8及其周边序列H3ac及H4K16ac水平均显着低于人胃粘膜细胞株GES-1。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）TSA处理后,SGC-7901与BGC-823中,CDH1 1054del83异常剪接产物相对全长野生型mRNA产物量的比值均显着降低。提示HDACi处理后,伴随着转录的激活及RNA聚合酶II（RNA polymerase II,RNAP II）延伸速度加快,存在着剪接模式的定量改变。5.组蛋白甲基化的差异发生于特定赖氨酸位点,体外培养胃癌细胞株与人胃粘膜细胞株比较,H3K4me2未见差异,而H3K36me3在CDH1 Exon 8及其周边区域富集。细胞中加入siSETD2（H3K36me3特异的甲基化转移酶SETD2的干扰RNA）后,CDH1 1054del83异常剪接产物量相对全长野生型mRNA产物量的比值显着降低。而提高H3K36me3水平则可能促进CDH1 1054del83异常剪接的产生。然而,针对siSRSF2干扰后,几种细胞中CDH1 1054del83剪接子相对野生型mRNA转录产物的比值均未见差异,提示CDH1 1054del83选择性剪接不受SRSF2剪接因子途径的调控。第二部分:胃癌细胞中hMLH1基因pre-mRNA选择性剪接的遗传学与表观遗传学基础在236例胃癌外周血样本和240例正常对照DNA中,我们筛查hMLH1基因胚系突变,并分析胃癌组织及同源正常组织样本cDNA中hMLH1 pre-mRNA选择性剪接状态,进一步探讨hMLH1基因pre-mRNA选择性剪接的遗传学与表观遗传学基础。结果显示:1.针对本实验室首报的中国人特有的错配修复基因的hMLH1 c.2101C>A（Q701K）突变的病例对照分析提示,该突变增加中国男性携带者的胃癌患病风险。RT-PCR分析携带突变及未携带突变胃癌患者的正常组织cDNA,并经克隆测序确定,hMLH1 c.2101C>A 影响 pre-mRNA 剪接,导致hMLHExon18 跳跃。2.RT-PCR及实时定量PCR分析胃癌患者的组织cDNA,发现除了存在正常mRNA 表达产物,且频繁检出 delEx10、delEx11、delEx10-11、delEx16及delEx17异常转录产物。并在多株体外培养正常胃粘膜细胞及胃癌细胞株的检测中得到验证,且这些异常剪接产物的表达丰度在癌细胞中显着增加。提示这些选择性剪接也是一种普遍现象。3.我们前期并未检出hMLH1 Exon10-11及16-17区域及邻近内含子序列的结构变异,遗传学改变对hMLH1 Exon10-11和Exon16-17区域选择性剪接的影响可以排除。因此,我们猜测表观遗传修饰可能影响hMLH1 pre-mRNA选择性剪接的形成。我们首先检测了 hMLH1 Exon10、11、16及Exon17序列的甲基化状态,分析其与hMLH1各种异常剪接产物的关系。结果表明,胃粘膜细胞与三种胃癌细胞中hMLH1 Exon10、11、16及17序列均存在DNA高甲基化。DNA甲基化转移酶抑制剂AZA处理前后,hMLH1各种异常剪接产物（hMLH1 delEx10、delEx11、delEx10-11、delEx16及delEx17）表达水平均未见显着差异。提示DNA甲基化水平对MLH1选择性剪接无明显影响。4.染色质免疫共沉淀结果表明,相对于人胃粘膜细胞系GES-1,胃癌细胞系BGC-823与SGC-7901中组蛋白乙酰化水平（H4K16ac和H3ac）在hMLH1基因Exon 10-11处富集程度均较低,推测将导致该区域染色质结构较紧凑,RNAP II延伸速率减慢,有利于评分较低的弱异常剪接位点被识别,提高基因选择性剪接的概率。而TSA处理后,部分胃癌细胞中hMLH1 delEx10-1 1异常剪接降低,进一步证实了该区域降低的乙酰化水平与外显子跳跃相关。而hMLH1 Exon16-17处乙酰化水平在人胃粘膜细胞系与胃癌细胞系间未见规律性差异,TSA处理后也未见改变,提示该区域选择性剪接结局与组蛋白乙酰化水平无直接关系。5.进一步组蛋白甲基化的分析揭示,相对于GES-1细胞,胃癌细胞中在hMLH1基因Exon 10-11及16-17区域组蛋白修饰H3K36me3富集程度均较低。siSETD2干扰后,细胞中异常剪接产物hMLLH1delEx10、delEx11及delEx10-11比例均显着增加,说明降低的H3K36me3水平与该区域跳跃相关。相对于GES-1细胞,胃癌细胞在hMLH1基因Exon 10-11及16-17区域组蛋白修饰H3K4me2富集程度也较低,提示H3K4me2对于该区域选择性剪接的可能影响。同时,siSRSF2干扰后,细胞系中hMLH1基因Exon 10-11跳跃的异常转录产物比例也增加。可能当剪接因子SRSF2水平降低,hMLH1 Exon10-11区域识别正常剪接位点能力降低,相对增加了其他剪接的模式。但是siSRSF2干扰后,未影响hMLH1 Exon 16-17区域的剪接结局,提示该区域剪接位点选择不是经由SRSF2作用的。本论文两部分的研究结果揭示,CDH1胚系突变c.1296C>G造成CDH1基因Exon 9跳跃;hMLH1胚系突变c.2101C>A引起hMLH1基因Exon18跳跃。胃癌细胞中广泛存在异常增高的CDH1 1054del83,及hMLH1 deEx10、ddelEx11、delEx10-11、delEx16及delEx17等选择性剪接产物,其丰度受到序列相关的组蛋白乙酰化水平调节,且受组蛋白特定位点氨基酸残基甲基化H3K36me3水平的影响。其机制可能通过影响剪接因子识别、染色质疏缩和RNA聚合酶II延伸速度等。因此,分析胃癌中pre-mRNA选择性剪接的调控,既要考虑相关基因遗传学改变的作用,也要重视表观遗传修饰变异的影响。
姜佳君[4]（2015）在《牙鲆（Paralichthys olivaceus）dazl基因的克隆、表达和功能初步研究》文中进行了进一步梳理近年来,关于生殖细胞的研究被全世界学者广泛关注,除在哺乳动物中有广泛深入的研究以外,在鱼类等低等脊椎动物中也逐渐开展起来,并取得很多进展。DAZL （deleted in azoospermia-like）是DAZ家族的成员之一,同时也是一种重要的RNA结合蛋白。现有研究发现,从无脊椎动物到脊椎动物,dazl特异地表达于雌性和雄性生殖细胞,可能在生殖细胞发育过程发挥重要作用。不少研究也从一些硬骨鱼中鉴定了dazl基因,并对其表达规律作出了详细的探讨。本研究克隆和鉴定了牙鲆（Paralichthys olivaceus） dazl基因,首次在硬骨鱼中发现了其mRNA的可变剪接形式,将这两种牙鲆dazl mRNA称为Podazl-Ⅰ和Podazl-Ⅱ,探究了它们在mRNA水平和蛋白水平的表达规律,并找到了牙鲆DAZL的靶mRNA,预测其功能。首先,通过基因克隆等方法,得到了牙鲆dazl基因,全长5413 bp,包括9个外显子和9个内含子,其中外显子1仅有ATG三个碱基,内含子9位于3’非翻译区,这些特征与许多dazl同源基因是相似的。一对dazl等位基因在内含子6的序列上有差异。由于外显子8在转录或修饰时被删除,导致牙鲆dazl会产生一种较短的mRNA,与完整的转录本相比,缺失外显子8对应的51 nt。 DAZL同源多肽序列比对发现在RNA识别基序（RRM）中,有7个氨基酸位点可以将硬骨鱼和其它物种区分开来。牙鲆DAZL两种多肽序列与尖吻鲈DAZL序列的一致度最高,达到80.6%和80.4%。转录因子结合位点预测到GATA、CEBP和SOX等转录因子可能调控牙鲆dazl的转录。然后,通过反转录PCR和实时定量PCR,验证了Podazl-Ⅰ和Podazl-Ⅱ都特异地表达于牙鲆的精巢和卵巢,以及胚胎发育的主要时期,且Podazl-Ⅱ较Podazl-Ⅰ的表达量略高,两者在卵巢的表达水平都明显高于精巢,在胚胎发育到原肠中期之前的表达量较高,之后的时期表达水平很低,仅在出膜前有瞬时的升高。通过组织切片原位杂交、western blot和免疫组织化学等方法,证明Podazl-Ⅰ和Podazl-Ⅱ主要定位于雌性和雄性生殖细胞,两者对应的蛋白产物也具有性腺特异的表达模式,同样集中表达于生殖细胞。预测到牙鲆dazl基因上游可能有两个CpG岛,通过亚硫酸盐处理和测序,并未发现这两个CpG岛的甲基化水平在性腺和非性腺组织有明显差异,可能甲基化并不是调控牙鲆dazl表达的主要方式。最后,通过RNA-蛋白免疫共沉淀和高通量测序方法,研究牙鲆卵巢中DAZL两种蛋白可能的靶mRNA。对测序结果的注释的分析共找到3334个可能直接或间接受到牙鲆DAZL调控的mRNA,牙鲆DAZL对组成核小体核心的组蛋白mRNA富集量最高,说明它可能参与组蛋白mRNA的处理和修饰。从靶mRNA中也找到一些与生长、发育和生殖相关的因子,如oct4、gata6、vasa、dazl和dnd等,提示牙鲆DAZL能够调控这些重要的生物过程。GO注释和KEGG信号通路分析,均预测牙鲆DAZL可以参与RNA处理和代谢、翻译调控、细胞周期、蛋白代谢等多种生物过程。对PODAZL-Ⅰ和PODAZL-Ⅱ的差异靶mRNA分析,并没有发现牙鲆两种DAZL具有明显的功能差异。最后,通过qRT-PCR进一步验证了两组免疫沉淀样品中都富集了Podazl-Ⅰ和Podazl-Ⅱ,说明牙鲆DAZL可能直接或间接调控其自身mRNA.本研究对牙鲆dazl两种mRNA和蛋白的鉴定、表达规律分析和靶mRNA分析,证明了牙鲆dazl可以作为生殖细胞标记因子应用到今后的相关研究中。牙鲆dazl两种mRNA和蛋白形式的表达规律比较及靶mRNA比较结果说明,两者在功能上可能不存在明显差异,或许牙鲆dazl较短的可变剪接形式的出现可以更高效的进行转录和翻译,与完整的剪接形式一起,共同执行相似的生物学功能。这些结果为牙鲆及其它硬骨鱼的生殖和发育研究提供重要的参考依据,为种质资源的利用和保存、育种工作的开展奠定基础。
庹德财[5]（2015）在《番木瓜畸形花叶病毒检测鉴定及侵染性克隆构建与应用》文中提出番木瓜（Carica papaya L.）是海南重要热带经济果树之一,除了番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus, PRSV）和番木瓜花叶病毒（Papaya mosaic virus, PaMV）对番木瓜种植造成严重的病害之外,本研究于2012年首次在海南东方市转基因抗PRSV的番木瓜植株上,发现一种新的危害番木瓜栽培的番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leafdistortion mosaic virus, PLDMV）。以上三种病毒在番木瓜上的病症极为相似,在田间难以通过症状表现进行鉴别,给防治工作带来极大的困难。为此,本研究建立了灵敏快速检测这三种病毒的反转录-环介导等温扩增（Reverse transcription loop mediated isothermal amplification, RT-LAMP）和多重RT-PCR的方法。目前,对PLDMV的致病机理的研究较少,而植物病毒侵染性cDNA克隆是研究病毒基因功能的重要工具。本研究通过对PLDMV海南东方市分离物（PLDMV-DF）全长基因组序列进行测定并对其分子特征进行生物信息学分析,并成功构建了可系统侵染番木瓜的PLDMV-DF全长cDNA克隆和表达GFP的PLDMV-DF病毒表达载体,为进一步研究该病毒基因功能、病症发生及病毒致病机理奠定了基础。另外,利用表达GFP的PLDMV-DF侵染性克隆和番木瓜叶片原生质体的RNA干扰体系,快速筛证了靶向PLDMV CP基因的具有较高沉默效率的ihpRNA载体,为后续进行转基因抗PLDMV研究奠定了基础。主要研究结果如下：（1） PLDMV的发现与寄主范围本研究首次在中国大陆报道发现了PLDMV,对其寄主范围鉴定发现PLDMV-DF既能侵染转基因抗PRSV番木瓜也能侵染非转基因番木瓜,但不能侵染西葫芦（Cucurbita pepo）和本生烟（Nicotiana benthamiana）.（2）克隆了PLDMV-DF分离物全长基因组序列PLDMV-DF分离物全长基因组序列由10153nt组成（GenBank登录号：JX974555）。5’端和3’端UTR分别为134nt和209nt,含一个编码3269个氨基酸的多聚蛋白和一个编码75个氨基酸的小ORF。与日本J56P、台湾KS和CZ分离物的全长核苷酸序列相似性为94.3%-94.9%,氨基酸序列相似性为95.9%-96.3%。核苷酸及氨基酸序列的进化树分析显示,PLDMV-DF分离物与日本J56P分离物为一支,表明PLDMV-DF分离物与地理位置相对较远的日本分离物J56P可能具有共同的进化起源。（3）建立了RT-LAMP和多重RT-PCR检测方法成功建立了检测PLDMV、PRSV和PaMV三种病毒的RT-LAMP可视化检测体系和同时检测这三种病毒的多重RT-PCR检测方法。利用多重RT-PCR对海南岛内番木瓜病毒病害发病生态进行调查发现,PRSV、PLDMV和PapMV的发病率分别为：54.5%,27.3%和0.9%,而且首次发现PRSV和PLDMV存在混合感染的现象17.3%。（4）利用In-Fusion融合的方法快速获得PLDMV-DF的全长cDNA侵染性克隆,成功地通过体外转录获得了具有侵染活性的病毒RNA转录本为了克服其在E.coli细胞中的不稳定性,本研究采用插入内含子intron2和intron IV2的策略[内含子intron2插入到P3（第3709/3710nt）区域；intron IV2插入到CI（第5028/5029nt）区域；内含子intron2和intron IV2分别插入到P3（第3709/3710nt）和CI（第5028/5029nt）区域],成功构建了2个侵染性克隆：pT7-FL-In2（内含子intron2插入到P3（第3709/3710nt）区域）和PT7-FL-In2/IV2（内含子intron2和intron IV2分别插入到P3（第3709/371011t）和CI（第5028/5029nt）区域）。pT7-FL-In2和pT7-FL-In2/IV2体外转录产物接种番木瓜都表现出系统性侵染,未添加帽子结构类似物的体外转录产物接种的侵染效率达到58.8%-61.1%,而添加帽子结构类似物的体外转录产物接种的侵染效率高达73.7%-75.0%。（5）利用酵母同源重组系统,建立了一种改良的快速构建植物病毒侵染性克隆的方法,成功地通过农杆菌接种获得了具有侵染活性的PLDMV-DF侵染性克隆本实验对酵母同源重组系统方法进行改进,成功构建了两种适用农杆菌侵染法接种的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL和p35S-FL-In2（内含子intron2插入到P3（第3709/3710nt）区域）,共获得4个农杆菌克隆p35S-FL39-12、p35S-FL39-34和p35S-FL-In22-1、p35S-FL-In22-3。以上4个克隆与构建的PLDMV-DF的沉默抑制子HC-Pro瞬时表达载体pBI121-HC-Pro混合接种番木瓜植株的侵染效率（85.7%-91.4%）比单独接种的侵染效率（64.7%-69.4%）高,而且能提前2-3天表现出症状。（6）利用改良的酵母同源重组系统,将PLDMV-DF改造为病毒表达载体,在番木瓜中GFP获得系统性表达利用改进后酵母重组方法,成功构建了在PLDMV-DF的P1与HC-Pro之间和NIb与CP之间插入gfp外源基因的病毒表达载体P35S-FL-P1/GFP-8、p35S-FL-P1/GFP-9、p35S-FL-P1/GFP-In2-5、p35S-FL-GFP/CP-23-1、p35S-FL-GFP/CP-38-1和p35S-FL-GFP/CP-38-2。GFP获得系统性表达的克隆为p35S-FL-P1/GFP-9、p35S-FL-GFP/CP-38-1和p35S-FL-GFP/CP-38-2,侵染效率达73.5%-93.9%,在共聚焦荧光显微镜和UV灯下都能检测到GFP发光,,western blot检测到GFP表达。而p35S-FL-P1/GFP-9的位点突变影响其病症,可能突变为弱毒株,可用于交叉保护防治PLDMV。而p35S-FL-GFP/CP-23-1的位点突变影响GFP表达,但不影响其侵染性（66.7%）,但病症延迟30-40天。在接种90天后,gfp报告基因从插入位点会发生丢失现象。（7）利用表达GFP的PLDMV-DF侵染性克隆和番木瓜叶片原生质体的RNA干扰体系,快速筛证了靶向PLDMV CP基因的具有较高沉默效率的ihpRNA载体利用OZ-LIC法,成功构建了4种不同CP基因片段长度的ihpRNA植物表达载体pRNAi-CP879、pRNAi-CP400、pRNAi-CP326和pRNAi-CP140。在接种克隆p35S-FL-GFP/CP-38-1的番木瓜原生质体中,通过共聚焦荧光显微镜和RT-PCR分析,快速验证出pRNAi-CP879、pRNAi-CP400和pRNAi-CP326有较高的沉默效率
谷振军[6]（2014）在《赤桉木质素单体合成途径的基因家族研究》文中指出桉树是目前全球三大人工林速生树种之一,但在工业生产木浆和纤维素乙醇的过程中,植物体内丰富的木质素降低了纤维素的提取效率,增加了生产成本。木质素遗传改良已成为林木定向育种的研究热点。目前,对于桉树等速生林木中调控木质素单体合成的基因家族研究还不够全面。因此,本文选取可在湖南、江西和四川等省份种植的耐寒型赤桉为研究对象,建立桉属植物的EST组装数据库,搜素木质素单体合成途径中的相关基因片段序列,然后通过同源克隆和RACE等技术克隆目的基因的全长cDNA和全长基因组DNA,并进行生物信息学注释,分析木质素单体合成关键基因的年周期中快速生长期的表达规律,探索可能的可变剪接模式。本论文取得的相关结果如下：（1）通过分析模式植物拟南芥木质素单体合成途径中存在的11种关键基因,结果表明,其中8种基因是基因家族形式。本论文通过同源克隆和RACE全长克隆最终获得了赤桉木质素单体合成途径中的11种基因,包括22个基因的全长cDNA和基因组DNA（含4个前期克隆的基因）,分别为：赤桉PAL基因家族的3个基因、4CL基因家族的2个基因、1个C4H基因、C3H基因家族的2个基因、1个HCT基因、1个CSE基因、CCoAOMT基因家族的4个基因、1个COMT基因、F5H基因家族的2个基因、CCR基因家族的2个基因和CAD基因家族的3个基因。通过生物信息学分析表明,本文除了克隆的赤桉CCoAOMT2基因是编码CCoAOMT-like酶,而克隆到的其他21个基因都与相应的拟南芥基因序列高度同源,并且能够翻译成正确的蛋白质和具有相应的蛋白质催化功能结构域。（2）通过半定量RT-PCR法,检测调控S/G木质素单体比例关键基因的年周期中快速生长期的表达规律。结果表明,在赤桉木质部中,赤桉4CLl基因从4月开始基因表达,并且基因的表达量逐渐升高,在8月份表达量最大；赤桉4CL2基因在6月（赤桉早材形成阶段）的表达量最大,推测赤桉4CL2基因与早材中大量富集的G木质素单体合成相关联；COMT1基因的表达量从4月开始表达并一直呈上升趋势,在8月、9月和10月的表达量都保持高丰度表达,而这段时期是赤桉形成晚材并大量累积S木质素单体的阶段,这证明了COMT基因主要参与赤桉S木质素生物合成；赤桉CCoAOMT1基因和CCoAOMT6基因在全年都有表达,推测这两个基因在赤桉体内主要负责连接苯丙氨酸途径至木质素单体特异合成途径的通路；CCoAOMT2和CCoAOMT5基因只有在5月至9月份有表达,推测这两个CCoAOMT基因特异参与赤桉S木质素单体的形成；赤桉F5H1和F5H2基因的表达模式基本一致,在晚材形成的阶段表达量大于早材形成的阶段,表明它们特异参与赤桉S木质素单体的合成；赤桉CAD1和CAD5基因的表达模式也较为相似,而赤桉CAD2基因在一年中快速生长期的基因表达量没有明显变化。（3）赤桉CCoAOMTl基因存在可变剪接现象,可编码2种mRNA。正常剪接体长度为738bp （CCoAOMT1-L, HM106291）,可编码269个氨基酸。而可变剪接体长度为696bp （CCoAOMT1-△42, GQ889423）,可编码232个氨基酸。可变剪接体发生在在第1个内含子的5’端剪切位点上,其不影响编码正确功能的蛋白质。赤桉CCoAOMTl基因在茎段中可变剪接发生在5-9月间,是桉树一年中树高和直径增长最快的阶段,这种可变剪接可能与组织器官生长发育有关。
高世超[7]（2014）在《模拟酸雨胁迫下青花菜叶片的cDNA-AFLP差异表达分析》文中认为目前,我国已成为继欧洲、北美之后出现的第三大酸雨区,污染覆盖广东、广西、湖南、四川等地,面积达200多万平方公里。我国酸雨面积扩大之快、降水率之高,是世界上罕见的。酸雨会损害蔬菜的生长发育,降低蔬菜产量,受到酸雨侵蚀的蔬菜叶片,叶绿素含量降低,光合作用受阻,伤害严重的会导致叶子萎缩和畸形。本研究,通过模拟酸雨胁迫,以青花菜幼苗为材料,探讨了青花菜幼苗的生长特性,并应用cDNA-AFLP技术进行青花菜基因差异表达分析,试图从转录水平对青花菜酸雨胁迫进行研究,更好地揭示酸雨危害的机理,为蔬菜生产、酸雨污染的防治提供理论依据。主要研究结果如下:1、研究了模拟酸雨胁迫下青花菜活性氧代谢变化。以模拟酸雨处理0、3、6、9天的青花菜叶片为材料,比较了质膜透性、MDA含量、抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性的变化。结果表明,随着模拟酸雨浓度增大,该叶片质膜透性增强,MDA含量升高,SOD和POD活性逐渐上升,CAT活性先呈现上升后下降的趋势。2、研究了模拟酸雨胁迫下青花菜光合特性变化。以模拟酸雨处理9天的青花菜为材料,比较了生物量、光合速率和荧光特性各项指标的变化。结果表明,随着模拟酸雨浓度的增大,生物量逐渐下降,光合速率（Pn）、PS Ⅱ最大光化学效率（Fv/Fm）和PSⅡ的潜在活性（Fv/Fo）先上升后下降,PSⅡ实际光化学量子产量（ΦPSⅡ）、光化学淬灭系数（qP）和非光化学淬灭系数（qN）的变化不明显。3、研究了模拟酸雨胁迫下青花菜基因转录水平的变化。采用cDNA-AFLP技术,选取了 192对引物组合,对模拟酸雨胁迫下青花菜叶片的基因差异表达片段进行分离,最终获得了 148条TDF,测序成功126个,经过去除载体序列和Blastn比对,结果显示:117个TDF与已知序列同源性较高（E-Value<10-10）,根据功能的不同,初步将其分为9类,电子传递、光合作用、膜和运输、能量和新陈代谢、宿主防御、细胞壁水解、信号传导、转录和翻译相关基因,以及一些其它未知功能的基因。4、克隆获得了与青花菜抗性相关的β-1,4-木糖基转移酶IRX9H、ERF2、NAC、GST四条基因,并进行了 qRT-PCR分析,四个基因的表达量在胁迫期间均是先上升后下降,且在第3d达到最大值。β-1,4-木糖基转移酶IRX9H基因的cDNA全长1550 bp,ORF共有1155个碱基组成,编码384个氨基酸,GenBank登录号为:KF715851。ERF2的cDNA全长为 958 bp,ORF共有 804个碱基组成,编码267个氨基酸,GenBank登录号为:KF715852。NAC基因的cDNA全长为1055 bp,ORF共有903个碱基组成,编码300个氨基酸,GenBank登录号为:KF715853。GST基因的cDNA全长为912 bp,ORF共有642个碱基组成,编码213个氨基酸,GenBank登录号为:KF715854。
李维克[8]（2014）在《犬瘟热病毒强毒株TM-CC反向遗传系统及表达犬细小病毒VP2蛋白重组犬瘟热弱毒株的构建》文中认为犬瘟热（Canine distemper, CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus, CDV）引起的犬科和其它肉食动物一种重要传染病,在全世界范围内广泛分布,常常给养犬业和毛皮动物养殖业造成严重的危害。近年来,CDV的宿主动物范围呈现逐步扩大的趋势,几乎囊括大多数肉食动物,严重影响着野生肉食动物的种群数量,引起了国内外学者的广泛关注。反向遗传操作（Reverse genetic）是20世纪90年代后期出现的新型病毒学技术,其主要是通过对病毒基因组cDNA操作而获得具有活性的病毒粒子的过程。反向遗传操作的发展和成熟,为不分节段的单股负链RNA病毒（Non-segments negative strand RNA virus, NSNSY）的病毒学基础和应用研究提供了技术手段。采用反向遗传操作系统可对病毒基因组cDNA进行定点突变、缺失或外源基因插入修饰,从而拯救获得相应的突变、重组病毒。目前,在我国已经建立了几株CDV弱毒疫苗株的反向遗传操作系统,但仍未能建立野生型强毒株的反向遗传技术平台,制约着犬瘟热病毒在宿主动物体内扩散与分布及其分子致病机制等方面的研究。因此,CDV强毒株反向遗传操作系统的建立具有重要的意义。本研究以2008年从自然感染死亡的藏獒病料中分离获得的CDV强毒株TM-CC为亲本株,进行全基因组序列测定,在此基础上构建了含有TM-CC株病毒基因组全长cDNA克隆的重组真核表达质粒pCI-CDV-TM-CC和分别表达TM-CC株病毒N、P、L蛋白基因的重组真核表达质粒pCI-CDV/NP、pCI-CDV/P和pCI-CDL/L。同时,构建了表达犬信号淋巴细胞激活因子（Signaling lymphocyte activation molecules, SLAM）基因的重组真核表达质粒pCAGG-dogSLAM。然后,采用磷酸钙转染的方法将上述5种质粒共转染BSR细胞,成功拯救出重组病毒,命名为rCDV-TM-CC。该重组病毒与亲本株相比,二者的生长特性基本一致,在表达犬SLAM受体的VerodogSLAM细胞上的生长曲线相似,病毒滴度达到峰值的时间相同,最高病毒滴度相近,分别为10694TCID50/mL和10678TCID50/mL。结果表明,本研究成功构建了CDV强毒株TM-CC的反向遗传操作系统,为开展犬瘟热病毒的病毒学基础研究提供了工具平台。为今后开展CDV强毒株病毒在动物机体组织中的扩散与分布和致病机制方面的研究,在重组质粒pCI-CDV-TM-CC的基础上,将增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein, EGFP）基因插入到犬瘟热病毒H和L基因之间,构成含有EGFP基因的TM-CC株病毒基因组全长cDNA克隆质粒pCI-CDV-TM-CC-EGFP,从而拯救并获得了表达EGFP基因的重组犬瘟热病毒rCDV-TM-CC-EGFP。重组病毒rCDV-TM-CC-EGFP基本保持了亲本株rCDV-TM-CC的生长特性,在VerodogSLAM细胞上的生长动力学曲线与亲本株rCDV-TM-CC基本相似,最高病毒滴度可达106.56TCID50/mL。该重组病毒在VerodogSLAM细胞上具有良好的生长特性和遗传稳定性,在VerodogSLAM细胞上连续传代20代次后,仍能稳定、高效的表达EGFP。以重组犬瘟热病毒rCDV-TM-CC-EGFP表达的EGFP作为目的蛋白的检测方法与传统的犬瘟热病毒检测方法相比,更为敏感、特异、方便,为CDV强毒株在动物体内、外扩散及致病机制研究提供了技术手段。本研究成功建立了CDV强毒株TM-CC的反向遗传操作系统,并在此基础上成功构建了表达EGFP基因的重组犬瘟热病毒rCDV-TM-CC-EGFP,为开展犬瘟热病毒的病毒学基础研究提供了工具平台和技术手段。另外,犬细小病毒病是由犬细小病毒（Canine parvovirus, CPV）引起的犬科、鼬科等肉食性动物的一种急性接触性传染病,严重威胁着养犬业和皮毛动物养殖业的发展。目前我国使用的犬细小病毒病疫苗以灭活疫苗为主。然而,灭活疫苗接种动物诱导的CPV中和抗体反应持续时间较短,且生产成本较高。因此,研发更加安全、有效、成本低廉的犬细小病毒病疫苗仍具有现实意义。本研究以我国生产实践中使用的犬瘟热弱毒疫苗株CDV/R-20/8为活病毒疫苗载体,在其P和M基因之间的非编码区插入CPV VP2蛋白基因,从而成功救获表达CPV VP2蛋白基因的重组CDV弱毒疫苗株rCDV/R-20/8-CPVVP2。间接免疫荧光试验和Western blotting结果表明CPV VP2蛋白在重组病毒rCDV/R-20/8-CPVVP2感染的细胞中获得正确表达。同时,重组病毒rCDV/R-20/8-CPVVP和亲本毒株CDV/R-20/8相比,二者的生长特性基本一致,在Vero细胞的生长曲线相似,病毒滴度达到峰值的时间相同,最高病毒滴度分别可达10581TCIDso/mL和106.89TCID50/mL。该重组病毒的构建为防制犬瘟热和犬细小病毒病二联活载体疫苗的研制奠定了基础。
张红[9]（2013）在《半滑舌鳎性别相关基因DAZL和WT1a的克隆与表达分析》文中研究指明半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）因具有生长快、口感鲜美、市场价值高等特点，是一种理想的增养殖对象。但是半滑舌鳎雌性的生长速度是雄性的2-3倍，且存在天然的性逆转现象，性逆转后的伪雄鱼繁殖能力差，后代伪雄鱼比例高。因而研究半滑舌鳎的性别决定机制，实现单性育种对于半滑舌鳎养殖业的发展具有重要的经济意义。本文克隆了半滑舌鳎DAZL和WT1a基因，发现它们均是半滑舌鳎性别相关基因。通过研究这两个基因的表达情况，尤其是与性腺分化早期的组织学观察结合起来，不仅有利于阐明DAZL基因和WT1a基因在ZZ/ZW型鱼类的性腺分化中的作用，而且为找出半滑舌鳎性别决定的关键控制基因以及实现全雌育种提供基础材料和理论依据。本文通过组织切片观察半滑舌鳎性腺的分化和发育情况，发现该批仔鱼雌性性腺在46天之前雄鱼性腺分化不明显。56天时，雌性仔鱼性腺开始出现不规则的沟壑，出现卵巢腔，说明性腺开始分化，并且雄性性腺的分化晚于雌性性腺。另外对成鱼的性腺切片观察发现性逆转后的雌鱼性腺中有大量的精子，且与正常雄鱼的性腺切片差异不大。本研究利用RACE技术克隆了半滑舌鳎DAZL基因的全长。通过测序和拼接获得了半滑舌鳎DAZL基因的cDNA序列2026bp，含有636bp的完整开放阅读框（ORF），编码211个氨基酸，编码产物含有典型的RNA识别基序RRM和DAZ重复序列。荧光定量PCR结果显示，DAZL基因在半滑舌鳎性腺特异表达，并且DAZL基因在雄鱼中的表达量显着高于雌鱼和伪雄鱼，但在雌鱼和伪雄鱼性腺中表达量差异不大，说明DAZL基因并不是性逆转的标志性基因，在生理性别为雄性的伪雄鱼性腺中仍然保持正常雌鱼的表达模式。在胚胎发育各时期的表达结果显示，DAZL基因在受精后20h（神经胚期）之前表达量较高，并在20h达到最高值，而20h以后表达迅速降低，可能是20h以后原始生殖细胞的形成导致。在仔鱼发育各时期的表达结果显示，DAZL在仔鱼发育25d至65d表达量呈上升趋势，并且在雌鱼46d时出现显着升高，在雄鱼56d时出现显着升高，与仔鱼的性腺的分化时期相吻合。这些结果说明，DAZL基因是半滑舌鳎性别特异基因，但并没有参与性反转的过程，并且可能在半滑舌鳎性腺的分化过程中起重要作用。本文从半滑舌鳎全基因组序列中获得WT1a的部分序列，然后利用同样的方法克隆了WT1a基因的全长。克隆结果显示：WT1a基因全长cDNA为1886bp，开放阅读框（ORF）长为1470bp，编码490个氨基酸，并且包含KTS三肽，5’UTR和3’UTR分别长为245bp和171bp。在ORF末端发现2个微卫星（SSR）序列和2个跨膜螺旋区域，而在其他物种中未发现该序列，经验证该序列在半滑舌鳎中普遍存在，这可能是半滑舌鳎所特有的。氨基酸序列分析显示WT1a基因的保守性很高，与人的同源性也高达90%。荧光实时定量分析结果显示：WT1a在雌鱼和雄鱼性腺中表达显着高于其它各组织，并且在雄鱼性腺中的表达显着高于雌鱼，在雌鱼性腺中的表达又显着高于伪雄鱼，说明该基因是性别相关基因。在胚胎发育各时期以及初出膜后的表达结果显示：在12h （原肠早期）显着升高，20h （神经胚期）达到最高。在性腺分化早期雌雄性腺中的表达结果显示：WT1a在雌雄半滑舌鳎16d-66d的性腺（性腺分化早期）中表达持续平稳升高。这些研究结果说明：WT1a基因是半滑舌鳎性别相关基因，参与了半滑舌鳎性腺的分化和形成，并对半滑舌鳎的的性腺分化、发育起一定的维持作用，但可能没有参加性反转的过程。
刘媛[10]（2011）在《三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）cDNA文库构建、EST分析及抗脂多糖因子研究》文中研究指明三疣梭子蟹是我国重要的海水养殖品种,但随着养殖规模的不断扩大以及养殖集约化程度的不断提高,由细菌、真菌和病毒等引起的各种病害日趋严重,给三疣梭子蟹养殖业造成巨大损失。深入开展三疣梭子蟹免疫防御机制相关研究,探索免疫防治新途径,是实现其健康养殖的可靠保障。本研究构建三疣梭子蟹血细胞和眼柄全长cDNA文库,利用表达序列标签技术（EST）,对三疣梭子蟹表达序列进行大规模测序分析,从中鉴定免疫相关基因,并利用cDNA末端快速扩增（RACE）、实时定量PCR、基因原核重组表达等技术系统研究三疣梭子蟹抗脂多糖因子7种亚型,确定抗脂多糖因子cDNA和基因组序列结构,分析其前体mRNA剪接方式,探讨它们在三疣梭子蟹免疫防御中的作用。本研究成功构建三疣梭子蟹血细胞和眼柄全长cDNA文库,库容分别是8.0×105和5.6×105克隆。从血细胞文库中随机测序获得4452条高质量的EST序列,经拼接得到1066条Unigenes,包括461条Contigs和605条Singletons。从眼柄文库中随机测序获得4606条高质量的EST序列,可拼接为510条Unigenes,包括301条Contigs和209条Singletons。通过BLAST比对发现,血细胞文库中660条Unigenes、眼柄文库中365条Unigenes与Genbank数据库中的基因有较高同源性。进一步分析发现,血细胞文库中64条Unigenes、眼柄文库中35条Unigenes与免疫相关。这些基因可分为6类,分别是抗菌肽、氧化还原蛋白、黑化反应相关蛋白、分子伴侣蛋白、凝集因子和其它类别。其中,有5种免疫相关基因都存在多种相应的蛋白亚型,即抗脂多糖因子（PtALF1-7）、Crustin（PtCrustin1-3）、硫氧还蛋白（PtTrx1-2）、带有clip结构域的丝氨酸蛋白酶（PtcSP1-5）和Kazal型蛋白酶抑制剂（PtKPI1-4）。EST序列的获得和免疫基因的富集,丰富了三疣梭子蟹的基因组信息,为进一步克隆和研究三疣梭子蟹免疫防御功能基因奠定基础。本研究在EST分析基础上,克隆得到三疣梭子蟹抗脂多糖因子7种亚型PtALF1-7。它们的开放读码框编码的蛋白均含有一段信号肽、两个保守的半胱氨酸残基,与相近物种的ALF均具有较高同源性。与大多数报道的ALF晶体结构类似,PtALF2、PtALF3、PtALF5和PtALF7预测的空间结构由4个β折叠片和3个α螺旋组成,而PtALF1蛋白的空间结构中仅包含1个α螺旋,PtALF4蛋白的空间结构中含有5个β折叠片。序列分析表明PtALF1-3是由同一个基因组位点编码,经mRNA前体可变剪接产生。PtALF4-7分别由不同的基因组位点编码。在PtALF4、PtALF5和PtALF7基因的内含子区域均发现串联重复序列。通过直接测序,在PtALF1-3和PtALF7基因组序列中分别发现89个和128个SNP位点。PtALF1-7基因在健康三疣梭子蟹各个检测组织中均有表达,但是呈不同的表达模式。在三疣梭子蟹受到溶藻弧菌刺激后,PtALF1-7基因的表达量随时间变化明显,提示PtALFs是清除入侵病原菌的快速应答因子和持续效应因子。三疣梭子蟹抗脂多糖因子在大肠杆菌中表达情况并不理想,重组的PtALF5经抑菌试验证明没有活性,PtALF3和PtALF7在加入IPTG的诱导初期对大肠杆菌具有强烈的抑制作用。以上研究结果揭示三疣梭子蟹抗脂多糖因子及其亚型的分子基础、组织分布特点及对微生物的响应机制,为全面理解抗脂多糖因子及其亚型的结构和功能奠定了良好基础。
二、人类PKNOX_1基因一种新剪接型全长cDNA的克隆与表达分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人类PKNOX_1基因一种新剪接型全长cDNA的克隆与表达分析（论文提纲范文）
（1）水稻纹枯病菌中2个双分体病毒的基因组结构与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词及英汉对照表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 水稻纹枯病研究进展 |
| 1.1.1 水稻纹枯病及其病原菌 |
| 1.1.2 水稻纹枯病菌的致病机理 |
| 1.1.3 水稻纹枯病菌的防治 |
| 1.2 真菌病毒的研究进展 |
| 1.2.1 真菌病毒的主要类群 |
| 1.2.1.1 +ssRNA病毒 |
| 1.2.1.2 -ssRNA病毒 |
| 1.2.1.3 ssDNA病毒 |
| 1.2.1.4 dsRNA病毒 |
| 1.2.2 双分体真菌病毒 |
| 1.2.2.1 双分体真菌病毒的发展历程和分类 |
| 1.2.2.2 双分体真菌病毒与寄主的相互作用 |
| 1.2.2.3 双分体真菌病毒的转染和脱除 |
| 1.2.3 弱毒真菌病毒在植物病害生物防治中的应用 |
| 1.2.3.1 弱毒真菌病毒的发现 |
| 1.2.3.2 弱毒真菌病毒在植物病害生物防治中的应用 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 1.4 本研究的技术路线 |
| 第2章 水稻纹枯病菌中新的真菌病毒的筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 供试菌株与培养基 |
| 2.2.2 酶和其他试剂 |
| 2.2.3 仪器和设备 |
| 2.2.4 供试菌株的活化、培养与菌丝收集 |
| 2.2.5 真菌病毒筛选引物 |
| 2.2.6 Total RNA提取及c DNA合成 |
| 2.2.6.1 总RNA体取 |
| 2.2.6.2 模板cDNA的合成 |
| 2.2.7 RT-PCR的方法筛选目的菌株 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 总RNA提取及c DNA合成结果 |
| 2.3.2 RT-PCR筛选结果 |
| 2.3.2.1 以病毒RsV1片段1检测 |
| 2.3.2.2 以病毒RsV1片段2检测 |
| 2.3.2.3 以病毒RsPV2片段1检测 |
| 2.3.2.4 以病毒RsPV2片段2检测 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 水稻纹枯病菌A105中dsRNA全长cDNA克隆与序列分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株及培养基 |
| 3.2.2 载体和引物 |
| 3.2.3 酶及其他试剂 |
| 3.2.4 仪器和设备 |
| 3.2.5 全基因组cDNA克隆 |
| 3.2.5.1 病毒核酸的抽提 |
| 3.2.5.2 病毒核酸性质鉴定 |
| 3.2.5.3 病毒核酸样品的纯化 |
| 3.2.5.4 随机引物合成cDNA |
| 3.2.5.5 pMD18-T转化和阳性克隆的筛选 |
| 3.2.5.6 DsRNA末端序列的扩增 |
| 3.2.6 序列拼接及分析 |
| 3.2.7 病毒粒子提取与观察 |
| 3.2.8 SDS-PAGE凝胶的制备及病毒粒子结构蛋白的检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 A105 菌株中病毒的核酸类型和dsRNA的 c DNA合成 |
| 3.3.2 A105 菌株中两条dsRNA片段的全基因组序列 |
| 3.3.3 蛋白质序列比较和系统进化分析 |
| 3.3.4 病毒粒子的负染观察及核酸检测 |
| 3.3.5 病毒粒子结构蛋白 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 水稻纹枯病菌D122 菌株中dsRNA的全长c DNA克隆与序列分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 真菌菌株及培养基 |
| 4.2.2 载体和引物 |
| 4.2.3 酶及其他试剂 |
| 4.2.4 仪器和设备 |
| 4.2.5 全基因组cDNA克隆 |
| 4.2.5.1 病毒核酸的提取和dsRNA样品纯化 |
| 4.2.5.2 随机引物合成cDNA |
| 4.2.5.3 pMD18-T转化和阳性克隆的筛选 |
| 4.2.5.4 DsRNA末端序列的扩增 |
| 4.2.5.5 序列拼接及分析 |
| 4.2.6 D122菌株中的病毒粒子 |
| 4.2.6.1 病毒粒子提取与观察 |
| 4.2.6.2 病毒粒子核酸检测 |
| 4.2.7 Northern杂交 |
| 4.2.7.1 探针的制备和标记 |
| 4.2.7.2 定量标记反应效率 |
| 4.2.7.3 DsRNA样品的电泳 |
| 4.2.7.4 DsRNA的转膜和固定 |
| 4.2.7.5 Northern杂交 |
| 4.2.7.6 免疫检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 D122 菌株中病毒的核酸类型和病毒dsRNA的 c DNA合成 |
| 4.3.2 D122 菌株中两条dsRNA片段的全基因组序列结构分析 |
| 4.3.3 蛋白质序列比较和系统进化分析 |
| 4.3.4 病毒粒子的负染观察及核酸检测 |
| 4.3.5 RsRV5病毒粒子结构蛋白 |
| 4.3.6 D122菌株中病毒cDNA序列的验证 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 真菌病毒RsRV5的转染和脱除 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 供试菌株及其培养基 |
| 5.2.2 酶及试剂 |
| 5.2.3 仪器和设备 |
| 5.2.4 水稻纹枯病菌原生质体的制备 |
| 5.2.4.1 酶液的配制 |
| 5.2.4.2 菌丝体的培养 |
| 5.2.4.3 原生质体的制备 |
| 5.2.5 RsRV5的转染 |
| 5.2.5.1 对峙培养法转染 |
| 5.2.5.2 病毒粒子转染 |
| 5.2.6 RsRV5的脱除 |
| 5.2.6.1 菌丝尖端法 |
| 5.2.6.2 病毒抑制剂和菌丝尖端结合法 |
| 5.2.6.3 菌丝碎段法 |
| 5.2.6.4 原生质体再生法 |
| 5.2.7 病毒RsRV5的转染和脱除检测 |
| 5.2.8 RsRV5对寄主真菌的影响 |
| 5.2.8.1 衍生菌株D122-P培养性状的测定 |
| 5.2.8.2 衍生菌株D122-P致病力的测定 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 RsRV5的转染和脱除检测结果 |
| 5.3.2 衍生菌株D122-P生物学性状的测定 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 水稻纹枯病菌等基因系的带毒D122和不带毒D122-P的转录组分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 供试菌株和培养基 |
| 6.2.2 酶和其他试剂 |
| 6.2.3 仪器与设备 |
| 6.2.4 测序样品制备及Hiseq3000测序 |
| 6.2.4.1 总RNA提取与质量检测 |
| 6.2.4.2 文库构建 |
| 6.2.4.3 Hiseq3000测序 |
| 6.2.5 生物信息学分析 |
| 6.2.5.1 基因组注释整理及表达量分析 |
| 6.2.5.2 差异表达基因分析 |
| 6.2.5.3 差异表达GO富集分析和PATHWAY富集分析 |
| 6.2.5.4 差异表达基因聚类分析 |
| 6.2.5.5 可变剪切分析 |
| 6.2.5.6 SNV和 InDel分析 |
| 6.2.6 荧光定量qRT-PCR验证 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 总RNA质量检测 |
| 6.3.2 测序数据质量分析 |
| 6.3.2.1 数据质量统计 |
| 6.3.2.2 数据质量评估 |
| 6.3.3 与参考基因组比对分析 |
| 6.3.4 基因表达分析 |
| 6.3.5 RNA-seq整体质量评估 |
| 6.3.6 基因表达水平对比 |
| 6.3.7 基因差异表达分析 |
| 6.3.8 可变剪接分析 |
| 6.3.9 SNV/InDel在基因组功能区分布 |
| 6.3.10 荧光定量qRT-PCR验证 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 全文讨论与结论 |
| 7.1 关于水稻纹枯病菌中新dsRNA真菌病毒的快速有效筛选 |
| 7.2 关于水稻纹枯病菌A105 菌株中的dsRNA病毒及其分类 |
| 7.3 关于水稻纹枯病菌D122 菌株中的dsRNA病毒及其分类 |
| 7.4 关于水稻纹枯病菌D122 菌株中的dsRNA病毒与寄主真菌的互作 |
| 7.5 本研究的主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 本文中用到的部分试剂的配方 |
| 附录 B 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（2）BrYV与PEMV2协生互作的生物学、转录组学和小RNA表达谱研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 植物病原间协生互作的研究进展 |
| 1.2 植物病毒与病毒互作 |
| 1.3 病毒协生互作产生的影响 |
| 1.4 参与病毒协生互作的病毒因子 |
| 1.5 利用演化博弈论研究病毒协生 |
| 1.6 马铃薯卷叶病毒属病毒及其韧皮部局限特性 |
| 1.7 幽影病毒属病毒简介 |
| 1.8 黄症病毒科病毒与幽影病毒属病毒互作的研究进展 |
| 1.9 马铃薯卷叶病毒属病毒的分类研究概况 |
| 1.10 本论文研究意义与目的 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 溶液及培养基的配置 |
| 2.3 实验方法 |
| 第三章 BrYV与PEMV 2协生互作的生物学特征 |
| 3.1 BrYV与PEMV2在本生烟中存在协生互作 |
| 3.2 PEMV 2能使BrYV进行摩擦接种 |
| 3.3 BrYV与PEMV-2复合侵染时能突破韧皮部局限 |
| 3.4 探索BrYV病毒中参与BrYV与PEMV 2协生互作的蛋白 |
| 3.5 P0~(Br)、ORF3~(PE)和ORF4~(PE)转基因本生烟的培育 |
| 3.6 小结与讨论 |
| 第四章 BrYV与PEMV 2协生互作所引起的植物转录组变化特征分析 |
| 4.1 样品采集与转录组测序 |
| 4.2 差异表达基因的鉴定 |
| 4.3 差异表达基因的GO分析 |
| 4.4 差异表达基因的KEGG分析 |
| 4.5 光合作用相关基因的变化 |
| 4.6 乙烯相关基因的变化 |
| 4.7 植物防御相关基因的变化 |
| 4.8 RNA沉默相关基因的变化 |
| 4.9 转录因子的变化 |
| 4.10 蛋白翻译相关基因的变化 |
| 4.11 RT-qPCR验证转录组测序结果 |
| 4.12 本章小结与讨论 |
| 第五章 BrYV与PEMV 2协生互作引起siRNAs的变化特征 |
| 5.1 BrYV与PEMV 2协生互作时病毒siRNAs的特征 |
| 5.2 BrYV与PEMV 2协生互作时miRNAs的变化特征 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 第六章 Polerovirus新病毒的分子鉴定与序列分析 |
| 6.1 一种侵染豆科作物的Polerovirus新病毒的分子鉴定与序列分析 |
| 6.2 甜菜西方黄化病毒北京株系的分子鉴定与序列分析 |
| 6.3 本章小结与讨论 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录Ⅰ 联合培养期间的主要研究工作 |
| 附录Ⅱ 载体构建和检测所用引物 |
| 附录Ⅲ 病毒vsiRNA杂交所用引物 |
| 附录Ⅳ RT-qPCR相关引物 |
| 个人简历 |
（3）胃癌细胞中抑癌基因CDH1、hMLH1 pre-mRNA选择性剪接的遗传结构与表观遗传修饰机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 研究一 CDH1基因突变及表观修饰异常与胃癌细胞CDH1 pre-mRNA选择性剪接的关系研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 研究对象与方法 |
| 1.2.1 研究对象 |
| 1.2.2 主要仪器 |
| 1.2.3 主要试剂 |
| 1.2.4 外周血DNA提取 |
| 1.2.5 CDH1基因外显子9胚系突变筛查及测序鉴定 |
| 1.2.6 DNA亚硫酸氢盐修饰及测序 |
| 1.2.7 组织和细胞RNA提取及cDNA合成 |
| 1.2.8 RT-PCR检测CDH1基因外显子9突变对RNA影响 |
| 1.2.9 转录特异PCR TaqMan探针法分析CDH1外显子8-9区域不同转录产物表达水平 |
| 1.2.10 生物信息学 |
| 1.2.11 细胞培养及药物处理 |
| 1.2.12 RNA干扰 |
| 1.2.13 染色质免疫共沉淀 |
| 1.2.14 统计学方法 |
| 1.3 实验结果 |
| G (N432K)和c.1297G>A(D433N)'>1.3.1 胃癌患者中首报CDH1基因胚系突变c.1296C>G (N432K)和c.1297G>A(D433N) |
| G突变影响pre-mRNA剪接而导致CDH1外显子9的跳跃'>1.3.2 CDH1 c.1296 C>G突变影响pre-mRNA剪接而导致CDH1外显子9的跳跃 |
| 1.3.3 CDH1外显子8-9及其侧翼内含子序列的生物信息学分析 |
| 1.3.4 CDH1 1054del83异常剪接在胃癌中广泛存在 |
| 1.3.5 胃癌细胞系和人胃粘膜上皮细胞系中CDH1外显子8及周边外显子均呈现DNA高甲基化状态,未见DNA甲基化对CDH1选择性剪接的影响 |
| 1.3.6 胃癌细胞中CDH1外显子8区域降低的组蛋白乙酰化水平(H4K16ac和H3ac)与CDH1 1054del83异常剪接产物升高相关 |
| 1.3.7 胃癌细胞中CDH1外显子8区域升高的H3K36me3水平是CDH11054 del83异常剪接的特征 |
| 1.3.8 siSRSF2干扰未影响CDH1 1054del83异常剪接相对正常转录产物的比值 |
| 1.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究二 胃癌细胞中hMLH1基因pre-mRNA选择性剪接的遗传学与表观遗传学基础 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 研究对象与方法 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 外周血DNA提取 |
| 2.2.5 高分辨率溶解曲线法筛查hMLH1基因外显子18胚系突变 |
| 2.2.6 DNA亚硫酸氢盐修饰及测序 |
| 2.2.7 组织和细胞RNA提取及cDNA合成 |
| 2.2.8 RT-PCR分析hMLH1基因外显子10-11区域和外显子16-18区域RNA表达 |
| 2.2.9 转录特异PCR SYBR Green法分析hMLH1基因外显子10-11区域和外显子16-17区域不同转录产物 |
| 2.2.10 生物信息学 |
| 2.2.11 细胞培养及药物处理 |
| 2.2.12 RNA干扰 |
| 2.2.13 染色质免疫共沉淀 |
| 2.2.14 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| A (Q701K)胚系突变增加中国男性胃癌患病风险'>2.3.1 hMLH1基因c.2101C>A (Q701K)胚系突变增加中国男性胃癌患病风险 |
| A突变可能是hMLH1外显子18跳跃的原因'>2.3.2 hMLH1c.2101C>A突变可能是hMLH1外显子18跳跃的原因 |
| 2.3.3 hMLH1基因剪接位点的NNSPLICE软件分析结果 |
| 2.3.4 hMLH1基因外显子10-11和16-17区域广泛存在选择性剪接 |
| 2.3.5 胃癌细胞系和人胃粘膜上皮细胞系中hMLH1外显子10、11、16及17均呈现高甲基化状态,DNA甲基化未对hMLH1选择性剪接产生影响 |
| 2.3.6 胃癌细胞hMLH1基因外显子10-11区域降低的组蛋白乙酰化水平(H4K16ac和H3ac)与该区域跳跃相关,未见外显子16-17区域乙酰化水平与选择性剪接结局的直接关系 |
| 2.3.7 hMLH1基因外显子10-11及16-17区域降低的H3K36me3及H3K4me2水平与该区域跳跃相关 |
| 2.3.8 降低的剪接因子SRSF2水平与从hMLH1基因外显子10-11区域跳跃相关 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 博士研究生期间发表论文 |
| 致谢 |
（4）牙鲆（Paralichthys olivaceus）dazl基因的克隆、表达和功能初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 鱼类生殖细胞发育 |
| 1.2.1 鱼类的性别决定及相关因子 |
| 1.2.2 鱼类生殖细胞发育及相关因子 |
| 1.2.3 鱼类生殖细胞特异表达基因 |
| 1.3 RNA结合蛋白 |
| 1.3.1 RNA结合蛋白的结构特征 |
| 1.3.2 RNA结合蛋白的功能 |
| 1.4 DAZ家族研究进展 |
| 1.4.1 DAZ家族的结构特征 |
| 1.4.2 DAZ家族成员的进化关系 |
| 1.4.3 DAZ家族的相关研究 |
| 1.4.4 DAZ家族与人类疾病 |
| 1.5 硬骨鱼dazl表达与功能研究 |
| 1.6 本研究的主要内容和意义 |
| 1.6.1 本研究的主要内容 |
| 1.6.2 本研究的创新性和意义 |
| 第二章 牙鲆dazl基因及其可变剪接mRNA的鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 牙鲆dazl cDNA序列 |
| 2.3.2 牙鲆dazl DNA序列 |
| 2.3.3 牙鲆dazl两种可变剪接mRNA的鉴定 |
| 2.3.4 牙鲆dazl基因上游调控序列的预测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 关于实验方法 |
| 2.4.2 关于牙鲆dazl UTR的可变剪接 |
| 2.4.3 关于牙鲆dazl可变剪接的意义 |
| 2.4.4 本章小结 |
| 第三章 牙鲆DAZL的表达规律 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 牙鲆dazl mRNA在各组织的相对表达水平 |
| 3.3.2 牙鲆dazl两种mRNA在性腺的表达 |
| 3.3.3 牙鲆dazl两种mRNA在胚胎发育时期的表达 |
| 3.3.4 牙鲆dazl两种mRNA在性腺的定位 |
| 3.3.5 牙鲆dazl甲基化对其表达的调控 |
| 3.3.6 牙鲆DAZL两种蛋白在组织的表达 |
| 3.3.7 牙鲆DAZL两种蛋白在性腺的定位 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 关于实验方法 |
| 3.4.2 关于牙鲆dazl mRNA与蛋白的表达 |
| 3.4.3 本章小结 |
| 第四章 牙鲆DAZL两种蛋白的靶mRNA研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 免疫沉淀产物的RT-PCR检测 |
| 4.3.2 高通量测序结果 |
| 4.3.3 牙鲆DAZL两种蛋白的靶mRNA |
| 4.3.4 牙鲆dazl的两种mRNA可能是其蛋白产物的靶mRNA |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 关于实验方法 |
| 4.4.2 关于PODAZL的功能 |
| 4.4.3 本章小结 |
| 4.5 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 发表的学术论文 |
（5）番木瓜畸形花叶病毒检测鉴定及侵染性克隆构建与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 番木瓜环斑病毒的研究 |
| 1.1.1 PRSV的发现与地区分布 |
| 1.1.2 PRSV的病症与传播途径 |
| 1.1.3 PRSV的寄主范围与生物型 |
| 1.1.4 PRSV的生物学特征及基因结构与功能 |
| 1.2 番木瓜畸形花叶病毒的研究 |
| 1.2.1. PLDMV的发现与地区分布 |
| 1.2.2. PLDMV的病症与传播途径 |
| 1.2.3. PLDMV的寄主范围与生物型 |
| 1.2.4. PLDMV的生物学特征及基因结构 |
| 1.3 番木瓜花叶病毒的研究 |
| 1.3.1. PaMV的发现与地区分布 |
| 1.3.2. PaMV的病症与传播途径 |
| 1.3.3. PaMV的寄主范围及生物学特征 |
| 1.4 植物病毒的检测方法 |
| 1.4.1. 生物学检测法 |
| 1.4.2. 形态学检测法 |
| 1.4.3. 免疫学检测法 |
| 1.4.4. 分子生物学检测法 |
| 1.5 全长cDNA侵染性克隆研究进展 |
| 1.5.1. 体外转录cDNA侵染性克隆 |
| 1.5.2. 体内转录cDNA侵染性克隆 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料和病毒株 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 菌株及载体 |
| 2.1.4 培养基及主要试剂配方 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 植物总RNA的提取及纯度检测 |
| 2.2.2 机械摩擦接种PLDMV及体外转录产物 |
| 2.2.3 酵母感受态细胞的制备、转化及质粒提取 |
| 2.2.4 农杆菌化学转化感受态细胞的制备及转化 |
| 2.2.5 PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、回收、T/A克隆及测序与数据分析 |
| 2.2.6 cDNA第一链的合成及3'RACE |
| 2.2.7 5'RACE |
| 2.2.8 In-Fusion反应 |
| 2.2.9 番木瓜叶片总DNA和总蛋白的提取 |
| 2.2.10 Western blot分析检测GFP表达 |
| 2.2.11 番木瓜叶肉原生质体的分离及转化 |
| 2.2.12 PLDMV的鉴定及病症表现 |
| 2.2.13 PLDMV、PRSV和PaMV RT-LAMP可视化检测技术的建立 |
| 2.2.14 PLDMV、PRSV和PaMV的多重RT-PCR检测方法的建立 |
| 2.2.15 构建体外转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆pT7-FL |
| 2.2.16 构建含内含子的体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 2.2.17 体外转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的侵染性分析 |
| 2.2.18 酵母重组系统构建体内转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 2.2.19 体内转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆侵染性分析 |
| 2.2.20 酵母重组系统构建PLDMV-DF表达GFP的病毒表达载体 |
| 2.2.21 PLDMV-DF病毒表达载体的表达分析 |
| 2.2.22 植物ihpRNA表达载体在番木瓜原生质体中沉默效果的验证 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1. PLDMV的发现与病症 |
| 3.1.1 番木瓜叶片总RNA的质量检测 |
| 3.1.2 PLDMV的鉴定发现 |
| 3.1.3 PLDMV-DF在番木瓜、西葫芦及本生烟草上的病症表现 |
| 3.2. PLDMV-DF分离物全长基因组序列的测定 |
| 3.2.1. 构建pMD-A、pMD-B、pMD-C、pMD-D、pMD-E和pMD-F |
| 3.2.2. 5'/3'RACE及质粒pMD-5R和pMD-3R的构建 |
| 3.3. PLDMV-DF分离物全长基因组的结构分析 |
| 3.3.1. PLDMV-DF分离物全长基因组的序列和ORF结构分析 |
| 3.3.2. PLDMV-DF分离物ORF编码的多聚蛋白酶切位点分析 |
| 3.3.3. PLDMV-DF分离物的全长核苷酸和氨基酸的相似性分析 |
| 3.3.4. PLDMV-DF与Taiwan-CZ、Taiwan-KS、Japan-J56P进化树分析 |
| 3.4. PLDMV、PRSV和PaMV RT-LAMP可视化检测技术的建立 |
| 3.4.1. PLDMV、PRSV和PaMV RT-LAMP引物设计 |
| 3.4.2. PRSV RT-LAMP检测方法的最佳反应体系和反应条件 |
| 3.4.3. PLDMV RT-LAMP检测方法的最佳反应体系和反应条件 |
| 3.4.4. PaMV RT-LAMP检测方法的最佳反应体系和反应条件 |
| 3.4.5. PLDMV RT-LAMP的特异性与灵敏度分析 |
| 3.4.6. PRSV RT-LAMP的特异性与灵敏度分析 |
| 3.4.7. PLDMV、PRSV和PaMV RT-LAMP的特异性检测 |
| 3.5. PLDMV、PRSV和PaMV的多重RT-PCR检测方法的建立 |
| 3.5.1. 引物的特异性及多重RT-PCR最适引物对的筛选 |
| 3.5.2. 单一RT-PCR和多重RT-PCR反应体系及条件的优化 |
| 3.5.3. 单一PCR和多重PCR的灵敏度检测 |
| 3.5.4. 单一RT-PCR和多重RT-PCR对田间样品的检测应用 |
| 3.6. 构建无内含子的体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.6.1. 构建pMD-AB、pMD-CD、pMD-EF、pGEM-ABC和pGEM-DEF |
| 3.6.2. 构建无内含子的体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.7. 构建含内含子的体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.7.1. 马铃薯ST-LS1和菜豆NiR基因的内含子序列测定 |
| 3.7.2. 构建含intron 2的体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.7.3. 构建含intron IV2的体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.7.4. 构建含intron2/IV2体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.8. 体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的侵染性分析 |
| 3.8.1. PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的体外转录 |
| 3.8.2. 体外转录侵染性克隆的体外转录物接种与症状表现 |
| 3.8.3. 体外转录侵染性克隆体外转录物接种后的RT-PCR检测 |
| 3.8.4. 侵染性克隆pT7-FL-In2和pT7-FL-In2/IV2侵染后的内含子检测 |
| 3.9. 酵母重组系统构建体内转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.9.1. 构建体内转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.9.2. 构建含intron 2的体内转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.10. 体内转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的侵染性分析 |
| 3.10.1. PLDMV-DF的沉默抑制子HC-Pro瞬时表达载体的构建 |
| 3.10.2. 体内转录侵染性克隆农杆菌注射接种与症状表现 |
| 3.10.3. 体内转录侵染性克隆农杆菌注射接种后RT-PCR检测及侵染效率 |
| 3.11. 酵母重组系统构建PLDMV-DF的病毒表达载体 |
| 3.11.1. 构建PLDMV-DF的P1/HC-Pro之间插入GFP的病毒表达载体 |
| 3.11.2. 构建PLDMV-DF的NIb/CP之间插入GFP的病毒表达载体 |
| 3.12. PLDMV-DF病毒表达载体的表达分析 |
| 3.12.1. PLDMV-DF病毒表达载体的农杆菌注射接种与症状表现 |
| 3.12.2. PLDMV-DF病毒表达载体接种后的RT-PCR检测及侵染效率 |
| 3.12.3. PLDMV-DF病毒表达载体的农杆菌注射接种后GFP荧光检测 |
| 3.12.4. PLDMV-DF病毒表达载体的western blot分析 |
| 3.13. 4种不同长度CP基因植物ihpRNA表达载体的构建 |
| 3.14. 植物ihpRNA表达载体沉默效率的检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1. 番木瓜畸形花叶病毒海南东方分离物的鉴定 |
| 4.2. PLDMV-DF全长基因组序列的测定与解析 |
| 4.3. PLDMV、PRSV和PaMV RT-LAMP可视化检测技术的建立 |
| 4.4. PLDMV、PRSV和PaMV的多重RT-PCR检测方法的建立 |
| 4.5. 体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的构建与侵染性分析 |
| 4.5.1. 无内含子的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的构建与分析 |
| 4.5.2. 含内含子的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的构建与分析 |
| 4.6. 体内转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆与侵染性分析 |
| 4.7. 插入外源gfp报告基因的PLDMV-DF病毒表达载体的构建与表达 |
| 4.7.1. 在P1/HC-Pro之间插入gfp的病毒表达载体的构建与表达分析 |
| 4.7.2. 在NIb/CP之间插入GFP的病毒表达载体的构建与表达分析 |
| 4.8. 用GFP的病毒表达载体在原生质体中验证ihpRNA载体的沉默效率 |
| 研究结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）赤桉木质素单体合成途径的基因家族研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 廉价能源的衰落 |
| 1.1.2 我国对能源需求正在迅速上升 |
| 1.1.3 日益严重的全球气候变暖问题 |
| 1.1.4 开发“可持续性能源” |
| 1.2 生物质能源 |
| 1.2.1 从生物质转化为生物燃料 |
| 1.2.2 生物燃料的CO_2减排效果 |
| 1.2.3 生物燃料的分类 |
| 1.2.4 主要生物燃料的商业化研究进展 |
| 1.2.5 纤维素乙醇研究面临的科学挑战 |
| 1.3 植物木质素合成途径的研究 |
| 1.3.1 植物细胞壁中的木质素 |
| 1.3.2 木质素在植物体内的功能 |
| 1.3.3 木质素单体合成途径中的基因家族 |
| 1.3.4 桉树基因组学研究 |
| 1.4 如何确定“基因型对表型”的影响 |
| 1.4.1 插入诱变技术 |
| 1.4.2 TILLING-高通量点突变筛选方法 |
| 1.4.3 RNAi(RNA干扰) |
| 1.5 植物基因组编辑技术 |
| 1.5.1 可用于植物基因敲除系统的比较研究 |
| 1.5.2 CRISPR/Cas9基因组编辑技术 |
| 1.5.3 Cas9蛋白酶在真核生物上基因打靶的运用 |
| 1.6 目的意义及技术路线 |
| 1.6.1 目的和意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 第2章 赤桉木质素单体合成途径中的基因家族克隆研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 基因数据库来源 |
| 2.1.2 研究的前期工作 |
| 2.1.3 材料与试剂 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 木质素合成途径的基因挖掘 |
| 2.2.2 赤桉木质素单体合成基因的全长克隆 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 第3章 赤桉木质素单体合成基因的生物信息学研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 基因来源 |
| 3.1.2 生物信息学分析软件 |
| 3.1.3 生物信息学分析方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 家族成员的基因结构分析 |
| 3.2.2 家族成员的蛋白质功能结构域和基因进化分析 |
| 3.2.3 关键调控基因的蛋白质三维结构分析 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第4章 赤桉木质素单体合成关键基因的时空表达与可变剪接研究. |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料与试剂 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 赤桉调控木质素单体比例关键基因的时空表达分析 |
| 4.2.2 赤桉CCoAOMT1基因可变剪接的时空表达分析 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 4.3.1 赤桉调控木质素单体比例关键基因的时空表达 |
| 4.3.2 赤桉CCoAOMT1基因的可变剪切的时空表达情况 |
| 第5章 结论与创新点 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读学位期间的主要学术成果 |
| 致谢 |
（7）模拟酸雨胁迫下青花菜叶片的cDNA-AFLP差异表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 酸雨 |
| 1.1 酸雨的形成 |
| 1.2 我国的酸雨现状 |
| 1.3 酸雨对植物的影响 |
| 2 青花菜 |
| 2.1 青花菜逆境生理影响 |
| 2.2 青花菜分子生物学相关研究 |
| 3 cDNA-AFLP的技术应用 |
| 4 研究的内容和意义 |
| 第二章 模拟酸雨对青花菜幼苗生理指标、光合特性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 模拟酸雨的配制 |
| 1.2.2 胁迫处理青花菜 |
| 1.3 各项指标测定步骤 |
| 1.4 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 模拟酸雨对青花菜质膜透性的影响 |
| 2.2 模拟酸雨对青花菜MDA含量的影响 |
| 2.3 模拟酸雨对青花菜SOD活性的影响 |
| 2.4 模拟酸雨对青花菜CAT活性的影响 |
| 2.5 模拟酸雨对青花菜POD活性的影响 |
| 2.6 模拟酸雨对青花菜生物量的影响 |
| 2.7 模拟酸雨对青花菜光合速率和叶绿素荧关特性的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 模拟酸雨对青花菜质膜透性和MDA含量影响 |
| 3.2 模拟酸雨对青花菜抗氧化酶活性的影响 |
| 3.3 模拟酸雨对青花菜生物量的影响 |
| 3.4 模拟酸雨对青花菜光合速率和叶绿素荧关特性的影响 |
| 第三章 青花菜cDNA-AFLP体系获得和分析差异片段 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 模拟酸雨的配制 |
| 1.2.2 胁迫处理青花菜 |
| 1.2.3 cDNA-AFLP实验步骤 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 总RNA提取结果 |
| 2.2 预扩增结果 |
| 2.3 选择性扩增的引物组合筛选 |
| 2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果 |
| 2.5 差异条带二次扩增结果 |
| 2.6 测序结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 总RNA的提取 |
| 3.2 cDNA-AFLP |
| 3.3 所得差异表达基因的功能分析 |
| 3.3.1 能量和新陈代谢类基因 |
| 3.3.2 转录和翻译类基因 |
| 3.3.3 信号传导类基因 |
| 3.3.4 宿主防御类基因 |
| 3.3.5 光合作用类基因 |
| 3.3.6 膜和运输类基因 |
| 3.3.7 电子传递类基因 |
| 3.3.8 细胞壁水解类基因 |
| 3.3.9 功能未知类基因 |
| 第四章 青花菜β-1,4-木糖基转移酶IRX9HcDNA的克隆与分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 提取及检测总RNA |
| 1.2.2 cDNA的合成 |
| 1.2.3 β-1,4-木糖基转移酶IRX9H基因3'端扩增 |
| 1.2.4 β-1,4-木糖基转移酶IRX9H基因5'端扩增 |
| 1.2.5 序列拼接 |
| 1.2.6 开放性阅读框的克隆 |
| 1.2.7 β-1,4-木糖基转移酶IRX9H基因生物信息学分析 |
| 1.2.8 Real-timePCR反应 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 β-1,4-木糖基转移酶IRX9H的克隆 |
| 2.2 开放阅读框结果分析 |
| 2.3 β-1,4-木糖基转移酶IRX9H的生物信息学分析 |
| 2.4 模拟酸雨胁迫下的β-1,4-木糖基转移酶IRX9H的表达分析 |
| 3 讨论 |
| 第五章 青花菜ERF2转录因子cDNA的克隆与分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 提取及检测总RNA |
| 1.2.2 cDNA的合成 |
| 1.2.3 ERF2转录因子3'端扩增 |
| 1.2.4 ERF2转录因子5'端扩增 |
| 1.2.5 序列拼接 |
| 1.2.6 开放性阅读框的克隆 |
| 1.2.7 ERF2转录因子基因生物信息学分析 |
| 1.2.8 Real-timePCR反应 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ERF2转录因子的克隆 |
| 2.2 开放阅读框结果分析 |
| 2.3 ERF2转录因子的生物信息学分析 |
| 2.4 模拟酸雨胁迫下的ERF2转录因子的表达分析 |
| 3 讨论 |
| 第六章 青花菜NAC转录因子cDNA的克隆与分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 提取及检测总RNA |
| 1.2.2 cDNA的合成 |
| 1.2.3 NAC转录因子3'端扩增 |
| 1.2.4 NAC转录因子5'端扩增 |
| 1.2.5 序列拼接 |
| 1.2.6 开放性阅读框的克隆 |
| 1.2.7 NAC转录因子基因生物信息学分析 |
| 1.2.8 Real-timePCR反应 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 NAC转录因子的克隆 |
| 2.2 开放阅读框结果分析 |
| 2.3 NAC转录因子的生物信息学分析 |
| 2.4 模拟酸雨胁迫下的NAC转录因子的表达分析 |
| 3 讨论 |
| 第七章 青花菜谷胱甘肽-S-转移酶cDNA的克隆与分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 提取及检测总RNA |
| 1.2.2 cDNA的合成 |
| 1.2.3 GST3'端扩增 |
| 1.2.4 GST5'端扩增 |
| 1.2.5 序列拼接 |
| 1.2.6 开放性阅读框的克隆 |
| 1.2.7 GST基因生物信息学分析 |
| 1.2.8 Real-timePCR反应 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 GST的克隆 |
| 2.2 开放阅读框结果分析 |
| 2.3 GST的生物信息学分析 |
| 2.4 模拟酸雨胁迫下的GST的表达分析 |
| 3 讨论 |
| 第八章 结论 |
| 1 模拟酸雨对青花菜生理生化指标影响 |
| 2 模拟酸雨对青花菜生物量、光合和荧光特性影响 |
| 3 青花菜cDNA-AFLP体系获得和分析差异片段 |
| 4 青花菜β-1,4-木糖基转移酶IRX9HcDNA的克隆与分析 |
| 5 青花菜ERF2转录因子cDNA的克隆与分析 |
| 6 青花菜NAC转录因子cDNA的克隆与分析 |
| 7 青花菜谷胱甘肽-S-转移酶cDNA的克隆与分析 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 缩略词 |
| 论文发表情况 |
（8）犬瘟热病毒强毒株TM-CC反向遗传系统及表达犬细小病毒VP2蛋白重组犬瘟热弱毒株的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 犬瘟热概况 |
| 1.1.1 CDV病原学特性 |
| 1.1.2 麻疹病毒属病毒受体分子 |
| 1.1.3 CDV致病机理和CD临床症状 |
| 1.1.4 我国CDV流行现状及其病原生态学概况 |
| 1.2 CD的免疫与防治 |
| 1.3 负链RNA病毒反向遗传学技术 |
| 1.3.1 不分节段负链RNA病毒的复制和转录 |
| 1.3.2 负链RNA病毒反向遗传操作系统研究进展 |
| 1.3.3 负链RNA病毒反向遗传操作技术的建立 |
| 1.3.4 负链RNA病毒反向遗传操作系统及其应用研究 |
| 1.3.5 CDV病毒反向遗传操作系统及其应用研究 |
| 2 犬瘟热病毒TM-CC株全基因组序列分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病毒毒株与载体 |
| 2.1.2 全基因组测序及序列分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 全基因组cDNA序列拼接 |
| 2.2.2 全基因组cDNA序列分析及其同源性分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 犬瘟热病毒TM-CC株反向遗传操作系统的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒株、细胞与载体 |
| 3.1.2 主要试剂和仪器 |
| 3.1.3 引物设计 |
| 3.1.4 RT-PCR扩增各基因片段及各片段阳性质粒的克隆 |
| 3.1.5 辅助质粒构建 |
| 3.1.6 CDV-TM-CC全长基因组的构建 |
| 3.1.7 病毒拯救 |
| 3.1.8 间接免疫荧光对救获病毒的检测 |
| 3.1.9 Western blotting |
| 3.1.10 rCDV-TM-CC种毒的制备及滴定 |
| 3.1.11 病毒生长动力学曲线的测定 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 CDV-TM-CC野毒株基因组全长cDNA克隆和辅助质粒的构建 |
| 3.2.2 病毒拯救 |
| 3.2.3 间接免疫荧光检测拯救的病毒 |
| 3.2.4 Western blotting |
| 3.2.5 救获病毒体外生长特性 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 表达绿色荧光蛋白重组犬瘟热病毒TM-CC株病毒系统的构建及其生物学特性研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 病毒株、细胞与载体 |
| 4.1.2 主要试剂和仪器 |
| 4.1.3 引物设计与合成 |
| 4.1.4 表达EGFP外源基因片段的重组CDV基因组全长cDNA克隆的构建 |
| 4.1.5 病毒的拯救 |
| 4.1.6 救获病毒的序列鉴定 |
| 4.1.7 重组病毒rCDV-TM-CC-EGFP在VerodogSLAM细胞上生长特性 |
| 4.1.8 救获病毒免疫荧光检测 |
| 4.1.9 Western blotting |
| 4.1.10 种毒的制备及滴定 |
| 4.1.11 病毒生长动力学曲线的测定 |
| 4.1.12 重组病毒遗传稳定性的检测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 含有EGFP基因重组CDV基因组全长cDNA克隆的构建 |
| 4.2.2 病毒的拯救 |
| 4.2.3 重组病毒rCDV-TM-CC-EGFP在VerodogSLAM上感染特性 |
| 4.2.4 激光共聚焦检测拯救的病毒 |
| 4.2.5 Western blotting |
| 4.2.6 重组病毒体外生长特性 |
| 4.2.7 重组病毒遗传稳定性的检测 |
| 4.2.8 重组病毒H基因抗原表位差异性及表面静态可及性分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 表达CPV VP2蛋白的重组CDV/R-20/8株的构建及其生物学特性研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 病毒株与载体 |
| 5.1.2 主要试剂和仪器 |
| 5.1.3 引物设计与合成 |
| 5.1.4 CPV基因组DNA的提取 |
| 5.1.5 表达CPV VP2蛋白重组CDV/R-20/8基因组全长cDNA克隆的构建 |
| 5.1.6 表达CPV VP2蛋白的重组病毒CDV/R-20/8-VP2的拯救 |
| 5.1.7 间接免疫荧光检测拯救的病毒 |
| 5.1.8 Western blotting |
| 5.1.9 种毒的制备及滴定 |
| 5.1.10 病毒生长动力学曲线的测定 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 表达CPV VP2蛋白重组CDV/R-20/8基因组全长cDNA克隆的构建 |
| 5.2.2 表达CPV VP2蛋白重组CDV/R-20/8病毒的拯救 |
| 5.2.3 间接免疫荧光对重组病毒rCDV/R-20/8-VP2进行检测 |
| 5.2.4 Western blotting |
| 5.2.5 重组病毒rCDV/R-20/8-VP2体外生长特性 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）半滑舌鳎性别相关基因DAZL和WT1a的克隆与表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1 鱼类的生殖发育过程 |
| 1.1 鱼类生殖细胞的发育 |
| 1.2 性腺的分化 |
| 1.2.1 雌雄异体性腺的分化 |
| 1.2.2 雌雄同体或雌雄间性以及性别稳定性 |
| 2 鱼类性别决定系统 |
| 2.1 遗传性别的鉴定 |
| 2.2 多基因控制的性别决定 |
| 2.2.1 鱼类的性别比例 |
| 2.2.2 鱼类中的性逆转 |
| 3 DAZL基因和WT1a基因的结构及性别相关研究进展 |
| 3.1 DAZL基因的结构及性别相关研究进展 |
| 3.2 WT1a基因的结构及性别相关研究进展 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 性别鉴定及性腺分化早期的组织学观察 |
| 1 实验材料和试剂 |
| 1.1 实验材料及处理方法 |
| 1.2 实验所用主要试剂及试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 遗传性别 |
| 2.1.1 基因组DNA的提取 |
| 2.1.2 PCR反应 |
| 2.1.3 聚丙烯酰胺凝胶的制备及电泳 |
| 2.1.4 银染 |
| 2.2 生理性别的鉴定及性腺分化早期的组织学观察 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 遗传性别鉴定结果 |
| 3.2 生理性别鉴定结果 |
| 3.3 性别分化早期的组织学观察 |
| 4 讨论 |
| 4.1 遗传性别鉴定 |
| 4.2 生理性别鉴定 |
| 4.3 性别分化早期 |
| 第三章 半滑舌鳎DAZL基因的克隆及表达分析 |
| 1 实验材料和试剂 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 耗材和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 总RNA的提取、cDNA的合成以及仔鱼性腺部位的获得 |
| 2.1.1 总RNA的提取 |
| 2.1.2 cDNA的合成 |
| 2.1.3 仔鱼性腺部位的获得 |
| 2.1.4 仔鱼伪雄鱼的鉴定 |
| 2.2 半滑舌鳎DAZL基因的全长cDNA克隆及序列分析 |
| 2.2.1 DAZL基因全长cDNA克隆 |
| 2.2.2 巢式PCR验证序列 |
| 2.2.3 序列分析 |
| 2.3 荧光实时定量PCR |
| 3 实验结果 |
| 3.1 RNA提取和仔鱼性腺部位精确获取结果 |
| 3.2 半滑舌鳎DAZL基因序列分析 |
| 3.2.1 半滑舌鳎DAZL基因序列特征及其编码的蛋白结构分析 |
| 3.2.2 DAZL基因同源性分析 |
| 3.3 荧光实时定量PCR |
| 3.3.1 DAZL基因在半滑舌鳎胚胎发育各时期的表达 |
| 3.3.2 DAZL基因在半滑舌鳎仔鱼性腺中的表达 |
| 3.3.3 DAZL基因在半滑舌鳎各组织中的表达 |
| 4 讨论 |
| 第四章 半滑舌鳎WT1a基因的克隆及表达分析 |
| 1 实验材料和试剂 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 DNA和总RNA的提取、cDNA的合成以及仔鱼性腺部位的获得 |
| 2.2 半滑舌鳎WT1a基因的全长cDNA克隆及序列分析 |
| 2.2.1 WT1a基因全长cDNA克隆与验证 |
| 2.2.2 序列分析 |
| 2.3 荧光实时定量PCR |
| 3 实验结果 |
| 3.1 半滑舌鳎 WT1a 基因序列特征及其编码的蛋白结构分析 |
| 3.2 WT1a 基因同源性分析 |
| 3.3 荧光实时定量PCR |
| 3.3.1 WT1a基因在半滑舌鳎胚胎发育各时期的表达 |
| 3.3.2 WT1a基因在半滑舌鳎仔鱼性腺中的表达 |
| 3.3.3 WT1a基因在半滑舌鳎各组织中的表达 |
| 4 跨膜螺旋区域的验证 |
| 5 讨论 |
| 5.1 WT1 基因的结构分析 |
| 5.2 WT1 基因荧光实时定量表达 |
| 第五章 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 发表的学术论文 |
（10）三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）cDNA文库构建、EST分析及抗脂多糖因子研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 三疣梭子蟹病害研究现状 |
| 第二节 甲壳动物的免疫防御机制 |
| 一、细胞免疫 |
| 1. 吞噬作用 |
| 2. 包囊作用 |
| 3. 结节形成 |
| 二、体液免疫 |
| 1. 免疫识别 |
| 2. 酚氧化酶原激活系统 |
| 3. 抗氧化防御系统 |
| 4. 抗菌肽 |
| 第三节 抗脂多糖因子的研究进展 |
| 一、抗脂多糖因子的发现 |
| 二、甲壳动物抗脂多糖因子的研究 |
| 三、抗脂多糖因子的应用前景 |
| 第四节 分子生物学技术的应用 |
| 一、cDNA文库构建和EST分析 |
| 二、基于荧光实时定量PCR的基因表达分析 |
| 三、基因的体外重组表达和功能验证 |
| 四、基因单核苷酸多态性分析 |
| 第五节 本研究的目的和意义 |
| 第二章 三疣梭子蟹血细胞和眼柄cDNA文库构建及EST分析 |
| 第一节 三疣梭子蟹血细胞和眼柄cDNA文库的构建 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 1. 三疣梭子蟹血细胞cDNA文库 |
| 2. 三疣梭子蟹眼柄cDNA文库 |
| 四、讨论 |
| 第二节 三疣梭子蟹血细胞和眼柄cDNA文库的EST分析 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 1. 三疣梭子蟹血细胞EST数据分析 |
| 2. 三疣梭子蟹眼柄EST数据分析 |
| 四、讨论 |
| 第三节 三疣梭子蟹免疫相关基因的注释及分析 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 1. 免疫相关基因分类 |
| 2. 两种组织中共有的免疫相关基因 |
| 3. 免疫基因的多种蛋白亚型分析 |
| 四、讨论 |
| 第三章 三疣梭子蟹抗脂多糖因子研究 |
| 第一节 三疣梭子蟹抗脂多糖因子7 种亚型的cDNA克隆和分析 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 1.P tALF1-3 基因的cDNA克隆和序列分析 |
| 2.P tALF4 基因的cDNA克隆和序列分析 |
| 3.P tALF5 基因的cDNA克隆和序列分析 |
| 4.P tALF6 基因的cDNA克隆和序列分析 |
| 5.P tALF7 基因的cDNA克隆和序列分析 |
| 6.P tALF1-7 基因的同源性分析 |
| 四、讨论 |
| 第二节 三疣梭子蟹抗脂多糖因子7 种亚型的基因组结构研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 1.P tALF1-3 基因组序列的克隆和分析 |
| 2.P tALF4 基因组序列的克隆和分析 |
| 3.P tALF5 基因组序列的克隆和分析 |
| 4.P tALF6 基因组序列的克隆和分析 |
| 5.P tALF7 基因组序列的克隆和分析 |
| 四、讨论 |
| 第三节 三疣梭子蟹PtALF1-3 和PtALF7 基因多态性初步分析 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 1.P tALF1-3 基因多态性分析 |
| 2.P tALF7 基因多态性分析 |
| 四、讨论 |
| 第四节 三疣梭子蟹抗脂多糖因子7 种亚型的组织表达特异性分析 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 1.P tALF1-3 基因的组织表达特异性分析 |
| 2.P tALF4 基因的组织表达特异性分析 |
| 3.P tALF5 基因的组织表达特异性分析 |
| 4.P tALF6 基因的组织表达特异性分析 |
| 5.P tALF7 基因的组织表达特异性分析 |
| 四、讨论 |
| 第五节 三疣梭子蟹抗脂多糖因子7 种亚型弧菌刺激后的时序表达分析 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 1.P tALF1-3 基因在弧菌刺激后时序表达分析 |
| 2.P tALF4 基因在弧菌刺激后时序表达分析 |
| 3.P tALF5 基因在弧菌刺激后时序表达分析 |
| 4.P tALF6 基因在弧菌刺激后时序表达分析 |
| 5.P tALF7 基因在弧菌刺激后时序表达分析 |
| 四、讨论 |
| 第六节 三疣梭子蟹PtALF3、PtALF5 和PtALF7 基因的原核重组表达 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 1.P tALF5 基因的原核重组表达和活性鉴定 |
| 2.P tALF3 和PtALF7 基因的原核重组表达 |
| 四、讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表文章 |
| 致谢 |
四、人类PKNOX_1基因一种新剪接型全长cDNA的克隆与表达分析（论文参考文献）
- [1]水稻纹枯病菌中2个双分体病毒的基因组结构与功能研究[D]. 张美玲. 华南农业大学, 2018(02)
- [2]BrYV与PEMV2协生互作的生物学、转录组学和小RNA表达谱研究[D]. 周翠姬. 中国农业大学, 2017(05)
- [3]胃癌细胞中抑癌基因CDH1、hMLH1 pre-mRNA选择性剪接的遗传结构与表观遗传修饰机制研究[D]. 李小薇. 南京大学, 2015(04)
- [4]牙鲆（Paralichthys olivaceus）dazl基因的克隆、表达和功能初步研究[D]. 姜佳君. 中国海洋大学, 2015(07)
- [5]番木瓜畸形花叶病毒检测鉴定及侵染性克隆构建与应用[D]. 庹德财. 海南大学, 2015(07)
- [6]赤桉木质素单体合成途径的基因家族研究[D]. 谷振军. 中南林业科技大学, 2014(01)
- [7]模拟酸雨胁迫下青花菜叶片的cDNA-AFLP差异表达分析[D]. 高世超. 福建农林大学, 2014(05)
- [8]犬瘟热病毒强毒株TM-CC反向遗传系统及表达犬细小病毒VP2蛋白重组犬瘟热弱毒株的构建[D]. 李维克. 东北林业大学, 2014(01)
- [9]半滑舌鳎性别相关基因DAZL和WT1a的克隆与表达分析[D]. 张红. 中国海洋大学, 2013(03)
- [10]三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）cDNA文库构建、EST分析及抗脂多糖因子研究[D]. 刘媛. 中国科学院研究生院（海洋研究所）, 2011(11)