一、SMMC-7721细胞诱导耐药培养中电镜形态的改变（论文文献综述）
武静桥[1]（2021）在《共表达Apoptin与MEL基因重组腺病毒的构建及其对肝癌抑制作用研究》文中研究指明肝细胞癌（HCC）异质性、死亡率和转移程度高,以血管增生为主要特征。早期患者临床症状不明显,晚期难以治愈,临床治疗较为棘手。人和动物患病率都逐年升高,耐药现象不断增加,因此,具靶向性的基因治疗成为肝癌治疗的研究热点。HIV反式激活转录（TAT）蛋白,源自人类HIV病毒TAT蛋白,可穿透细胞膜,促进大分子物质进入细胞质;Apoptin诱导的细胞凋亡受到Bcl-2和Apaf-1凋亡小体的调控,通过激活凋亡小体和Bcl-2调节的死亡途径,同时激活自噬和线粒体凋亡途径特异性诱导肿瘤细胞凋亡;肿瘤归巢肽RGD能够识别存在于癌细胞表面的整联蛋白,特异性靶向肿瘤的血管区;MEL通过与细胞膜结合,形成跨膜环状孔而使细胞膜破坏,细胞中的物质泄漏,细胞膜通透性增加,最终导致细胞溶解。本课题选择凋亡素Apoptin与蜂毒肽MEL作为肝癌靶向治疗基因,借助腺病毒作为载体,高效传递至靶细胞。将穿膜肽TAT与Apoptin融合表达,促进裂解的肝癌细胞中Apoptin蛋白二次内化进癌细胞;以靶向肽RGD靶向肝癌血管中的整合素受体,使其与MEL融合表达,引导MEL特异性杀伤肿瘤细胞,减轻对正常组织的非特异性损伤。共表达Apoptin与MEL基因,利用Apoptin以线粒体凋亡和自噬特异性诱导杀伤肿瘤细胞,同时,结合MEL溶解癌细胞的细胞膜、破坏细胞的完整结构特性,实现双基因协调抑瘤的目的,为肝癌的基因靶向治疗奠定基础。试验中将pMD-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL基因片段利用高保真特异性扩增,无缝克隆连接至线性化的GV314,构建腺病毒穿梭载体GV-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL。将腺病毒穿梭载体与大骨架质粒共转染至HEK293A细胞,包装纯化获得的重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin滴度为1010.75 pfu/m L,Ad-RGD-MEL的滴度为1010.38 pfu/m L,TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL的滴度为1010.25 pfu/m L,Ad-EGFP的滴度为1011 pfu/m L。将各重组腺病毒分别侵染SMMC-7721细胞,间接免疫荧光和Western Blotting检测到肝癌细胞中目的基因成功表达;重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL增加了活性氧的表达含量,促使细胞核DNA碎片化;重组腺病毒对L-02无显着抑制作用,对SMMC-7721与Huh 7细胞抑制作用呈现时间和剂量依赖性;流式细胞术检测1000 MOI重组腺病毒侵染SMMC-7721细胞36 h后,与对照组相比,Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL的早期和晚期凋亡率均存在极显着升高（P<0.01）;重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL极显着抑制SMMC-7721细胞的迁移,极显着抑制FBS介导的SMMC-7721细胞的侵袭和趋化作用（P<0.01）。重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL能够延缓裸鼠体重下降趋势;Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL组靶向性强,对正常组织器官损伤小,同时诱导肿瘤与肝脏中Caspase3和P53蛋白表达,凋亡细胞数增多。本实验成功包装了重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL,体外试验结果证实重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL能够显着抑制SMMC-7721的增殖、迁移和侵袭。经异位瘤模型验证,重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL治疗组肿瘤中P53、Casepase3蛋白表达量增加,延缓裸鼠体重下降趋势,对正常组织无明显杀伤作用。综上所述,本试验表明重组腺病毒Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL能够靶向抑制肝癌细胞,为比较医学和肿瘤靶向治疗提供理论基础。
李惠兰[2]（2021）在《新型NO供体聚合物紫杉醇胶束的制备及抗肿瘤作用和机制研究》文中研究说明目的:设计与合成NO供体（mPEG-PLA-NO）型可生物降解的聚合物胶束包载紫杉醇作为纳米药物输送系统（NO/PTX）,旨在增强紫杉醇的溶解度,降低毒性和增强抗肿瘤活性,并对其进行急性毒性研究,药物动力学研究,抗肿瘤的作用和机制研究以及药性评价,为新药开发提供依据。方法:第一部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束的制备和表征选用呋咱型一氧化氮供体,采用活性酸酐法制备了m PEG-PLA-NO两亲性聚合物胶束,采用核磁共振谱（1H NMR）,凝胶渗透色谱仪对m PEG-PLA-NO进行分析。采用自乳化法制备包载紫杉醇于聚合物胶束内核的一氧化氮供体型聚合物紫杉醇纳米胶束（NO/PTX）,采用透射电镜,马尔文激光散射粒度仪对NO/PTX进行形态表征。采用高效液相法对药物载药量和包封率进行了检测和计算。采用Greiss法测定NO/PTX体外一氧化氮的释放。第二部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束急性毒性研究SPF级昆明小鼠60只,适应喂养3 d后,分为m PEG-PLA组和m PEG-PLA-NO组。从800 mg/kg剂量开始,以20 m L/kg的给药体积进行尾静脉注射m PEG-PLA或m PEG-PLA-NO,每个剂量组最少6只小鼠。计算出LD50,进行载药材料安全性评价。另取SPF级昆明小鼠120只,适应喂养3 d后,分为PTX组,NO/PTX组,每组KM小鼠40只,禁食不禁水,称重标记。进行PTX组与NO/PTX组的急性毒性比较。按照15、30、45、60、75 mg/kg浓度梯度尾静脉注射的紫杉醇。在确定Dn和Dm后,根据给药间隔i,以i或i的倍数确定3-5个给药剂量。每个剂量至少5只小鼠,观察,记录状态和死亡情况。计算出LD50,进行药物安全性的比较。观察,记录状态和死亡情况。并且连续观察14 d内小鼠的体重变化,以及毛色、四肢活动、进食、饮水、排泄等情况,并记录各组有无中毒情况出现,以及是否有死亡情况。第三部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束药物动力学研究采用H22细胞建立的雄性KM小鼠异种移植模型,研究了药代动力学和组织分布,以描述NO/PTX在体内的分布。通过尾静脉给小鼠注射盐水中的PTX（20 mg/kg,以紫杉醇计算）或NO/PTX（50 mg/kg,以紫杉醇计算）溶液。在0、0.05、0.5、1、2、3、4、8、12和24 h收集血浆和肿瘤。在每个采样时间点,用乙醚麻醉3至4只小鼠,并通过心脏穿刺从每只小鼠收集血液。然后,处死这些小鼠并收集所有肿瘤。离心后,从每只小鼠收集约100μL血浆并冷冻。通过HPLC测定血浆和肿瘤中PTX的浓度,并以多西紫杉醇为内标,通过HPLC-MS/MS测定心脏,肝脏,脾脏,肺和肾脏中PTX的浓度。使用DAS 2.0软件包（中国药理学会）通过房室分析处理药代动力学参数。第四部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束体外抗肿瘤细胞及对P-gp蛋白的影响体外培养SMMC-7721,SCG-7901,SW480,Sk-ov-3,A549,Bel-7402,HCT-116,MCF-7,Hela,HEPG-2,HT29和NCI-H460共12株人源性肿瘤细胞,采用MTT法检测PTX和NO/PTX对肿瘤细胞的抑制率,并计算半效抑制浓度IC50,实验至少重复3次。体外培养SMMC-7721,SCG-7901,SW480,Sk-ov-3,A549,Bel-7402,HCT-116,MCF-7,Hela,HEPG-2,HT29和NCI-H460共12株人源性肿瘤细胞,采用Western blotting检测PTX和NO/PTX干预后,外排蛋白P-gp蛋白的表达。第五部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束抗结肠癌和紫杉醇耐药性结肠癌作用机制研究通过体外培养人HCT116细胞,PTX,NO/PTX或不含一氧化氮供体的聚合物紫杉醇胶束（PTX Nano）干预24 h后,采用Hoechest/PI染色,倒置荧光显微镜观察细胞数量和形态;流式细胞术观察PTX,NO/PTX对HCT116细胞周期的影响;细胞划痕实验检测PTX,NO/PTX对细胞迁移的影响;Western Blot检测与细胞凋亡和增殖迁移相关蛋白的表达。通过体外培养人HCT116细胞和Taxol/HCT116细胞,倒置荧光显微镜观察两者细胞形态差异;CCK8实验检测PTX和NO/PTX对HCT116细胞和Taxol/HCT116细胞增殖的影响,并计算IC50值和Taxol/HCT116细胞的耐药指数;Western blotting检测HCT116与Taxol/HCT116细胞P-gp蛋白的表达差异以及PTX、NO/PTX对Taxol/HCT116细胞紫杉醇耐药关键蛋白P-gp蛋白和β3-Tublin蛋白的表达。第六部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束抗肝癌作用机制研究通过体外培养人Bel-7402细胞,CCK8检测PTX和NO/PTX对Bel-7402细胞的抑制作用。采用Hoechst 33258染色观察细胞形态和数量。建立H22肝癌小鼠模型,分为空白组,m PEG-PLA组和m PEG-PLA-NO组,给药3次,每次间隔72 h,末次给药后72 h取瘤,称量瘤重计算抑瘤率（%）,观察m PEG-PLA和m PEG-PLA-NO干预后对各移植瘤的影响。通过建立H22肝癌小鼠模型,通过尾静脉注射PTX,Genexol?-PM和NO/PTX,并以生理盐水作为对照。同样给药3次,每次间隔72 h,末次给药后72 h取瘤,称量瘤重计算抑瘤率（%）,观察PTX和NO/PTX干预后对各移植瘤的影响。通过体外培养人Bel-7402细胞,给与PTX和NO/PTX 48 h后,提取Bel-7402细胞蛋白质,采用试剂盒检测细胞内SOD、MDA和GSH-PX水平。流式细胞术观察PTX和NO/PTX对细胞Bel-7402凋亡检测。Western Blot检测NO/PTX对于铁死亡,焦亡,内质网应激相关蛋白的作用。第七部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束药性评价SD大鼠40只,分为空白组,PTX组,NO/PTX组,PTX Nano组。每组10只。每三天给药一次,共给药七次。检测大鼠体温和体重变化,安捷伦1290串联6460三重四级杆质谱仪检测大鼠尿液代谢组。正交偏最小二乘（OSC-PLS-DA）分析数据,进行药性判别。结果第一部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束的制备和表征制备并合成了m PEG-PLA-NO,核磁共振谱（1H NMR）结构确证其分子结构,凝胶渗透色谱仪（GPC）分析m PEG-PLA的PDI为1.19,m PEG-PLA-NO的PDI为1.13。制备了聚合物胶束NO/PTX,粒径为30±0.58 nm,zeta电位为-2.76±0.25。透射电镜结果表明NO/PTX呈球形,分布均匀。NO/PTX的包封率为98.6%,NO/PTX的紫杉醇载药量4.69%。Greiss法测定一氧化氮释放率,结果表明,与硝酸甘油和PTX相比,NO/PTX在10 h内具有良好的释放性能,在6 h内释放率最高,达到66.8%。第二部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束急性毒性研究通过CALC 2.0软件和BLISS方法确定半数致死量(LD50)和最大非致死剂量（MNLD）。m PEG-PLA和m PEG-PLA-NO的MNLD分别为2000 mg/kg和1500 mg/kg,表明m PEG-PLA和m PEG-PLA-NO均为无毒两亲性共聚物。PTX的最大耐受剂量LD0为36.3 mg/kg,绝对致死剂量LD100为45 mg/kg。NO/PTX的最大耐受剂量LD0为80 mg/kg,绝对致死剂量LD100为160 mg/kg。KM小鼠中PTX和NO/PTX的LD50分别为39.9 mg/kg和137.1 mg/kg。NO/PTX的急性毒性比PTX降低了3.43倍。第三部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束药物动力学研究血清样品预处理后,其中的内源性物质不干扰紫杉醇和内标的测定。在此色谱条件下血浆中多西紫杉醇、紫杉醇的保留时间分别为19.43 min和22.08 min。按照加权最小二乘法计算线性关系式为:Y=0.0618X-0.0648（R2=0.9986）,（n=3）表明血浆紫杉醇的质量浓度在0.5～150μg/m L内线性关系好。按照加权最小二乘法计算线性关系式为:Y=0.0783X-0.2581（R2=0.9961）,（n=3）表明肿瘤组织紫杉醇的质量浓度在1～150μg/m L内线性关系好。紫杉醇浓度由高到低逐渐稀释,测定出最低检测限紫杉醇浓度为0.25μg/m L,最低定量限血浆紫杉醇浓度为0.5μM/m L,肿瘤组织为1μg/m L,准确度均在85%-115%之间,精密度RSD均小于15%。血浆提取回收率分别为103.2%,99.4%,95.7%,肿瘤提取去回收率分别为112.0%,95.2%,95.5%。内标提取回收率为92.55%。小鼠尾静脉注射PTX或NO/PTX后在体内的代谢与二室模型相符。小鼠尾静脉注射50 mg/kg剂量的NO/PTX后,获得的峰值血浆浓度(Cmax)为105.2μg/m L,尾静脉注射20 mg/kg剂量的PTX后,Cmax为71.7μg/m L。PTX的消除半衰期(t1/2β)1.5 h,NO/PTX的t1/2β为1.7 h。NO/PTX和PTX的血浆浓度-时间曲线下的面积(AUC（0-∞）)分别为128.1μg.h/m L和86.9μg.h/m L/kg。NO/PTX的AUC（0-∞）是PTX的1.35倍。在给药用后,紫杉醇广泛分布于大多数组织中。其中,在肿瘤中明显发现了最高的紫杉醇浓度。在所有时间点,肿瘤中NO/PTX组的紫杉醇浓度均高于PTX组,并在3 h左右达到最大紫杉醇浓度。除肿瘤外的各组织器官中紫杉醇的浓度较低,在KM小鼠组织器官中,紫杉醇最高浓度低于10μg/m L,大部分在24 h以后消除完全。给药后（3 min以后）,PTX在组织器官中分布顺序为:肿瘤>肾>肺>心>脾>肝,NO/PTX在各组织器官中分布顺序为:肿瘤>肺>肾>心>脾>肝。第四部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束体外抗肿瘤细胞及对P-gp蛋白的影响本实验采MTT法对12种人源性肿瘤细胞进行药效学研究,实验均最少重复三次。结果显示NO/PTX在人乳腺癌细胞MCF-7,人胃腺癌细胞SCG-7901,人结肠癌细胞SW480,人结直肠腺癌细胞HCT-116,人肝癌细胞Bel-7402的IC50值较国产紫杉醇注射液低,表明其抗肿瘤效果优于国产紫杉醇注射液。电泳显色结果显示,在紫杉醇0.01μg/mL的浓度下,NO/PTX组Bel-7402细胞SW480细胞,Hela细胞,SMMC-7721细胞,HCT-116细胞,Hep G2细胞,MCF-7细胞,HT29细胞,SCG-7901细胞的P-gp蛋白表达量低于PTX组,表明NO/PTX增强紫杉醇抗肿瘤效果可能与抑制P-gp蛋白相关。第五部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束抗结肠癌和紫杉醇耐药性结肠癌作用机制研究首先,通过Hoechst/PI染色,可以更直观的观察到NO/PTX较PTX具有更好的抗结肠癌HCT116作用。通过细胞周期实验,我们检测到NO/PTX在0.001μg/m L和PTX 0.01μg/m L两个浓度对细胞G2M期的抑制作用均大于PTX（NO/PTX抑制率为39.6%和50%,PTX为30.2%和36.3%）。Western Blot检测结果表明,NO/PTX较空白组,PTX组更能够降低HCT116细胞P-gp蛋白的表达。Western Blot检测同时表明,NO/PTX较空白组和PTX组,能够增加促凋亡蛋白BAX表达,降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达,升高BAX/Bcl-2的比值,增加Cleaved Caspase 3的表达,显示出比市售紫杉醇注射液PTX更好的抗人结肠癌HCT116的结果。无一氧化氮供体的聚合物紫杉醇纳米胶束PTX Nano较空白组和PTX组,也能够降低HCT116细胞P-gp蛋白和增加Cleaved Caspase 3的表达,但降低P-gp蛋白和增加Cleaved Caspase 3的表达的作用比不上NO/PTX。PTX Nano证明m PEG-PLA聚合物胶束具有一定的抗肿瘤制剂优势,同时表明NO/PTX抗肿瘤作用不仅仅是因为制剂优势,还是紫杉醇与一氧化氮供体双重阻断的结果。其次,细胞划痕实验表明,NO/PTX较空白组和PTX组具有更好的抗HCT116细胞增殖迁移的能力。Western Blot检测结果表明,NO/PTX降低Vimentin蛋白表达,增加ZO-1蛋白表达,降低β3-Tublin和p-GSK-3β表达。PTX Nano较NO/PTX显示出更好的降低Vimentin蛋白表达,增加ZO-1蛋白表达能力,然而对于没有显示出降低β3-Tublin和p-GSK-3β表达作用。再者,NO/PTX抗结肠癌肿瘤优势还体现在对于结肠癌耐药细胞具有更好的抗肿瘤作用。我们首先对耐紫杉醇人结肠癌细胞Taxol/HCT116细胞的细胞形态,耐药稀释和P-gp蛋白表达进行了研究。确认Taxol/HCT116细胞较HCT116细胞具有强的紫杉醇耐药性。CCK8实验分析PTX和NO/PTX对taxol/HCT116细胞的增殖的影响,结果表明NO/PTX(IC50:1.2±0.4μg/m L)的IC50显着低于PTX(IC50:5.6±1.9μg/m L),NO/PTX具有比PTX低至4.66倍的IC50值,表明NO/PTX较PTX具有更加显着的抗结肠癌耐药性作用。Western Blot检测结果表明,NO/PTX较空白组和PTX组,显着降低了紫杉醇耐药性的关键蛋白P-gp蛋白和β3-tublin蛋白的表达。第六部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束抗肝癌作用机制研究首先,我们用CCK8检查了NO/PTX和PTX对肝癌Bel-7402细胞的影响。PTX的IC50为7.8±0.4μg/m L,NO/PTX IC50为3.7±1.1μg/m L。这些结果表明,NO/PTX对Bel-7402细胞的毒性比PTX强。用Hoechst 33258染色法检测各组细胞凋亡情况有相同结论。其次,本部分首先制备了H22肝癌荷瘤小鼠模型,实验结果表明,聚合物m PEG-PLA没有显示任何抗肿瘤反应,在m PEG-PLA-NO组中观察到轻微的抗肿瘤作用。在PTX,Genexol?-PM和NO/PTX组中观察到了显着的抗肿瘤活性。PTX,Genexol?-PM和NO/PTX组在低剂量（10 mg/kg）下显示出可比的抗肿瘤活性（抑制率分别为39%,36%和41%）。此外,当剂量达到15 mg/kg时,NO/PTX的抗肿瘤作用明显强于PTX和Genexol?-PM组（PTX,Genexol?-PM和NO/PTX组分别为53%,41%和67%）,证明NO和紫杉醇的协同作用增强了抗肿瘤活性。此外,我们阐明了NO/PTX诱导肝癌细胞死亡是由铁死亡,焦亡,内质网应激（ERS）和凋亡相关网络介导的。NO/PTX通过增加活性氧（ROS）和丙二醛的水平,并降低谷胱甘肽过氧化物酶,超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶4的水平引起铁死亡。使用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1或ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸会降低NO/PTX的抗癌活性。此外,NO/PTX上调了caspase-1的表达,下调了炎性细胞因子IL-1β,这是细胞焦亡的关键蛋白。此外,NO/PTX上调了一系列调节剂的表达,例如钙结合蛋白,需肌醇酶1a（IRE1a）,葡萄糖调节蛋白78（GRP78）,cleaved-caspase-7,cleaved-caspase-3和降低的B-细胞淋巴瘤2（BCL-2）,核NF-κB,可诱导Bel-7402内质网介导的应激和凋亡。更重要的是,我们证明了NO/PTX增强的抗肿瘤作用可能与下调多药耐药转运蛋白P-gp蛋白,β3-微管蛋白,致敏紫杉醇化疗有关。最后,我们通过流式细胞仪,紫杉醇干预48 h后,检测了Bel-7402细胞凋亡率。NO/PTX在各浓度的凋亡率均高于PTX,表明NO/PTX较PTX具有更好的抗Bel-7402细胞作用。第七部分一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束药性评价PTX组,NO/PTX组和PTX Nano组均位于寒性药区域,无明显的差异。表明PTX,NO/PTX和PTX Nano均属于寒性药,通过制剂手段制备成聚合物紫杉醇胶束或者连接供体的聚合物紫杉醇胶束,均没有改变药物的药性。结论1、NO/PTX是一种粒径为30 nm左右,呈球形,分布均匀的一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束,NO/PTX的包封率为98.6%,NO/PTX的紫杉醇的载药量4.69%,具有良好的一氧化氮释放性能。载药材料m PEG-PLA和m PEG-PLA-NO均具有良好的安全性。NO/PTX耐受性好,最大耐受剂量是PTX的2.2倍。NO/PTX主要分布于肿瘤组织中,在组织器官中的浓度低。2、NO/PTX对MCF-7,SCG-7901,SW480,HCT-116,Bel-7402细胞中抗肿瘤效果优于国产紫杉醇注射液PTX,其增强紫杉醇的抗肿瘤效果与抑制P-gp蛋白表达相关。3、NO/PTX较PTX具有更好的抗结肠癌HCT116作用和抗HCT116细胞增殖迁移的能力,与紫杉醇和一氧化氮供体双重阻断相关。NO/PTX较PTX对于结肠癌耐药具有更好的抗紫杉醇耐药性,NO/PTX的抗紫杉醇耐药性作用与NO/PTX抑制P-gp和β3-tublin蛋白表达相关。4、NO/PTX诱导肝癌细胞死亡是由铁死亡,焦亡,内质网应激和凋亡相关网络介导的。抑制铁死亡降低了NO/PTX对Bel-7402细胞毒性。高浓度的NO/PTX引起Bel-7402细胞主要死亡方式为凋亡,而焦亡发生在NO/PTX中低浓度。5、PTX,NO/PTX和PTX Nano均属于寒性药,通过制剂手段制备成PTX Nano或者连接供体的NO/PTX,均没有改变药物的药性。
黎婕[3]（2021）在《双硫仑/铜复合物（CuET）抑制肝癌细胞增殖诱导细胞凋亡的分子机制研究》文中研究指明背景肝细胞癌是常见的恶性肿瘤,病情隐匿且易转移复发。我国每年新增确诊肝癌患者和因肝癌死亡人数都持续增加,远高于世界平均水平。目前肝癌治疗方法包括外科治疗、放射治疗、系统治疗等多种手段,其中以化疗药物为基础的系统治疗是肝癌治疗中重要的手段,尤其是针对不能进行外科治疗的病人或者对于晚期肝癌病人。索拉非尼作为系统治疗中推荐使用的一线药物,增加患者生存获益的同时,其耐药问题也一直十分突出。因此,继续开发研制新的抗癌药物十分重要。相比于传统新药开发路线,“老药新用”有其不能比拟的优势——研发周期短、临床数据丰富、成本低等。双硫仑是美国食品和药品管理局批准用治疗酒精成瘾的药物,已广泛使用超过60年,具有完善的药代动力学、安全性和耐受性等多方面患者数据资料。近年来有文献报道,双硫仑体内代谢产物——CuET在临床和临床前研究中均展示良好的抗癌活性。但CuET在肝癌治疗中的研究很少,且肝脏是双硫仑的主要代谢器官,因此我们将对CuET对肝癌细胞增殖与凋亡的影响及其分子机制进行深入探讨,以期为双硫仑“老药新用”提供新的思路,同时也为CuET成为临床肝癌治疗药物提供理论与实验依据。目的阐明CuET抑制肝癌细胞HepG2、SMMC-7721增殖诱导凋亡的分子机制,以期为CuET成为临床肝癌治疗药物奠定基础。方法MTT比色法和软琼脂克隆形成实验检测细胞增殖;流式细胞术检测ROS和细胞凋亡;Western Blot实验检测凋亡相关和线粒体分裂相关蛋白表达;激光共聚焦观察线粒体分裂和Drp1与线粒体共定位;透射电镜观察线粒体形态。内容与结果1.CuET抑制肝癌细胞增殖诱导凋亡MTT检测发现CuET可以抑制不同类型肿瘤细胞增殖,其中对肝癌细胞Hep G2、SMMC-7721效果更明显（P<0.01）,但对正常肝细胞THLE增殖没有影响（P<0.01）。软琼脂克隆形成实验也证实CuET对肝癌细胞增殖具有抑制作用（P<0.01）。流式细胞术和Western Blot检测表明,CuET可诱导肝癌细胞Hep G2、SMMC-7721凋亡（P<0.01）并促进凋亡关键蛋白细胞色素C释放到胞浆,Caspase 3和Caspase 9剪切活化,PARP降解。2.CuET促进线粒体过度分裂诱导线粒体损伤透射电镜观察发现,CuET处理后,Hep G2和SMMC-7721细胞线粒体数量减少（P<0.01）,且剩余线粒体出现肿胀、断裂和嵴扭曲变形。激光共聚焦显微镜观察发现,CuET处理后导致细胞线粒体发生过度分裂（P<0.01）,断裂呈“点状”。3.CuET通过促进Drp1 Ser637位点去磷酸化、Drp1线粒体转位,引发线粒体过度分裂和细胞凋亡Western Blot检测发现CuET可导致Drp1 Ser637位点去磷酸化以及Drp1线粒体转位,均呈现良好的剂量和时间依赖性,但对Drp1 Ser616位点磷酸化水平无明显影响。紧接着,采用Drp1线粒体转位抑制剂Mdivi-1预处理细胞,预处理后可明显阻断CuET引起的Drp1线粒体转位,减少细胞凋亡（P<0.01）。通过sh RNA技术敲降Drp1,发现敲降Drp1蛋白后,肝癌细胞线粒体不再过度分裂（P<0.01）,分裂融合重新恢复平衡,细胞凋亡明显减少（P<0.01）;通过点突变技术,构建Drp1 637A、Drp1 637D质粒分别模拟Drp1 637位点去磷酸化状态和磷酸化状态,发现转染Drp1 637D质粒在恢复Drp1Ser637位点磷酸化水平的同时,也直接阻断CuET引起的Drp1线粒体转位,避免了线粒体分裂-融合平衡遭到破坏,极大地减少了CuET引起的细胞凋亡（P<0.01）;而转染Drp1 637A质粒效果与之相反,不仅加剧Ser637位点去磷酸化以及Drp1线粒体转位的程度,而且进一步导致线粒体损伤断裂,促进CuET诱导的细胞凋亡（P<0.01）。4.CuET通过增加肝癌细胞线粒体超氧型ROS水平,促进Drp1 Ser637位点去磷酸化和Drp1线粒体转位,进而导致线粒体分裂和细胞凋亡流式细胞术检测发现,CuET可导致肝癌细胞内ROS水平上升（P<0.01）,且ROS为超氧阴离子（O2）型ROS,主要来自于线粒体。采用线粒体超氧阴离子清除剂Mito Q预处理细胞,预处理后直接阻断CuET引起的线粒体内O2水平升高（P<0.01）,恢复Drp1 Ser637位点磷酸化水平,同时抑制Drp1线粒体转位,进而维持线粒体分裂-融合平衡,减少CuET引起的细胞凋亡（P<0.01）。结论CuET诱导肝癌细胞线粒体分裂和细胞凋亡。CuET刺激肝癌细胞线粒体内超氧型ROS水平升高,促使Drp1 Ser637位点去磷酸化,继而解除对Drp1线粒体转位的抑制,促进其大量转位至线粒体;转位后,破坏线粒体分裂-融合平衡,导致线粒体分裂加剧,释放细胞色素C;释放到胞浆中的细胞色素C,传递凋亡信号,激活Csaspase凋亡通路,最终导致细胞凋亡。
武家成[4]（2021）在《血竭素高氯酸盐通过内质网应激诱导肝细胞癌凋亡的机制研究》文中提出目的:肝细胞癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,发病率在世界范围内位居第六位,每年新增病例数超过84万,尽管目前针对肝细胞癌的治疗方式多种多样,包括手术治疗、介入治疗、消融治疗以及化学药物治疗及分子靶向治疗等,但总体治疗效果不佳,总体五年生存期仅18%,每年因肝细胞癌死亡人数超过78万。因此,如何改善肝细胞癌预后是人们亟待解决的难题。手术切除是临床上针对肝细胞癌最基本的治疗方式,但由于其恶性程度高,发展隐匿等特点,绝大多数病例在确诊时已无法行根治性手术,且术后极易发生复发及转移,因此药物治疗成为目前抗肝细胞癌治疗的重要手段。虽然目前已经出现了以索拉菲尼为代表的多种抗肝癌药物,但效果并不理想,开发新型抗肝癌药物已成为研究者们关注的热点。细胞凋亡是程序性细胞死亡最重要的方式之一,是通过在生理和病理条件下有序协调的细胞程序而最终发生的主动性死亡,其过程受到严密的调控。在正常生理状态下,通过细胞凋亡能去除衰老及异常细胞,对进化、维持机体内环境稳态及器官发育存在重要意义。然而在某些病理条件下,细胞凋亡调节异常也能够导致多种疾病,包括肿瘤、神经退行性变等。根据凋亡信号启动途径的不同,细胞凋亡主要分为外源性凋亡及内源性凋亡,也称为死亡受体凋亡途径及线粒体凋亡途径,两者通过不同的级联信号传导最终均以激活caspase-3等蛋白而执行凋亡改变。通过各种方式诱导肿瘤细胞凋亡是达到抗肿瘤目的重要方式,其中,通过开发新颖的药物直接作用于肝癌细胞并选择性的诱导肝癌细胞凋亡是目前抗肝癌药物研发的重要方向。血竭素高氯酸盐是人工合成的类血竭素样的黄酮类化合物,其药用价值已经被多项研究证实,包括对组织愈合,创面修复及抗糖尿病方面存在一定作用。然而目前,其抗肿瘤作用已成为其药物研究的焦点。目前通过部分体外试验初步证实其在体外对人宫颈癌、肺癌、乳腺癌等存在抑制作用,且其抗肿瘤作用的机制主要以其诱导肿瘤细胞凋亡为主。然而,目前对血竭素高氯酸盐的抗肿瘤作用机制研究并不深入,且其是否对肝细胞癌存在有效的抗癌作用尚未有研究明确证实,因此,我们将通过体内外实验探索血竭素高氯酸盐对肝细胞癌的抗癌作用,并进一步探索其抗癌机制,为研发新颖的抗肝细胞癌药物提供依据。方法:1、通过MTT法、Hoechst33342、流式细胞仪凋亡检测以检测血竭素高氯酸盐对肝癌细胞及正常肝细胞的作用。2、通过电子显微镜观察肝癌细胞在血竭素高氯酸盐的作用下,细胞器形态学发生的改变。3、通过转录组测序分析肝癌细胞在血竭素高氯酸盐的作用下,转录水平上发生的改变。4、通过MTT法、Western Blot检测、流式细胞仪凋亡检测、流式细胞仪线粒体膜电势检测等检测血竭素高氯酸盐对肝癌细胞凋亡通路、内质网应激通路以及mTORC1通路的影响,并通过加入相应信号通路抑制剂分析各通路上下游关系。5、建立肝癌裸鼠移植瘤模型,测量记录在肿瘤在血竭素高氯酸盐作用下体积变化,并记录小鼠体重变化。6、HE染色观察移植瘤及其他重要器官组织的病理结构改变。8、TUNEL染色检测移植瘤组织凋亡情况。7、免疫组化检测移植瘤内p-4EBP1、p-PERK及CHOP的表达。结果:1、血竭素高氯酸盐在体外能够使人肝癌细胞系SMMC-7721、Hep G2、Hep3B及Huh-7细胞活力显着下降,且对人正常肝细胞L02的细胞毒性明显小于肝癌细胞系。2、通过Hoechst染色、流式细胞仪凋亡检测及Western Blot发现血竭素高氯酸盐在体外能够诱导肝癌细胞凋亡,且细胞活力的抑制及细胞凋亡率能够被凋亡抑制剂Z-VAD-FMK所逆转。3、血竭素高氯酸盐对肝癌细胞系在转录组层面上诱导巨大变化,涉及多种生物学过程及信号通路,包括内质网应激、内源性凋亡及mTORC1信号激活等。4、在电子显微镜下观察血竭素素高氯酸盐能够诱导肝癌细胞线粒体肿胀、内质网扩张、溶酶体增多等改变。5、通过流式细胞仪线粒体膜电势检测及Western Blot检测发现血竭素高氯酸盐能够诱导肝癌细胞线粒体膜电势降低,并诱导Bax及Bcl-2表达比例失衡及caspase-9活化。6、通过Western Blot检测发现血竭素高氯酸盐激活肝癌细胞内质网应激,PERK-ATF4-CHOP信号通路被显着激活,在应用4-PBA抑制内质网应激信号的同时,其诱导的线粒体途径凋亡信号得到逆转。7、通过Western Blot检测发现血竭素高氯酸盐能够激活肝癌细胞mTORC1信号,通过应用Torin-1抑制mTORC1的激活,能够逆转其诱导的内质网应激及下游凋亡信号。8、血竭素高氯酸盐能够在体内抑制肝癌细胞的生长,且对裸鼠体重无明显影响,通过HE染色观察肿瘤及重要器官的病理结构发现,血竭素高氯酸盐能够诱导肝癌移植瘤组织结构紊乱,坏死程度加重,且对肝、肺、肾、心、脑无明显毒性作用。9、应用TUNEL法对肿瘤切片进行检测发现血竭素高氯酸使移植瘤组织TUNEL凋亡染色显着增强。10、通过免疫组化检测,发现血竭素高氯酸盐能够上调移植瘤内mTORC1通路及内质网应激通路关键蛋白的表达。结论:1.血竭素高氯酸盐在体内及体外均能够显着抑制肝癌细胞的生长,并对正常细胞及组织毒性较小。2.血竭素高氯酸盐能够激活肝癌细胞内质网应激信号通路,并介导诱发内源性凋亡。3.血竭素高氯酸盐能够激活mTORC1,并通过激活内质网应激分支信号通路PERK-ATF4-CHOP介导下游凋亡信号。
张楠[5]（2021）在《Regorafenib对肝癌细胞侵袭转移和VM形成的影响及机制研究》文中研究说明目的:肝癌侵袭转移和耐药是不良预后及进展的主要原因,肝癌是典型的富血管恶性肿瘤且存在血管生成拟态。Regorafenib于2017年被FDA批准用于不可切除肝癌的二线治疗药物,但是Regorafenib在肝癌转移中的治疗功效及作用机制尚不清楚。本论文第一部分旨在考察Regorafenib对肝癌细胞侵袭转移及VM形成的影响并探明相关分子机制。长期用药,Regorafenib面临耐药风险,前期我们已筛选肝癌Regorafenib耐药细胞,但其耐药机制尚需深入研究。本论文第二部分旨在表征肝癌Regorafenib耐药细胞的侵袭转移和VM形成等特征,筛选潜在逆转耐药靶点并探讨相关机制。上述研究将为临床上肝癌复发转移治疗及Regorafenib的合理用药提供有效策略。方法:1、第一部分:（1）分别采用CCK8、Transwell小室、管状形成和Western blot实验考察Regorafenib对肝癌细胞增殖、迁移侵袭、VM形成、EMT及VM相关蛋白表达的影响。（2）采用RNA-seq、Western blot及q RT-PCR筛选并验证Regorafenib治疗肝癌的潜在靶标,采用CETSA和基因敲减、回补实验证明ID1是Regorafenib的靶标。（3）采用Western blot、免疫组化、CD34-PAS双染等方法分析肝癌样本中ID1与EMT、VM蛋白表达相关性。（4）采用基因sh RNA和过表达等实验探讨ID1调节Snail介导肝癌细胞增殖、迁移侵袭和VM形成的作用机制,进一步采用裸鼠尾静脉肺转移模型进行体内验证。（5）采用肝癌PDX模型,体内考察Regorafenib对肿瘤中EMT及VM的影响。2、第二部分:（1）采用低浓度梯度间歇诱导筛选MHCC-97H/Rego耐药细胞,分别采用CCK8、Transwell小室、管状形成和Western blot实验分析耐药细胞的耐药性、增殖、迁移侵袭、VM形成、EMT及VM相关蛋白表达等特征。（2）采用RNA-seq、Western blot及q RT-PCR筛选并验证CD90是肝癌Regorafenib耐药细胞的重要靶标。（3）采用裸鼠皮下成瘤和CD34-PAS双染考察耐药细胞的肿瘤生长及VM结构,采用Western blot及免疫组化考察肿瘤组织中CD90及EMT、VM相关蛋白表达。（4）采用基因sh RNA实验考察CD90敲减对耐药细胞特征的影响,并进一步在裸鼠肺转移模型中验证。（5）采用GEPIA数据库分析临床肝癌样本中CD90与Pin1表达相关性,采用Western blot检测耐药细胞中CD90敲减对Pin1表达的影响。（6）采用Western blot分析肝癌标本中Pin1与Gli1表达相关性,进一步采用基因sh RNA、过表达及点突变,Co-IP、GST-pull down、CHX等实验探讨Pin1/Gli1信号轴对耐药细胞特征的影响及作用机制。（7）采用CCK8、Transwell小室、管状形成和Western blot实验考察Dasatinib对耐药细胞增殖、迁移侵袭、VM形成、EMT及VM相关蛋白表达的逆转情况。结果:1、第一部分:（1）肝癌细胞经Regorafenib预处理48 h,细胞迁移侵袭及VM形成能力减弱,而细胞增殖能力不受影响;Regorafenib抑制EMT相关蛋白Snail、Vimentin及VM相关蛋白VE-cadherin表达。（2）基于RNA-seq筛选并验证Regorafenib显着下调ID1表达;CETSA实验结果表明Regorafenib与ID1结合后热稳定性增强,ID1敲减降低了Regorafenib对肝癌细胞迁移能力的抑制作用,ID1回补可以恢复Regorafenib对细胞迁移能力的影响,表明ID1是Regorafenib的直接靶标。（3）在临床肝癌标本中ID1与Vimentin及VE-cadherin表达呈正相关,与E-cadherin表达呈负相关;ID1高表达的肝癌组织中CD34-PAS+的VM阳性结构多于ID1低表达组织。（4）ID1与Snail表达呈正相关;ID1敲减后,肝癌细胞迁移侵袭、VM形成及体内转移能力减弱,Snail过表达可增强sh ID1细胞的迁移侵袭及VM形成能力,并恢复其EMT及VM相关蛋白表达;ID1过表达增强肝癌细胞EMT、VM相关生物学行为及蛋白表达,Snail敲减可抑制其功能。（5）在肝癌PDX模型中,经15 mg/kg Regorafenib治疗后,肿瘤体积变小、VM结构减少;Regorafenib显着抑制肿瘤组织中ID1、Vimentin、Snail、VE-cadherin表达并促进E-cadherin表达。2、第二部分:（1）成功筛选MHCC-97H/Rego耐药细胞,耐药细胞具有增殖、迁移侵袭及VM形成能力增强,EMT及VM相关蛋白表达增加等特征。（2）基于RNA-seq筛选并验证肝癌Regorafenib耐药细胞中CD90异常高表达,提示CD90是逆转肝癌Regorafenib耐药的重要靶标。（3）肝癌Regorafenib耐药细胞的体内成瘤能力增强,组织中CD34-PAS+结构增多,CD90、Snail、Vimentin及VE-cadherin表达增加。（4）CD90敲减使肝癌Regorafenib耐药细胞迁移侵袭及VM形成能力减弱,体内肺转移能力降低,并下调Snail、Vimentin及VE-cadherin表达。（5）GEPIA数据库分析表明CD90与Pin1表达呈正相关,CD90敲减可降低Pin1表达。（6）Pin1敲减使耐药细胞迁移侵袭、VM形成能力减弱,并下调EMT及VM相关蛋白;Pin1过表达增强肝癌细胞EMT及VM相关生物学行为并上调其相关蛋白表达;肝癌标本中Pin1与Gli1呈正相关,Pin1与Gli1相互作用并调控Gli1蛋白稳定性介导耐药细胞迁移侵袭、VM形成及相关蛋白表达。（7）Dasatinib使肝癌Regorafenib耐药细胞迁移侵袭、VM形成能力减弱,下调CD90/Pin1/Gli1信号轴及下游EMT、VM相关蛋白,提示其可用于逆转肝癌Regorafenib耐药。结论:Regorafenib通过靶向ID1介导的EMT抑制肝癌细胞侵袭转移及VM形成,为Regorafenib用于肝癌转移治疗提供理论支撑。CD90调节Pin1表达进而调控肝癌Regorafenib耐药细胞的侵袭转移及VM形成,Dasatinib可通过抑制CD90/Pin1/Gli1轴逆转肝癌Regorafenib耐药,揭示了Regorafenib耐药的新型分子机制。本研究为肝癌复发转移提供治疗策略,对临床上Regorafenib的合理用药及其耐药逆转具有指导意义。
杨玥[6]（2021）在《桑黄总提物及其活性单体紫萁酮抗肿瘤作用及机制研究》文中进行了进一步梳理第一部分 桑黄总提物诱导黑色素瘤A375细胞凋亡的作用研究物对A375细胞线粒体膜电位的影响。用免疫印迹实验检测不同浓度桑黄总提物作用 A375 细胞 24h 后,凋亡相关蛋白 Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3 和 cleaved PARP的表达水平变化。通过裸鼠异种移植瘤实验检测桑黄总提物在体内对肿瘤生长速度的影响,瘤组织石蜡切片用H&E染色、TUNEL染色及免疫组化（IHC）染色并分析其病理学特征,验证体外实验的结论。此外,还通过伤口愈合实验和transwell小室实验分别检测桑黄总提物对A375细胞迁移和侵袭能力的影响。黑色素瘤是最具有侵袭性和耐药性的癌症之一,恶性程度较高,虽然在皮肤癌中的比例较低但其死亡率高达80%。用于治疗晚期或不可切除的黑色素瘤的达卡巴嗪、达拉非尼、曲美替尼、威罗菲尼等药物时常发生的不良反应和短期间出现耐药的情况降低了这些药物治疗的临床收益。还需要继续不断开发新的治疗方法和药物给黑色素瘤患者带来更多希望。天然产物因其大部分具有安全、有效、低毒的特性受到越来越多的关注。其中,在中国和其他东亚国家有一种着名的药用真菌——桑黄被用于治疗包括癌症在内的多种疾病。桑黄,又名“桑臣”、“桑耳”,在古代中医药典籍中多有记载,这些典籍中记载的疾病与现代的很多病症相当,如体内肿瘤、免疫力低下、女子带下或恶性腹腔积液等。目的:本研究旨在评估桑黄总提物其对人黑色素瘤A375细胞诱导凋亡的作用,对其可能涉及的分子机制进行初步探讨,为开发桑黄提供部分理论基础。方法:用95%乙醇和水分别提取桑黄子实体,合并提取液,浓缩干燥,制备桑黄总提物。采用CCK-8法检测桑黄总提物浓度为0、25、50、100、200和400μg/mL时,对五种人源肿瘤细胞MDA-MB-231、HCT116、U87、U251和A375的增殖抑制作用。在光学显微镜和倒置荧光显微镜下观察低、中、高浓度（100、200和400 μg/mL）的桑黄总提物对人黑色素瘤细胞A375作用24 h后细胞及细胞核形态的影响。以PI为探针用流式细胞仪检测不同浓度桑黄总提物对A375细胞周期分布的影响。使用Annexin-V/PI双染法用流式细胞仪检测不同浓度桑黄总提物对黑色素瘤细胞A375作用24h后,正常细胞、早期凋亡细胞、中晚期凋亡和坏死细胞的相对比例。以JC-1为探针用流式细胞仪检测不同浓度桑黄总提结果:CCK-8法检测结果显示桑黄总提物对人黑色素瘤细胞A375的活力抑制作用最强,并以剂量和时间依赖性方式抑制A375细胞活力,其IC50值为64.9μg/mL。细胞周期检测结果显示A375细胞被桑黄总提物阻滞在细胞周期的S期,S期细胞在对照组中比例为32.3%,经桑黄总提物低、中、高剂量组处理后分别升高至33.0%、46.7%和71.7%。细胞形态学观察可见A375细胞在桑黄总提物的作用下,细胞棱角消失、细胞缩圆甚至破碎。Hoechst染色结果可见细胞核固缩,蓝色荧光强度增大,细胞破碎,这些现象随着桑黄总提物浓度的升高愈发明显。流式细胞术结果表明桑黄总提物低、中、高剂量处理后,细胞凋亡率从5.8%分别增大到13.4%、21.7%和39.4%,线粒体膜电位下降的细胞比例从0.98%增至13.57%、53.47%和92.8%。免疫印迹实验结果显示桑黄总提物剂量依赖性地上调促凋亡蛋白Bax的表达,下调抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达,并且cleaved caspase-3和cleaved PARP蛋白被上调。体内实验结果显示桑黄低、中、高剂量组抑瘤率分别为46.52%、49.57%和65.92%且高剂量的抑瘤率与阳性药接近。H&E染色显示对照组的细胞排列紧密而整齐,其中有核裂变,显示快速生长的状态,而桑黄组的细胞排列稀疏,细胞间裂隙多,细胞核固缩。组织蛋白免疫印迹结果显示桑黄以剂量依赖性方式增加了促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的表达,降低了抑凋亡蛋白Bcl-2的表达。TUNEL染色显示绿色荧光强度与桑黄总提物剂量的增加呈正相关。针对cleaved caspase-3的IHC染色结果显示模型组中棕色点较少,桑黄组棕色点随剂量增加而增多,说明桑黄组cleaved caspase-3表达与剂量的增加呈正相关。此外,伤口愈合实验结果显示对照组伤口愈合率为51.68%,而桑黄组各剂量组分别为40.89%、23.66%和13.14%。Transwell小室实验结果显示细胞经桑黄作用24 h后,结晶紫染色的侵袭细胞数量呈剂量依赖性减少。结论:桑黄提取物对人黑色素瘤细胞A375生长具有明显的抑制作用,其抗肿瘤作用的分子机制与多种途径有关,包括诱导线粒体途径凋亡,抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力,这对于具有快速增殖和高转移特性的黑色素瘤来说,是非常具有潜力的天然产物。第二部分 桑黄活性单体紫萁酮对非小细胞肺癌的抗肿瘤作用及机制研究根据国内外研究报道以及本课题组多年研究,桑黄总提物具有引人瞩目的抗肿瘤作用,其作用物质基础有必要进一步探究。本研究第一部分内容阐述了桑黄总提物对人黑色素瘤细胞A375在体内体外均有诱导其凋亡的作用。本课题组其他研究表明桑黄总提物对肝癌细胞SMMC-7721、宫颈癌细胞SiHa通过不同的作用机制在体内外均有诱导肿瘤细胞死亡的作用。事实上,桑黄对很多种肿瘤细胞都具有抑制增殖或者诱导死亡的作用,作用机制是“多通路、多靶点”的。本课题组前期从桑黄中提取分离得到23个单体化合物,并将这些单体对11种癌症的41种肿瘤细胞系进行高通量筛选。根据筛选结果,本研究从这23个单体化合物中选出7个活性较好的化合物扩大筛选范围,发现化合物15（紫萁酮）对非小细胞肺癌H460和A549细胞均具有明显的抑制增殖作用。根据国内外报道,没有学者对紫萁酮在非小细胞肺癌方面的抗肿瘤活性做过相关研究。本研究通过对桑黄活性单体紫萁酮对于非小细胞肺癌的抗肿瘤作用及其作用机制进行深入探究,从而为研发抗癌新药提供更多的天然药物来源。肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,近年来发病率和死亡率一直居高不下,其中,非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌总量的85%。虽然现在的治疗方法和治疗药物不断增加,但发病率和死亡率并未得到缓解。现存的治疗方法和药物在临床中总有各种局限性,小分子抗肿瘤活性研究仍然是不可放弃的抗癌药物开发方向。目的:本研究旨在探讨桑黄活性单体紫萁酮对非小细胞肺癌H460和A549细胞的抑制增殖作用及其相关机制。方法:采用MTT法检测7种桑黄活性单体在浓度为0、6.25、12.5、25、50和 100 μM 时,对 8 种人源肿瘤细胞 A375、SiHa、SK-OV-3、A2780、SH-SY5Y、H460、A549、PC-3增殖的影响。采用克隆形成实验观察不同浓度紫萁酮（0、10、20、40 μM）对非小细胞肺癌H460和A549细胞克隆形成能力的影响。以PI为探针用流式细胞仪检测不同浓度紫萁酮对A375细胞周期分布的影响。在光学显微镜下观察低、中、高浓度（10、20和40 μM）的紫萁酮对H460和A549细胞作用48 h后细胞形态的影响。通过裸鼠异种移植瘤实验检测紫萁酮在体内对肿瘤生长速度的影响,且对瘤组织用H&E染色和免疫组化（IHC）染色分析其病理学特征。以代谢组学为窗口,对裸鼠血清代谢物进行分析,推测药物对代谢通路的影响。后续通过体外细胞模型对谷氨酸代谢通路相关代谢物和蛋白表达水平测定,验证体内实验结果。通过对通路中被紫萁酮调控的关键蛋白GLUD1沉默或过表达,验证紫萁酮对GLUD1的调控作用。通过电镜观测紫萁酮对线粒体形态的影响,且以JC-1为探针用激光共聚焦显微镜观察紫萁酮对细胞线粒体膜电位的影响。用ELISA试剂盒检测对H460和A549细胞线粒体谷氨酸代谢通路代谢物α-KG和NADH浓度在紫萁酮不同浓度下的变化;在GLUD1沉默和过表达的细胞中NADH浓度的变化;以及紫萁酮对GLUD1沉默和过表达细胞中NADH的调控。通过安捷伦Seahorse XF ATP实时速率试剂盒,检测紫萁酮对线粒体氧化磷酸化和糖酵解两种途径分别产生的ATP速率以及总ATP速率的影响,从而判断紫萁酮对线粒体是否具有靶向性。以蛋白组学分析来评估紫萁酮在体内瘤组织发挥出的药效作用。结果:MTT法检测结果显示化合物15（紫萁酮）对人非小细胞肺癌细胞H460、A549增殖抑制效果最明显,且呈浓度和时间依赖性,作用48 h的IC50值分别为20.69±1.04和21.20±0.16 μM。克隆形成实验结果显示紫萁酮对两种细胞的克隆形成均具有剂量依赖性抑制作用。细胞周期检测结果显示细胞被紫萁酮阻滞在细胞周期的G2/M期,G2/M期细胞在对照组中比例为2.86%,经紫萁酮低、中、高剂量组处理后分别升高至7.49%、11.78%和21.93%。细胞形态学观察可见在紫萁酮的作用下,细胞形态变异甚至破碎。裸鼠皮下移植瘤实验结果显示紫萁酮低、中、高剂量组抑瘤率分别为53.17%、53.49%和68.51%,且相较于顺铂组小鼠体重的明显下降,紫萁酮组小鼠体重没有降低,与正常组小鼠相近。H&E染色显示对照组的细胞排列紧密而整齐,其中有核裂变,显示快速生长的状态,而紫萁酮组的细胞排列稀疏,细胞间裂隙多。小鼠血清代谢组分析结果显示经过紫萁酮治疗的模型组小鼠谷氨酰胺和谷氨酸代谢通路、三羧酸循环通路受到影响。模型组中升高的代谢通路中的关键代谢物α-KG和柠檬酸在紫萁酮治疗后下降到正常组水平。qRT-PCR和蛋白免疫印迹结果显示紫萁酮可下调谷氨酸代谢通路中关键酶GLUD1的转录和翻译水平的表达。这一结论在GLUD1沉默和过表达细胞模型中得到验证。并且,在瘤组织切片免疫组化和组织蛋白免疫印迹分析中显示经紫萁酮治疗后GLUD1同样可在瘤组织中被下调。ELISA实验结果显示GLUD1的催化产物α-KG胞内浓度随着紫萁酮浓度增加而下降。透射电镜结果显示经过紫萁酮处理后,H460和A549细胞的线粒体结构均被破坏,以JC-1为探针的线粒体膜电位检测验证了这一结论。ELISA结果显示,为电子呼吸链氧化磷酸化递氢的NADH随着紫萁酮浓度增加而下降。ATP速率检测结果显示紫萁酮处理后细胞线粒体氧化磷酸化产生的ATP明显降低,而糖酵解产生的ATP变化不明显。这些结果表明紫萁酮影响了谷氨酸代谢途径且靶向作用于线粒体。瘤组织蛋白组分析结果显示紫萁酮治疗后线粒体能量产生、细胞增殖、转移的相关蛋白受到调控,这些变化有利于抑制肿瘤的生长、转移以及能量代谢,从蛋白组学的角度验证了紫萁酮在体内的药效作用。结论:紫萁酮在NSCLC细胞中靶向线粒体,在能量代谢中的关键作用是通过下调GLUD1从而抑制谷氨酰胺-谷氨酸-α-KG轴代谢和此代谢轴驱动的氧化磷酸化来抑制NSCLC细胞增殖和肿瘤生长。
郑雁[7]（2020）在《新型多金属氧酸盐抗非小细胞肺癌作用及机制研究》文中进行了进一步梳理恶性肿瘤发病率逐年上升,其中以肺癌发病率最高。非小细胞肺癌占肺癌发病率的85%左右,且具有恶性度高和预后差的特点,对其治疗现已经成为临床肿瘤治疗亟待解决的问题之一。目前临床对非小细胞肺癌的治疗主要采用手术治疗、放射治疗、化疗等方法。但各种治疗方法均存在诸多不足之处,如化疗药物毒副作用较大,靶向治疗药物虽敏感但耐药问题非常棘手,同时价格昂贵,免疫治疗适应症的选择等问题。因而研发高效低毒的抗肿瘤药物仍然是目前肺癌治疗关键问题之一。多金属氧酸盐是一类金属氧簇化合物,具有结构特异、表面高电荷、氧化还原能力较强、分子可设计等特点。研究表明,具有Keggin结构的多金属氧酸盐具有较好的抗肿瘤作用。本研究自主设计合成一系列具有Keggin结构的多金属氧酸盐,采用红外光谱法、紫外可见光谱法、单晶X射线衍射、核磁共振分析、热重分析等方法对其结构进行表征。采用MTT法及MTS法对合成的多金属氧酸盐进行体外抗肿瘤活性筛选,筛选出抗非小细胞肺癌活性较高,同时毒性较低的化合物,代号为As MOP-8。采用体内急性毒性实验评价As MOP-8的急性毒性,并做为体内抗肿瘤实验剂量选择的依据。以ICR Lewis肺癌荷瘤小鼠作为实验研究模型,对As MOP-8进行体内抗非小细胞肺癌作用研究。分别采用体内外实验方法探讨As MOP-8抗非小细胞肺癌的作用机制,进而寻找其抗非小细胞肺癌的作用靶点。结果表明,自主合成的含砷多酸化合物As MOP-8结构明确,在氨基酸溶液中稳定性良好,体外对多种肿瘤细胞有较好的抑制作用且抗非小细胞肺癌作用最为显着,对正常肺组织细胞的毒性较小,与阳性对照顺铂相比抗肿瘤作用更显着且毒性较小。体内具有较好的抗非小细胞肺癌作用,作用效果优于阳性药顺铂。在机制探讨中发现As MOP-8可以诱导肿瘤细胞凋亡,且同时通过Caspase依赖的线粒体通路和非Caspase依赖的线粒体通路发挥抗肿瘤作用。本课题自主设计、合成一系列的具有Keggin结构的多金属氧酸盐,采用体内外实验方法探讨受试物抗非小细胞肺癌作用及机制,并研究受试化合物的体外细胞毒性和体内急性毒性。课题部分研究成果已申请国家发明专利。本研究为开发自主知识产权的新型多酸抗肿瘤药物奠定一定的理论实验基础。
黄登[8]（2020）在《缺氧诱导肌动蛋白丝细胞骨架重塑促进肝细胞癌侵袭转移的机制研究》文中认为背景肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是具有高度恶性的肿瘤之一,其术后5年复发转移率高达70%以上。研究表明,HCC的高侵袭特性是患者术后复发转移的重要原因。因此,深入研究肝癌细胞侵袭转移的调控机制,对防治HCC的侵袭转移和提高患者预后具有重要理论意义和潜在临床实用价值。缺氧（Hypoxia）是实体肿瘤内普遍存在的现象,可诱导肿瘤细胞发生侵袭和迁移。现已证实,缺氧可通过其效应因分子缺氧诱导因子1α（Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）激活相关信号通路以及增强转录因子的表达等途径诱导肝癌细胞发生侵袭和迁移。但基于相关信号通路及转录因子的相关干预措施不能有效遏制肝癌细胞侵袭转移的进程,说明还可能存在发挥更为重要作用的调控途径及机制。细胞骨架是一个由蛋白丝组成的错综复杂、遍布整个细胞质中的网状支架,在维持细胞形态和运动等方面发挥重要作用。肌动蛋白丝是细胞骨架的重要组成成分,它的动态重塑是肿瘤细胞形态变化和侵袭迁移运动的结构基础和动力来源。文献报道,HIF-1α作为介导细胞缺氧反应的重要转录因子,可活化RhoA/ROCK信号通路介导细胞骨架损伤及重塑,但其具体分子机制有待进一步阐明。磷脂酰肌醇4,5二磷酸（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate,PIP2）是一种磷脂,虽然其含量在膜磷脂中占比不到1%,但其功能却非常复杂,是传递细胞外刺激信号至细胞内的重要膜分子。研究发现,作为脂筏的重要组成成分,PIP2可直接参与调节细胞迁移过程中所必需的肌动蛋白丝细胞骨架重塑等生物学过程。研究报道,RhoA/ROCK通路特异性抑制剂Y-27632可抑制PIP2诱导的小鼠心肌细胞骨架重塑及心脏肥大,提示PIP2很可能是HIF-1α/RhoA/ROCK信号通路下游的关键调控因子以及传递细胞外缺氧信号至细胞骨架的重要功能分子。戴帽蛋白（Capping actin protein of muscle Z-line,CapZ）是一种肌动蛋白结合蛋白,呈帽状结构结合在肌动蛋白丝（Actin filament,F-actin）的正极,通过阻隔球状肌动蛋白（Globular actin,G-actin）在F-actin正极聚合参与调控肌动蛋白丝细胞骨架的重塑。CAPZA1是CapZ的α1亚基。作者在攻读硕士学位期间,研究发现下调CAPZA1的表达可促进肌动蛋白丝细胞骨架重塑诱导HCC EMT,从而增强肝癌细胞的侵袭和迁移能力。但作为评判HCC侵袭转移和预后的重要分子标志物,CAPZA1的上游调控机制尚不清楚。Hartman,T J和Li J等研究发现,在心室肌细胞肥大模型中,CapZ对肌动蛋白细胞骨架的重塑受PIP2调控。Roman Pleskot等发现在动物和植物细胞中PIP2和Cap Z具有非常强的亲和作用。但在肿瘤细胞尤其是肝癌细胞中是否存在PIP2和Cap Z的相互作用及作用机制目前尚未见报道。为深入研究缺氧诱导肝癌细胞侵袭和迁移的分子机制,结合前期研究工作基础,我们提出如下研究设想:缺氧可通过激活HIF-1α/RhoA/ROCK信号通路促进细胞膜上PIP2的合成,而质膜上的PIP2与CAPZA1发生相互作用并促使CAPZA1从F-actin的正极脱落,进而开放F-actin的正极,肌动蛋白单体可不断聚合在F-actin正极上,促进F-actin沿正极方向延长,诱导EMT并驱动细胞运动,最终增强肝癌细胞的侵袭和迁移能力。目的1.通过临床病例分析,检测HCC组织样本中HIF-1α、PIP2和CAPZA1的表达,探讨三者之间表达的相关性,明确其表达改变对HCC患者临床病理因素及预后的影响,为后续的机制研究提供依据。2.建立体外缺氧培养模型,在肝癌细胞水平上研究缺氧对PIP2水平的影响,并验证缺氧是否通过激活HIF-1α/RhoA/ROCK信号通路促进PIP2的合成。3.阐明CAPZA1通过影响细胞骨架重塑对肝癌细胞侵袭转移发挥关键负向调控作用的内在机制;研究PIP2与CAPZA1的相互作用以及PIP2对CAPZA1的调控机制。4.构建裸鼠肝脏原位移植癌模型,在动物水平上探讨阻断HIF-1α/PIP2/CAPZA1信号通路对HCC侵袭转移的影响,探讨以肌动蛋白丝细胞骨架重塑为靶点的HCC侵袭转移防治策略的可行性。方法1.采用免疫组化检测HCC组织中HIF-1α、PIP2和CAPZA1的水平,并用Image J软件分别评估三者的阳性率（包括肝癌细胞阳性率和染色深浅）。根据它们的阳性率分别将HCC病例分为HIF-1α高表达组（HIF-1α-OE）和HIF-1α低表达组（HIF-1α-UE）、PIP2低水平组（PIP2-Low）和PIP2高水平组（PIP2-High）以及CAPZA1高表达组（CAPZA1-OE）和CAPZA1低表达组（CAPZA1-UE）,分别统计上述分组病例间HCC的肿瘤大小、TNM分期、病理分化、血管侵犯以及患者预后等的差异。通过免疫组化检测HCC组织芯片中CAPZA1、E-cadherin、Vimentin、HIF-1α的表达和PIP2的水平,统计分析CAPZA1的表达与EMT的关系以及HIF-1α、PIP2和CAPZA1三者之间的表达线性关系。2.在体外用400μM二氯化钴（CoCl2）模拟缺氧环境培养肝癌细胞,采用Dot blot、PIP2 ELISA和免疫荧光等实验检测PIP2在肝癌细胞内的水平,RhoA-GTP pull down实验检测活化态RhoA的水平,western blot检测HIF-1α、RhoA、ROCK1和CAPZA1的表达及免疫荧光观察肝癌细胞内肌动蛋白丝细胞骨架的状态和分布。通过加入化学抑制剂YC-1抑制HIF-1α、C3转移酶蛋白抑制RhoA和Y-27632抑制ROCK等方法验证HIF-1α/RhoA/ROCK1信号通路的存在及其活化对肝癌细胞膜上PIP2的合成和肌动蛋白丝细胞骨架重塑的调控作用。3.通过感染CAPZA1干扰慢病毒LV10-CAPZA1和CAPZA1过表达慢病毒LV8-CAPZA1以操控肝癌细胞内CAPZA1的表达,并采用Transwell、划痕实验、Western blot、qPCR、免疫共沉淀和免疫荧光等技术观察CAPZA1对肝癌细胞的侵袭、迁移、EMT和F-actin水平的影响;利用PIP2包被的酰胺珠进行亲和沉淀实验验证PIP2与CAPZA1相互作用;采用直接添加Neomycin封闭PIP2以阻断PIP2与CAPZA1的结合和直接加入PIP2以增强PIP2与CAPZA1的结合,并利用免疫共沉淀、细胞亚结构定位和免疫荧光等技术证明PIP2与CAPZA1的相结合可改变CAPZA1在细胞骨架和胞浆中的分布及其对肌动蛋白丝细胞骨架重塑的影响。4.通过接种CAPZA1稳定低表达的SMMC-7721细胞和CAPZA1稳定高表达的MHCCLM3细胞构建裸鼠肝脏原位移植癌模型,6周后利用小动物磁共振和摘取裸鼠肝脏观察裸鼠体内HCC的病灶数目;通过接种MHCCLM3细胞构建裸鼠肝脏原位移植癌模型,予Neomycin腹腔注射治疗裸鼠1月,并通过分析肝脏表面HCC病灶数目判断Neomycin抑制HCC侵袭转移的效果。结果1.与HIF-1α-UE组相比,HIF-1α-OE组的肿瘤直径显着较大（7.96±3.56 cm VS.6.67±3.57 cm,P=0.046）,且处于于TNM分期中Ⅲ期和Ⅳ期的病例数（75.0%VS.50.0%,P=0.036）和处于病理分化中低分化的患者数量（23.6%VS.5.6%,P=0.016）均显着较多;HIF-1α-OE组患者的术后5年无瘤生存率和术后5年生存率均低于HIF-1α-UE组。与PIP2-Low组相比,PIP2-High组的HCC的肿瘤直径更大（8.52±4.00 cm VS.6.66±3.59 cm,P=0.018）,血管侵犯率更高（44%VS.23.9%,P=0.038）,且其处于TNM分期中Ⅲ期和Ⅳ期的病例数也显着较多（82%VS.52.1%,P=0.010）;比较两组患者的预后发现,PIP2-High组患者的术后5年生存率显着低于PIP2-Low组。在60例HCC癌和癌旁相配对的组织中,CAPZA1在癌旁中的表达高于其在癌组织中表达的有44例（P=0.001）。与CAPZA1-OE组相比,CAPZA1-UE组HCC的血管侵犯率显着较高（45.1%VS 28.9%,P=0.038）,且其处于TNM分期中Ⅲ期和Ⅳ期的患者数量（77.5%VS 57.8%,P=0.002）和处于HCC病理分化中低分化的患者数量（29.6%VS 7.2%,P=0.001）也明显较多;比较两组患者的预后发现,CAPZA1-UE组患者术后5年无瘤生存率和术后5年生存率均低于CAPZA1-OE组。在HCC组织中,CAPZA1与E-cadherin的表达呈正相关（r=0.3129,P<0.001）,与Vimentin的表达呈负相关（r=-0.5923,P<0.001）。在HCC组织芯片中,HIF-1α的表达与PIP2的水平呈正相关（r=0.6371,P<0.001）,PIP2的水平与CAPZA1的表达无线性相关性（r=0.1111,P=0.2232）,HIF-1α与CAPZA1的表达无线性相关性（r=0.1444,P=0.1126）。2.与20%O2培养组相比,1%O2培养组和CoCl2处理组中肝癌细胞内HIF-1α、RhoA和ROCK1的表达水平均升高,但三组中CAPZA1的表达均未发生变化。随CoCl2处理时间的延长,肝癌细胞内HIF-1α、RhoA、ROCK1的表达和PIP2的水平均呈梯度升高。YC-1可抑制缺氧导致的HIF-1α蓄积,同时也抑制了肝癌细胞内RhoA和ROCK1的表达。在缺氧条件下,加入C3转移酶蛋白可抑制肝癌细胞内RhoA的活化和ROCK1的表达。在缺氧条件下,肝癌细胞内PIP2和F-actin的水平增加,且F-actin呈细长丝状;而加入Y-27632可抑制肝癌细胞内PIP2的合成和F-actin的装配。3.CAPZA1在HCCLM3细胞中的表达最高,在SMMC-7721细胞内的表达最低。干扰CAPZA1的表达可促进肝癌细胞SMMC-7721的侵袭和迁移,上调CAPZA1的表达可抑制肝癌细胞SMMC-7721和MHCCLM3的侵袭和迁移。干扰CAPZA1在肝癌细胞内的表达,可下调E-cadherin的表达,而上调Vimentin的表达;上调CAPZA1在肝癌细胞内的表达,可上调E-cadherin的表达,而下调Vimentin的表达。CAPZA1可与F-actin相互作用,并且干扰CAPZA1的表达可升高肝癌细胞内F-actin的水平。包被PIP2的酰胺珠可将CAPZA1从细胞裂解液中拉出来。免疫荧光显示,经Neomycin处理后,肝癌细胞内F-actin的含量减少,且细胞形态呈圆形;而经PIP2处理后,肝癌细胞内F-actin的含量增加,且细胞形态呈梭状。免疫共沉淀显示Neomycin和PIP2的处理并不影响CAPZA1的表达;但经Neomycin处理后,与F-actin相结合的CAPZA1增多;而经PIP2处理后,与F-actin相结合的CAPZA1减少。细胞亚结构定位、Transwell和划痕实验显示,加入Neomycin阻断PIP2与CAPZA1的结合后,CAPZA1更多地结合在细胞骨架上,而在胞浆中的分布减少,并可抑制肝癌细胞的侵袭和迁移;加入人工合成的PIP2增强PIP2与CAPZA1的结合后,CAPZA1结合在细胞骨架上的数量减少,而在胞浆中的分布增多,并可增强肝癌细胞的侵袭和迁移。4.接受Neomycin治疗的裸鼠肝脏表面肿瘤病灶较少,且主要局限于原发部位;而接受无菌水治疗的裸鼠肝脏表面均匀布满肿瘤病灶（P=0.0001）。与对照组相比,接种LV10-CAPZA1 SMMC-7721细胞组裸鼠肝脏上的肿瘤病灶数目明显较多（P=0.0435）,接种LV8-CAPZA1 MHCCLM3细胞组裸鼠肝脏上的肿瘤病灶数目明显较少（P=0.0399）。结论1.肝癌组织中HIF-1α、PIP2和CAPZA1的表达与HCC的侵袭转移和患者预后密切相关。HIF-1α和PIP2高表达可促进HCC的恶性进展并导致患者预后差;CAPZA1低表达可通过正向调控EMT促进HCC侵袭转移。相关分析显示:HIF-1α的表达与PIP2水平呈正相关,HIF-1α和PIP2与CAPZA1的表达均无线性相关性,提示缺氧可能通过其效应因子HIF-1α诱导PIP2的合成,进而促进HCC侵袭转移。但CAPZA1的表达不受HIF-1α和PIP2的调控,提示它们之间可能存在其他调控机制。2.缺氧可通过激活HIF-1α/RhoA/ROCK1信号通路促进PIP2在肝癌细胞膜上的合成,进而诱导肌动蛋白丝细胞骨架重塑,阻断PIP2的合成可抑制肌动蛋白丝细胞骨架的重塑。3.PIP2与CAPZA1结合并相互作用,使CAPZA1从F-actin的正极脱落,开放F-actin正极,并促进其不断聚合延长,从而驱动EMT及细胞运动,增强肝癌细胞的侵袭和迁移能力。但PIP2与CAPZA1的相互作用机制阐释不够透彻。我们推测PIP2可能通过与CAPZA1结合改变了CAPZA1的分子构象,从而导致CAPZA1失去与F-actin正极结合的能力。相关研究工作有待后续深入推进。4.阻断HIF-1α/RhoA/ROCK1/PIP2/CAPZA1信号通路可抑制裸鼠肝脏原位移植癌的侵袭转移。本研究通过深入探讨HIF-1α/RhoA/ROCK通路对肝癌细胞PIP2水平的影响及PIP2对CAPZA1的调控机制,首次提出并证实缺氧可通HIF-1α/RhoA/ROCK/PIP2/CAPZA1途径调控肌动蛋白丝细胞骨架重塑,进而促进肝癌细胞侵袭转移的研究假说,进一步丰富了HCC侵袭转移机制研究的理论宝库,并为临床HCC侵袭转移的防治提供了新的潜在靶点。
韩梦飞[9]（2020）在《自噬在蟾毒灵诱导人肝癌细胞凋亡及有氧糖酵解中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理背景:自噬是普遍存在于真核细胞中高度进化保守的生命过程,与肿瘤的发生、发展密切相关,将自噬作为抗肿瘤药物作用靶点是目前肿瘤治疗前沿研究领域之一。蟾毒灵（Bufalin）是中药蟾酥的主要活性成分之一,能通过多通路、多靶点抑制肝癌细胞增殖、诱导凋亡。前期预实验通过电镜、蛋白印迹检测观察到蟾毒灵能抑制人肝癌SMMC-7721细胞自噬体形成,降低自噬标记蛋白Beclin 1、LC3-Ⅱ表达水平,证实了蟾毒灵可抑制人肝癌细胞自噬发生。同时,蟾毒灵能抑制人肝癌细胞有氧糖酵解。那么,自噬在蟾毒灵诱导人肝癌细胞凋亡及有氧糖酵解中起到怎样的作用?本课题选取人肝癌细胞株SMMC-7721、Bel-7402,以Beclin 1复合物系统相关信号通路研究蟾毒灵抑制人肝癌细胞自噬的作用靶点,阐明自噬在蟾毒灵诱导人肝癌细胞死亡中的作用。目的:本课题以人肝癌细胞株SMMC-7721、Bel-7402为研究对象,并建立了人肝癌细胞荷瘤鼠模型,在体、内外研究蟾毒灵对人肝癌细胞自噬的抑制作用,并分别通过激活和抑制自噬观察蟾毒灵对人肝癌细胞增殖、凋亡、有氧糖酵解的作用,明确自噬在蟾毒灵诱导人肝癌细胞死亡中的作用和地位。通过人基因表达谱芯片,探讨蟾毒灵诱导人肝癌细胞死亡可能的相关作用机制,为以后蟾毒灵的抗肿瘤研究提供实验基础和思路。方法:第一部分蟾毒灵对人肝癌细胞增殖、凋亡、自噬、有氧糖酵解的影响采用MTT法检测不同浓度蟾毒灵作用四种人肝癌细胞株SMMC-7721、Hep G2、Hep3B、Bel-7402的细胞增殖抑制率;通过Annexin V-FIFC/PI双染法检测不同浓度蟾毒灵作用人肝癌SMMC-7721、Bel-7402细胞24h后细胞凋亡情况;采用透射电镜检测不同浓度蟾毒灵作用人肝癌SMMC-7721细胞24h后胞内自噬体的形成情况;对人肝癌SMMC-7721细胞进行p-EGFP-LC3质粒转染,荧光显微镜下观察蟾毒灵作用人肝癌SMMC-7721细胞24h后LC3表达的情况;Western-blot检测细胞自噬标志蛋白LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin 1、P62、ATG5表达的情况;q RT-PCR检测肿瘤细胞有氧糖酵解关键蛋白GLUT1、LDHA、HK2及自噬标志蛋白Beclin 1 m RNA的表达水平。第二部分自噬机制在蟾毒灵诱导人肝癌细胞增殖、凋亡及有氧糖酵解的作用采用MTT法、Annexin V-FIFC/PI双染法、Western-blot、q RT-PCR检测自噬抑制剂氯喹（Chloroquine,CQ）、自噬激活剂雷帕霉素（Rapamycin,RAPA）单独和联合100 n M蟾毒灵对人肝癌SMMC-7721细胞分别作用24 h后的细胞增殖抑制率、细胞凋亡、有氧糖酵解情况。采用人基因表达谱芯片检测蟾毒灵作用相关的靶标及信号通路。第三部分ROS及线粒体动力蛋白相关蛋白Drp1在蟾毒灵诱导人肝癌细胞死亡中的作用采用流式细胞术检测蟾毒灵干预人肝癌SMMC-7721细胞后ROS的产生水平;采用MTT法、Annexin V-FIFC/PI双染法、Western-blot、q RT-PCR检测ROS抑制剂NAC单独和联合100 n M蟾毒灵对人肝癌SMMC-7721细胞分别作用24 h后的细胞增殖抑制率、细胞凋亡、有氧糖酵解情况。构建Drp 1干扰和过表达质粒,病毒包装后感染SMMC-7721细胞,q RT-PCR检测NAC单独和联合100 n M蟾毒灵对细胞内HK2、Beclin1 m RNA表达水平的影响。第四部分蟾毒灵及NAC对人肝癌细胞增殖、凋亡、自噬、有氧糖酵解影响的体内研究构建人肝癌SMMC-7721细胞荷瘤裸鼠模型,裸鼠成瘤后,随机分为阴性对照组、蟾毒灵组[1.5 mg/（kg·d）]、NAC[300 mg/（kg·d）]组、蟾毒灵+NAC组,连续给药10天。测量肿瘤体积,免疫组化检测各组皮下瘤组织中有氧糖酵解相关蛋白及Beclin1、Cleaved Caspase-3蛋白表达情况。结果:第一部分蟾毒灵对人肝癌细胞增殖、凋亡、自噬、有氧糖酵解的影响1、蟾毒灵对四种人肝癌细胞增殖均具有一定的抑制作用,其抑制作用呈药物剂量依赖性;在相同浓度药物干预下,蟾毒灵对SMMC-7721、Bel-7402细胞增殖的抑制作用强于Hep G2、Hep3B细胞。流式细胞术检测结果提示,蟾毒灵能诱导人肝癌SMMC-7721、Bel-7402细胞凋亡,且呈药物剂量依赖性。2、蟾毒灵处理SMMC-7721细胞24 h后能降低细胞内自噬水平,且呈药物剂量依赖性。蟾毒灵作用SMMC-7721细胞24 h后,细胞浆LC3 dots低于空白对照组。Western-blot检测结果显示,LC3-II向LC3-I的转化比率和Beclin 1蛋白表达量随蟾毒灵作用剂量增加而逐渐降低。q RT-PCR检测结果显示,蟾毒灵能降低SMMC-7721细胞中GLUT1、LDHA、HK2、Beclin 1 m RNA的表达水平。第二部分自噬机制在蟾毒灵诱导人肝癌细胞增殖、凋亡及有氧糖酵解的作用1、CQ、RAPA分别联合蟾毒灵均能增强蟾毒灵对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的抑制作用及细胞凋亡的诱导作用,CQ联合蟾毒灵作用效应强于RAPA联合蟾毒灵;2、CQ减弱蟾毒灵对SMMC-7721细胞中HK2 m RNA表达水平的抑制作用,而RAPA则增强蟾毒灵对SMMC-7721细胞中HK2 m RNA表达水平的抑制作用;Tab-Beclin 1诱导Beclin1的表达减弱蟾毒灵对SMMC-7721细胞中HK2 m RNA表达水平的抑制作用;3、人基因表达谱芯片结果IPA分析表明,蟾毒灵能显着激活SMMC-7721细胞中TNFR2 Signaling信号通路,上游调控因子TNF被预测为强烈激活。第三部分ROS及线粒体动力蛋白相关蛋白Drp1在蟾毒灵诱导人肝癌细胞死亡中的作用1、蟾毒灵能诱导人肝癌SMMC-7721细胞中ROS产生,且呈药物剂量依赖性;NAC联合蟾毒灵干预减弱了蟾毒灵对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的抑制作用及细胞凋亡的诱导作用;2、NAC联合蟾毒灵干预能增强蟾毒灵对LC3-II向LC3-I的转化比率及Beclin 1、ATG5蛋白表达量的抑制作用,增加P62蛋白表达水平;NAC联合蟾毒灵干预能增强蟾毒灵对HK2 m RNA表达水平的抑制作用;3、Drp1敲减后能减弱蟾毒灵对SMMC-7721细胞Beclin1、HK2 m RNA表达水平的抑制作用;Drp1敲减增加了NAC联合蟾毒灵作用SMMC-7721细胞后胞内Beclin1、HK2 m RNA的表达水平。第四部分蟾毒灵及NAC对人肝癌细胞增殖、凋亡、自噬、有氧糖酵解影响的体内研究1、蟾毒灵能明显抑制人肝癌荷瘤鼠皮下瘤的生长,而NAC则能促进人肝癌荷瘤鼠皮下瘤的生长;联合NAC后,减弱了蟾毒灵对人肝癌荷瘤鼠皮下瘤生长的抑制作用;2、蟾毒灵抑制GLUT1、LDHA、HK2、PKM2、Beclin1的表达、诱导Cleaved Caspase-3表达上调。结论:1、蟾毒灵能抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖、自噬、有氧糖酵解、诱导细胞凋亡;2、联合自噬抑制剂可增强蟾毒灵对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的诱导作用;3、蟾毒灵诱导细胞产生的ROS对其抑制人肝癌SMMC-7721细胞自噬呈负向调节作用,Drp1可能参与此调节过程;4、蟾毒灵通过作用于Drp1抑制Beclin1的表达而抑制HK 2的表达,进而抑制人肝癌SMMC-7721细胞有氧糖酵解。
刘逍[10]（2020）在《磁性Fe3O4/Fe2O3异质体纳米棒负载雷公藤红素传递系统的构建及其对SMMC-7721细胞凋亡的影响》文中研究表明雷公藤红素优异的抗肿瘤活性使其有望成为比顺铂、紫杉醇等传统化疗药物更高效的抗肿瘤药物。但其水溶性差,生物利用度低和易造成全身毒性等缺点均阻碍其临床应用。近年来,使用磁性氧化铁纳米材料作为载体实现对抗肿瘤药物的准确递送成为研究热点之一。纳米材料的棒状形态带来的优异细胞/组织穿透效果同样受到科研领域的广泛关注。本文以氧化铁异质体纳米棒作为雷公藤红素的载药体系,实现雷公藤红素的高负载量和缓释效应,增强雷公藤红素的治疗效果,减少副作用,为难溶于水的天然中草药提取物在临床上的应用开辟新道路,也为肝癌的治疗和预防提供新思路。具体研究结论如下:（1）磁性Fe3O4/Fe2O3异质体纳米棒的制备以无机盐为基本原料,采用水热法制备了α-FeOOH纳米棒。探究了反应温度、滴定速度、溶液浓度、反应压强对α-FeOOH纳米棒形貌的影响规律,发现α-FeOOH纳米棒长度和直径均随滴定速度、溶液浓度的增加而增大;反应压强的增加可使材料长度增大但直径减小。在FeCl3与KOH浓度为0.1 M、滴定速度为30 mL·h-1、中等压力条件下可得到理想尺寸的α-FeOOH纳米棒,其长度为170 nm,直径为40 nm。以α-FeOOH纳米棒为前体,采用快速燃烧法制备了磁性Fe3O4/Fe2O3异质体纳米棒,考察乙醇体积、煅烧温度对Fe3O4/Fe2O3异质体形貌、组分以及磁性的影响,发现Fe3O4/Fe2O3异质体的长度、直径随煅烧温度的升高呈先增减小后增大的趋势;Fe3O4的含量和Fe3O4/Fe2O3的磁饱和强度都分别随煅烧温度的升高、乙醇体积的增加呈先增大后减小的趋势。通过XRD可初步判断Fe3O4/Fe2O3异质体纳米棒中相的比例,确定30 mL乙醇与300 oC煅烧温度可得到磁性能较强的Fe3O4/Fe2O3异质体纳米棒,其磁饱和强度最高为33.2 emu·g-1,平均长度为140 nm,平均直径为20 nm。（2）磁性Fe3O4/Fe2O3/CA-PEG-celastrol纳米复合物（Fe3O4/Fe2O3/CA-PEG-CST）的构建及评价采用柠檬酸和PEG通过EDC/NHS反应对Fe3O4/Fe2O3异质体纳米棒进行修饰,改善其在水溶液中的分散特性,进行雷公藤红素的负载,探究雷公藤红素的负载条件,并进行药物释放实验。结果显示,Fe3O4/Fe2O3/CA-PEG-CST的水动力学尺寸范围为250500 nm,表面电位为-15 mV,饱和磁化强度为23emu·g-1,具有优秀的磁响应性能。此外,对Fe3O4/Fe2O3/CA-PEG的药物负载及释放效果进行评价,其具有较好的载药效果,且Fe3O4/Fe2O3/CA-PEG-CST具备药物缓释及pH敏感特性。（3）Fe3O4/Fe2O3/CA-PEG-CST对肝癌细胞SMMC-7721的凋亡作用机制对制备得到的Fe3O4/Fe2O3/CA-PEG-CST进行体外细胞实验,探究其对肝癌细胞SMMC-7721的作用。普鲁士蓝以及电化学方法证明:Fe3O4/Fe2O3/CA-PEG-CST可被肝癌细胞SMMC-7721所摄取,磁场可显着提升细胞对载体的摄取能力。MTT检测结果表明:Fe3O4/Fe2O3和Fe3O4/Fe2O3/CA-PEG对肝癌细胞及正常肝细胞L-02无细胞毒性,证明了载体良好的细胞相容性。由于Fe3O4/Fe2O3/CA-PEG-CST的缓释效果,无磁场条件下载药载体对肝癌细胞的抑制作用弱于游离的雷公藤红素,降低了药物毒性。磁场作用影响明显,可显着促进Fe3O4/Fe2O3/CA-PEG-CST对肝癌细胞活性的抑制。Fe3O4/Fe2O3/CA-PEG-CST可抑制细胞迁移,促进细胞内ROS表达。通过免疫蛋白印迹法对细胞凋亡相关蛋白（p53、Bax、Bcl-2）、低氧诱导因子（HIF-1α）进行检测,并用NAC活性氧清除剂对相关通路进行验证。Fe3O4/Fe2O3/CA-PEG-CST促进细胞凋亡的机制为:Fe3O4/Fe2O3与CST促进细胞内ROS表达,进而使低氧诱导因子HIF-1α积累增加,促进p53积累,进而激活p53诱导的细胞凋亡通路,使Bax、caspase-3表达上升,Bcl-2表达下降,从而导致细胞凋亡。
二、SMMC-7721细胞诱导耐药培养中电镜形态的改变（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、SMMC-7721细胞诱导耐药培养中电镜形态的改变（论文提纲范文）
（1）共表达Apoptin与MEL基因重组腺病毒的构建及其对肝癌抑制作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 重组腺病毒在肝癌治疗中的研究进展 |
| 1.1.1 肝癌的研究背景 |
| 1.1.2 腺病毒载体的研究现状和问题 |
| 1.1.2.1 腺病毒载体的研究现状 |
| 1.1.2.2 腺病毒载体在肿瘤治疗中的进展 |
| 1.2 肿瘤靶向肽与细胞穿膜肽在肿瘤治疗中的研究进展 |
| 1.2.1 肿瘤靶向肽在肿瘤治疗中的研究进展 |
| 1.2.2 细胞穿膜肽在肿瘤治疗中的研究进展 |
| 1.3 蜂毒肽的抑瘤机制及研究进展 |
| 1.3.1 蜂毒肽的抑瘤机制 |
| 1.3.2 蜂毒肽的研究进展 |
| 1.4 凋亡素的抑瘤机制及研究进展 |
| 1.4.1 凋亡素的抑瘤机制 |
| 1.4.2 凋亡素的研究进展 |
| 1.5 研究方案 |
| 1.5.1 技术路线 |
| 1.5.2 研究内容及意义 |
| 第二章 共表达GV-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL腺病毒穿梭载体的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 菌株和载体 |
| 2.1.1.2 试剂 |
| 2.1.1.3 主要仪器 |
| 2.1.1.4 溶液和培养基 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 引物设计 |
| 2.1.2.2 重组质粒pMD-TAT-Apoptin和 pMD-UBI-RGD-MEL提取 |
| 2.1.2.3 高保真扩增目的基因TAT-Apoptin和 UBI-RGD-MEL |
| 2.1.2.4 PCR产物胶回收 |
| 2.1.2.5 重组腺病毒载体构建 |
| 2.1.2.6 连接产物转化DH5α感受态细胞 |
| 2.1.2.7 重组质粒的鉴定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 目的基因特异性扩增 |
| 2.2.2 GV-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL重组质粒鉴定 |
| 2.2.3 GV-TAT-Apoptin重组质粒鉴定 |
| 2.2.4 GV-RGD-MEL重组质粒鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 共表达Ad-TAT-Apoptin+UBI-RGD-MEL重组腺病毒的包装与鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 菌株、细胞系和载体 |
| 3.1.1.2 主要试剂 |
| 3.1.1.3 主要仪器 |
| 3.1.1.4 溶液和培养基 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 细胞培养 |
| 3.1.2.2 重组腺病毒穿梭质粒与大骨架质粒提取 |
| 3.1.2.3 共转染HEK293A细胞 |
| 3.1.2.4 重组腺病毒扩增与纯化 |
| 3.1.2.5 重组腺病毒滴度测定 |
| 3.1.2.6 RT-PCR检测目的基因的表达 |
| 3.1.2.7 间接免疫荧光检测目的基因表达 |
| 3.1.2.8 Western blotting检测目的蛋白表达 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 各重组腺病毒包装及滴度测定 |
| 3.2.2 RT-PCR检测目的基因转录情况 |
| 3.2.3 各重组腺病毒感染SMMC-7721 肝癌细胞情况 |
| 3.2.4 Western blotting检测SMMC-7721 细胞中目的基因表达情况 |
| 3.2.5 间接免疫荧光检测SMMC-7721 细胞中目的基因表达 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 重组腺病毒体外抑瘤作用研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.1.1 重组腺病毒和细胞系 |
| 4.1.1.2 主要试剂 |
| 4.1.1.3 主要仪器 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.2.1 CCK-8 法检测重组腺病毒对SMMC-7721 细胞、Huh7 细胞、L-02 细胞的杀伤作用 |
| 4.1.2.2 Western blotting检测凋亡相关蛋白表达 |
| 4.1.2.3 流式细胞术检测SMMC-7721 细胞凋亡情况 |
| 4.1.2.4 细胞划痕试验检测SMMC-7721 细胞迁移能力 |
| 4.1.2.5 细胞趋化试验检测FBS介导的SMMC-7721 细胞迁移能力 |
| 4.1.2.6 细胞侵袭试验检测SMMC-7721 细胞侵袭能力 |
| 4.1.2.7 ROS检测重组腺病毒对SMMC-7721 细胞活性氧含量影响 |
| 4.1.2.8 TUNEL检测SMMC-7721 细胞凋亡情况 |
| 4.1.2.9 扫描电镜观察 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 各重组腺病毒抑制L-02 细胞增殖 |
| 4.2.2 各重组腺病毒抑制SMMC-7721 细胞增殖 |
| 4.2.3 各重组腺病毒抑制Huh7 细胞增殖 |
| 4.2.4 各重组腺病毒SMMC-7721 细胞凋亡蛋白表达 |
| 4.2.5 流式细胞术检测SMMC-7721 细胞凋亡结果 |
| 4.2.6 细胞划痕试验结果 |
| 4.2.7 细胞趋化试验结果 |
| 4.2.8 细胞侵袭试验结果 |
| 4.2.9 ROS含量检测结果 |
| 4.2.10 TUNEL检测SMMC-7721 细胞凋亡 |
| 4.2.11 扫描电镜观察各重组腺病毒诱导SMMC-7721 细胞形态变化 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 重组腺病毒体内抑瘤作用研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.1.1 细胞系和试验动物 |
| 5.1.1.2 主要试剂 |
| 5.1.1.3 主要仪器 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.2.1 SMMC-7721 实体瘤模型的建立与荷瘤裸鼠治疗 |
| 5.1.2.2 病理切片制备及HE染色 |
| 5.1.2.3 免疫组织化学染色 |
| 5.1.2.4 TUNEL染色 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 荷瘤裸鼠体重变化曲线 |
| 5.2.2 各重组腺病毒对荷瘤裸鼠内脏器官及肿瘤重量影响 |
| 5.2.3 裸鼠各组织HE染色结果 |
| 5.2.4 肿瘤组织免疫组织化学结果 |
| 5.2.5 TUNEL染色结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 英文缩写词表 |
| 攻读硕士学位论文期间发表的论文及着作 |
（2）新型NO供体聚合物紫杉醇胶束的制备及抗肿瘤作用和机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束的制备和表征 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果与分析 |
| 4 讨论与小结 |
| 第二部分 一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束急性毒性研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果与分析 |
| 4 讨论与小结 |
| 第三部分 一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束药物动力学研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果与分析 |
| 4 讨论与小结 |
| 第四部分 一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束体外抗肿瘤细胞及对P-糖蛋白的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果与分析 |
| 4 讨论与小结 |
| 第五部分 一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束抗结肠癌和紫杉醇耐药性结肠癌作用机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果与分析 |
| 4 讨论与小结 |
| 第六部分 一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束抗肝癌作用机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果与分析 |
| 4 讨论与小结 |
| 第七部分 一氧化氮供体型聚合物紫杉醇胶束药性评价 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果和讨论 |
| 4 讨论与小结 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 一氧化氮对肿瘤作用的浓度依赖作用和化疗增敏机制 |
| References |
| 个人简介 |
（3）双硫仑/铜复合物（CuET）抑制肝癌细胞增殖诱导细胞凋亡的分子机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 双硫仑/铜复合物抑制细胞增殖活性诱导细胞凋亡 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 双硫仑/铜复合物促进线粒体过度分裂诱导线粒体损伤 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 双硫仑/铜复合物促进Drp1 Ser637 位点去磷酸化与Drp1 线粒体转位 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 双硫仑/铜复合物诱导肝癌细胞产生ROS |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 线粒体动力学与相关疾病 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（4）血竭素高氯酸盐通过内质网应激诱导肝细胞癌凋亡的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 肝细胞癌流行病学概述 |
| 1.2 肝细胞癌的治疗现状 |
| 1.2.1 概述 |
| 1.2.2 外科及介入治疗 |
| 1.2.3 临床系统药物治疗 |
| 1.3 内质网应激在肝细胞癌中的多重调控作用 |
| 1.3.1 内质网应激概述 |
| 1.3.2 内质网应激与肿瘤 |
| 1.3.3 内质网应激与肝癌 |
| 1.4 血竭素高氯酸盐的研究现状 |
| 第二章 实验材料及方法 |
| 2.1 实验器材及试剂 |
| 2.1.1 实验器材 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 体外实验用血竭素高氯酸盐溶液配制 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 细胞活力检测实验 |
| 2.2.4 荧光显微镜细胞核形态检测 |
| 2.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.2.6 流式细胞仪检测线粒体膜电势(MMP) |
| 2.2.7 电子显微镜检测细胞器形态 |
| 2.2.8 RNA-seq |
| 2.2.9 实时荧光定量PCR(q RT-PCR) |
| 2.2.10 裸鼠皮下肝癌移植瘤模型建立及相关实验 |
| 2.2.11 提取细胞总蛋白 |
| 2.2.12 Westen blot法检测细胞及组织蛋白变化 |
| 2.2.13 HE染色观察组织结构 |
| 2.2.14 TUNEL凋亡检测 |
| 2.2.15 免疫组化检测 |
| 2.2.16 统计 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 血竭素高氯酸盐对人肝癌细胞及正常肝细胞的影响 |
| 3.1.1 MTT法检测显示血竭素高氯酸盐使人肝癌细胞系细胞活力显着下降 |
| 3.1.2 MTT法检测显示血竭素高氯酸盐对人正常肝细胞的细胞毒性明显小于人肝癌细胞系 |
| 3.1.3 荧光显微镜下发现血竭素高氯酸盐诱导肝癌细胞发生凋亡改变 |
| 3.1.4 凋亡抑制剂Z-VAD-FMK逆转血竭素高氯酸盐对肝癌细胞的抑制 |
| 3.1.5 流式细胞仪定量检测血竭素高氯酸盐诱导的细胞凋亡 |
| 3.1.6 血竭素高氯酸盐引起肝癌细胞凋亡蛋白改变 |
| 3.2 基于转录组测序探究血竭素高氯酸盐对肝细胞癌产生的生物过程改变 |
| 3.2.1 测序基因质量控制 |
| 3.2.2 差异基因分析 |
| 3.2.3 基于差异基因的GO富集分析 |
| 3.2.4 基于基因表达矩阵的信号通路富集分析 |
| 3.2.5 qRT-PCR验证 |
| 3.3 电子显微镜观察血竭素高氯酸盐诱发肝癌细胞形态学改变 |
| 3.4 血竭素高氯酸盐可诱导肝癌细胞发生线粒体途径凋亡 |
| 3.4.1 血竭素高氯酸盐诱导线粒体途径凋亡标志性蛋白上调 |
| 3.4.2 流式细胞仪检测提示血竭素高氯酸盐诱导肝癌细胞线粒体膜电势降低 |
| 3.5 血竭素高氯酸盐诱导肝癌细胞内质网应激 |
| 3.5.1 血竭素高氯酸盐诱导肝癌细胞内质网应激相关蛋白改变 |
| 3.5.2 4-PBA减轻血竭素高氯酸盐对的肝癌细胞的毒性 |
| 3.5.3 4-PBA逆转血竭素高氯酸盐诱导肝癌细胞凋亡 |
| 3.5.4 4-PBA逆转血竭素高氯酸盐诱导的线粒体膜电势降低 |
| 3.5.5 4-PBA逆转血竭素高氯酸盐诱导的线粒体途径凋亡蛋白改变 |
| 3.6 mTORC1 信号通路在血竭素高氯酸盐诱导细胞凋亡中的作用 |
| 3.6.1 血竭素高氯酸盐上调肝癌细胞内mTORC1 信号通路相关蛋白 |
| 3.6.2 Torin-1 逆转血竭素高氯酸盐诱导的肝癌细胞毒性 |
| 3.6.3 Torin-1 逆转血竭素高氯酸盐诱导的内质网应激通路激活 |
| 3.6.4 Torin-1 逆转血竭素高氯酸盐诱导的细胞凋亡 |
| 3.6.5 Torin-1 逆转血竭素高氯酸盐诱导的线粒体膜电势降低 |
| 3.7 血竭素高氯酸盐在体内对肝癌移植瘤小鼠的影响 |
| 3.7.1 血竭素高氯酸盐抑制肝癌移植瘤生长 |
| 3.7.2 血竭素高氯酸盐对移植瘤小鼠重要脏器无明显毒性作用 |
| 3.7.3 HE染色提示血竭素高氯酸盐影响肝癌移植瘤组织结构 |
| 3.7.4 TUNEL染色检测肿瘤组织凋亡 |
| 3.7.5 免疫组化发现血竭素高氯酸盐诱导肝癌移植瘤p-4EBP1、p-PERK及 CHOP表达上调。 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 第六章 创新点与不足 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）Regorafenib对肝癌细胞侵袭转移和VM形成的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 Regorafenib通过靶向ID1 介导的EMT抑制肝癌细胞侵袭转移及VM形成 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞系和免疫缺陷小鼠 |
| 1.2 临床标本 |
| 1.3 慢病毒表达系统 |
| 1.4 主要试剂及试剂盒 |
| 1.5 主要抗体 |
| 1.6 主要仪器及耗材 |
| 1.7 主要溶液及配制 |
| 2.方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 质粒构建 |
| 2.3 慢病毒制备 |
| 2.4 慢病毒感染肝癌细胞 |
| 2.5 倒置荧光显微镜观察细胞形态 |
| 2.6 Western blot检测蛋白表达水平 |
| 2.7 qRT-PCR法检测基因敲减或过表达效率 |
| 2.8 CCK8 检测细胞活力及增殖能力 |
| 2.9 生长曲线法检测细胞生长能力的变化 |
| 2.10 划痕实验检测细胞迁移能力的变化 |
| 2.11 Transwell小室实验检测细胞迁移侵袭能力的变化 |
| 2.12 管状形成实验检测细胞VM形成能力 |
| 2.13 转录组测序分析寻找差异基因 |
| 2.14 CETSA实验检测药物与靶蛋白结合 |
| 2.15 PDX模型的复苏及移植 |
| 2.16 裸鼠肺转移模型的建立 |
| 2.17 细胞免疫荧光法检测蛋白的表达 |
| 2.18 组织免疫荧光法检测蛋白的表达 |
| 2.19 HE染色 |
| 2.20 免疫组化染色 |
| 2.21 CD34-PAS双染鉴定VM结构 |
| 2.22 统计学分析 |
| 结果 |
| 1.Regorafenib抑制肝癌细胞迁移侵袭、VM形成及相关蛋白表达 |
| 1.1 Regorafenib有效抑制肝癌细胞活力 |
| 1.2 Regorafenib抑制肝癌细胞迁移侵袭能力 |
| 1.3 Regorafenib抑制肝癌细胞VM形成能力 |
| 1.4 Regorafenib抑制肝癌细胞中EMT及 VM相关蛋白表达 |
| 2.Regorafenib显着抑制ID1 表达 |
| 2.1 转录组测序分析Regorafenib可显着抑制ID1 表达水平 |
| 2.2 mRNA及蛋白水平验证Regorafenib抑制ID1 表达 |
| 3.分析临床肝癌样本中ID1与EMT及 VM蛋白标记物表达相关性 |
| 3.1 ID1与EMT及 VM相关蛋白表达呈线性相关 |
| 3.2 ID1 高表达增加临床肝癌样本中VM结构 |
| 3.3 Western blot及免疫组化证明临床肝癌样本中ID1与EMT及 VM蛋白标记物表达相关 |
| 4.ID1 敲减抑制肝癌细胞侵袭转移、VM形成及EMT相关蛋白表达 |
| 4.1 sh ID1 显着下调ID1 蛋白表达水平 |
| 4.2 ID1 敲减抑制了肝癌细胞迁移侵袭及VM形成能力 |
| 4.3 ID1 敲减抑制肝癌细胞中EMT及 VM相关蛋白表达 |
| 4.4 ID1 敲减抑制肝癌细胞体内转移能力 |
| 5.ID1 过表达增强肝癌细胞迁移侵袭、VM形成能力及EMT、VM相关蛋白表达 |
| 5.1 ID1 过表达对肝癌细胞增殖能力没有影响 |
| 5.2 ID1 过表达增强肝癌细胞迁移侵袭及VM形成能力 |
| 5.3 ID1 过表达促进了肝癌细胞中EMT及 VM相关蛋白表达 |
| 6.ID1是Regorafenib的靶标 |
| 6.1 ID1 敲减后减弱了Regorafenib对肝癌细胞迁移能力的抑制 |
| 6.2 ID1 回补恢复了Regorafenib对肝癌细胞迁移侵袭能力的抑制 |
| 6.3 CETSA实验证明ID1是Regorafenib的靶标 |
| 7.ID1 调控Snail影响肝癌细胞迁移、侵袭及VM形成能力 |
| 7.1 临床肝癌样本中Snail与 ID1 表达成正相关 |
| 7.2 Snail过表达不影响sh ID1 肝癌细胞的增殖能力 |
| 7.3 Snail过表达增强了sh ID1 肝癌细胞的迁移侵袭及VM形成能力 |
| 7.4 Snail敲减不影响OE-ID1 肝癌细胞的增殖能力 |
| 7.5 Snail敲减抑制了OE-ID1 肝癌细胞的迁移侵袭及VM形成能力 |
| 8.Regorafenib有效抑制肿瘤生长及VM形成 |
| 8.1 Regorafenib有效抑制肿瘤生长 |
| 8.2 Regorafenib有效抑制肿瘤形成VM结构 |
| 8.3 Regorafenib有效抑制肿瘤组织中EMT及 VM相关蛋白表达 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 CD90 调节Pin1 影响肝癌Regorafenib耐药细胞的侵袭转移及VM形成能力 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞系和免疫缺陷小鼠 |
| 1.2 临床标本 |
| 1.3 慢病毒表达系统 |
| 1.4 主要试剂及试剂盒 |
| 1.5 主要抗体 |
| 1.6 主要仪器及耗材 |
| 1.7 主要溶液及配制 |
| 2.方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 质粒构建 |
| 2.3 慢病毒制备 |
| 2.4 慢病毒感染肝癌细胞 |
| 2.5 倒置荧光显微镜观察细胞形态 |
| 2.6 Western blot检测蛋白表达水平 |
| 2.7 q RT-PCR法检测基因敲减或过表达效率 |
| 2.8 CCK8 检测细胞活力及增值能力 |
| 2.9 生长曲线法检测细胞生长能力的变化 |
| 2.10 划痕实验检测细胞迁移能力的变化 |
| 2.11 Transwell小室实验检测细胞迁移侵袭能力的变化 |
| 2.12 管状形成实验检测细胞VM形成能力 |
| 2.13 转录组测序分析寻找差异基因 |
| 2.14 CHX试验检测蛋白稳定性 |
| 2.15 裸鼠肺转移模型的建立 |
| 2.16 细胞免疫荧光法检测蛋白的表达 |
| 2.17 HE染色 |
| 2.18 免疫组化染色 |
| 2.19 CD34-PAS双染鉴定VM结构 |
| 2.20 Co-immunoprecipitation检测蛋白相互作用 |
| 2.21 GST-pull down检测蛋白相互作用 |
| 2.22 统计学分析 |
| 结果 |
| 1.肝癌细胞Regorafenib耐药后迁移侵袭及VM形成能力增强 |
| 1.1 MHCC-97H/Rego耐药细胞株的筛选及鉴定 |
| 1.2 MHCC-97H细胞Regorafenib耐药后增殖能力增强 |
| 1.3 MHCC-97H细胞Regorafenib耐药后迁移侵袭能力增强 |
| 1.4 肝癌细胞Regorafenib耐药后VM形成能力增强 |
| 1.5 肝癌细胞Regorafenib耐药后EMT及 VM相关蛋白表达增加 |
| 2.CD90 在肝癌Regorafenib耐药细胞中高表达 |
| 2.1 转录组测序分析肝癌细胞Regorafenib耐药后CD90 高表达 |
| 2.2 mRNA及蛋白水平验证肝癌细胞Regorafenib耐药后CD90 表达上调 |
| 3.肝癌细胞Regorafenib耐药后肿瘤组织中VM结构增多且EMT及 VM相关蛋白发生改变 |
| 3.1 肝癌细胞Regorafenib耐药后肿瘤增殖能力增强 |
| 3.2 肝癌细胞Regorafenib耐药使肿瘤组织中EMT及 VM相关蛋白表达增加 |
| 3.3 肝癌细胞Regorafenib耐药后肿瘤组织中VM结构增多 |
| 4.CD90 敲减抑制肝癌Regorafenib耐药细胞的迁移侵袭、VM形成及体内转移能力 |
| 4.1 CD90 敲减不影响肝癌Regorafenib耐药细胞的增殖能力 |
| 4.2 CD90 敲减抑制肝癌Regorafenib耐药细胞的迁移侵袭能力 |
| 4.3 CD90 敲减抑制肝癌Regorafenib耐药细胞的VM形成能力 |
| 4.4 CD90 敲减抑制肝癌Regorafenib耐药细胞中EMT及 VM相关蛋白表达 |
| 4.5 CD90 敲减抑制肝癌Regorafenib耐药细胞的体内转移能力 |
| 4.6 CD90 敲减抑制肝癌Regorafenib耐药细胞的体内EMT及 VM相关蛋白表达 |
| 5.CD90 调节Pin1 影响肝癌细胞迁移侵袭及VM形成能力 |
| 5.1 CD90 调节Regorafenib耐药细胞中Pin1 表达 |
| 5.2 Pin1 敲减抑制了肝癌Regorafenib耐药细胞的VM形成能力 |
| 5.3 Pin1 过表达使肝癌细胞形态发生改变 |
| 5.4 Pin1 过表达增强肝癌细胞迁移侵袭及VM形成能力 |
| 5.5 Pin1 过表达使肝癌细胞中EMT及 VM相关蛋白表达增加 |
| 6.Pin1 上调Gli1 促进肝癌细胞迁移侵袭及VM形成能力 |
| 6.1 肝癌临床标本中Gli1与Pin1 蛋白表达正相关 |
| 6.2 Pin1与Gli1 相互作用 |
| 6.3 Pin1 调控Gli1 蛋白稳定性 |
| 6.4 Gli1 敲减抑制Flag-Pin1 细胞的迁移侵袭及VM形成能力 |
| 7.Dasatinib可逆转肝癌Regorafenib耐药 |
| 7.1 Dasatinib对肝癌Regorafenib耐药细胞活力的影响 |
| 7.2 Dasatinib抑制肝癌Regorafenib耐药细胞的迁移侵袭及VM形成能力 |
| 7.3 Dasatinib抑制肝癌Regorafenib耐药细胞中EMT及 VM相关蛋白表达 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 肝细胞癌中VM形成的主要机制及靶向治疗 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（6）桑黄总提物及其活性单体紫萁酮抗肿瘤作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要1 |
| Abstract1 |
| 中文摘要2 |
| Abstract2 |
| 第一部分 桑黄总提物诱导黑色素瘤A375细胞凋亡的作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验试剂、材料与仪器 |
| 2.1 实验药物与试剂 |
| 2.2 实验动物与细胞 |
| 2.3 实验仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 桑黄总提物制备 |
| 3.2 细胞培养 |
| 3.3 CCK-8 法检测细胞活力 |
| 3.4 细胞形态学观察 |
| 3.5 流式细胞术检测细胞周期分布 |
| 3.6 Hoechst33258 染色 |
| 3.7 Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡 |
| 3.8 线粒体膜电位(MMP)检测 |
| 3.9 迁移和侵袭实验 |
| 3.10 蛋白免疫印迹分析 |
| 3.11 裸鼠皮下异种移植瘤实验 |
| 3.12 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 桑黄总提物对五种人源肿瘤细胞系的增殖抑制作用 |
| 4.2 桑黄总提物对A375 细胞形态的影响 |
| 4.3 桑黄总提物将A375 细胞阻滞在细胞周期S期 |
| 4.4 桑黄总提物诱导A375 细胞凋亡 |
| 4.5 桑黄总提物诱导A375 细胞MMP下降 |
| 4.6 桑黄总提物对凋亡相关蛋白表达水平的调控 |
| 4.7 桑黄总提物抑制A375 细胞迁移和侵袭 |
| 4.8 桑黄总提物抑制裸鼠皮下异种移植瘤的生长 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 桑黄活性单体紫萁酮对非小细胞肺癌的抗肿瘤作用及机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验试剂、材料与仪器 |
| 2.1 实验药物与试剂 |
| 2.2 实验动物与细胞 |
| 2.3 实验仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 细胞增殖实验 |
| 3.2.1 MTT法检测细胞活力 |
| 3.2.2 克隆集落形成实验 |
| 3.2.3 流式细胞术检测细胞周期分布 |
| 3.3 细胞形态学观察 |
| 3.4 电镜观察细胞线粒体形态 |
| 3.5 线粒体膜电位检测 |
| 3.6 能量代谢物检测 |
| 3.6.1 α-KG和 NADH检测 |
| 3.6.2 ATP实时速率检测 |
| 3.7 实时荧光定量PCR分析 |
| 3.7.1 总RNA提取 |
| 3.7.2 定量 |
| 3.7.3 逆转录 |
| 3.7.4 实时荧光定量PCR检测 |
| 3.7.5 引物信息 |
| 3.7.6 转染 |
| 3.8 蛋白免疫印迹分析 |
| 3.9 体内实验 |
| 3.9.1 裸鼠皮下异种移植瘤实验 |
| 3.9.2 基于代谢组学的血清代谢物分析 |
| 3.9.3 基于蛋白组学的组织蛋白表达分析 |
| 3.10 统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 紫萁酮抑制非小细胞肺癌细胞增殖 |
| 4.1.1 紫萁酮剂量依赖性抑制H460 和A549 细胞增殖 |
| 4.1.2 紫萁酮抑制H460 和A549 细胞克隆形成 |
| 4.1.3 紫萁酮将H460 和A549 细胞阻滞在细胞周期G2/M期 |
| 4.2 紫萁酮改变H460 和A549 细胞形态 |
| 4.3 紫萁酮抑制裸鼠皮下异种移植瘤生长 |
| 4.4 紫萁酮在体内外抑制谷氨酰胺-谷氨酸-α-KG代谢通路 |
| 4.4.1 紫萁酮改变模型组裸鼠血清谷氨酰胺代谢通路 |
| 4.4.2 紫萁酮下调谷氨酸脱氢酶GLUD1 的表达 |
| 4.4.3 紫萁酮抑制GLUD1 催化产物α-KG产生 |
| 4.5 紫萁酮抑制线粒体氧化磷酸化 |
| 4.5.1 紫萁酮改变线粒体形态 |
| 4.5.2 紫萁酮下调线粒体膜电位 |
| 4.5.3 紫萁酮抑制NADH产生 |
| 4.5.4 紫萁酮抑制线粒体ATP产生 |
| 4.6 紫萁酮对裸鼠抑瘤作用的蛋白组学研究 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 附件:桑黄品种鉴定报告 |
| 综述 癌症中靶向线粒体的天然产物研究进展 |
| 参考文献 |
（7）新型多金属氧酸盐抗非小细胞肺癌作用及机制研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 恶性肿瘤的流行病学简介 |
| 1.1.1 全球恶性肿瘤流行病学简介 |
| 1.1.2 我国恶性肿瘤流行病学简介 |
| 1.2 恶性肿瘤的治疗 |
| 1.2.1 外科治疗 |
| 1.2.2 放射治疗 |
| 1.2.3 药物治疗 |
| 1.3 多金属氧酸盐的药物化学研究进展 |
| 第2章 多金属氧酸盐的合成表征及稳定性研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 化合物的合成 |
| 2.2.1 VMOP-31 的合成 |
| 2.2.2 AsMOP-8 的合成 |
| 2.3 化合物的结构分析和表征 |
| 2.3.1 VMOP-31 的结构分析和表征 |
| 2.3.2 AsMOP-8 的结构分析和表征 |
| 2.4 As MOP-8 稳定性研究 |
| 2.4.1 AsMOP-8在PBS中的稳定性 |
| 2.4.2 AsMOP-8 在氨基酸及谷胱甘肽中的稳定性 |
| 2.5 结果与讨论 |
| 第3章 多金属氧酸盐体外抗肿瘤活性筛选及毒性研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 VMOP-31 抗肿瘤活性及毒性 |
| 3.2.2 AsMOP-8 抗肿瘤活性及毒性 |
| 3.2.3 AsMOP-6 抗肿瘤活性及毒性 |
| 3.2.4 三种多金属氧酸盐抗肿瘤活性及毒性比较 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 三种多金属氧酸盐抗肿瘤活性比较 |
| 3.3.2 三种多金属氧酸盐对正常细胞毒性的比较 |
| 3.3.3 三种多金属氧酸盐抗 A549 细胞治疗指数的比较 |
| 第4章 AsMOP-8 急性毒性研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第 5 章 As MOP-8 体内抗非小细胞肺癌作用及毒性研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 小鼠的一般状态 |
| 5.2.2 AsMOP-8 体内抑瘤效果 |
| 5.2.3 小鼠外周血白细胞计数 |
| 5.2.4 小鼠脏器指数 |
| 5.2.5 小鼠各脏器病理改变 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 AsMOP-8 对小鼠一般状态的影响 |
| 5.3.2 AsMOP-8 体内抑瘤效果 |
| 5.3.3 AsMOP-8 对小鼠各脏器的影响 |
| 第6章 AsMOP-8 抗非小细胞肺癌机制的研究 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 体外实验结果 |
| 6.2.2 体内实验结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 AsMOP-8与ct DNA的相互作用 |
| 6.3.2 AsMOP-8与BSA的相互作用 |
| 6.3.3 AsMOP-8对A549 细胞周期的影响 |
| 6.3.4 AsMOP-8对A549 细胞凋亡的影响 |
| 6.3.5 AsMOP-8 对免疫功能的影响 |
| 第七章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（8）缺氧诱导肌动蛋白丝细胞骨架重塑促进肝细胞癌侵袭转移的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 肝癌组织中HIF-1α、PIP2和CAPZA1 的表达及其对HCC恶性进展的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 缺氧促进肝癌细胞PIP2合成的信号通路研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 PIP2 通过CAPZA1 调控肌动蛋白丝细胞骨架重塑的机制研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 阻断HIF-1α/PIP2/CAPZA1 信号通路对裸鼠肝脏原位移植癌侵袭转移的影响 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 肌动蛋白丝细胞骨架重塑在肿瘤细胞侵袭和迁移中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（9）自噬在蟾毒灵诱导人肝癌细胞凋亡及有氧糖酵解中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 蟾毒灵对人肝癌细胞增殖、凋亡、自噬、有氧糖酵解的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第二部分 自噬机制在蟾毒灵诱导人肝癌细胞增殖、凋亡及有氧糖酵解的作用 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第三部分 ROS及线粒体动力蛋白相关蛋白Drp1 在蟾毒灵诱导人肝癌细胞死亡中的作用 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 六、小结 |
| 第四部分 蟾毒灵及NAC对人肝癌细胞增殖、凋亡、自噬、有氧糖酵解影响的体内研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 蟾毒灵抗肿瘤机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（10）磁性Fe3O4/Fe2O3异质体纳米棒负载雷公藤红素传递系统的构建及其对SMMC-7721细胞凋亡的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 雷公藤红素概述 |
| 1.2 提高雷公藤红素水溶性的方法 |
| 1.3 磁性纳米颗粒概述 |
| 1.3.1 氧化铁纳米材料的形状 |
| 1.3.2 氧化铁纳米材料的制备 |
| 1.3.3 氧化铁纳米材料的表面修饰 |
| 1.4 细胞凋亡 |
| 1.4.1 低氧诱导因子HIF-1 与肿瘤的关系 |
| 1.4.2 肿瘤抑制因子p53 诱导的细胞凋亡 |
| 1.4.3 细胞凋亡中的治疗靶标 |
| 1.5 研究背景、目的及意义 |
| 1.5.1 研究背景 |
| 1.5.2 研究目的及意义 |
| 1.6 实验研究方案 |
| 第二章 磁性Fe_3O_4/Fe_2O_3 异质体纳米棒的制备与表征 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 磁性Fe_3O_4/Fe_2O_3 异质体纳米棒的制备 |
| 2.2.1 棒状FeOOH的制备 |
| 2.2.2 反应条件对FeOOH形貌的影响 |
| 2.2.3 磁性Fe_3O_4/Fe_2O_3 异质体纳米棒的制备 |
| 2.3 磁性Fe_3O_4/Fe_2O_3 异质体纳米棒的表征 |
| 2.4 结果及讨论 |
| 2.4.1 棒状FeOOH的制备 |
| 2.4.2 反应条件对FeOOH形貌的影响 |
| 2.4.3 磁性Fe_3O_4/Fe_2O_3 异质体纳米棒的表征 |
| 2.4.4 煅烧温度对Fe_3O_4/Fe_2O_3 异质体纳米棒形貌、组分的影响 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 棒状Fe_3O_4/Fe_2O_3/CA-PEG-CST纳米复合物的构建及评价 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 棒状Fe_3O_4/Fe_2O_3/CA-PEG-CST的制备 |
| 3.2.1 Fe_3O_4/Fe_2O_3/CA的制备 |
| 3.2.2 Fe_3O_4/Fe_2O_3/CA-PEG-OH的制备 |
| 3.2.3 Fe_3O_4/Fe_2O_3/CA-PEG-CST的制备 |
| 3.3 Fe_3O_4/Fe_2O_3/CA-PEG-CST的表征 |
| 3.4 载药量与释放量测定 |
| 3.5 结果与讨论 |
| 3.5.1 Fe_3O_4/Fe_2O_3/CA-PEG-CST的表征 |
| 3.5.2 雷公藤红素的负载及释放 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 棒状Fe_3O_4/Fe_2O_3/CA-PEG-CST对肝癌细胞的凋亡作用机制 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要溶液配制 |
| 4.2 实验内容 |
| 4.2.1 细胞培养 |
| 4.2.2 MTT检测细胞活力 |
| 4.2.3 细胞摄取及磁靶向实验 |
| 4.2.4 DCFH-DA探针法检测细胞内ROS水平 |
| 4.2.5 细胞内氧自由基检测 |
| 4.2.6 细胞形态学观察 |
| 4.2.7 细胞划痕实验 |
| 4.2.8 细胞凋亡检测 |
| 4.2.9 免疫蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白 |
| 4.2.10 数据统计 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 普鲁士蓝及体外细胞磁靶向检测细胞摄取 |
| 4.3.2 对SMMC-7721 细胞活性的影响 |
| 4.3.3 细胞内氧自由基、活性氧ROS表达水平 |
| 4.3.4 对细胞迁移的影响 |
| 4.3.5 对细胞凋亡的影响 |
| 4.3.6 Fe_3O_4/Fe_2O_3/CA-PEG-CST对 SMMC-7721 凋亡机制的探讨 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间取得的学术成果 |
四、SMMC-7721细胞诱导耐药培养中电镜形态的改变（论文参考文献）
- [1]共表达Apoptin与MEL基因重组腺病毒的构建及其对肝癌抑制作用研究[D]. 武静桥. 天津农学院, 2021(08)
- [2]新型NO供体聚合物紫杉醇胶束的制备及抗肿瘤作用和机制研究[D]. 李惠兰. 江西中医药大学, 2021(01)
- [3]双硫仑/铜复合物（CuET）抑制肝癌细胞增殖诱导细胞凋亡的分子机制研究[D]. 黎婕. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [4]血竭素高氯酸盐通过内质网应激诱导肝细胞癌凋亡的机制研究[D]. 武家成. 吉林大学, 2021(01)
- [5]Regorafenib对肝癌细胞侵袭转移和VM形成的影响及机制研究[D]. 张楠. 福建医科大学, 2021
- [6]桑黄总提物及其活性单体紫萁酮抗肿瘤作用及机制研究[D]. 杨玥. 安徽医科大学, 2021(01)
- [7]新型多金属氧酸盐抗非小细胞肺癌作用及机制研究[D]. 郑雁. 吉林大学, 2020(08)
- [8]缺氧诱导肌动蛋白丝细胞骨架重塑促进肝细胞癌侵袭转移的机制研究[D]. 黄登. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(01)
- [9]自噬在蟾毒灵诱导人肝癌细胞凋亡及有氧糖酵解中的作用及机制研究[D]. 韩梦飞. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [10]磁性Fe3O4/Fe2O3异质体纳米棒负载雷公藤红素传递系统的构建及其对SMMC-7721细胞凋亡的影响[D]. 刘逍. 江苏大学, 2020(02)