一、腺病毒介导p16基因的表达及其对肺癌细胞的周期阻滞作用（论文文献综述）
瞿静[1]（2020）在《肺癌靶向性丝素/ING4-IL-24双基因共表达腺病毒复合物》文中研究指明肺癌是威胁人类健康的重大疾病之一。恶性肿瘤的基因疗法因具有针对性强、毒副作用小、疗效好等优势而备受关注。生长抑制因子4（ING4）和白细胞介素-24（IL-24）基因能分别从细胞内、外两条途径抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡。腺病毒作为基因传递载体能够高效地传递和表达目的基因,但因存在免疫原性风险、高滴度时的细胞毒性、对固有受体细胞的趋向性等不足,限制了其在临床的广泛应用。柞蚕丝素蛋白具有优异的生物相容性和低免疫原性,并且包含的大量极性氨基酸残基赋予其丰富的化学反应活性和修饰位点。为了进一步提高腺病毒作为ING4-IL-24双基因传递载体的感染效率,以减少其有效使用滴度,降低其毒副作用,同时为了保护腺病毒免受腺病毒血清抗体的中和,本课题研制一种新型的肺癌靶向性的阳离子化柞蚕丝素/ING4-IL-24双基因共表达腺病毒复合物。通过体外实验和动物实验,研究该复合物对肺癌细胞的靶向感染作用、抑制生长作用、促进凋亡作用,以及对正常组织细胞的毒性。以期使用较低滴度的腺病毒,达到有效的抑制肺癌效果,避免使用高滴度腺病毒的潜在毒副作用。为实现这一目标,本文采用低分子量聚乙烯亚胺对柞蚕丝素蛋白进行阳离子化改性,并在丝素蛋白的侧链接枝肺癌细胞特异性寡肽C9（CSNIDARAC）,用此肺癌细胞靶向的阳离子化柞蚕丝素包被ING4-IL-24双基因共表达腺病毒,获得肺癌靶向性丝素/ING4-IL-24双基因共表达复合物。体外研究复合物对肺癌细胞H460的靶向作用、感染效率、抑制增殖和诱导凋亡作用,体内研究复合物对小鼠H460肺癌移植瘤的生长抑制作用及抑癌机制,同时通过体外、体内实验,分析和评价复合物对正常细胞脐静脉内皮细胞HUVEC和正常组织的毒副作用。首先,构建ING4-IL-24双基因共表达腺病毒载体。将ING4-IL-24双基因共表达转移质粒与腺病毒骨架质粒同源重组后感染人胚肾细胞QBI-293A,多次扩增后获得ING4-IL-24双基因共表达腺病毒（Ad）。Western blotting和ELISA测试结果表明,腺病毒能介导外源性的ING4和IL-24基因在人胚肾细胞QBI-293A细胞中表达。其次,在碳二亚胺的介导下,使低分子量聚乙烯亚胺（PEI）的氨基与柞蚕丝素蛋白（ASF）的羧基偶联后生成酰胺键,获得阳离子化柞蚕丝素蛋白（CASF）。当参加反应的PEI占柞蚕丝素的质量百分比为4%时,改性后柞蚕丝素蛋白的表面Zeta电位达到+12.03 mV,接枝效率约为86.34%。接着,以3-（2-吡啶二硫）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯作为交联剂,将肺癌细胞特异性寡肽C9以二硫键的形式接枝到阳离子化柞蚕丝素蛋白的侧链,制得肺癌细胞靶向性柞蚕丝素蛋白（CASF-C9）,实验结果表明,CASF-C9的表面Zeta电位较CASF有所下降。为了初步评价CASF-C9装载基因的能力及其生物学效应,先用CASF-C9包装质粒DNA（pDNA）,制备不同质量比的CASF-C9/pDNA复合物。实验结果显示,CASF-C9与pDNA质量比为64/2、128/2、256/2时,能够完全包裹住质粒DNA。CASF-C9/pDNA复合物转染肺癌细胞H460后表达绿色荧光的细胞数量和转染效率显着高于对照组CASF/pDNA复合物,并且接枝寡肽C9的量越高,表达荧光的细胞数量和基因转染效率越高,CASF-C9/pDNA复合物对H460细胞增殖的抑制作用也更显着。在此基础上,用CASF-C9依靠静电吸附作用包被腺病毒载体,制备肺癌靶向性丝素/ING4-IL-24双基因共表达腺病毒复合物CASF-C9/Ad。从形貌、表面Zeta电位和粒径分布的检测结果可知,复合物呈球形或类球形颗粒,其表面Zeta电位和粒径均随着包覆于腺病毒表面的CASF-C9浓度的增加而增大。对CASF-C9进行异硫氰酸荧光素标记,研究短肽C9对肺癌细胞H460的靶向识别作用。激光共聚焦显微镜观察和分析结果表明,接枝短肽C9的CASF-C9及复合物CASF-C9/Ad均能特异性识别并粘附至肺癌细胞H460的表面,提示复合物CASF-C9/Ad具有肺癌细胞靶向性,具有以较低滴度的复合物达到有效感染肺癌细胞的潜力。进一步,用CASF-C9/Ad复合物体外分别感染肺癌细胞H460和脐静脉内皮细胞HUVEC,检测荧光表达和感染效率。研究结果表明,H460细胞和HUVEC细胞感染复合物CASF-C9/Ad后的荧光表达强度和感染效率均显着高于对照组裸Ad。H460细胞感染复合物CASF-C9/Ad后的生长受到了明显的抑制,细胞存活率显着低于对照组裸Ad和CASF/Ad复合物。复合物CASF-C9/Ad中的目的基因ING4和IL-24均能在肺癌细胞H460中有效表达并诱导细胞凋亡。感染复合物CASF-C9/Ad的H460细胞凋亡率显着高于对照组裸Ad和CASF/Ad复合物。而与H460细胞完全不同,HUVEC细胞感染CASF-C9/Ad复合物后,其细胞形态和细胞增殖活力均未受到明显的影响。证明CASF-C9/Ad复合物对肺癌细胞具有明显的靶向性和抑制增殖、促进凋亡效应,而对正常细胞无明显毒性。最后,用ING4-IL-24双基因共表达CASF-C9/Ad复合物体内治疗小鼠H460肺癌移植瘤。肺癌移植瘤的体积变化、肿瘤重量、抑瘤率的检测结果证明,CASF-C9/Ad能显着抑制肺癌移植瘤的生长,抑瘤率显着高于对照组裸Ad和CASF/Ad复合物。经复合物CASF-C9/Ad治疗后的肿瘤组织出现大片坏死灶,肿瘤细胞崩解、胞核染色消失,肿瘤细胞发生肿胀,呈空泡化结构,细胞膜出现连续性破坏。经复合物CASF-C9/Ad治疗后的肿瘤组织坏死程度较对照组裸Ad和CASF/Ad复合物更显着。双基因共表达复合物CASF-C9/Ad能够将目的基因ING4和IL-24高效递送至肺癌细胞,通过下调Ki 67、Bcl-2的表达抑制肺癌细胞增殖;通过上调C Caspase-3、Bax的表达促进肺癌细胞凋亡;通过下调VEGF、CD31的表达阻断肿瘤血管新生,多途径实现对小鼠H460肺癌移植瘤的抑瘤效应。本文将肺癌细胞特异性的寡肽CSNIDARAC接枝到柞蚕丝素蛋白侧链,构建能靶向识别和感染肺癌细胞的阳离子化柞蚕丝素蛋白/ING4-IL-24双基因共表达腺病毒复合物CASF-C9/Ad。该复合物不仅能靶向、高效地将目的基因递送至肺癌细胞,减少腺病毒的有效使用滴度;也能屏蔽腺病毒与宿主的直接作用,保护腺病毒免受血清抗体的中和,降低腺病毒的免疫原性风险;同时对正常细胞无明显毒性。动物实验证明,复合物CASF-C9/Ad通过抑制肺癌细胞增殖、促进肺癌细胞凋亡、阻断肿瘤血管新生等多种途径实现抑瘤效应。
邓堂刚[2]（2019）在《去泛素化酶USP11通过p21调控细胞周期介导非小细胞肺癌增殖的分子机制研究》文中认为USP11是去泛素化酶中泛素特异性蛋白酶家族（ubiquitin-specific proteases,UPS）成员之一。全长包含920个氨基酸,N端含有DUSP结构域（domain present in ubiquitin specific proteases,DUSP）和UBL结构域（ubiquitin-like domain,UBL）,C末端为催化结构域,其中包括第二个UBL结构域。在细胞内,USP11通过去泛素化作用稳定多种底物蛋白,如BRCA2、ALK5、IκBα、PML、γH2AX、RanBPM等,参与细胞信号转导调控,DNA损伤修复,并影响细胞的增殖和侵袭转移。但是,目前研究表明,USP11在不同类型的肿瘤细胞中,发挥的功能不同。在神经胶质瘤中,USP11通过去泛素化并稳定PML,抑制神经胶质瘤的增殖、迁移和侵袭。在乳腺癌中,USP11通过稳定XIAP而促进乳腺癌细胞的增殖。然而,至今USP11与非小细胞肺癌（NSCLC）的关系仍然未阐明。p21是第一个被鉴定的细胞周期素依赖性激酶抑制因子（CKI）,属于CIP/KIP家族成员,介导细胞周期停滞、DNA复制与修复、增殖与分化、衰老与凋亡等重要细胞生命活动的调控。p21由CDKN1A基因编码,蛋白全长164个氨基酸。p21通过对CDKs活性的精确调节在确保细胞周期有序运行中发挥重要的作用,它的表达受转录和转录后机制的严密调控。在转录水平,p21通常以p53依赖和p53非依赖的方式被调控。在分裂细胞中,p21是一种非常不稳定的蛋白,半衰期仅有20-60分钟,主要通过泛素-蛋白酶体通路降解。目前研究表明有三种E3泛素连接酶复合物包括SCFSKP2、CRL4CDT2和APC/CCDC20参与细胞周期不同时相对p21的降解。在G1/S期,SCFSKP2促进Ser130位点被CDK2磷酸化的p21的泛素化降解。在S期,CRL4CDT2特异性靶向与PCNA结合的p21,导致p21的泛素化降解。在G2/M期,APC/CCDC20识别与CDK1-cyclin A和CDK1-cyclin B结合的p21并负责p21泛素化降解。E3泛素连接酶复合物中的SKP2、CDT2和CDC20蛋白在功能上是作为底物识别亚单位,充当p21与E3泛素连接酶复合物其它部分的连接桥梁。另一方面,研究也发现细胞内多个蛋白能通过不同的机制稳定p21,如p38和JNK通过磷酸化p21促进p21稳定;WISp39、hSSB1和TRIM39经蛋白相互作用稳定p21;Ras通过促进p21-cyclin D1复合物的形成稳定p21;Cabels1通过干扰PSMA3与p21的结合而促进p21稳定。但是这些蛋白都不具有任何去泛素化酶的活性和功能,在细胞内是否存在去泛素化酶,能够直接逆转p21泛素化过程至今仍然不清楚。本文通过质谱数据和数据库分析,发现USP11和p21可能存在相互作用。为了进一步验证两者的相互关系,我们采用间接免疫荧光染色技术发现USP11与p21存在共定位,免疫共沉淀及体外蛋白直接孵育等实验发现USP11免疫沉淀物中均可检测到p21,这些实验证明USP11与p21存在直接相互作用。p21是非常不稳定的蛋白,能被不同的E3泛素连接酶泛素化,进而通过蛋白酶体降解。考虑到USP11作为去泛素化酶的特征以及USP11与p21的相互作用关系,我们检测USP11对p21蛋白水平和mRNA水平的影响。通过在A549、HCT116和HCT116p53-/-中过表达USP11,发现内源性p21显着增加,而抑制USP11的表达能下调p21,且USP11对p21的调控呈剂量依赖性并依赖于USP11的去泛素化酶活性。然而,改变USP11表达对p21的mRNA水平没有影响,表明USP11对p21的调控发生在翻译后修饰水平。细胞内80%的蛋白主要通过蛋白酶体途径降解,为了证明USP11是否调控p21的泛素蛋白酶体途径降解,通过蛋白酶体特异性抑制剂阻断p21泛素化降解,明确USP11是通过蛋白酶体途径影响p21的泛素化降解。通过放线菌酮CHX抑制新生蛋白的合成进一步发现敲低内源USP11的表达能明显缩短p21的半衰期,而过表达野生型USP11使p21的半衰期延长,说明USP11能增强p21的蛋白稳定性。体内和体外泛素化实验进一步证明USP11能直接对p21进行去泛素化,主要移除K48连接的多聚泛素链。由于p21在细胞周期不同阶段分别由不同的E3泛素连接酶介导其泛素化降解,为了明确USP11在细胞中主要抵抗哪种E3泛素连接酶的作用,我们通过泛素化分析和细胞周期同步化实验,发现USP11能抵抗SCFSKP2、CRL4CDT2和APC/CCDC20三种E3连接酶复合体对p21的泛素化降解,表明USP11对p21的稳定性调控是不依赖于细胞周期的。p21作为细胞周期素依赖性激酶抑制子,介导细胞周期G1/S和G2/M期的调控。鉴于USP11能去泛素化稳定p21,为了证明USP11是否通过p21调控细胞周期的演进,我们通过细胞周期分析和细胞周期同步化实验,发现在p21正常表达的细胞中,干扰USP11表达能诱导细胞周期S期显着增加,而p21缺失的细胞中,USP11表达的改变对细胞周期无明显影响。在遭受DNA损伤时,USP11通过p21调控细胞周期G2/M期转换。以上实验说明USP11可通过p21调控细胞周期运转。细胞核中p21的主要功能是作为细胞周期负性调控因子,抑制细胞周期运转和肿瘤增殖。考虑到USP11与p21在NSCLC细胞系A549的细胞核存在共定位,我们检测USP11对NSCLC增殖是否存在影响。通过细胞实验和动物实验,发现USP11通过去泛素化稳定p21抑制非小细胞肺癌的增殖。免疫组化实验进一步证明USP11与p21表达水平在非小细胞肺癌临床样本中呈明显的正相关。综上所述,本论文首次明确p21是去泛素化酶USP11的重要底物蛋白,USP11能够直接结合p21,并去泛素化稳定p21。明确了USP11通过p21参与细胞周期G1/S和G2/M期的调控,从而介导NSCLC细胞增殖的分子机制。进一步拓宽我们对细胞周期调控理论的认识,将为NSCLC的靶向治疗、优化抗肿瘤治疗措施提供科学基础。
李婷[3]（2019）在《CUL4 E3连接酶调控肺鳞癌和小细胞肺癌增殖及凋亡的机制研究》文中研究指明目的:细胞内约80%的蛋白经泛素蛋白酶体系统降解,E3连接酶在UPS中决定了底物特异性,充当泛素与底物空间接近的脚手架结构。其中CUL4A和CUL4B组成了CUL4家族,虽然两个分子同源相似性达到近80%,但二者在其细胞定位及功能上各有特色,同时因CRL4s中不同的底物受体呈递不同的底物,使得CUL4A和CUL4B在不同的生物刺激下及不同的细胞定位中发挥不尽相同的作用,增加了CRL4s的生物功能多样性。近年的研究表明,肿瘤中CUL4参与细胞周期调控、细胞凋亡、转录调控、DNA损伤修复、表观遗传学稳定性等多种生物学过程。CUL4在多种肿瘤中存在异常高表达,并与肿瘤进展、转移、不良预后相关,如:乳腺癌、前列腺癌、鳞癌、肾上腺皮质腺癌、肝癌等。我们前期研究发现CUL4在肺癌中高表达,且与吸烟指数、肿瘤高级别分期及不良预后相关。另外,在敲降CUL4的肺鳞癌和小细胞肺癌小鼠皮下成瘤实验中发现,降低CUL4表达后,肿瘤生长明显受到抑制。以上研究结果表明CUL4在肺鳞癌及小细胞肺癌进展过程中发挥了非常重要的作用。本研究旨在通过细胞学实验探索CUL4对肺鳞癌及小细胞肺癌的生长调控及凋亡调控的机制,为肺鳞癌及小细胞肺癌潜在治疗靶点提供有力证据。方法:1.通过免疫印迹技术筛选高表达CUL4A及CUL4B的肺鳞癌及小细胞肺癌细胞株后,应用慢病毒质粒系统转染并包装成能够敲降CUL4A和CUL4B表达的病毒液,构建稳定低表达CUL4A、CUL4B的肺鳞癌及小细胞肺癌细胞株模型各2株。通过免疫印迹和实时荧光定量PCR技术检测筛选构建的稳系中CUL4A、CUL4B的蛋白水平和RNA水平的表达情况。并应用细胞镜下计数法观察降表达CUL4A和CUL4B后细胞增殖速度的变化情况。2.通过PI单染法检测沉默CUL4A、CUL4B蛋白后对肺癌细胞系细胞周期的影响。同时,提取同批次细胞总蛋白检测P21及cyclin E1蛋白水平在CUL4A敲降后的变化情况。进一步通过流式细胞方法检测沉默P21后对CUL4A敲降引起的细胞周期阻滞现象的挽救作用。3.通过Annexin V-FITC/PE法检测敲降CUL4A、CUL4B蛋白后对肺癌细胞系细胞凋亡的影响。提取同批次细胞总蛋白检测凋亡相关蛋白及抗凋亡相关蛋白在稳定敲降CUL4A、CUL4B后的变化。IHC法及免疫印迹法分别检测肺鳞癌及小细胞肺癌组织中CUL4B与FOXO3A蛋白相关性和细胞中FOXO3A及P-FOXO3A在敲降CUL4B后的变化情况。另外,在敲降CUL4B的基础上RNA沉默FOXO3A后观察肺癌细胞系凋亡情况的变化,以确定FOXO3A对肺癌细胞凋亡的调控作用。4.利用免疫印迹法检测ERK通路活性在CUL4B敲降后的变化情况,并通过PD98059的抑制实验检测P-FOXO3A的蛋白水平以验证ERK通路对FOXO3A的磷酸化调控。应用MG132、MLN4924及沉默UBC12等方法确定P-FOXO3A通过UPS途径降解,且非CUL4B介导。5.通过查阅文献及细胞学实验排除LATS1在肺鳞癌及小细胞肺癌中参与CUL4B调节ERK活性,最终结合文献、质谱检测及细胞学实验发现P16可能受CUL4B的转录抑制,同时,在敲降CUL4B的基础上RNA沉默P16后发现ERK通路活性恢复,验证了CUL4B通过可能转录抑制P16参与调控ERK通路活性。结果:1.敲降CUL4A和CUL4B后,肺鳞癌和小细胞肺癌增殖速度减缓。2.肺鳞癌和小细胞肺癌中,敲降CUL4A导致G1期阻滞;双敲减CULA和P21后,G1期阻滞现象被解除。3.肺鳞癌和小细胞肺癌中,敲降CUL4B导致细胞凋亡增加;双敲减CUL4B及FOXO3A能够逆转凋亡增加的现象。CUL4B低表达后,FOXO3A上调,并伴随P-FOXO3A的下调。FOXO3A的上调并非受CUL4B转录调控,而是由于CUL4B降表达后,ERK活性下调引起的磷酸化降解减少引起的。随后的P16 m RNA检测及双敲降实验结果显示,CUL4B可能通过抑制P16的转录,使P16的ERK抑制作用减弱,上调ERK活性。综上,在肺鳞癌和小细胞肺癌中CUL4B通过抑制P16的转录,上调ERK活性,促使FOXO3A磷酸化降解,从而减少细胞凋亡。结论:1.肺鳞癌及小细胞肺癌中,CUL4A和CUL4B参与细胞生长增殖及细胞凋亡调控。2.肺鳞癌及小细胞肺癌中,CUL4A通过调控其泛素化底物P21的蛋白水平影响细胞周期调控。3.肺鳞癌及小细胞肺癌中,CUL4B通过转录抑制P16的表达情况上调ERK通路活性,使FOXO3A磷酸化及泛素化降解增加,抑制其促细胞凋亡的作用,从而增强肺鳞癌及小细胞肺癌的生存能力。
李伟婷[4]（2019）在《HOTAIR在非小细胞肺癌中EGFR-TKIs耐药机制的研究》文中认为背景与目的:HOTAIR与多种肿瘤的发生发展有关,在许多肿瘤中呈现高表达状态,作为lncRNA中的一个明星分子,HOTAIR在各种肿瘤中的研究多不胜数。当然,在肺癌中的研究也有相当的进展,而肺癌在我国发病率及病死率常年居高不下,目前也有很多治疗手段及分子靶向药在不断地更新;分子靶向治疗改变了肺癌的治疗历史,但是,由于获得性耐药的出现,最终导致疾病复发和治疗的失败,也成为肿瘤治疗领域所面临的难题。本研究就HOTAIR在非小细胞肺癌中EGFR-TKIs通过调控细胞周期介导耐药进行了一系列机制的探讨。方法:本研究首先结合前期实验结果的总结与分析后沿袭前期实验所用细胞PC-9,PC-9/AB2细胞对其分别进行过表达和敲低HOTAIR的稳转细胞系的建立,以上述所建立稳转细胞系为本研究的主要实验对象,通过流式细胞分析细胞周期、CCK8实验检测细胞耐药性、Western Blot实验明确HOTAIR可在蛋白水平调控细胞周期;进一步运用si-RNA干扰技术、染色质免疫共沉淀技术以及EDU检测细胞增殖实验共同阐述HOTAIR通过表观遗传水平调控细胞周期介导耐药;运用miRNA测序及靶基因预测的方式,通过荧光素酶报告基因实验及转染等方法阐述HOTAIR通过miRNA调控细胞周期参与耐药机制,同时也运用一些抑制剂（如DZNEP抑制EZH2、PD抑制细胞周期、EED226抑制H3K27甲基化）在相应的调控位点明确此位点所发挥的作用。结果:结合前期实验,本研究发现HOTAIR在耐药细胞系中表达量较高,尤其是获得性耐药细胞系中（PC-9/AB2）,通过裸鼠成瘤后肿瘤组织石蜡切片进行免疫组化染色发现过表达HOTAIR后P16、P21表达下降,后续实验结果显示HOTAIR可阻滞细胞分裂时的G1期,延长S期,并且在蛋白水平沉默P16、P21,修饰Rb磷酸化,上调了E2F1、CDK4、CDK6、CyclinD1表达,以此促进细胞周期进程介导耐药发生。在蛋白水平然后我们也发现HOTAIR可上调EZH2/H3K24表达,而后实验结果提示HOTAIR通过表观遗传修饰EZH2/H3K24调控P16、P21和E2F1的表达以加速细胞周期进程从而参与到耐药机制中。miRNA测序提示HOTAIR升高了miR-1249-5P和miR-1910-3P的表达,进一步实验结果提示HOTAIR与miR-1249-5P和miR-1910-3P相辅相成共同作用于调控细胞周期介导耐药发生结论:1.HOTAIR可通过加速细胞周期进程而调控非小细胞肺癌EGFR-TKIs耐药。2.HOTAIR在表观遗传水平通过修饰EZH2/H3K27调控细胞周期参与EGFR-TKIs耐药机制。3.HOTAIR与miR-1249-5P和miR-1910-3P共同调控细胞周期介导非小细胞肺癌EGFR-TKIs耐药。
位云艳[5]（2017）在《ROR α基因在非小细胞肺癌中的作用及相关机制研究》文中研究指明研究背景和目的:肺癌是全球范围内严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一,发病率及死亡率均为恶性肿瘤首位。近来研究发现肺癌也是一种衰老相关性疾病,其中位发病时间约为70岁左右,且发病率随着年龄的增长逐渐增加。肺癌还是一种高消耗疾病,肿瘤细胞生长需要提供大量的营养物质,而老年人代谢水平较低,老年患者相对非老年患者肺癌进展缓慢。有研究表明,在肝癌中,ROR α通过活化P53/P21通路抑制为肿瘤细胞生长提供能量的细胞糖酵解过程,从而降低肿瘤细胞增殖活力。此外,ROR α近年来被发现与大肠癌、乳腺癌、前列腺癌等相关。然而,ROR α与肺癌的关系尚不明确,具体作用及相关调控机制有待进一步研究。P53/P21信号通路是经典的研究衰老相关通路之一,该通路激活后可促进细胞衰老从而抑制细胞增殖活性。同时,P53、P21还是调节细胞周期活动的关键转录因子,细胞周期阻滞也是细胞衰老的典型特征。本研究首先分析ROR α在人肺癌组织及癌旁组织中的表达差异,进一步通过体外体内研究探讨ROR α对肺癌细胞增殖活力、克隆形成能力、细胞周期分布、衰老相关β-半乳糖苷酶染色、体内成瘤等功能的影响,以明确ROR α在肺癌生长中的作用及其机制。研究方法:1.Western blot方法检测6对人非小细胞肺癌（NSCLC）组织及癌旁组织中ROR α的表达。2.构建ROR α敲低质粒和过表达质粒,验证ROR α敲低及过表达效果,筛选稳定过表达ROR α的NSCLC A549、PC9细胞株。3.MTT实验及克隆形成实验验证ROR α对A549、PC9细胞株增殖能力的影响。4.Western blot检测ROR α对P53/P21信号通路的影响。5.衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色及细胞周期检测评估ROR α对细胞衰老的影响。结果:1.ROR α在肺癌组织中表达显着低于癌旁组织,主要表达亚型为ROR α4。2.ROR α敲低可显着促进NSCLC细胞增殖,相反,ROR α过表达或使用RORα激动剂均明显抑制细胞增殖活性。3.在A549细胞株,与对照组相比,ROR α过表达组SA-β-Gal染色阳性率明显增加,细胞G2周期阻滞,而在P53突变的PC9细胞株,过表达组细胞SA-β-Gal染色阳性率及细胞周期分布无显着差异,表明细胞衰老与P53活性密切相关。4.在A549细胞株,ROR α 4过表达或使用ROR α激动剂显着增加P53、P21表达,降低了 CyclinB1表达。5.在稳定过表达ROR α4的A549细胞株,敲低P53,抑制ROR α4诱导的细胞衰老。同样,P53抑制剂PFT显示了类似结果,表明ROR α 4诱导的细胞衰老是P53依赖的。结论:ROR α4是ROR α基因在人体肺组织中表达的主要亚型,且在NSCLC组织的表达显着低于癌旁组织。ROR α 4可以通过激活P53/P21通路诱导细胞衰老从而抑制NSCLC细胞增殖能力。本研究丰富了对肺癌和细胞衰老关系的认识,可能为临床肺癌的治疗提供新的思路。研究背景肺癌是恶性程度最高的恶性肿瘤之一,随着年龄的增长,其发病率逐年上升。伴随着我国人口老龄化进程的加剧,肺癌所致的社会负担急剧升高,成为影响人民健康和生活质量的重要障碍。近年来随着诊疗技术的进步,肺癌的治疗效果有所改善,但5年生存率仍不足15%。因此,新的肺癌治疗方向的研究是必要的。维甲酸相关孤儿核受体α（ROR α）基因与多种肿瘤关系密切,在多种肿瘤特别是消化系统肿瘤中发挥抑癌基因的作用。但它与肺癌的关系尚不清楚。我们前期发现,肺癌组织中ROR α蛋白表达较癌旁组织降低,它可以抑制肺癌细胞A549、PC9的增殖活力,且在A549细胞中它通过P53依赖的细胞衰老来抑制肿瘤细胞增殖。因此,我们提出假设,在体内,ROR alpha基因可能抑制A549细胞成瘤能力。目的为研究在裸鼠体内研究ROR α基因对NSCLC细胞成瘤能力的影响,我们构建了 ROR α过表达质粒,感染肺腺癌细胞株A549,筛选出稳定转染细胞株,然后在裸鼠皮下成瘤。方法1.构建ROR α基因的过表达质粒,转染细胞后PCR、Western blot方法验证过表达情况;2.转染A549细胞后用G418筛选出稳定表达细胞株;3.将裸鼠分为ROR α组和GV144两组,每组6只,分别在皮下接种稳定表达细胞株。动态观察瘤体生长情况、体积大小,得出肿瘤生长曲线,30天后结束试验,Western blot检测瘤体P53、P21、CyclinB1蛋白表达。结果1.成功筛选出ROR α基因稳定表达的A549细胞株,并通过qRT-PCR、Western blot方法进行验证。2.裸鼠皮下成瘤后,ROR α组瘤体生长速度及体积大小均小于GV144组（P<0.05）;Western blot结果显示在裸鼠体内过表达ROR alpha基因后P53、P21表达升高,CyclinB1蛋白表达下降。结论成功筛选出ROR α基因稳定表达的A549细胞株。在裸鼠体内中,过表达ROR α的A549细胞成瘤能力降低,瘤体内P53、P21表达升高,CyclinB1蛋白表达下降。研究背景和目的:顺铂是非小细胞肺癌（NSCLC）治疗的一线化疗药物。然而,其耐药已成为非小细胞肺癌治疗的主要障碍。乙醛脱氢酶1A1（ALDH1A1）在包括肺癌在内的多种恶性肿瘤中被发现过度表达。本研究的主要目的是探讨ALDH1A1表达对顺铂耐药的影响并探讨其机制。研究方法:采用逆转录PCR检测ALDH1A1的mRNA的表达,Western blot法评估ALDH1A1、B细胞淋巴瘤2、磷酸化蛋白kinase（p-Akt）和Akt蛋白表达。shRNA被用来抑制ALDH1A1表达。MTT法测定抑制ALDH1A1表达对细胞存活率的影响。流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:与亲本株A549相比,ALDH1A1在肺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP细胞中高表达。ALDH1A1敲低显着抑制A549/DDP细胞增殖,促进细胞凋亡,并降低顺铂耐药性。此外,磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/Akt途径在A549/DDP细胞中活化,在该细胞中抑制ALDH1A1活性可以降低Akt的磷酸化水平。此外,ALDH1A1敲低质粒shRNA和PI3K/Akt抑制剂LY294002显着抑制细胞活力,增强细胞凋亡,增加了顺铂敏感性。结论:这些结果表明,ALDH1A1敲低逆转人肺腺癌细胞株A549/DDP顺铂耐药,并可能作为肺癌顺铂耐药的治疗的一个潜在靶点。
何峰[6]（2015）在《RGD修饰的腺病毒介导ING4或/和P53基因表达对人肺腺癌细胞的体内外生长抑制作用》文中研究表明目的:在本室已构建Ad.RGD空载体和Ad.RGD-ING4重组腺病毒的基础上,再构建Ad.RGD-P53和Ad.RGD-ING4-P53单双基因重组腺病毒,研究其对人肺腺癌细胞（A549）的体内外抑制效应及潜在分子机制。方法:PCR克隆获得P53目的基因,在本室已成功构建pAdTrack-CMV-PolyApromoter、pAdTrack-CMV-ING4-PolyA-promoter转移质粒的基础上,在多克隆酶切位点NotⅠ和XhoⅠ之间插入P53目的片段,构建pAdTrack-CMV-PolyApromoter-P53和pAdTrack-CMV-ING4-PolyA-promoter-P53重组转移质粒,再与RGD-4C修饰的腺病毒骨架质粒pAdeasy-1.RGD同源重组,经QBI-293A细胞包装、扩增和效价检测后获得高滴度重组腺病毒Ad.RGD-P53和Ad.RGD-ING4-P53。本项研究共分5组:PBS组、Ad.RGD空载对照组、Ad.RGD-ING4和Ad.RGD-P53单基因组、Ad.RGD-ING4-P53双基因组。将上述各组重组腺病毒分别感染A549肺癌细胞后,荧光显微镜及流式细胞仪（FCM）检测各组重组腺病毒对A549肺癌细胞的感染效率。各组重组腺病毒感染A549肺癌细胞后,RT-PCR和Western blot法检测目的基因ING4或/和P53基因在QBI-293A细胞和A549肺癌细胞中的表达,采用MTT法检测ING4或/和P53基因表达对A549肺癌细胞增殖的影响,AnexinV-PE/7-AAD双染后,FCM检测各组重组腺病毒对A549肺癌细胞的诱导凋亡效应,PI单染,FCM检测各组A549肺癌细胞的周期变化,细胞划痕实验和Transwell法检测各组重组腺病毒对A549肺癌细胞迁移及侵袭能力的影响。Real time-PCR检测A549肺癌细胞内凋亡、周期及迁移和侵袭相关基因Caspase-3、Bax、Bcl-2、P21、Cyclin E、MMP-2和MMP-9 mRNA的表达水平,Western blot法检测A549肺癌细胞内凋亡相关基因Bax、Bad和Bcl-xl的蛋白表达水平。用A549细胞建立裸鼠人肺腺癌移植瘤模型,通过观察并测量瘤体体积、重量研究ING4或/和P53基因表达对裸鼠人肺腺癌移植瘤的生长抑制作用,免疫组化检测瘤体细胞的凋亡和周期相关基因caspase-3、bax、bcl-2、p21及血管形成相关因子vegf的蛋白表达水平。结果:pcr和酶切鉴定表明成功构建了pad.rgd-p53和pad.rgd-ing4-p53同源重组腺病毒质粒,包装扩增后各组重组腺病毒经效价检测可达109-1010pfu/ml,各组重组腺病毒对a549肺癌细胞的感染效率可达90-95%。rt-pcr和westernblot法证实了腺病毒介导的ing4或/和p53基因能够在qbi-293a细胞和a549肺癌细胞中成功表达。体外实验结果表明腺病毒介导的ing4或/和p53基因表达均能抑制a549肺癌细胞的生长,诱导细胞凋亡,阻滞细胞g1期进程,抑制细胞迁移和侵袭,且ad.rgd-ing4-p53双基因组较ad.rgd-ing4和ad.rgd-p53单基因组效果更优。体内实验结果表明ing4或/和p53单双基因重组腺病毒均能抑制a549裸鼠人肺腺癌移植瘤的生长,且双基因组较单基因组呈明显的抑瘤增效效果。分子机制检测表明ing4或/和p53基因表达能够上调细胞内凋亡相关基因caspase-3、bax、bad,下调bcl-2和bcl-xl的表达,上调周期相关基因p21,下调cycline的表达,下调肿瘤迁移和侵袭相关基因mmp-2和mmp-9的表达,下调肿瘤血管形成相关因子vegf的表达,且双基因组优于单基因组。结论:1、成功构建rgd-4c修饰的单双基因重组腺病毒ad.rgd-p53和ad.rgd-ing4-p53。2、rgd修饰的ing4或/和p53重组腺病毒均能显着抑制a549肺癌细胞的生长,诱导细胞凋亡,阻滞细胞g1期进程,并抑制细胞迁移和侵袭,且ad.rgd-ing4-p53双基因共表达组较ad.rgd-ing4和ad.rgd-p53单基因组效果更为明显。3、ad.rgd-ing4-p53双基因共表达较ad.rgd-ing4或ad.rgd-p53单基因表达在体内对a549人肺腺癌裸鼠移植瘤的生长产生更加显着的抑瘤效应。4、腺病毒介导的ing4或/和p53基因表达能通过上调细胞内周期相关基因p21和下调cycline的表达阻滞细胞g1期进程,上调凋亡相关基因caspase-3、bax、bad和下调bcl-2、bcl-xl的表达诱导细胞凋亡,下调肿瘤迁移和侵袭相关基因mmp-2,mmp-9的表达抑制细胞的迁移和侵袭,下调裸鼠移植瘤内肿瘤血管形成因子VEGF的表达抑制肿瘤新血管的生成,且Ad.RGD-ING4-P53双基因共表达较Ad.RGD-ING4或Ad.RGD-P53单基因表达对上述因子的调控作用更为明显,这可能是双基因共表达发挥抑瘤增效作用的重要机制之一。
郭秀伟[7]（2014）在《苏木、鸡血藤含药血清对PG细胞增殖影响的机制研究》文中研究说明中医学认为,瘀血与癌毒胶结不解,产生癌瘤。《景岳全书》云：“瘀血留滞作症”,表明血瘀证与肿瘤的产生密切相关。现代医学通过对肿瘤患者血液高凝、高黏状态进行调查研究,发现95%的肿瘤转移患者具有1项或多项实验室检查凝血指标的异常。因此,活血化瘀药在中医界中一直被广泛应用于肿瘤的治疗。苏木、鸡血藤作为活血化瘀药,在临床上广泛用于治疗肺癌等各种恶性肿瘤。近年来有关苏木、鸡血藤的体内外研究表明,其对各种肿瘤均有一定抑制作用。本课题在既往的体内实验中,研究了川芎、鸡血藤、苏木和水蛭四种活血化瘀药对不同阶段Lewis肺癌生长和转移的影响,结果亦表明苏木、鸡血藤的抑瘤及抑制转移的作用显着。在前期体外实验中,通过MTT法检测不同剂量苏木提取液对常氧和低氧培养的高转移人肺巨细胞癌细胞系（PG）增殖的影响,结果发现苏木提取液在常氧和低氧条件下均表现出对PG细胞的增殖抑制作用,而且常氧环境对其增殖的抑制作用较低氧更加明显。首都医科大学附属北京中医医院肿瘤科的实验也发现,鸡血藤水提物体外对六种肿瘤细胞系（A549, HT229, PG, PANC21, SMMC27721, IEC26）具有抗增殖作用。肺癌是常见的预后较差的恶性肿瘤之一,绝大部分肺癌患者到医院就诊时,已经失去了外科手术和多学科治疗的最佳时机。肺癌治疗方面,化疗是其综合基本措施之一虽然它能杀死肿瘤细胞,但其对处于细胞周期中的非肿瘤细胞也可以损害并杀死,这些细胞主要包括肠上皮细胞、毛囊细胞、造血干细胞,正是由于这些副作用造成的严重后果,化疗的应用受到了很大的限制。因此,寻求新的抗癌药物,提高肺癌患者的生活质量,延长其生存时间,一直是肿瘤治疗领域亟待解决的问题之一。本研究采用了苏木含药血清相关各组（苏木含药血清、苏木含药血清联合顺铂、空白血清、单药顺铂）及鸡血藤含药血清相关各组（鸡血藤含药血清、鸡血藤含药血清联合顺铂、空白血清、单药顺铂）作用于体外培养的人肺癌PG细胞,观察其对PG细胞增殖作用、细胞形态、细胞周期各期比例、细胞周期相关蛋白即细胞周期蛋白D1（CyclinDl）、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶4（CDK4）、增殖细胞核相关抗原（PCNA）及相关基因即视网膜母细胞瘤基因（Rb）、多肿瘤抑制基因1（P16） mRNA表达量的影响,为苏木、鸡血藤的抗肺癌作用机制提供实验依据。目的探讨苏木、鸡血藤含药血清联合顺铂对人肺癌PG细胞株的增殖抑制作用、周期阻滞作用及其分子机制。方法1制备苏木、鸡血藤含药血清和空白血清,通过MTT法观察苏木、鸡血藤含药血清联合顺铂对PG细胞增殖的抑制作用。2采用光镜和激光共聚焦显微镜观察空白组、苏木组、苏木+顺铂组和顺铂组及其空白组、鸡血藤组、鸡血藤+顺铂组和顺铂组对PG细胞形态的影响。3流式细胞仪检测各组的细胞周期4激光共聚焦显微镜观察各组血清对PG细胞Cyc1inD1、CDK4、PCNA蛋白表达的影响。5PCR法检测各组血清对PG细胞p16、Rbl基因mRNA表达的影响。结果1苏木相关各含药血清组均在药物干预24h后出现抑制作用,并且具有时间和剂量依赖性。与苏木组比较,苏木+顺铂组和顺铂组抑制作用显着。苏木+顺铂组较顺铂组抑制作用明显,但无统计学意义2光镜和激光共聚焦显微镜下苏木组细胞的胞核浓缩呈半月形、胞质浓缩深染程度明显,但低于顺铂组和苏木+顺铂组,苏木+顺铂组较顺铂组抑制作用明显,但无统计学意义。3与空白组比较,苏木组PG细胞的G0/G1和s期比例增加,G2/M期降低；顺铂组和苏木+顺铂组的s和G2/M期比例增加,G0/G1期降低,较苏木组的s期和G2/M期比例增加,G0/G1期降低。苏木+顺铂组PG细胞的各期较顺铂组差异无统计学意义4苏木组Cyc1inD1、CDK4、PCNA蛋白表达较空白组降低,顺铂组和苏木+顺铂组亦降低且比苏木组降低幅度更明显；与顺铂组比较,苏木+顺铂组Cyc1inD1、CDK4、PCNA蛋白表达降低但差异无统计学意义。5苏木组P16和Rb1mRNA的表达较空白组增加,顺铂组和苏木+顺铂组亦增加且优于苏木组；与顺铂组比较,苏木+顺铂组P16和Rb1mRNA的表达差异无统计学意义。6鸡血藤相关各含药血清组均在药物干预24h后出现抑制作用,并且具有时间和剂量依赖性。与鸡血藤组比较,鸡血藤+顺铂组和顺铂组抑制作用显着。鸡血藤+顺铂组较顺铂组抑制作用明显,但无统计学意义。7光镜和激光共聚焦显微镜下鸡血藤组细胞的胞核浓缩呈半月形、胞质浓缩深染程度明显,但低于顺铂组和鸡血藤+顺铂组,鸡血藤+顺铂组较顺铂组抑制作用明显,但无统计学意义。8与空白组比较,鸡血藤组PG细胞的G2/M比例显着增加,G0/G1和s期降低,但无统计学意义；顺铂组和鸡血藤+顺铂组的s和G2/M期比例显着增加,G0/G1期降低,较鸡血藤组的s期和G2/M期比例显着增加,G0/G1期显着降低。鸡血藤+顺铂组PG细胞的各期比例较顺铂组差异无统计学意义。9鸡血藤组较空白组Cyc1inD1、CDK4蛋白表达无明显差异,PCNA蛋白表达减少,顺铂组和鸡血藤+顺铂组较空白组和鸡血藤组Cyc1inD1、CDK4、PCNA蛋白表达均降低；与顺铂组比较,鸡血藤+顺铂组Cyc1inD1、CDK4、PCNA蛋白表达降低但差异无统计学意义。10鸡血藤组P16和RblmRNA的表达较空白组无明显差异,顺铂组和鸡血藤+顺铂组较空白组和鸡血藤组增加；与顺铂组比较,鸡血藤+顺铂组P16和RblmRNA的表达差异无统计学意义。结论苏木含药血清具有明显的抑制肿瘤细胞增殖的作用,这种抑制作用通过下调CyclinDl、CDK4、PCNA蛋白表达、上调P16、RblmRNA转录水平从而引起PG细胞GO/G1、S期阻滞而发挥作用的。这与顺铂通过cyclinBl使细胞停滞在G2/M、S期不同。顺铂亦可通过下调CyclinDl、CDK4、PCNA蛋白表达、上调P16、RblmRNA转录水平对细胞周期产生影响。苏木未能协同顺铂发挥对PG细胞的增殖抑制作用,从实验操作角度考虑,顺铂为体外添加的直接作用于PG细胞的细胞毒药物,其细胞增殖抑制作用较强,由于添加顺铂时可能在剂量方面出现误差,从而掩盖了苏木的抑制增殖作用。从体内实验考虑,前期试验中,分7、14、21天3个时间点动态观察苏木对C57BL小鼠肺癌瘤重的影响,结果发现同一时间点各组的抑瘤率由低到高依次为苏木低剂量、苏木高剂量组、化疗组、化疗加苏木低剂量组、化疗加苏木高剂量组,其中化疗加苏木高剂量组的瘤重低于同期化疗组,而化疗加苏木低剂量组的瘤重与同期化疗组比较无统计学意义,分析其原因可能是1.本实验中苏木组既然可以发挥抑癌效果,苏木理应可以协同顺铂的作用,分析其原因可能是体外添加顺铂引起的实验误差使得苏木并未表现出增效效果的原因占主要地位；2.中药苏木并未直接增强化疗药顺铂的增殖抑制作用,虽然在体内试验中体现出了这种作用,可是体内试验的微环境与体外实验不同,体内试验中可能是苏木通过其他靶点、途径间接发挥抑瘤作用,如中药可以通过减缓胃肠道反应、改善骨髓抑制、减轻免疫抑制、防止多器官功能损伤而发挥抑瘤作用。3.中药与化疗药联合应用并不能使抗肿瘤作用加强,无增效作用,也不会使抗肿瘤作用减弱,无减效作用。鸡血藤含药血清具有明显的抑制肿瘤细胞增殖的作用,这种抑制作用并未通过下调CyclinDl、CDK4蛋白表达、上调P16、RblmRNA转录水平从而引起PG细胞GO/G1、S期阻滞而发挥作用的,而是通过下调PCNA蛋白表达,间接引起PG细胞G2/M期阻滞。这与顺铂通过cyclinBl使细胞停滞在G2/M、S期不同。顺铂亦可通过下调CyclinDl、CDK4、PCNA蛋白表达、上调P16、RblmRNA转录水平对细胞周期产生影响。鸡血藤未能协同顺铂发挥对PG细胞的增殖抑制作用,从实验操作角度考虑,顺铂为体外添加的直接作用于PG细胞的细胞毒药物,其细胞增殖抑制作用较强,由于添加顺铂时可能在剂量方面出现误差,从而掩盖了鸡血藤的抑制增殖作用。从体内研究考虑,富琦等采用小鼠移植性Lewis肺癌模型,观察鸡血藤SSCE体内的抑瘤效应,结果发现,化疗与中药联合应用并不能使抗肿瘤作用加强,无增效作用。这就从体内角度说明鸡血藤不能协同顺铂发挥增效作用的原因。
柯小亮[8]（2009）在《涎腺腺样囊性癌转基因治疗研究》文中指出p16和p21是和细胞周期相关的抑癌基因,直接影响肿瘤的生长、浸润和转移。mda-7/IL-24是一种选择性凋亡基因,能促进多种肿瘤细胞凋亡,增强肿瘤细胞对放射线的敏感性,而对正常细胞没有明显杀伤作用。利用这些基因的生物学特性,在国家自然科学基金（No.30740420551）资助下,我们首先利用免疫组织化学研究了p16、p21WAF1在涎腺腺样囊性癌组织中的表达情况,证明两者与腺样囊性癌相关,进一步应用腺病毒介导的p16、p21基因共转染人涎腺腺样囊性癌细胞株SACC-83,结果表明二者共转染对SACC-83细胞有抑制作用,但与对照组比,杀伤效应不是很强。应用杂合病毒载体介导mda-7/IL-24基因转染SACC-83细胞,证明其能在SACC-83细胞中表达并发挥明显抑制肿瘤细胞生长、促凋亡作用,而且mda-7/IL-24在诱导SACC-83细胞凋亡的同时对正常细胞影响较小。这对我们下一步进行动物体内抑瘤实验及研究对其他涎腺肿瘤的靶向基因治疗奠定基础。
梁硕[9]（2007）在《核心蛋白聚糖对肺腺癌细胞生长侵袭的影响及其靶向治疗的实验研究》文中研究说明核心蛋白聚糖对肺腺癌细胞生长侵袭的影响及其靶向治疗研究背景肿瘤演变的最终归宿取决于肿瘤与微环境的相互作用，两者的互动关系成为近年肿瘤研究的热点与难点。肿瘤的发生、发展、侵袭及转移可以看作是对这种动态平衡的破坏。细胞的微环境主要包括细胞外基质，直接接触的相邻细胞，生长因子、激素等可溶性介质及间质组织。核心蛋白聚糖（Decorin）是细胞外基质的重要组成成分，是一种在体内组织分布广泛，可以和多种生长因子及细胞因子结合，参与细胞生长调节及组织重塑过程的小分子蛋白聚糖。近年来在国际上广泛受注目。许多研究结果表明Decorin是一种抗增殖因子，与肿瘤的发生、发展、生长密切相关，极可能是一种肿瘤抑制物，这就提示Decorin有可能成为新的抗肿瘤药物。Decorin由一个球形的核心蛋白和一条含CS／DS的糖胺聚糖（GAG）组成。其分子量为92.5kDa，核心蛋白为40kDa，属于小分子间质性PG家族成员，又称为PGⅡ，PG40，因最早发现其具有修饰胶原作用又称为饰胶蛋白。为进一步了解decorin与肿瘤的关系，国内外学者通过直接干预、原位杂交和基因转染等技术对于肝癌、结肠癌、齿龈癌、卵巢癌、肾癌及胃癌等方面进行了研究。表明Decorin对多种肿瘤细胞有抑制作用，其机制可能是1)decorin可与转化生长因子-β（TGF-β）结合，抑制TGF-β的生物活性；2)decorin使p 21表达增加，抑制肿瘤细胞生长。目前已明确TGF-β和p21对肺癌有作用，但缺少decorin对肺癌细胞生长影响的研究报道，因此本课题以人肺腺癌细胞株A549及裸鼠移植瘤模型为研究对象，进行了三个部分研究：第一部分．decorin对人肺腺癌细胞株A549体外生长的影响；第二部分．decorin对人肺腺癌细胞粘附、迁延及侵袭能力的影响；第三部分．decorin靶向治疗裸鼠人肺腺癌A549移植瘤的实验研究。了解decorin对肺腺癌细胞体外生长及侵袭力的影响，并探讨其可能机制，进一步观察decorin对裸鼠移植瘤生长的抑制作用。旨在为探讨decorin在肺腺癌形成机制中的作用提供理论依据，为肺腺癌的治疗提供新的思路。方法1细胞培养人肺腺癌细胞株A549培养于RPMI-1640培养液中，取对数生长期细胞用于实验。2 MTT法检测decorin对人肺腺癌细胞A549生长的影响对数生长期细胞加入decorin,使最终浓度为0、2．5、5、10、20、30、40μg／ml，实验分为7组，每组设3个复孔。7组细胞分别培养0 h，24h，48h，72h，96h，120h后行MTT实验。酶标仪上测定波长为490nm，计算A549细胞的存活率。3流式细胞术检测细胞增殖和凋亡比率收集对数期细胞与浓度为0、5、10、20、30、40μg／ml的decorin共同孵育0-96h，收集细胞于离心管内，离心，洗涤，固定，染色，置流式细胞仪上，每份标本测定20000个细胞，测量速率为150～200个细胞／s。用MultiCycle for Windows软件分析被采集资料，计算细胞凋亡比率。4 RT-PCR法检测decorin对其mRNA的表达的影响收集对数期细胞与浓度为0、10、20、30、40、50μg／ml的decorin共同孵育24h，按照decorin的浓度分为5组，进行RNA提取，定量后以其为模板逆转录合成cDNA链，然后用引物进行PCR扩增，产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，decorin mRNA的表达量通过与内对照光密度的比较来判断。5 Elisa法检测TGF-β蛋白的表达收集对数期细胞，加decorin,使最终浓度为对照组0μg／ml、实验组30μg／ml，每个组设定3复孔，培养4d，激活标本，建立标准曲线，检测。6 Western blot法检测p21蛋白的表达收集对数期细胞，加decorin,使最终浓度为对照组Oμg／ml、实验组30μg／ml，细胞提取细胞中总蛋白，测定出样品的蛋白质含量，然后将蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳，染色，转膜观察结果。7 decorin对A549、细胞体外粘附、侵袭及迁移的影响检测收集对数期细胞，加decorin,使最终浓度为对照组0μg／ml、实验组2.5μg／ml。包被及水化基底膜，接种及培养细胞，然后MTT比色法检测，计算细胞粘附率。Transwell小室铺Matrigel胶，培养细胞，趋化，固定，染色，显微镜下计数，计算侵袭率。包被及水化基底膜，制备培养单层细胞，用人工划痕法，在相差显微镜下随机选择5个100x视野内计算迁移到划痕空隙中的细胞总数。8构建移植瘤裸鼠模型检测decorin体内靶向作用构建移植瘤裸鼠模型后，decorin直接移植瘤内注射，观察其抗移植瘤生长效应，包括一般状况，局部实体瘤生长抑制率的测定以及病理组织学检测。取肿瘤组织，Western法检测P21蛋白的表达，EIlSA法检测TGF-β蛋白的表达。结果1在一定范围内，decorin对A549细胞存活率抑制呈浓度和时间依赖性（decorin浓度为30μg／ml作用96 h时抑制作用最明显）。2 Decorin作用于A549细胞后，G1期细胞数明显增多，S期细胞数明显减少，G2期细胞数则无明显变化，提示decorin可能延缓肿瘤细胞由G1期向S期的过渡。decorin作用A549细胞后，A549凋亡率升高，最佳浓度为30μg／ml，最佳时间为96 h。3 30μg／mldecorin作用96h，经RT-PCR扩增后，decorinmRNA的表达明显高于无decorin组。4 A549细胞经30μg／ml decorin作用96h，TGF-β蛋白表达水平明显降低（0.584±0.107，0.252±0.008）P＜0.0001。5 30μg／ml decorin作用96h，经Western检测，P21蛋白表达水平明显高于无decorin6 2.5μg／mldecorin作用A549细胞4天后，粘附率由0.462±0.034下降为0.142±0.024，P＜0.001。7 2.5μg／mldecorin作用A549细胞4天后，侵袭细胞数为164.09±9.52，显着低于无decorin组（229.89±10.72）P＜0.0001。8 2.5μg／mldecorin作用A549细胞4天后，迁移细胞数由57.75±2.42减少至11.33±1.23，显着低于无decorin组（57.75±2.42）P＜0.0001。9裸鼠移植瘤成瘤率为97.2％，平均成瘤时间为约30±3天。Decorin作用后，抑瘤率（％）为49.58％。肿瘤生长指数为1.02±0.71，明显低于对照组6.66±2.96。肿瘤结节重量为（1.19±0.71）g，明显低于对照组（2.36±0.46）g。心肝肾组织观察，结构均基本正常，未见有明显的组织损伤改变。Decorin作用后，P21蛋白表达水平明显高于无decorin组，TGF-β蛋白表达水平明显低于无decorin组（0.071±0.008，0.229±0.002）P＜0.0001。结论1 Decorin能够抑制A549肿瘤细胞的体外增殖，且这种增殖抑制作用呈剂量和时间依赖性。2 Decorin抑制肺癌细胞生长，其机制可能与上调p21，抑制TGF-β表达，阻滞肺癌细胞周期G1／S期转换，促进肺癌细胞凋亡有关。3 Decorin在体外可抑制肿瘤细胞粘附，迁移和侵袭能力。4 Decorin瘤体注射可抑制裸鼠移植瘤生长，且无明显的心，肝，肾等毒副作用。
阮永威[10]（2007）在《Ad-p16、Ad-p53联合紫杉醇治疗乳腺癌的实验研究》文中进行了进一步梳理第一部分乳腺癌p16，p53基因蛋白及其mRNA表达的研究目的乳腺癌位居女性恶性肿瘤之首，全球每年大约有40万人死于乳腺癌，同时发病率呈逐年上升、发病呈现年轻化之势。大量研究表明，癌基因、肿瘤抑制基因（抑癌基因）的异常与乳腺癌的发生、发展密切相关。如p16、p53、C-cerbB-2及p21基因等。p16抑癌基因突变和／或缺失广泛存在于各种肿瘤中，参与肿瘤细胞增殖的调控，在肿瘤的发生、发展过程中起着重要作用。通过免疫组织化学方法检测p16基因表达蛋白，发现阳性率在24％～60％不等。p53抑癌基因突变在人类肿瘤中最为常见，是目前发现与人类肿瘤关系最为密切的基因，已知乳腺癌组织p53基因的突变率为15％～60％。我们通过检测乳腺癌组织内p16、p53基因蛋白以及mRNA的表达，分析其表达与乳腺癌临床病理特征的相互关系，探讨其表达对乳腺癌分子生物学特性的影响，为临床和临床基础研究乳腺癌的治疗和预后评估提供理论基础和依据。方法我们利用免疫组织化学SP法和逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）技术，检测乳腺癌组织内p16、p53基因蛋白和mRNA的表达。运用统计学方法分析各种表达与乳腺癌临床病理学特征之间的关系。结果免疫组织化学检测癌旁正常乳腺组织中p16基因蛋白的表达率为90％（27／30），其中48.1％（13／27）为（+++）；29.6％（8／27）为（++）；22.2％（6／27）为（+）；p53基因蛋白的表达率为6.67％（2／30），全部为（+）。乳腺癌组织中p16基因蛋白阳性表达率为38.3％（23／60），其中60.9％（14／23）为（+++），26.1％（6／23）为（++），13.0％（3／23）为（+）；p53基因蛋白阳性表达率为48.3％（29／60），其中79.3％（23／29）为（+++），13.8％（4／29）为（++），6.9％（2／29）为（+）。RT-PCR检测癌旁正常乳腺组织的p16mRNA显着高于乳腺癌组织（P=0.023），而p53mRNA在乳腺癌组织的水平显着高于癌旁正常乳腺组织（P=0.001）。p16、p53蛋白表达与乳腺癌组织学分级、淋巴结和／或器官转移相关。乳腺癌细胞分化程度越高p16蛋白阳性表达率越高，而p53表达蛋白正相反；有淋巴结和／或器官转移的病例p16蛋白的表达率明显低于无淋巴结和／或器官转移者，而p53蛋白的表达率显着增加。p16mRNA在组织学Ⅰ级的水平显着高于Ⅱ、Ⅲ级，而Ⅱ、Ⅲ级之间无明显差异；p53mRNA与组织学分型无明显关系。有淋巴结和／或器官转移的p16mRNA、p53mRNA表达均明显高于无淋巴结和／或器官转移。结论（1）p16、p53基因蛋白的表达与乳腺癌组织学分级、淋巴结和／或器官转移有密切关系。（2）p16mRNA的表达与乳腺癌组织学分级有关。p16mRNA、p53mRNA表达与淋巴结和／或器官转移有关。（3）p16、p53基因的缺失、突变或甲基化等改变与乳腺癌的发生发展密切相关，可以用于评估乳腺癌的预后。（4）通过特殊载体将外源性野生型p16和p53基因进行转导，以纠正p16、p53基因的异常改变，将有帮助于乳腺癌的治疗。第二部分重组p16和p53腺病毒的构建、鉴定、纯化和测定目的研究显示恶性肿瘤的发生、发展与基因突变、缺失、磷酸化和甲基化等密切相关，其中基因突变在恶性肿瘤细胞表型中起重要作用。表明通过转导外源正常的目的基因的方法，进行修饰突变的基因可以治疗肿瘤。设计肿瘤基因治疗方案的关键在于构建有效的目的基因载体系统，以达到特异性地将目的基因转送至靶细胞。非病毒载体在体内的转染效率远低于病毒载体。腺病毒载体可以有效地感染和传递目的基因，广泛地适用于分裂和静息的组织和细胞，腺病毒DNA不与宿主细胞DNA整合。腺病毒载体的缺点是如要保持转基因的持续表达可导致机体强烈的炎性和免疫反应。但是这种免疫特性可增加目的基因对肿瘤的杀伤作用。腺病毒载体易于构建，经辅助细胞培养可产生大量腺病毒载体。该研究应用基因重组腺病毒的方法，构建携带抑癌基因p16、p53的C亚群5型重组腺病毒（Ad5），并对其进行鉴定、筛选和纯化；应用人胚胎肾293细胞进行扩增，并确定重组腺病毒p53（Ad-p53）、p16（Ad-p16）和Lac Z（Ad-Lac Z）的纯化程度、病毒滴度、感染率、转导率和扩增情况，以及细胞感染后p53、p16蛋白的表达状况。方法应用HindⅢ和SpeⅠ酶对含野生型p16cDNA质粒pBluescript-p16进行双酶切；应用KpnⅠ和XaⅠ酶对野生型p53cDNA质粒pGEM-p53进行双酶切。酶切后进行电泳，回收p16cDNA和p53cDNA。用HindⅢ／KpnⅠ和SpeⅠ酶对pAdCMV穿梭质粒进行双酶切，酶切后将回收的p16cDNA和p53cDNA插入定向pAdCMV中，并得到pAdCMV-p16和pAdCMV-p53。pAdCMV-p16／p53重组质粒与腺病毒质粒pJM17在293细胞内进行同源重组，p16／p53基因被转移到腺病毒基因中，生成的E1基因缺陷的重组腺病毒在293细胞中进行繁殖，因E1基因产物的反式作用下大量增殖。以腺病毒、p16、p53特异引物进行扩增，琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物，根据PCR扩增产物特有的片段长短筛选p53cDNA、p16cDNA阳性的重组腺病毒空斑，通过传代293细胞扩增阳性空斑内的病毒，以氯化铯密度梯度超速离心机进行病毒的纯化。再次在293细胞中进行繁殖以增加滴度，最多繁殖5代。采用293细胞空斑实验（plaque formation test）测定重组腺病毒滴度。应用报告基因Lac Z以测定重组腺病毒感染率。免疫组织化学技术（SP方法）检测重组腺病毒介导的基因转移效率。Western blot分析p53和p16蛋白表达。结果p16cDNA、p53cDNA插入pAdCMV得到pAdCMV-p16、pAdCMV-p53。经293细胞中进行繁殖，10-14d即可出现细胞病变（cytopathic effect，CPE），即典型的病毒空斑，此时显微镜下可见293细胞圆缩脱落，表明pAdCMV-p16、pAdCMV-p53重组质粒与腺病毒质粒pJM17已在293细胞内发生了同源重组，p16、p53基因被转移到腺病毒基因中，培养液的上清液中含有重组腺病毒颗粒，所制备的重组腺病毒分别命各为Ad-p16、Ad-p53。PCR扩增出860bp的腺病毒DNA片段和570 bp的p16cDNA片段、642 bp的p53cDNA片段即为重组p16、p53腺病毒。空斑形成试验计算出的滴度为：Ad-p53 2.1×1010；Ad-p16 6.7×1010；Ad-Lac Z1.0×1010。当Ad-Lac Z的MOI为25时，293细胞的感染率为32％：MOI为50时，感染率达到78.9％；而MOI为100时，感染率达到98.6％，因此可以应用重组腺病毒MOI≥100感染人乳腺癌MDA-MB-231细胞株，以观察细胞的基因表达和凋亡情况。免疫组织化学染色结果表明重组腺病毒介导的基因转导率（％）p16为93.8±2.5，p53为96.3±3.8。Ad-Lac Z感染的肿瘤细胞无p53和p16蛋白表达。但是，p53和p16联合感染的肿瘤细胞有明显的p53和p16蛋白表达，说明重组腺病毒可有效地介导外源基因的高效转移。结论（1）重组腺病毒能够正确携带目的基因进入靶细胞，并准确表达目的基因蛋白。（2）生产重组腺病毒载体较为经济、滴度高。（3）治疗量病毒的体积小，有助于在体内使用。第三部分Ad-p16、Ad-p53联合紫杉醇治疗乳腺癌的研究目的正常细胞通过关卡作用以调节细胞周期的进程，保持细胞增殖和凋亡地平衡。发现癌基因和抑癌基因均是通过调控细胞周期而发挥作用。肿瘤的发生常涉及多个抑癌基因的突变、磷酸化或／和失活。将正常肿瘤抑制基因导入肿瘤细胞以替代失去功能的基因，而达到逆转其恶性表型、抑制肿瘤生长，甚至消灭肿瘤成为肿瘤基因治疗的热点。p16和p53是人体内重要的肿瘤抑制基因，直接或间接调控细胞周期，使细胞周期停滞于G1期。p16和p53基因发生缺失、突变、重排、磷酸化或不表达可存在于多种肿瘤的发生、发展过程中。恢复野生型p16和p53基因的功能成为抗肿瘤基因治疗研究的重要途径。紫杉醇可诱导多种肿瘤的凋亡，尤其对转移性乳腺癌的作用尤为引人注目。该研究对Tax、Ad-p16、Ad-p53及其联合应用对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231的生长抑制和细胞凋亡进行深入研究。然后，应用Tax、Ad-p16、Ad-p53及其联合对乳腺癌细胞MDA-MB-231成瘤裸鼠模型进行动物治疗实验。观察治疗效果，为研究肿瘤治疗以及治疗途径提供依据。方法显微镜下观察Ad-p16、Ad-p53及其联合对MDA-MB-231细胞形态学以及生长抑制的影响。MTT法监测Tax、Ad-p16、Ad-p53及联合应用对MDA-MB-231细胞生长的抑制率。应用流式细胞仪Annexin V-FITC／PI法检测分析Tax、Ad-p16、Ad-p53及其联合应用后MDA-MB-231细胞的凋亡率。应用流式细胞仪分析Tax、Ad-p16、Ad-p53及其联合对MDA-MB-231细胞周期和凋亡影响。裸鼠乳房脂肪垫内注射MDA-MB-231细胞悬浮液，使裸鼠形成乳腺癌模型。应用Ad-Lac Z、Tax、Ad-p16、Ad-p53、Tax+Ad-p16、Tax+Ad-p53、Ad-p16+Ad-p53和Tax+Ad-p16+Ad-p53对成瘤裸鼠进行治疗，观察肿瘤体积和抑瘤率的变化治疗，分析治疗效果。并对治疗后的肿瘤标本进行常规病理检查。应用脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）检测分析肿瘤组织细胞凋亡的状况。实验数据采用SPSS11.0统计软件包进行分析。结果Ad-p16、Ad-p53和二者联合感染可导致人乳腺癌MDA-MB-231细胞生长抑制。Ad-p16对细胞生长的抑制作用比Ad-p53强，但导致的细胞形态学发生改变时间晚。Ad-p16和Ad-p53联合感染可导致细胞生长近乎停止，在细胞生长抑制和形态学改变均较单一感染明显且发生时间早。而Ad-Lac Z感染后细胞生长良好，细胞形态学无明显变化。Tax对MDA-MB-231细胞的抑制随着剂量的增加，细胞生长抑制率明显增加，细胞抑制率与时间呈正相关（r=0.923，P=0.000）。与Ad-Lac Z相比较，Ad-p16、Ad-p53以及二者联合感染MDA-MB-231细胞后，对肿瘤细胞均有明显的抑制作用（P值均为0.000）。Ad-p16的抑制率在各个时相均高于Ad-p53(P24h=0.038，P48h=0.004，P72h=0.003，P96h=0.001，P120h=0000)。Ad-p16的抑制作用呈现逐渐上升趋势，而Ad-p53在72h时达到高峰后有下降趋势，但是均无统计学意义。Ad-p16与Ad-p53联合感染MDA-MB-231细胞后，在各个时相的细胞抑制率均显着大于单一感染的抑制率（vs Ad-p16，P值在0.001-0.004之间；vs Ad-p53，P值均为0.000）；并且随着时间的延长，细胞抑制率明显增加（120h vs72h，P=0.006），与感染时间有明显的正相关（r=0.89，P=0.001）。Tax与Ad-p16联合作用于MDA-MB-231细胞后，在各个时相上细胞生长抑制率均显着大于单一应用，于96h时达到高峰，抑制率达到70.96％（70.96±3.30）（vs Ad-p16，P=0.001；vs Tax，P=0.000）；并且细胞抑制率随着时间的延长明显增加（120h vs 72h，P=0.028）。Tax与Ad-p53联合有同样效果，但与Tax与Ad-p16联合的抑制率在各个时相上相比较无显着性差异（P值在0.069-0.86之间）。Tax、Ad-p16和Ad-p53三者联合应用，对MDA-MB-231细胞的抑制作用更加明显，在各个时相上均有明显增加（P值均为0.000），最高抑制率达到90％以上。Tax、Ad-p16或Ad-p53单一作用于MDA-MB-231细胞可诱导其发生凋亡，并且随着时间的延长细胞凋亡率明显增加，72h时分别达到15.31％、19.34％和29.05％。但是，感染Ad-p16的MDA-MB-231细胞发生凋亡较Tax和Ad-p53晚，凋亡率明显低于Ad-p53。Tax与Ad-p16或Ad-p53联合可明显增加MDA-MB-231细胞的凋亡率。Ad-p16与Ad-p53联合也可明显增加MDA-MB-231细胞的凋亡。Tax、Ad-p16和Ad-p53三者联合诱导MDA-MB-231细胞的能力明显提高，效果更加显着。Tax可导致MDA-MB-231细胞停滞于G2／M期，Ad-p16、Ad-p53或二者联合感染使MDA-MB-231细胞停滞于G0／G1期。Tax、Ad-p16和Ad-p53联合时，大多数细胞停滞于G0／G1和G2／M期。Tax、Ad-p16、Ad-p53及其联合作用于MDA-MB-231细胞72h后琼脂糖凝胶电泳呈现典型的凋亡梯形电泳带，而对照组仅仅呈现基因组DNA。Tax、Ad-p16和Ad-p53组裸鼠体内肿瘤明显受到抑制，第20天时与Ad-Lac Z组比较的P值均为0.000；各组较治疗前肿瘤体积虽有所减小，但是均无统计学意义（P值分别为0.216、0.895和0.138）。Ad-p16与Ad-p53联合应用不仅可以抑制肿瘤的增长，尚可以使肿瘤体积明显减小（0d vs 16d，P=0.034；0d vs 20d，P=0.007）。Tax、Ad-p16和Ad-p53三者联合，裸鼠肿瘤减小更加明显（0d vs 12d，P=0.041；0d vs 16d，P=0.003；0d vs 20d，P=0.000）。治疗组的肿瘤组织间质明显增加，肿瘤细胞以及细胞核分裂明显减少，细胞核呈现浅蓝色，细胞核与细胞浆比例减小，可见散在的新月形核染色质和细胞核碎裂的碎片。Ad-Lac Z、Tax、Ad-p16、Ad-p53、Ad-p16+Ad-p53和Tax+Ad-p16+Ad-p53组肿瘤组织细胞凋亡率（％）分别为1.4±0.9、14.7±2.6、19.5±2.5、21.3±3.1、30.5±3.2和42.3±4.3。结论（1）Ad-p16、Ad-p53和二者联合感染可导致人乳腺癌MDA-MB-231细胞形态学改变和生长抑制。而此现象并非是腺病毒本身所致，而是外源性p16和p53基因所发挥的作用。（2）Tax、Ad-p16和Ad-p53在诱导MDA-MB-231细胞凋亡上有明显的协同作用，p16和p53基因的表达可以增加Tax对MDA-MB-231细胞的敏感性，p16基因可以促进p53基因所诱导的细胞凋亡。（3）Tax可导致MDA-MB-231细胞停滞于G2／M期，Ad-p16、Ad-p53或二者联合感染使MDA-MB-231细胞停滞于G0／G1期。Tax、Ad-p16和Ad-p53联合时，大多数细胞停滞于G0／G1和G2／M期。（4）Tax、Ad-p16和Ad-p53三者之间有协同抑制裸鼠体内肿瘤生长的作用，尤其是三者联合更加明显。在抑制肿瘤生长同时，可导致肿瘤组织细胞凋亡。
二、腺病毒介导p16基因的表达及其对肺癌细胞的周期阻滞作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、腺病毒介导p16基因的表达及其对肺癌细胞的周期阻滞作用（论文提纲范文）
（1）肺癌靶向性丝素/ING4-IL-24双基因共表达腺病毒复合物（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 肺癌抑制基因 |
| 1.2 ING4及IL-24基因的抑癌作用 |
| 1.2.1 ING4基因 |
| 1.2.2 IL-24基因 |
| 1.2.3 ING4及IL-24双基因协同作用 |
| 1.3 ING4及IL-24基因的传递载体 |
| 1.4 腺病毒载体 |
| 1.4.1 腺病毒性质 |
| 1.4.2 腺病毒载体的修饰 |
| 1.5 柞蚕丝素蛋白 |
| 1.5.1 柞蚕丝素蛋白的性质 |
| 1.5.2 柞蚕丝素蛋白应用于基因传递载体 |
| 1.5.3 柞蚕丝素蛋白的阳离子化修饰 |
| 1.6 肺癌细胞的靶向配体 |
| 1.6.1 靶向分子 |
| 1.6.2 靶向肽 |
| 1.7 本文的研究目的及内容 |
| 第二章 ING4-IL-24双基因共表达腺病毒的构建及鉴定 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 溶液、卡那板及凝胶的配制 |
| 2.2.2 双基因重组转移质粒的扩增 |
| 2.2.3 双基因重组转移质粒的PCR鉴定 |
| 2.2.4 同源重组腺病毒质粒的构建 |
| 2.2.5 双基因共表达同源重组腺病毒的包装和扩增 |
| 2.2.6 双基因共表达腺病毒的效价 |
| 2.2.7 双基因共表达腺病毒中ING4基因的表达 |
| 2.2.8 双基因共表达腺病毒中IL-24基因的表达 |
| 2.2.9 数据统计分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 双基因共表达质粒的鉴定 |
| 2.3.2 同源重组腺病毒的构建和鉴定 |
| 2.3.3 腺病毒的包装和扩增 |
| 2.3.4 鉴定同源重组腺病毒中双基因的表达 |
| 2.4 本章结论 |
| 第三章 柞蚕丝素蛋白的阳离子化改性 |
| 3.1 实验材料与仪器 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 溶液的配制 |
| 3.2.2 柞蚕生丝脱胶 |
| 3.2.3 柞蚕丝素溶解 |
| 3.2.4 柞蚕溶液浓度测定 |
| 3.2.5 PEI改性柞蚕丝素蛋白 |
| 3.2.6 CASF的表面Zeta电位 |
| 3.2.7 CASF的核磁共振氢谱 |
| 3.2.8 CASF的X-射线光电子能谱 |
| 3.2.9 CASF的红外吸收光谱 |
| 3.2.10 Cu~(2+)滴定法测定PEI接枝效率 |
| 3.2.11 CASF溶液粘度 |
| 3.2.12 CASF的圆二色光谱 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 PEI改性柞蚕丝素蛋白的反应过程 |
| 3.3.2 CASF的表面Zeta电位 |
| 3.3.3 CASF的核磁共振氢谱 |
| 3.3.4 CASF的红外吸收光谱 |
| 3.3.5 CASF的X-射线光电子能谱 |
| 3.3.6 PEI接枝柞蚕丝素蛋白的效率 |
| 3.3.7 CASF溶液粘度 |
| 3.3.8 CASF的二级结构 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 阳离子化柞蚕丝素蛋白的肺癌靶向肽修饰 |
| 4.1 实验材料与仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 柞蚕丝脱胶、溶解、浓度测定、阳离子化改性 |
| 4.2.2 靶向肽C_9修饰阳离子化柞蚕丝素蛋白 |
| 4.2.3 CASF-C_9的表面Zeta电位测定 |
| 4.2.4 CASF-C_9的核磁共振氢谱测试 |
| 4.2.5 CASF-C_9的X-射线光电子能谱测试 |
| 4.2.6 CASF-C_9的红外吸收光谱测试 |
| 4.2.7 CASF-C_9的能谱测试 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 寡肽C_9修饰阳离子化柞蚕丝素蛋白 |
| 4.3.2 CASF-C_9的表面Zeta电位 |
| 4.3.3 CASF-C_9的能量色散X-射线光谱 |
| 4.3.4 CASF-C_9的核磁共振氢谱 |
| 4.3.5 CASF-C_9的红外吸收光谱 |
| 4.3.6 CASF-C_9的X-射线光电子能谱 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 CASF-C_9/pDNA复合物对肺癌细胞的靶向生物学效应 |
| 5.1 实验材料与仪器 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 琼脂糖凝胶的配制 |
| 5.2.2 质粒的摇菌、抽提及浓度测定 |
| 5.2.3 CASF-C_9/pDNA复合物的制备 |
| 5.2.4 CASF-C_9/pDNA复合物的琼脂糖凝胶电泳 |
| 5.2.5 CASF-C_9/pDNA复合物的表面Zeta电位 |
| 5.2.6 CASF-C_9/pDNA复合物的形貌及粒径 |
| 5.2.7 CASF-C_9/pDNA复合物转染细胞的绿色荧光表达 |
| 5.2.8 CASF-C_9/pDNA复合物的转染效率 |
| 5.2.9 CASF-C_9/pDNA复合物转染细胞的存活率 |
| 5.2.10 数据统计分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 CASF-C_9/pDNA复合物的琼脂糖凝胶电泳 |
| 5.3.2 CASF-C_9/pDNA复合物的表面Zeta电位 |
| 5.3.3 CASF-C_9/pDNA复合物的形貌及粒径 |
| 5.3.4 CASF-C_9/pDNA复合物转染细胞的荧光表达 |
| 5.3.5 CASF-C_9/pDNA复合物的转染效率 |
| 5.3.6 CASF-C_9/pDNA复合物对细胞增殖的影响 |
| 5.3.7 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 CASF-C_9/Ad复合物的制备及其体外生物学效应 |
| 6.1 实验材料与仪器 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 柞蚕丝的脱胶、溶解、浓度测定、阳离子化改性 |
| 6.2.2 靶向肽修饰阳离子化柞蚕丝素蛋白 |
| 6.2.3 材料与腺病毒的荧光标记 |
| 6.2.4 不同感染复数的腺病毒体外感染细胞 |
| 6.2.5 CASF-C_9/Ad复合物的制备 |
| 6.2.6 CASF-C_9/Ad复合物的表面Zeta电位 |
| 6.2.7 CASF-C_9/Ad复合物的形貌及粒径 |
| 6.2.8 CASF-C_9/Ad复合物的靶向作用 |
| 6.2.9 CASF-C_9/Ad复合物感染细胞的绿色荧光表达 |
| 6.2.10 CASF-C_9/Ad复合物感染细胞的效率 |
| 6.2.11 CASF-C_9/Ad复合物中ING4基因在H460细胞中的表达 |
| 6.2.12 CASF-C_9/Ad复合物中IL-24基因在H460细胞中的表达 |
| 6.2.13 CASF-C_9/Ad复合物感染细胞后的存活率 |
| 6.2.14 CASF-C_9/Ad复合物诱导肺癌细胞凋亡 |
| 6.2.15 数据统计分析 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 不同感染复数的裸腺病毒体外感染细胞 |
| 6.3.2 CASF-C_9/Ad复合物的表面Zeta电位 |
| 6.3.3 CASF-C_9/Ad复合物的形貌及粒径 |
| 6.3.4 CASF-C_9/Ad复合物与细胞共作用 |
| 6.3.5 CASF-C_9/Ad复合物感染细胞的绿色荧光表达 |
| 6.3.6 CASF-C_9/Ad复合物感染细胞的效率 |
| 6.3.7 CASF-C_9/Ad复合物对细胞增殖的影响 |
| 6.3.8 CASF-C_9/Ad复合物中外源性双基因在H460细胞中的表达 |
| 6.3.9 CASF-C_9/Ad复合物诱导肺癌细胞H460凋亡 |
| 6.3.10 讨论 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 CASF-C_9/Ad复合物抑制肺癌移植瘤生长的动物实验 |
| 7.1 实验材料与仪器 |
| 7.1.1 实验材料 |
| 7.1.2 实验仪器 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 柞蚕丝的脱胶、溶解、浓度测定、阳离子化改性 |
| 7.2.2 靶向肽修饰阳离子化柞蚕丝素蛋白 |
| 7.2.3 CASF-C9/Ad复合物的制备 |
| 7.2.4 荷瘤小鼠致瘤所需H460细胞数量试验 |
| 7.2.5 建立小鼠H460肺癌移植瘤 |
| 7.2.6 CASF-C9/Ad复合物治疗肺癌移植瘤 |
| 7.2.7 免疫组化检测 |
| 7.2.8 数据统计分析 |
| 7.3 实验结果 |
| 7.3.1 小鼠移植瘤的致瘤细胞数量 |
| 7.3.2 CASF-C9/Ad复合物的抑瘤作用 |
| 7.3.3 HE染色观察肿瘤组织 |
| 7.3.4 免疫组化检测肿瘤相关因子的表达 |
| 7.3.5 讨论 |
| 7.4 本章小结 |
| 第八章 结语 |
| 8.1 全文结论 |
| 8.2 本论文的主要创新点 |
| 8.3 后续研究计划 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读博士学位期间本人发表的论文及着作 |
| 致谢 |
（2）去泛素化酶USP11通过p21调控细胞周期介导非小细胞肺癌增殖的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩写对照 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 蛋白酶体途径 |
| 1.1.1 泛素化 |
| 1.1.2 去泛素化 |
| 1.1.3 去泛素化酶的分类与功能 |
| 1.1.4 去泛素化酶活性的调控 |
| 1.1.5 去泛素化酶与肿瘤的关系 |
| 1.2 USP11 蛋白的概述 |
| 1.2.1 USP11 蛋白的结构 |
| 1.2.2 USP11 蛋白的功能 |
| 1.2.3 USP11 与疾病的关系 |
| 1.3 p21 蛋白的概述 |
| 1.3.1 p21 蛋白的结构 |
| 1.3.2 p21 的功能 |
| 1.3.3 p21 亚细胞定位的调控机制 |
| 1.3.4 p21 与肿瘤的关系 |
| 1.3.5 p21 蛋白的调控 |
| 1.4 本课题的研究目的、内容和意义 |
| 第2章 去泛素化酶USP11 调控p21 的蛋白稳定性 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与实验仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 相关实验试剂的配制 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3 细胞转染实验 |
| 2.3.4 蛋白质的检测 |
| 2.3.5 免疫共沉淀实验 |
| 2.3.6 免疫荧光实验 |
| 2.3.7 荧光定量PCR实验 |
| 2.3.8 蛋白半衰期的检测 |
| 2.3.9 蛋白质的原核表达与纯化 |
| 2.3.10 泛素化实验 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 USP11与p21 在细胞中相互作用 |
| 2.4.2 USP11 调控p21 的蛋白水平 |
| 2.4.3 USP11 影响p21 半衰期和泛素化 |
| 2.4.4 USP11 敲低废除DNA损伤引起的p21 增加 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 第3章 USP11 通过p21 影响细胞周期的演进 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与实验仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 相关实验试剂的配制 |
| 3.3.2 PI染色检测细胞周期实验 |
| 3.3.3 BrdU染色检测S期细胞含量 |
| 3.3.4 pH3 染色检测G2/M转换 |
| 3.3.5 细胞周期同步化实验 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 USP11 通过p21 调控细胞周期G1/S期转变 |
| 3.4.2 USP11 通过p21 调控DNA损伤诱导G2/M期转变 |
| 3.4.3 USP11 通过p21 调控DNA损伤诱导的细胞凋亡 |
| 3.5 小结与讨论 |
| 第4章 USP11 通过p21 抑制NSCLC细胞增殖 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与实验仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 相关实验试剂的配制 |
| 4.3.2 USP11和p21 过表达慢病毒制备 |
| 4.3.3 裸鼠肺癌模型的建立 |
| 4.3.4 免疫组化实验 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 USP11 过表达通过稳定p21 抑制肺癌移植瘤生长 |
| 4.4.2 USP11 干扰促进肺癌移植瘤生长依赖于p21 |
| 4.4.3 USP11和p21在NSCLC组织中具有相关性 |
| 4.5 小结与讨论 |
| 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读学位期间发表学术论文目录 |
| 致谢 |
（3）CUL4 E3连接酶调控肺鳞癌和小细胞肺癌增殖及凋亡的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、CUL4A和CUL4B对肺鳞癌及小细胞肺癌增殖的影响 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验对象 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 实验材料 |
| 1.1.4 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 稳系的构建 |
| 1.2.2 CUL4A和CUL4B敲降对肺鳞癌和小细胞肺癌生长的影响 |
| 1.2.3 CUL4A和CUL4B表达下调后对肺鳞癌及小细胞肺癌细胞周期及细胞凋亡的影响 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、CUL4A对肺鳞癌及小细胞肺癌的周期调控及其作用机制 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 实验材料 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 CUL4A敲降后P21表达上调 |
| 2.2.2 CUL4Aknockdown中敲降P21后,CyclinE1表达水平恢复及G1期阻滞现象解除 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、CUL4B对肺鳞癌及小细胞肺癌的凋亡调控及其作用机制 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验对象 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 实验材料 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 CUL4B敲降后凋亡蛋白上调,抗凋亡蛋白下调 |
| 3.2.2 CUL4B与FOXO3A的关系 |
| 3.2.3 CUL4B与ERK的关系 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 CRLs介导的泛素化与肿瘤的关系 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）HOTAIR在非小细胞肺癌中EGFR-TKIs耐药机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、HOTAIR通过调控细胞周期介导非小细胞肺癌获得性耐药的发生 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 实验仪器及试剂 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 HOTAIR在耐药细胞株中表达量升高 |
| 1.2.2 长链非编码RNA HOTAIR促进非小细胞肺癌细胞耐药的发生 |
| 1.2.3 HOTAIR可调控非小细胞肺癌细胞周期G1/S期并影响P16、P21 的表达 |
| 1.2.4 HOTAIR可表观遗传沉默P16,P21 进而促进细胞周期进程 |
| 1.2.5 EZH2 参与HOTAIR调控细胞周期促进耐药发生 |
| 1.2.6 HOTAIR通过表观遗传调控H3K27/EZH2 调控细胞周期参与耐药机制 |
| 1.2.7 HOTAIR可促进非小细胞肺癌细胞增殖而促使耐药的发生 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、miR-1249、miR-1910 通过靶向沉默P16、P21与HOTAIR共同促进细胞周期进程 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 实验仪器及试剂 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 HOTAIR可促进miR-1249-5P和 miR-1910-3P的高表达 |
| 2.2.2 高表达的miR-1249-5P和 miR-1910-3P可以提高细胞对Gefitinib耐药性 |
| 2.2.3 miR-1249-5P和 miR-1910-3P可靶向沉默P16,P21 促进细胞周期进程 |
| 2.2.4 miR-1249-5P和 miR-1910-3P的过表达可通过细胞周期可促进细胞对Gefitinib的耐药 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新及不足 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 长链非编码RNA HOTAIR在非小细胞肺癌中的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）ROR α基因在非小细胞肺癌中的作用及相关机制研究（论文提纲范文）
| 第一部分 ROR α在细胞水平对非小细胞肺癌的增殖活力作用及相关机制 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ROR α基因在体内对非小细胞肺癌（NSCLC)肿瘤形成影响的研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 ALDH1A1对非小细胞肺癌A549细胞顺铂耐药的影响及相关机制 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述: 肿瘤与衰老 |
| 参考文献 |
| 附录一 缩略词对照表 |
| 附录二 攻读学位期间发表文章 |
| 致谢 |
（6）RGD修饰的腺病毒介导ING4或/和P53基因表达对人肺腺癌细胞的体内外生长抑制作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 ING4或/和P53单双基因重组腺病毒的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 P53基因克隆和单双基因重组转移质粒的构建和鉴定 |
| 2.2 RGD修饰的单双基因同源重组腺病毒质粒的构建和鉴定 |
| 2.3 各组重组腺病毒在QBI-293A细胞中的包装 |
| 2.4 各组重组腺病毒的效价检测 |
| 2.5 RT-PCR法鉴定ING4或/和P53单双基因重组腺病毒的构建 |
| 2.6 Western Blot法鉴定ING4或/和P53基因在QBI-293A细胞中的蛋白表达 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 腺病毒介导ING4或/和P53基因表达对人肺腺癌细胞( A549)抑制作用的体外试验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2.实验结果 |
| 2.1 荧光显微镜观察各组重组腺病毒感染A549肺癌细胞后细胞内GFP表达 |
| 2.2 流式细胞仪检测各组重组腺病毒对A549肺癌细胞的感染效率 |
| 2.3 Western blot法鉴定ING4或/和P53基因在A549肺癌细胞中的蛋白表达 |
| 2.4 MTT法检测ING4或/和P53基因表达对A549肺癌细胞的生长抑制作用 |
| 2.5 流式细胞仪双染法检测ING4或/和P53基因表达对A549肺癌细胞凋亡的影响 |
| 2.6 Real time-PCR检测ING4或/和P53基因表达对A549肺癌细胞内Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA表达水平的影响 |
| 2.7 Western blot法检测ING4或/和P53基因表达对A549肺癌细胞内Bax、Bad、Bcl-xl蛋白表达水平的影响 |
| 2.8 流式细胞仪单染法检测ING4或/和P53基因表达对A549肺癌细胞周期的影响 |
| 2.9 Real time-PCR检测ING4或/和P53基因表达对A549肺癌细胞内P21和Cyclin -E mRNA表达水平的影响 |
| 2.10划痕实验鉴定ING4或/和P53基因表达对人肺腺癌细胞迁移能力的影响 |
| 2.11 Transwell法检测ING4或/和P53基因表达对人肺癌细胞侵袭能力的影响 |
| 2.12 Real time-PCR检测ING4或/和P53基因表达对A549肺癌细胞内MMP-2 和MMP-9 mRNA表达水平的影响 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 腺病毒介导ING4或/和P53基因表达对裸鼠人肺腺癌移植瘤生长抑制效应的体内试验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 裸鼠人肺腺癌移植瘤模型的建立及成瘤率 |
| 2.2 裸鼠体内药物实验安全性观察 |
| 2.3 各组重组腺病毒对A549裸鼠人肺腺癌移植瘤的体内抗肿瘤效应 |
| 2.4 免疫组化检测ING4或/和P53基因表达在裸鼠体内抗肿瘤效应的分子机制 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述：ING4与P53的结合对肿瘤的影响 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间本人公开出版或发表的论着、论文 |
| 本论文受下列课题资助 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（7）苏木、鸡血藤含药血清对PG细胞增殖影响的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 含药血清的制备 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 苏木含药血清对PG细胞增殖作用的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 统计分析方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 第三章 苏木含药血清对PG细胞形态的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 苏木含药血清对PG细胞周期的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 统计分析方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 第五章 苏木含药血清对PG细胞CYCLIND1、CDK4、PCNA蛋白表达的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 统计分析方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 第六章 苏木含药血清对PG细胞P16、RB1MRNA表达的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 统计分析方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 第七章 鸡血藤含药血清对PG细胞增殖作用的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 统计分析方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 第八章 鸡血藤含药血清对PG细胞形态的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第九章 鸡血藤含药血清对PG细胞周期的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 统计分析方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 第十章 鸡血藤含药血清对PG细胞CYCLIND1、CDK4、PCNA蛋白表达的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 统计分析方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 第十一章 鸡血藤含药血清对PG细胞P16、RB1MRNA表达的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 统计分析方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 结语 |
| 1 主要研究结果 |
| 2 讨论 |
| 3 存在问题与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）涎腺腺样囊性癌转基因治疗研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 文献综述 |
| 1.2 肿瘤基因治疗的现状 |
| 1.3 研究思路及实验设计 |
| 第二章 涎腺腺样囊性癌组织中P16 和 P21~(WAF1)蛋白表达 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 标本来源 |
| 2.1.2 试剂与仪器 |
| 2.1.3 免疫组织化学染色 |
| 2.1.4 结果判定 |
| 2.1.5 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 实验体会 |
| 第三章 腺病毒介导 p16、p21 基因共转染对涎腺腺样囊性癌细胞 系 SACC-83 的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 倒置显微镜下观察细胞生长状态 |
| 3.2.2 转染效率的测定 |
| 3.2.3 RT-PCR 可检测到外源基因p16、p21 的表达 |
| 3.2.4 p16、p21 基因共转染对SACC-83 细胞增殖影响 |
| 3.2.5 流式细胞仪检测细胞周期变化情况 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 实验体会 |
| 第四章 mda-7/IL-24 基因转染体外诱导腺样囊性癌细胞 SACC-83 凋亡作用研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 外源性 mda-7/IL-24 基因在小鼠成纤维细胞系 L-929 及腺样囊性癌细 胞系 SACC-83 中的表达 |
| 4.2.2 转染 mda-7/IL-24 对两种细胞生长状态的影响 |
| 4.2.3 mda-7/IL-24 对小鼠成纤维细胞系 L-929 及腺样囊性癌细胞系 SACC-83 增殖的影响 |
| 4.2.4 转染 mda-7/IL-24 对腺样囊性癌细胞 SACC-83 克隆形成的影响 |
| 4.2.5 mda-7/IL-24 能诱导腺样囊性癌细胞凋亡 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 实验体会 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表的论文及参与的科学研究 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
（9）核心蛋白聚糖对肺腺癌细胞生长侵袭的影响及其靶向治疗的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词表 |
| 研究论文 Decorin对肺腺癌细胞生长侵袭的影响及其靶向治疗研究 |
| 前言 |
| 实验设计 |
| 第一章 decorin对人肺腺癌细胞株A549体外生长的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二章 decorin对人肺腺癌细胞粘附、迁延及侵袭能力的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三章 decorin靶向治疗裸鼠人肺腺癌A549移植瘤的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 肺癌分子生物学研究现状及前景 |
| 综述二 Decorin与肿瘤 |
| 致谢 |
| 攻博期间主要的研究成果目录 |
（10）Ad-p16、Ad-p53联合紫杉醇治疗乳腺癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 中文部分 |
| 第一部分 乳腺癌p16、p53基因蛋白及其mRNA表达的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 重组p16和p53腺病毒的构建、鉴定、纯化和测定 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第三部分 Ad-p16、Ad-p53联合紫杉醇治疗乳腺癌的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文 |
| Abstract |
| Part 1 |
| Part 2 |
| Part 3 |
| Part 1 Study on breast cancer p16 and p53 gene protein and mRNA expression |
| Foreword |
| Materials and Methods |
| Results |
| Discussions |
| Conclusion |
| Annexal Figure and Table |
| Reference |
| Part 2 Construction, identification, purification and determination of recombinant p16 and p53 adenovirus |
| Foreword |
| Materials and Methods |
| Results |
| Discussions |
| Conclusion |
| Annexal Figure and Table |
| Reference |
| Part 3 Study on breast cancer therapy combining Ad-p16 and Ad-p53 with Tax |
| Foreword |
| Materials and Methods |
| Results |
| Discussions |
| Conclusion |
| Annexal Figure and Table |
| Reference |
四、腺病毒介导p16基因的表达及其对肺癌细胞的周期阻滞作用（论文参考文献）
- [1]肺癌靶向性丝素/ING4-IL-24双基因共表达腺病毒复合物[D]. 瞿静. 苏州大学, 2020(06)
- [2]去泛素化酶USP11通过p21调控细胞周期介导非小细胞肺癌增殖的分子机制研究[D]. 邓堂刚. 湖南大学, 2019(01)
- [3]CUL4 E3连接酶调控肺鳞癌和小细胞肺癌增殖及凋亡的机制研究[D]. 李婷. 天津医科大学, 2019(02)
- [4]HOTAIR在非小细胞肺癌中EGFR-TKIs耐药机制的研究[D]. 李伟婷. 天津医科大学, 2019(02)
- [5]ROR α基因在非小细胞肺癌中的作用及相关机制研究[D]. 位云艳. 南京医科大学, 2017(06)
- [6]RGD修饰的腺病毒介导ING4或/和P53基因表达对人肺腺癌细胞的体内外生长抑制作用[D]. 何峰. 苏州大学, 2015(02)
- [7]苏木、鸡血藤含药血清对PG细胞增殖影响的机制研究[D]. 郭秀伟. 北京中医药大学, 2014(09)
- [8]涎腺腺样囊性癌转基因治疗研究[D]. 柯小亮. 吉林大学, 2009(08)
- [9]核心蛋白聚糖对肺腺癌细胞生长侵袭的影响及其靶向治疗的实验研究[D]. 梁硕. 中南大学, 2007(01)
- [10]Ad-p16、Ad-p53联合紫杉醇治疗乳腺癌的实验研究[D]. 阮永威. 山东大学, 2007(03)