离体豚鼠内耳Deiters细胞的形态学和电生理特性

一、单离豚鼠内耳Deiters细胞的形态及电生理特性（论文文献综述）

唐峰^[1]（2020）在《小鼠耳蜗不同部位内毛细胞基因表达差异性研究》文中研究说明一、目的内毛细胞（inner hair cell,IHC）是哺乳动物耳蜗内主要的听觉感受细胞,并能将机械刺激转化为电信号。在低等脊椎动物听觉上皮中,如龟和蛙类,其毛细胞是内在调谐的,其突触神经递质释放呈现明显的频率选择性。而哺乳动物内耳毛细胞是否存在类似内在调谐的功能特性仍然是一个值得探讨和研究的问题。最近研究发现耳蜗不同部位IHC在纤毛的数目和长度、带状突触数目、细胞膜电生理特性、Ca2+通道电生理特性、Ca2+依赖性胞吐作用和囊泡循环等与细胞结构相关的以及听觉信号传递密切相关的生理功能方面呈现出明显的差异。同时,频率选择性损伤是年龄、噪音、耳毒性药物、遗传缺陷等因素导致的感音神经性聋表现出的一种常见现象,而IHC损失是其主要原因之一,提示耳蜗不同部位的IHC的存活能力可能存在差异。这些结果均提示小鼠耳蜗IHC可能也是内在调谐的,对耳蜗不同部位IHC的基因表达模式差异性的研究是探究IHC内在调谐功能特性和机制的重要基础。而目前仍然缺乏将IHC精确地沿着耳蜗纵轴分离后进行基因表达检测与表达差异分析的研究。本研究利用已建立的显微捕获的方法收集正常成年小鼠顶回和底回游离IHC进行RNA测序（Ribonucleic acid sequencing,RNA-seq）,对其差异表达基因进行筛选分析并验证,尝试为将来耳蜗不同部位IHC表现出的结构功能以及细胞存活等差异的机制研究提供基础数据和思路。二、方法1.C57BL/6J小鼠顶、底回IHC的分离与捕获:通过耳蜗基底膜解剖,胶原酶消化和机械分离,显微捕获的步骤方法收集顶底回IHC。2.高通量测序与基因表达差异性分析:将收集的耳蜗顶、底回IHC裂解后,使用SmartSeq2的步骤进行反转录和扩增,完成RNA质控后在BGISEQ-500平台进行高通量测序。利用HISAT2与DESeq进行基因表达分析,主要筛选分析了与IHC纤毛结构功能,突触电生理,耳聋基因,细胞存活等密切相关的关键基因。3.差异基因表达验证:利用免疫化学染色的方法,对PVα、OM、Fbx32和γ-Synuclein在成年C57BL/6J小鼠以及BABLc小鼠内耳的表达同时进行验证。三、结果1.IHC的分离效率较OHC低,同时底回IHC因解剖困难分离效率较顶回底,最终捕获顶回和底回IHC各3组,每组各40个细胞。2.总共有13,908和12,915个转录本分别在顶回IHC和底回IHC中表达（FPKM≥1）,其中有689个基因表达差异超过2倍,而93.4%的DEGs在顶回IHC中上调。同时筛选发现耳聋基因在顶回和底回IHC间的表达无明显差异,而与IHC纤毛结构功能、突触电生理、细胞存活等相关的部分基因,特别是Pvalb、Prkd1、Fbxo32和Sncg,在顶回和底回IHC的表达存在差异,其中Pvalb、Fbxo32在底回IHC中表达上调,Prkd1和Sncg在顶回IHC中表达上调。3.成年C57BL/6J小鼠耳蜗基底膜免疫荧光染色结果显示PVα和Fbx32在底回IHC中表达高于顶回IHC,γ-Synuclein在底回IHC中呈现选择性表达缺失,与测序结果相符。而OM仅在OHC中高表达,在IHC中几乎不表达。OM、PVα和Fbx32的免疫组织化学染色结果与免疫荧光染色结果相似,但γ-Synuclein的免疫组织化学染色结果没有发现在底回IHC中表达缺失的现象。成年BABLc小鼠耳蜗基底膜PVα和Fbx32的免疫荧光染色结果与C57BL/6J小鼠高度一致,均在高表达于底回IHC,但是未发现γ-Synuclein在BABLc小鼠耳蜗底回IHC中呈现选择性表达缺失。四、结论1.本研究建立了成年小鼠耳蜗顶、底回IHC机械分离与显微捕获的方法,采用两次吸取捕获的方法可以减少样本受细胞碎屑和杂质的污染和干扰。2.本研究揭示了成年小鼠耳蜗不同部位的IHC具有不同的基因表达谱。3.本研究发现了CaBPs的差异表达,PVα在底回IHC中表达高于顶回IHC。4.本研究发现了细胞存活相关基因的差异表达,起保护作用的基因Sncg高表达于顶回IHC,而负调控基因Fbxo32高表达于底回IHC。5.本研究提供了C57BL/6J小鼠耳蜗不同部位IHC基因表达的基础数据,可以为耳蜗不同部位IHC的结构功能以及细胞存活等差异的机制研究提供思路。

张凌,杨仕明^[2]（2014）在《耳蜗毛细胞相关细胞及影响因子的发育研究进展》文中认为听觉感知细胞即毛细胞,因其顶端被毛状的纤毛所覆盖而得名。人耳在出生时大约包含15 000个毛细胞,随着年龄的增长数目逐渐减少。近年来,毛细胞是否再生的问题受到了国内外广大研究者越来越多的关注。Cruz等[1]发现新生小鸡的耳蜗毛细胞在受损伤后有再生的能力,并被以后的许多实验证实。Forge等[2]利用在体实验结合电镜研究,首先在豚鼠前庭系统观察到毛细胞再生,使毛

周涛^[3]（2013）在《乙酰胆碱在前庭传出神经系统外周的作用机制及酶对其受体介导电流的影响》文中研究说明第一部分M2型胆碱能受体介导的BK电流在豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞内的信号转导机制目的：大量的研究证实乙酰胆碱（ACh）是前庭外周传出系统的主要抑制性传出神经递质。我们最新研究发现,在豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞上我们记录到的ACh激活的大电导钙激活钾通道是通过m2型胆碱能受体介导。m2型胆碱能受体属于代谢型受体,其在Ⅱ型前庭毛细胞内的信号转导机制尚不清楚。方法：取健康成年豚鼠,麻醉后取出耳蜗,分离出前庭外周终器（球囊、椭圆囊、壶腹）,酶消化后,分离出活性良好的前庭毛细胞,置入涂有鼠尾胶原的培养皿中贴壁,在倒置显微镜下选取Ⅱ型前庭毛细胞行全细胞膜片钳研究。结果：1)细胞内应用100μM/L的GTPyS（一种不能被水解的GTP类似物）引起一持续的外向电流,1-2分钟内电流达到最大（225.8±42.6pA,n=4）；2)细胞外给予10μM/L的GAPnt-2（一种Gi蛋白的a亚单位抑制剂）孵育1分钟,对ACh引起的电流没有影响（ACh,117.6±21.5pA, GAPnt-2+ACh111.6±19.3pA, p=0.14, n=5）;然而,细胞外给予Gi蛋白α亚单位和βγ亚单位抑制剂400ng/ml的PTX,4分钟内最大抑制作用为85.3±6.6%（n=5）;3)1mM db-cAMP（一种cAMP的类似物）与100μM/L的ACh一起作用于豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞,电流幅度增加了1.3倍（n=5）。然后,给予腺苷酸环化酶抑制剂100μM/L的2,5-dd-Ado1分钟,最大抑制效应是65.9±8.8%（n=5）,这时需要孵育3分钟外液才能完全恢复（n6）。结论：通过本研究,在豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞上乙酰胆碱激活的大电导钙激活钾通道是通过m2型胆碱能受体介导的Gi蛋白的βγ亚单位转导,从而影响AC的活性,进一步引起细胞内cAMP的升高,,进一步导致钙通道的磷酸化,钙离子内流,从而激活BK电流。第二部分M2型和α9型胆碱能受体介导的两种不同通道在豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞上共存目的：分子生物学研究证实乙酰胆碱（ACh）是前庭外周传出系统的主要抑制性传出神经递质。目前认为哺乳动物前庭外周传出神经递质ACh释放作用于Ⅱ型前庭毛细胞上,引起离子型的胆碱能受体α9介导的通道打开,进一步引起钙离子内流,从而激活小电导钙激活的钾离子通道（SK2）开放。然而我们最新研究发现,在豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞上我们记录到ACh作用于M2型胆碱能受体,从而激活细胞内信号转导通路,进一步激活大电导钙激活的钾离子通道（BK）开放。根据以上两种结果的差异性,在本次研究中我们进一步研究这两种不同受体介导的不同通道（SK2和BK）在同一个细胞上的关系。方法：取健康成年豚鼠,麻醉后取出耳蜗,分离出前庭外周终器（球囊、椭圆囊、壶腹）,酶消化后,分离出活性良好的前庭毛细胞,置入涂有鼠尾胶原的培养皿中贴壁,在倒置显微镜下选取Ⅱ型前庭毛细胞行全细胞膜片钳研究。结果：1)在胶原酶IA消化的Ⅱ型前庭毛细胞上我们记录到M2型胆碱能受体介导的BK电流；2)在胰酶消化的Ⅱ型前庭毛细胞上我们记录到α9型胆碱能受体激活的SK2电流；3)首先在胰酶消化的毛细胞上我们记录到了α9型胆碱能受体激活的SK2电流,这种电流能被a9型胆碱能受体特异性抑制剂蜂毒明肽（apamin）抑制,而不能被M2型胆碱能受体抑制剂美索曲明（methoctramine）抑制。然后我们对这个在记录状态下的细胞用胶原酶IA进行消化3分钟。用正常外液孵育5分钟后,再次给予ACh,引起一缓慢激活的不失活的外向电流,这种电流不能被α9型胆碱能受体特异性抑制剂蜂毒明肽（apamin）抑制,而能被M2型胆碱能受体抑制剂美索曲明（methoctramine）抑制。结论：本研究发现M2和a9型胆碱能受体在豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞上共存,同时BK和SK2通道也共存于同一个细胞上。但是两种不同受体介导的不同通道的激活需要的消化酶不同,从而揭示酶可能对通道具有消化作用。第三部分大电导钙激活的钾通道（BK）和小电导钙激活钾通道（SK2）在大鼠前庭感觉上皮和Scarpa神经节上的分布目的：大量的研究证实乙酰胆碱（ACh）是前庭外周传出系统的主要抑制性神经递质。目前认为哺乳动物前庭外周传出神经递质ACh释放作用于Ⅱ型前庭毛细胞上,引起离子型的胆碱能受体α9介导的通道打开,进一步引起钙离子内流,从而激活小电导钙激活的钾离子通道（SK2）开放。并且我们最新研究发现,在豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞上我们记录到ACh通过m2型胆碱能受体激活大电导钙激活钾离子通道（BK）。然而,BK和SK2通道在哺乳动物前庭外周感觉上皮和Scarpa神经节上的分布尚不清楚。方法：采用正常成年大鼠,取内耳行冰冻切片,进行免疫荧光染色,检测BK和SK2在大鼠前庭感觉上皮和Scarpa神经节上的表达。结果：BK和SK2通道在大鼠前庭感觉上皮和Scarpa神经节上均有表达。1)BK通道选择性的表达于部分Ⅰ型和部分Ⅱ型前庭毛细胞上,而SK2通道表达于所有的Ⅰ型和Ⅱ型前庭毛细胞上；2)SK2通道表达于前庭支持细胞上,而BK通道不表达于支持细胞上；3)SK2通道表达于传入神经末梢上,而BK通道不表达；4)BK和SK2通道都表达于三种类型的Scarpa神经节胞体上。结论：BK和SK2通道在大鼠前庭感觉上皮和Scarpa神经节上均有表达。表明BK和SK2通道不仅在传出神经递质ACh释放调节Ⅱ型前庭毛细胞中起作用,在维持Ⅰ型前庭毛细胞的兴奋性中也可能起重要的作用。同时SK2通道的激活在前庭平衡感觉传入中也起到了重要的调节,但是BK通道不参入这个过程。在Scarpa神经节上BK和SK2通道可能参与了细胞动作电位产生从而调节细胞的兴奋性。

黄非^[4]（2009）在《过氧化氢与维生素C对老年豚鼠耳蜗外毛细胞大电导钙激活钾通道电流影响的实验研究》文中研究表明目的:研究氧自由基（oxygen free radidical）供体——过氧化氢（H2O2）及氧自由基清除剂维生素C对老年豚鼠耳蜗外毛细胞大电导钙激活钾通道（large conductance Ca2+—activated potassium channels, BKCa channels）电流的影响,探讨氧自由基及氧自由基清除剂对老年豚鼠耳蜗外毛细胞BKCa通道电流的作用机制,以及如何调节外毛细胞的功能状态,从而影响老年性聋（presbycusis）的发生和发展,并为临床预防、治疗老年性聋提供理论依据和新的思路。方法:采用急性酶分离方法分离老年豚鼠耳蜗外毛细胞和膜片钳全细胞记录模式观察、记录BKCa通道电流及其变化。1.细胞分离选择耳廓反射灵敏的健康老年杂色豚鼠（250～400g）60只,快速断头处死,取出听泡,耳蜗置入已充氧的冷细胞外液中;解剖显微镜下仔细剔除耳蜗骨壳,断开蜗轴,将去除蜗壳的剩余耳蜗移入含Ⅳ型胶原酶（1mg/ml）的细胞外液中消化12分钟;然后移入装有浴液并预先用纤维连接纯化蛋白处理底部1小时的浴槽中终止消化。解剖显微镜下用微镊环形撕除螺旋韧带,酶消化后的外毛细胞及部分未充分消化的基底膜即脱落于浴槽中。撕碎解剖镜下可见的基底膜组织,轻轻吹打后静置20～30分钟,使单离的外毛细胞贴附于浴槽底部,以上操作均在室温条件（2025℃）下完成。2.通道电流记录拉制电极,电极抛光,更换浴液,选择贴壁良好、立体感强、形态典型的单离外毛细胞形成高阻封接。电极施加短促的负压,电极尖端吸附的胞膜破裂,形成膜片钳全细胞记录模式。选择钳制电压（VH）为-60mV,从-50mV起除极至+50mV,以10mV为一个阶跃,刺激持续时间400ms,激活BKCa通道,观察、记录BKCa通道电流。电流信号经膜片钳放大器放大后,引入记忆示波器及12位A/D、D/A转换器,再输入计算机用于电流信号采集,采样频率为10KHz,低通滤波2KHz后完成。P-Clamp 9.0专用软件进行数据分析处理。采用电流幅值（Current Amplitude, Am）,电流密度（Current density）,电流-电压关系曲线（I-V Curve）作为分析项目。3.鉴别并分析通道特性通过改变指令电压（VT）,观察、记录该通道电流的电生理特性,包括通道开放的电压依赖性,电流幅值,电流密度,电流—电压曲线。并观察电流激活、失活时间,是否具有电压依赖性等。观察BKCa通道特异性阻断剂伊比利亚毒素（iberiotoxin, IbTX）对通道活动的影响。4.药物作用观察⑴记录到稳定、正常的BKCa通道电流后,向新鲜分离外毛细胞的2ml浴槽浴液内分组加入H2O2稀释液（0.2mmol/L）0、10、20、40μl,使浴液中H2O2浓度分别为0、1、2、4μmol/L,观察、记录不同浓度H2O2对BKCa通道电流的影响。记录后,用不含药物的新鲜浴液洗脱,观察通道电流的恢复情况。⑵分组向新鲜分离贴壁外毛细胞的2ml浴槽浴液中加入维生素C溶液（5mg/ml） 0、10、20、40μl,使浴液中维生素C浓度分别为0、25、50、100μg/ml,观察、记录不同浓度维生素C对BKCa通道电流的影响。⑶先向新鲜分离贴壁外毛细胞的2ml浴槽的浴液中加入H2O2稀释液40μl,使浴液中H2O2浓度为4μmol/L,再分组加入维生素C溶液10、20、40μl,使浴液中维生素C终浓度分别为25、50、100μg/ml,观察、记录H2O2和维生素C联合作用对BKCa通道电流的影响。结果:1.膜片钳全细胞模式下,记录到一串幅值较大,快速激活,几乎不失活的电流,激活电压大于-40～-30mv,电流随膜电位的增加而增强,电流幅值不断增大,并表现出外向整流的特性,记录的电流无“rundown”现象;IbTX 100nmol/L时,通道活动完全阻断,证实为BKCa通道电流。2.⑴H2O2浓度为1、2、4μmol/L时,BKCa通道电流表现明显的H2O2浓度依赖性兴奋,电流幅值和峰值电流密度随浓度增加而增大,I-V曲线上升,新鲜浴液洗脱后通道电流可部分恢复。用药3分钟内,当VT为+50mv时,加药各组对比对照组BKCa通道峰值电流密度最大值分别为:1μmol/L组比对照组从22.09±0.27 PA/PF升至27.43±0.51PA/PF,增幅24.17%;2μmol/L组比对照组从22.09±0.27PA/PF升至35.81±0.74 PA/PF,增幅62.11% ; 4μmol/L组比对照组从22.09±0.27 PA/PF升至43.53±1.09PA/PF,增幅97.06%。⑵各组单独应用维生素C组对BKCa通道电流无明显影响。⑶H2O2 4μmol/L +维生素C不同浓度25、50、100μg/ml组时,BKCa通道电流表现浓度依赖性抑制,电流幅值和峰值电流密度随着维生素C浓度的增加而减小, I-V曲线下降。用药3分钟内,当VT为+50mv时,各组对比对照组BKCa通道峰值电流密度最大值分别为:25μg/ml维生素C +4μmol/LH2O2组比对照组从43.53±1.09PA/PF降至34.85±0.49PA/PF,增幅为-19.94%;50μg/ml维生素C +4μmol/LH2O2组比对照组从43.53±1.09PA/PF降至30.63±0.56PA/PF,增幅为-29.64%;100μg/ml维生素C +4μmol/LH2O2组比对照组从43.53±1.09PA/PF降至25.79±0.58PA/PF,增幅为-40.75%。但仍不能恢复至加药前正常水平。结论:1.本实验测得的电流为BKCa通道电流,具有大电导、电压依赖性、快速激活、几乎不失活,且对BKCa通道特异性阻断剂IbTX敏感。2.氧自由基供体H2O2可呈剂量依赖性的激活BKCa通道电流,而抗氧化剂维生素C可以呈剂量依赖性的抑制该激活电流,但并不能恢复到加药前正常水平。3.实验结果证明,在氧自由基供体H2O2对老年豚鼠耳蜗外毛细胞BKCa通道电流的影响过程中,存在氧自由基/BKCa途径,而氧自由基清除剂维生素C则能很大程度逆转该过程。4.推测氧自由基/BKCa途径可能在抑制外毛细胞钙超载及神经细胞损伤中起负反馈机制,抗氧化剂能有效减轻氧自由基对外毛细胞BKCa通道的影响。

朱云,孔维佳,夏交,张宇,程华茂,郭长凯^[5]（2008）在《豚鼠I型前庭毛细胞胆碱能受体通道特性》文中研究指明本文旨在探讨豚鼠I型前庭毛细胞上有无胆碱能受体存在,并对其相应的离子通道特性进行研究。应用全细胞膜片钳技术检测急性分离的豚鼠I型前庭毛细胞对乙酰胆碱（acetylcholine,ACh）的反应。结果显示,7.5%（21/279）的I型前庭毛细胞对101000μmol/L ACh敏感,引发明显的外向电流。该电流对ACh的反应呈浓度依赖性,半数激活浓度（EC50）为（63.78±2.31）μmol/L,但该电流为非电压依赖性。在-50mV钳制电压和正常细胞外液中,100μmol/L ACh激活一持久缓慢的外向电流,电流幅值为（170±15）pA,该电流幅值依赖于胞外钙离子浓度,可被胞外给予的钙依赖性钾通道拮抗剂TEA阻断。I型前庭毛细胞的再次激活时间不小于1min。长时间暴露在ACh的情况下,受体离子通道不会发生自发性关闭。以上结果提示,部分豚鼠I型前庭毛细胞上存在胆碱能受体,胞外给予ACh可激活一持久缓慢的外向电流,其胆碱能受体通道对于ACh的作用呈浓度依赖性和外钙依赖性、非电压依赖性或失敏性。本研究结果对于阐明前庭传出神经的功能及其作用机制,证实并揭示I型前庭毛细胞上存在传出神经递质受体以及日后临床指导眩晕疾病的康复治疗具有重要的意义。

朱云^[6]（2008）在《豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞胆碱能受体特性的研究》文中研究指明第一部分Ⅰ型前庭毛细胞改良分离法目的探讨一种能提供更多数量并更长时间保留单离豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞（VHCⅠ）细胞活性的分离方法。方法将耳廓反射正常的杂色豚鼠随机分为4组,每组12只,分别为0.25%胶原酶Ⅳ+常用分离法组（A组）,0.05%胰蛋白酶+常用分离法组（B组）,0.25%胶原酶Ⅳ+改良分离法组（C组）和0.05%胰蛋白酶+改良分离法组（D组）分离豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞,通过光镜、膜片钳、胞内钙成像等方法观察、鉴定和评价VHCⅠ活性。结果A组平均每耳分离出存活单离VHCⅠ25个,镜下可见成簇的细胞团块,3h后存活细胞约14个,6h后存活细胞约8个,3h膜片钳测得静息电位平均为-55±10mV,钙离子成像技术测得胞内钙离子浓度平均为105±15nmol/ L; B组平均每耳分离出存活单离VHCⅠ40个, 3h后存活细胞约19个,6h后存活细胞约6个,3h膜片钳测得静息电位平均为-60±10mV,钙离子成像技术测得胞内钙离子浓度平均为95±10nmol/ L; C组平均每耳分离出存活单离VHCⅠ24个,3h后存活细胞约17个,6h后存活细胞约11个,3h膜片钳测得静息电位平均为-55±10mV,钙离子成像技术测得胞内钙离子浓度平均为95±15nmol/ L;D组平均每耳分离出VHCⅠ42个,镜下成簇细胞团块较少,细胞与组织离解充分,3h后存活细胞约32个,6h后存活细胞约23个, 3h膜片钳测得静息电位平均为-60±10mV,钙离子成像技术测得胞内钙离子浓度平均为90±10nmol/ L,且胞内钙离子浓度更稳定。结论以胰蛋白酶酶解结合改良式液体外加机械分离技术分离方法简便易行,能提供足够量的存活时间较长的单离豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞,适用于对细胞活性要求较高的实验如膜片钳电生理研究等。第二部分豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上存在胆碱能受体通道目的探讨豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上有无胆碱能受体存在。方法应用全细胞膜片钳技术检测豚鼠急性分离的Ⅰ型前庭毛细胞（vestibular hair cell typeⅠ, VHCⅠ）对乙酰胆碱（acetylcholine , ACh）的反应特性及其浓度依赖性。结果7.5%（21/279）的Ⅰ型前庭毛细胞对10～1000μmol/L的ACh敏感,对ACh的反应呈浓度依赖性（EC50=63.78±2.31μmol/L）。结论部分豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上存在胆碱能受体,胞外给予ACh（10～1000μmol/L）可激活一持久缓慢的外向电流,Ⅰ型前庭毛细胞的胆碱能受体通道对于ACh的作用呈现浓度依赖性。第三部分豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上胆碱能受体通道电生理特性的研究目的对豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上胆碱能受体介导的离子通道的特性进行研究。方法应用全细胞膜片钳技术,检测豚鼠急性分离的Ⅰ型前庭毛细胞（vestibular hair cell typeⅠ, VHCⅠ）对乙酰胆碱（acetylcholine , ACh）的电流特性。结果豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上胆碱受体诱发电流为非电压依赖性。在-50mV钳制电压和正常细胞外液中,100μmol/L乙酰胆碱激活一持久缓慢的外向电流,电流幅值为170±15pA。VHCⅠ的再次激活时间不小于1min。在长时间暴露在ACh的情况下,受体离子通道不会发生自发性关闭。结论胞外给予ACh（10～1000μmol/L）部分豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上可激活一持久缓慢的外向电流,Ⅰ型前庭毛细胞的胆碱能受体通道对于ACh的作用呈现外钙依赖性,非电压依赖性或失敏性。第四部分胆碱能激动剂对豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞内钙离子浓度的影响目的通过观察胆碱能受体激动剂对豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞（VHCⅠ）胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的影响,探讨前庭毛细胞膜所存在的胆碱能受体及其分型,检验该细胞上胆碱能受体的脱敏现象。方法用胰蛋白酶消化结合机械分离法,分离豚鼠VHCⅠ,荧光探针Fura-2染色后在荧光倒置显微镜下记录VHCⅠ胞内游离钙离子浓度的动态变化。结果①非选择性胆碱能受体激动剂乙酰胆碱（ACh）、M型胆碱能受体激动剂毒蕈碱（muscarine）在正常细胞外液中均可引起大部分（21/25, 14/18）单离VHCⅠ[Ca2+]i的升高,但无钙外液中ACh、muscarine仅使少部分（3/20,2/16）VHCⅠ[Ca2+]i升高且作用减弱;正常外液中,N型受体激动剂尼古丁（nicotine）仅在高浓度（≥10 mmol/L）时引起部分（7/32） VHCⅠ[Ca2+]i升高,在低浓度时对胞内钙离子浓度影响不明显,无钙外液中,10 mmol/L nicotine对胞内钙离子浓度影响不明显。②ACh引起VHCⅠ内[Ca2+]i升高在同一细胞可重复出现,不存在脱敏现象③M型胆碱能受体拮抗剂阿托品（atropine）可抑制ACh引起的VHCⅠ[Ca2+]i的升高,N型胆碱能受体拮抗剂筒箭毒素（d-TC）对ACh引起的VHCⅠ[Ca2+]i的升高具有竞争性抑制作用。④分别以m1、m2、m3、m4型胆碱能受体拮抗剂pirenzepine、methoctramine、4-DAMP、tropicamide预孵育VHCⅠ5min后胞外给予ACh,均可引起[Ca2+]i ratio值升高幅度降低,但pirenzepine、4-DAMP和tropicamide对ACh对再次引起VHCⅠ[Ca2+]i ratio值升高的抑制作用不明显,methoctramine预孵育后细胞的[Ca2+]i ratio的升高幅度较首次正常外液中给予100μmol/L ACh后[Ca2+]i ratio值升高幅度降低约35±10%。结论豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞膜上存在M型和N型两种亚型的胆碱能受体,ACh对VHCⅠ内[Ca2+]i升高的作用主要以激动m2型胆碱能受体为主;胞外钙内流是[Ca2+]i升高的主要途径;豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞膜上的胆碱能受体对乙酰胆碱无脱敏现象。第五部分豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上乙酰胆碱敏感性电流的胞内信号转导机制目的本文探讨了豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上胆碱能受体介导的乙酰胆碱敏感性电流胞内信号转导机制。方法应用膜片钳技术检测急性分离的豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞（vestibular hair cell typeⅠ, VHCⅠ）上乙酰胆碱敏感性电流的胞内信号转导机制。结果在-50mV钳制电压和正常细胞外液中,100μmol/L乙酰胆碱在豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上激活一持久缓慢的外向电流,大电导钙依赖性钾通道（BK）选择性阻断剂北非蝎毒素（CTX）可大幅度抑制IACh,小电导钙依赖性钾通道（SK）选择性阻断剂蜂毒明肽（apamin）对IACh的影响不明显,IACh可被M型胆碱能受体拮抗剂阿托品（atropine）和N型胆碱能受体拮抗剂筒箭毒素（d-TC）竞争性抑制; m2型胆碱能受体选择性拮抗剂methoctramine可抑制VHCⅠ上引发的IACh,m1、、m3、m4型胆碱能受体拮抗剂pirenzepine、4-DAMP、tropicamide对VHCⅠ上IACh作用不明显;G蛋白抑制剂百日咳毒素（PTX）可使IACh幅值减小,非水解性GTP类似物GTP-γ-s可增大IACh幅值; IP3受体拮抗剂肝素（heparin）,PKG抑制剂KT5823,PKC特异选择性抑制剂BIM对豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上IACh的影响不明显,PKA抑制剂H-89可明显抑制IACh,胞外应用PKA激动剂forskolin可激活一类似IACh电流;胞外应用cAMP膜可渗透性类似物db-cAMP可激活一类似IACh电流,cGMP膜可渗透性类似物8-BrcGMP不能产生类似电流,PLC抑制剂U73122对IACh的作用不明显。结论ACh在VHCⅠ上主要作用于m2型胆碱能受体,激活一BK电流,该BK电流在胞内由m2型胆碱能受体偶联的G蛋白-cAMP-PKA通路介导。

刘英鹏^[7]（2008）在《缝隙连接Cx26和Cx30基因蛋白在哺乳动物耳蜗的细胞及亚细胞表达》文中认为目的:研究缝隙连接Cx26和Cx30在耳蜗侧壁中的表达和细胞分布,同时比较Cx26和Cx30在不同哺乳动物耳蜗中表达的差异。方法:采用免疫荧光染色方法和激光共聚焦显微镜检测大鼠、小鼠和豚鼠耳蜗侧壁血管纹和螺旋韧带中缝隙连接Cx26和Cx30表达和细胞分布情况。结果:耳蜗侧壁由血管纹和螺旋韧带组成,通过血管纹中间细胞的特异性细胞标记Kir4.1,我们检测到在血管纹中间细胞层,Cx26和Cx30均有广泛表达,并且呈树叶状分布;而在血管纹的基底细胞层,Cx26和Cx30表达呈六角形分布在细胞周围;Cx26和Cx30在血管纹的边缘细胞没有表达。在螺旋韧带中,Cx26和Cx30的表达与血管纹中不一样,Cx26和Cx30表达是沿着与螺旋韧带的纵轴垂直的方向排列分布的。Cx26主要表达在螺旋韧带的边缘部位,在螺旋韧带中间部位,即在螺旋韧带的血管纹侧表达较弱;而在螺旋韧带中间部位主要以Cx30表达为主。结论:Cx26和Cx30表达在耳蜗侧壁血管纹和螺旋韧带不同,在血管纹和螺旋韧带不同细胞中的表达也不一样,Cx26与Cx30在耳蜗侧壁的分布差异,提示Cx26和Cx30在耳蜗内淋巴电位和离子梯度的形成中发挥不同的作用。目的:研究不同哺乳动物耳蜗侧壁中缝隙连接Cx26和Cx30蛋白和mRNA表达情况及定量分析。方法:首先,采用Western-blot方法检测不同的动物（包括小鼠、大鼠和豚鼠）耳蜗侧壁血管纹和螺旋韧带,以及顶回和低回的血管纹和螺旋韧带中缝隙连接Cx26和Cx30蛋白表达情况及定量分析。其次,RT-PCR方法检测小鼠耳蜗血管纹和螺旋韧带中Cx26和Cx30的mRNA表达情况及定量分析。结果:耳蜗血管纹和螺旋韧带的Western-blot结果分析,显示三种动物的螺旋韧带中Cx26和Cx30蛋白表达量是高于血管纹Cx26和Cx30的蛋白表达量,在豚鼠、大鼠和小鼠螺旋韧带中的Cx26蛋白表达量分别是血管纹中的5.1958、1.7708和1.7570倍;三种动物Cx26蛋白表达量不同具有统计学差异（P< 0.05,ANOVA）。Cx30蛋白表达量在豚鼠、大鼠和小鼠螺旋韧带和血管纹的比例分别是4.2973、3.6205和3.5554,三种动物Cx30蛋白表达量不同没有显着统计学差异（P > 0.05,ANOVA）。此外,三种动物耳蜗侧壁顶回和底回Cx26和Cx30蛋白表达量比较结果,显示顶回和底回Cx26和Cx30蛋白表达量没有显着统计学差异（P > 0.05,T-test）。RT-PCR结果显示小鼠耳蜗螺旋韧带中Cx26和Cx30的mRNA表达要高于血管纹,Cx26和Cx30在螺旋韧带与血管纹的比值分别是1.8812和1.1643倍。结论: Cx26和Cx30的蛋白和mRNA表达在耳蜗螺旋韧带总是要高于血管纹,在不同动物耳蜗血管纹和螺旋韧带的表达不一样;Cx26和Cx30在侧壁表达的差异提示Cx26和Cx30在内耳侧壁中的作用可能不完全一样。目的:研究耳蜗基底膜组织中Cx26、Cx30和紧密连接ZO1的表达和相互关系。方法:采用免疫荧光双标记和激光共聚焦显微镜方法观察耳蜗基底膜组织中缝隙连接Cx26和Cx30与紧密连接ZO1的分布和相互关系。结果:在耳蜗基底膜非感觉上皮细胞,Cx26和Cx30共同表达在Hensen细胞、内外支柱细胞和Claudius细胞,Cx26在基底膜的表达部位大部分与Cx30的表达重合;在蜗轴螺旋缘也检测到Cx26和Cx30表达。在耳蜗内、外毛细胞没有Cx26和Cx30的表达。Cx26和ZO1在基底膜表达不重合,在基底膜的不同层面,Cx26和ZO1的表达逐渐发生改变;在基底膜网状板面,ZO1广泛分布在与内、外毛细胞和与之相邻的支持细胞之间的细胞连接中,Cx26在基底膜网状板面没有表达。而在基底膜深面, Cx26广泛分布在基底膜组织的各种支持细胞,在该层面没有发现的ZO1表达。结论:Cx26和Cx30分布在基底膜的各种支持细胞,在感觉毛细胞没有表达;此外,该研究发现Cx26和ZO1在耳蜗内具有不同的表达方式和表达部位,紧密连接ZO1在网状板面构成了毛细胞之间或与其支持细胞之间的离子屏障,阻止内、外淋巴之间的相互流通,保持了各自之间的离子平衡;缝隙连接则表达在基底膜的深层,参与离子转运。

夏交^[8]（2008）在《运用红外可视脑片膜片钳技术对大鼠前庭内侧核神经元内在膜特性和放电反应特性的研究》文中研究指明第一部分红外可视脑片膜片钳术中大鼠脑干脑片的改良制备方法目的:改良脑片制备方法,探讨影响脑片活性的实验因素;方法:在国内外报道常用方法的基础上进行改良,制备含有前庭内侧核的大鼠脑干脑片,从肉眼观、镜下观和放电特性三个方面判断脑片活性,观察鼠龄、生理溶液、温度等因素对脑片活性的影响;结果:在不同年龄组动物建立了稳定可靠的脑片制备方法,通过红外微分干涉相差技术可直接观察脑片表层下50-100μm前庭内侧核神经元的立体影像,并可进行长时间稳定的电生理记录;鼠龄越小神经元活性越易恢复,在成年鼠制备脑片时采取低温人工脑脊液心脏灌注、使用高蔗糖溶液、较高温度预孵育等措施可明显提高脑片活性;孵育和记录温度可直接影响神经元的兴奋性,在一定范围内提高温度可提高神经元兴奋性,但会缩短脑片存活时间;结论:改良后的脑片制备方法简单可行,可为电生理研究提供大量具有良好活性的前庭内侧核神经元;根据试验目的选择合适年龄的试验动物,脑片制备方法的选择和温度、外液实验等环境的控制应根据所选用动物的年龄而进行调整。第二部分大鼠前庭内侧核神经元的基本膜特性和自发放电活动目的:观察大鼠前庭内侧核神经元的基本膜特性及其在静息膜电位下的放电活动,探讨前庭系统生理功能的可能机制。方法:运用红外微分干涉相差技术,可视状态下对前庭内侧核神经元进行全细胞记录,观察电流钳模式下神经元在正常人工脑脊液和低钙高镁脑脊液中的放电活动,按平均动作电位形状对神经元进行分型,比较不同类型神经元基本膜特性和放电活动的差异。结果:在正常人工脑脊液中大鼠前庭内侧核神经元存在规律的放电活动,在低钙高镁人工脑脊液中神经元表现出较不规律的放电活动,放电活性也明显降低;神经元可被分为具有单相后超极化及A样整流特性的A型（n=17,33%）,有双相后超极化的B型（n=32,63%）,以及同时拥有或不拥有以上特征的其他型（n=2,4%）;A、B型神经元的部分主动膜特性存在明显差异。结论:大鼠前庭内侧核神经元的放电为基于其内在膜特性的自发活动,其放电模式受到胞外钙浓度的影响;大部分神经元的放电表现为典型的A型或B型,但仍有少量非典型放电存在。第三部分大鼠前庭内侧核神经元对模拟传入信号的放电反应目的:观察大鼠前庭内侧核神经元对模拟传入刺激信号的放电反应动力学特征,探讨中枢前庭系统生理功能的可能机制。方法:运用红外微分干涉相差技术,可视状态下对前庭内侧核神经元进行全细胞记录,在电流钳模式下记录神经元的放电活动,向神经元胞内注入短暂超级化脉冲模拟突触后抑制性电流,注入线性去极化电流模拟头部作直线加速运动时外周前庭的传入信号,注入正弦刺激电流以模拟头部作匀速旋转运动时外周前庭的传入信号,观察不同类型神经元对刺激电流的放电反应。结果:前庭内侧核神经元在超级化脉冲后放电的后超级化幅度加深,并表现出抑制后反弹现象;神经元放电频率随去极化电流的增加而增加,在同等强度去极化电流刺激下B型神经元比A型神经元表现出较少的衰减现象和较强的超射现象;A、B型神经元的放电反应都可与输入正弦刺激形成共振并引起相位的移动。结论:头部做直线加速运动和匀速旋转运动时,前庭内侧核A、B型神经元对不同的传入刺激都可产生主动反应,放电反应表现出多样性,A、B型神经元放电反应动力学的差异是它们执行不同生理功能的基础。

康喜讯^[9]（2008）在《前庭椭圆囊Ⅰ型毛细胞钾通道》文中研究说明第一部分光学倒置相差显微镜下前庭囊斑两型毛细胞的形态学鉴别目的:探索电生理实验中,光学倒置相差显微镜下较为可靠的前庭椭圆囊斑和球囊斑所分离的两型单离毛细胞的辨别标准,为合理分析所记录到的电流打下比较可靠的基础。方法:对于豚鼠椭圆囊斑和球囊斑分离所得的单离前庭毛细胞,分别在光学倒置相差显微镜下对细胞胞体的长度、宽度以及表皮板纤毛的长度进行显微测量,并对长和宽的比例值以及细胞体的长度和纤毛长度的比例值即胞长比进行分析。结果:经过极低浓度胶原酶配合轻微机械吹打得到豚鼠椭圆囊斑和球囊斑的两型单离的前庭毛细胞。这两种毛细胞经过显微测量后相比,两种细胞之间细胞的宽度和纤毛的长度统计学比较没有显着性差异。有显着统计学差别的是和囊斑II型毛细胞相比,囊斑I型毛细胞的长度明显较长,长宽比比较大,纤毛胞长比比较小。结论:在既往以是否具有明显狭窄的颈部来区分两型前庭毛细胞的基础上,结合分析囊斑细胞的长宽比以及纤毛胞长比进一步进行辨别,有助于更准确地区分两型毛细胞,不失为区别囊斑两型毛细胞的有效辅助方法。第二部分前庭椭圆囊I型毛细胞的钾电流目的:通过应用电生理的方法来研究豚鼠椭圆囊I型毛细胞存在的通道电流及其特性,并对所记录的电流进行初步鉴别。方法:利用膜片钳全细胞和单通道两种方法,在标准外液中,对单离的豚鼠椭圆囊I型毛细胞记录到的电流进行记录和分析,并应用钾通道抑制剂TEA进行鉴别。结果:标准细胞外液中测得的全细胞电流含有内向电流成分和外向整流成分,应用TEA阻滞后电流完全消失,提示为钾电流。单通道贴附式和内面向外两种模式下电流均为较大的外向电流,被TEA阻滞后所记录的电流特性不同,提示记录到的为大的外向钾电流,并且被TEA阻滞时贴附式和内面向外两种模片上经过不同的阻滞途径。贴附式时TEA清除后电流不再出现,内面向外情况下TEA清除后电流完全恢复。结论:在标准细胞外液中豚鼠椭圆囊I型毛细胞表面存在较大的钾通道电流,可以被TEA阻滞,膜片钳单通道贴附式情况下阻滞不可逆,内面向外情况下阻滞可逆。第三部分钙和乙酰胆碱对前庭椭圆囊I型毛细胞钾电流的调节目的:研究钙离子和乙酰胆碱对单离的豚鼠椭圆囊I型毛细胞所记录到的大电导的钾电流是否有调节作用,期望从电生理学方面为豚鼠椭圆囊I型毛细胞表面可能存在乙酰胆碱受体提供佐证。方法:将细胞外液分为三种:标准外液、高钙外液、含有乙酰胆碱的高钙外液。并把标准外液组定位对照组。分别用膜片钳单通道的方法对单离的椭圆囊I型毛细胞外向的钾电流进行记录。组间应用两两比较的方法对结果进行统计学分析。结果:在标准外液中引出可靠钾电流后,钙离子终浓度为2.0mM的高钙外液使原来在标准外液中记录到的钾通道电流明显增加,电流开放的幅值和开放概率均发生明显变化。但也有部分钾电流表现不同:钙离子虽然也提高了电流的幅值,却降低了通道的开放概率。钙离子联合应用乙酰胆碱除可以明显提高钾电流的幅值外,还恢复了通道的开放概率。在标准外液中应用乙酰胆碱无效。结论:钙离子可以通过提高钾电导而减少通道开放次数起到稳定细胞膜的作用。加用适量的乙酰胆碱可以提高钾通道的兴奋性,这个过程在离体的细胞环境下需要高浓度的钙离子参与。

肖自安,谢鼎华,伍伟景,杨曙^[10]（2003）在《豚鼠柯替氏器支持细胞的分离和鉴定》文中研究指明目的 建立豚鼠柯替氏器支持细胞的分离方法,并观察活性支持细胞的形态特征。方法 对豚鼠基底膜用IV型胶原酶（1 mg/ml）消化和微机械分离法获得柯替氏器单离支持细胞,在倒置显微镜下观察细胞的活性和形态特征并记数。结果 不同支持细胞在倒置显微镜下各有其形态特征,第一、二排Deiters细胞为逗点状,第三排为弓状;Hensen细胞为长圆形,半透明的胞质内含有数个脂质样颗粒;外柱细胞呈哑铃状,两端对称性圆球形,中间可见清晰的微管;内柱细胞呈“长勺形”,底部为圆球状,顶部逐渐向外侧弯曲成杯口样结构。每个豚鼠耳蜗可分离出单离Deiters细胞1～4个,Hensen细胞10～20个,内柱细胞和外柱细胞分别约80～100个。结论 IV型胶原酶消化和微机械分离法可分离出豚鼠柯替氏器的Deiters细胞、Hensen细胞和内、外柱细胞,可为在细胞和分子水平对单离活性支持细胞进行形态和功能变化的研究提供一种简便实用的方法。

二、单离豚鼠内耳Deiters细胞的形态及电生理特性（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、单离豚鼠内耳Deiters细胞的形态及电生理特性（论文提纲范文）

（1）小鼠耳蜗不同部位内毛细胞基因表达差异性研究（论文提纲范文）

（2）耳蜗毛细胞相关细胞及影响因子的发育研究进展（论文提纲范文）

（3）乙酰胆碱在前庭传出神经系统外周的作用机制及酶对其受体介导电流的影响（论文提纲范文）

（4）过氧化氢与维生素C对老年豚鼠耳蜗外毛细胞大电导钙激活钾通道电流影响的实验研究（论文提纲范文）

（5）豚鼠I型前庭毛细胞胆碱能受体通道特性（论文提纲范文）

（6）豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞胆碱能受体特性的研究（论文提纲范文）

（7）缝隙连接Cx26和Cx30基因蛋白在哺乳动物耳蜗的细胞及亚细胞表达（论文提纲范文）

（8）运用红外可视脑片膜片钳技术对大鼠前庭内侧核神经元内在膜特性和放电反应特性的研究（论文提纲范文）

（9）前庭椭圆囊Ⅰ型毛细胞钾通道（论文提纲范文）

四、单离豚鼠内耳Deiters细胞的形态及电生理特性（论文参考文献）

• [1]小鼠耳蜗不同部位内毛细胞基因表达差异性研究[D]. 唐峰. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(01)
• [2]耳蜗毛细胞相关细胞及影响因子的发育研究进展[J]. 张凌,杨仕明. 山西医药杂志, 2014(21)
• [3]乙酰胆碱在前庭传出神经系统外周的作用机制及酶对其受体介导电流的影响[D]. 周涛. 华中科技大学, 2013(02)
• [4]过氧化氢与维生素C对老年豚鼠耳蜗外毛细胞大电导钙激活钾通道电流影响的实验研究[D]. 黄非. 泸州医学院, 2009(06)
• [5]豚鼠I型前庭毛细胞胆碱能受体通道特性[J]. 朱云,孔维佳,夏交,张宇,程华茂,郭长凯. 生理学报, 2008(03)
• [6]豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞胆碱能受体特性的研究[D]. 朱云. 华中科技大学, 2008(12)
• [7]缝隙连接Cx26和Cx30基因蛋白在哺乳动物耳蜗的细胞及亚细胞表达[D]. 刘英鹏. 华中科技大学, 2008(12)
• [8]运用红外可视脑片膜片钳技术对大鼠前庭内侧核神经元内在膜特性和放电反应特性的研究[D]. 夏交. 华中科技大学, 2008(12)
• [9]前庭椭圆囊Ⅰ型毛细胞钾通道[D]. 康喜讯. 华中科技大学, 2008(12)
• [10]豚鼠柯替氏器支持细胞的分离和鉴定[J]. 肖自安,谢鼎华,伍伟景,杨曙. 中国耳鼻咽喉颅底外科杂志, 2003(04)

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