一、斜纹夜蛾核多角体病毒基因组的hr序列分析（论文文献综述）
于乾龙[1]（2019）在《苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒GP64蛋白的结构与功能关系研究》文中进行了进一步梳理杆状病毒是一类感染昆虫的双链大分子DNA病毒,通常产生出芽型病毒（budded virions,BV）和包涵型病毒（occlusion-derived virions,ODV）两类形态不同的病毒粒子。苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）BV的主要囊膜蛋白GP64属于第三类病毒膜融合蛋白家族,该家族代表性成员还包括水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus,VSV）G蛋白和单纯疱疹病毒（herpes simplex virus type 1,HSV-1）gB等。目前,已解析的AcMNPV GP64在低pH条件下的三级结构包含五个结构域（domain I-V,简称DI-DV）,但其中性pH条件下的三级结构以及低pH诱导的构象变化分子机制尚不清楚。本文针对AcMNPV GP64的DI与DV之间可能的相互作用以及晶体结构仍未被完全解析的DIV开展了结构与功能关系研究,取得的主要结果如下:一、DI与DV的结构与功能关系结构分析表明,GP64 DV与DI中邻近融合环2（fusion loop 2）的两个区域存在多个可能的相互作用位点。氨基酸序列比对分析显示,这些相互作用位点及其邻近的氨基酸残基比较保守。采用丙氨酸替换的方法对DI和DV中保守性较高或参与相互作用的24个氨基酸进行单点或双点突变。结果分析发现,DI与DV中氨基酸之间形成的分子内相互作用不是GP64表达、多聚体形成、细胞膜定位及膜融合功能所必需,但是参与相互作用的单个氨基酸对GP64膜融合功能却具有重要意义,其中DV区域内的4个氨基酸残基（G438、W439、T452和T456）对膜融合的起始及后续融合孔的形成或扩大具有重要作用。进一步研究发现,G438与W439可能参与维持GP64融合前构象的形成或稳定。二、DIV的结构与功能关系结构分析表明,DIV由两个平行的loop（loop 1-2）组成,其中loop2内的第394398位氨基酸残基在已有的三级结构中缺失。分子内位点相互作用分析显示,在DIV内可能存在12个氨基酸之间的相互作用,主要分布在三个区域:1)顶部区域的N384-Y388;2)中部区域,由7个氨基酸形成包含位于loop1内的N381-N385、N381-K389、N385-K389和位于loop2内的D398-S400、D398-Q401以及连接loop1与loop2的N381-Q401、N381-I403、N385-W393、K389-W393的9个相互作用;3)底部区域,包括连接loop1与loop2的T379-F405以及位于loop2内的D404-S406。氨基酸序列分析表明,这些相互作用位点及其邻近氨基酸在GP64蛋白家族中高度保守。采用丙氨酸替换对DIV中保守的氨基酸及其形成的相互作用进行突变,发现所有位点的突变不影响GP64的表达及三聚体形成,但突变效应主要表现为:1.在转染质粒表达突变体的条件下,D404A、N407A不影响GP64在细胞表面的定位,却显着抑制融合孔的扩大;而另外5个保守位点（Y388、E390、G391、R392、W393）的氨基酸突变显着降低了GP64在细胞膜的定位并完全抑制膜融合起始;在重组bacmid表达各个突变体的条件下,E390A与G391A诱导形成较小的细胞融合嵌合体并抑制病毒入侵但不抑制病毒出芽释放。2.在双点突变中,T379/F405A、N385/K389A、D398/S400A、D398/Q401A不影响GP64的功能,而N381/Q401A、N381/I403A、D404/S406A抑制融合孔的扩大,N381/N385A、N381/K389A、N384/Y388A、N385/W393A、K389/W393A则抑制膜融合起始。此外,在重组bacmid表达突变体条件下,N381/K389A抑制病毒入侵但不抑制病毒出芽释放。3.特性类似的氨基酸取代突变体（Y388F、Y388W、E390D、R392H、R392K、W393F、W393Y）中,只有Y388F、E390D、W393Y诱导细胞融合,而其余4个突变体在细胞表面的定位显着下降。结构分析显示,在上述突变中,Y388A或N384/Y388A突变消除了N384-Y388的相互作用;而W393控制DIV的构象,丙氨酸替换W393导致DIV构象显着变化,突出表现为loop1内的S386、I387与loop2内的N396邻近并形成相互作用促使loop2顶部区域向蛋白中心偏移大约2.5?;另外,N381/K389A消除了N381-K389、N385-K389、N381-Q401、N381-I403的相互作用,而N381/I403A则消除了N381-Q401、N381-I403的相互作用,揭示破坏loop1与loop2之间的互作影响GP64的转运及其膜融合功能。最后,N381-N385、N385-K389与上述相互作用之间在维持DIV构象中具有冗余功能,消除这些相互作用后,DIV构象由于局部氨基酸的邻近形成新的相互作用（如A381-V394、A389-R392）协助其余的相互作用仍维持稳定。总之,我们的研究结果表明,DV结构域内的G438与W439以及DIV结构域内的N381、Y388、E390、G391、R392、W393及其与邻近氨酸酸形成的分子内相互作用在维持GP64中性pH条件下的三级结构及诱导膜融合的起始和融合孔扩大过程中具有关键调控作用。根据已获得的部分第三类病毒膜融合蛋白的融合前及融合后结构,我们提出了GP64可能的构象变化机制。
邹金城,杨勇,杨益众,苏宏华[2]（2016）在《斜纹夜蛾核型多角体病毒研究进展》文中研究说明斜纹夜蛾Spodoptera litura（Fabricius）是一种世界性分布的杂食性害虫,经常暴发成灾,给农业生产带来巨大损失。斜纹夜蛾核型多角体病毒（SpltNPV）能有效控制斜纹夜蛾种群数量,是有效防治斜纹夜蛾的生物制剂,具有重要的经济、生态和环保价值。本文从毒力、流行病学、分子生物学、复配剂及其田间应用和对斜纹夜蛾天敌的影响等方面综述了斜纹夜蛾核型多角体病毒的研究进展。
邵天玉,刘兴龙,刘思竹,谢维欣,王克勤[3]（2016）在《我国甜菜夜蛾核型多角体病毒研究新进展》文中进行了进一步梳理核型多角体病毒是昆虫病毒中最大的类群,它能够专一性地侵染并杀死一种或者几种农林害虫,并对害虫天敌、环境和人畜无害,是一种值得推广的绿色生物农药。为有效利用绿色生物农药防治病虫害,对我国近几年关于甜菜夜蛾核多角体病毒的毒力、病毒制剂研究与生产、田间应用及药效试验、增效剂研究、分子生物学等方面进行了阐述,并提出了新的展望和应用需求。
王成燕[4]（2012）在《混合侵染和交替传代对斜纹夜蛾核型多角体病毒宿主域和毒力影响及机制》文中研究说明核型多角体病毒（Nucleopolyhedrovirus, NPV）作为一类昆虫病原微生物,资源丰富,对害虫作用独特且对环境安全,是一种理想的害虫生物防治剂。但天然的昆虫病毒因宿主范围窄、作用速度慢和作用活性低,大大限制了其在生产上的应用。如何打破昆虫病毒的专化性以及提高它们的毒力成了拓宽昆虫病毒应用范围的重点和难点。NPV间自然重组现象较为普遍,不同NPV间重组可产生宿主域扩大病毒；另外病毒的毒力与宿主密切相关,在一种新宿主中的连续传代可提升其对传代宿主毒力,不过其对原宿主毒力显着下降。病毒在两种不同宿主中交替传代后,病毒能否对两种宿主同时具有高毒力?尚无实验证明。因此,研究不同病毒混合侵染后的宿主域变化及其在不同宿主中交替传代过程中的毒力演化对于揭示病毒进化规律及发掘宿主域扩大和病毒毒力提升具有着重要意义。本研究以鳞翅目重大害虫斜纹夜蛾Spodoptera litura和甜菜夜蛾S. exigua为靶标对象,首先研究两种病毒混合侵染后的宿主域变化,接着研究宿主域扩大病毒在甜菜夜蛾和斜纹夜蛾中交替传代时的毒力演化,最后研究病毒多角体超微结构变化和遗传变异,主要研究结果如下：1病毒混合侵染后的宿主域扩大和交替传代时的毒力演化本文选用不能经口感染甜菜夜蛾的斜纹夜蛾NPV （SINPV）日本福冈株和不能经口感染斜纹夜蛾的甜菜夜蛾NPV （SeNPV）美国株,将它们共同侵染甜菜夜蛾后,获得了能同时感染甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的宿主域扩大病毒株系,其对斜纹夜蛾的致病力与SINPV相当,致死中浓度（LC50值）无显着差异,同时对甜菜夜蛾也具备了一定的侵染力,但尚显着低于SeNPV对甜菜夜蛾的毒力。进一步将该病毒在甜菜夜蛾和斜纹夜蛾这两种宿主中按4种模式进行交替传代,分别为以甜菜夜蛾和斜纹夜蛾为起始宿主的严格交替传代,以及以甜菜夜蛾和斜纹夜蛾为起始宿主的非严格交替传代,研究病毒毒力的演化规律。发现宿主域扩大病毒在经历斜纹夜蛾和甜菜夜蛾多代交替传递过程中,其对甜菜夜蛾的毒力有显着上升,且对斜纹夜蛾的毒力未有显着下降,但在传递20代过程中,除从斜纹夜蛾开始的严格交替传代模式下,病毒对甜菜夜蛾的毒力一直呈上升趋势,以甜菜夜蛾为起始宿主的严格交替模式以及两种非严格交替传代模式下,病毒对甜菜夜蛾毒力未一直呈上升趋势,在14代以内显着上升,此后则有所下降。研究表明两种宿主中的交替传代可以提高病毒对一种宿主的适应性且同时保持了其对另一种宿主的适应性。2混合侵染和交替传代后多角体超微结构变化通过透射电镜观察研究了病毒混合侵染和交替传代后其多角体超微结构变化。比较了混合侵染前、混合侵染后、交替传代后以及连续传代后病毒的多角体超微结构。观察结果表明,各病毒均属多粒包埋型病毒,混合侵染没有引起病毒多角体大小的改变,多角体直径无显着差异。但经以斜纹夜蛾为起始宿主的交替传代以及在斜纹夜蛾中的连续传代后,病毒多角体的直径显着减小。同时还发现混合侵染和交替传代都没有造成病毒多角体内病毒束数量的改变,多角体内病毒束平均数量在各病毒间无显着差异。但带来病毒束内核衣壳数量的变化,经过混合侵染及在甜菜夜蛾和斜纹夜蛾中的一次交替传代后,病毒束内平均病毒核衣壳数较起始的SINPV福冈株显着下降,在经历20代次交替后,仍显着低于福冈株,而在斜纹夜蛾中连续传代时病毒核衣壳的数量未有显着变化。另外从各病毒束内不同核衣壳的分布来看,SeNPV美国株中病毒束内核衣壳分布均匀,62.5%病毒束中病毒核衣壳数量为3个,而其余病毒则分布较广,在以斜纹夜蛾为起始宿主的交替传代后的病毒中,病毒核衣壳的数量在1-12个间。研究表明,SeNPV和SlNPV昆合侵染以及在两种宿主中交替繁殖后能够改变其多角体的组装,从而带来多角体超微结构的变化。3混合侵染后宿主域扩大病毒polh和iap基因变异通过基因组酶切、基因克隆分析研究了病毒混合侵染后的遗传变异。病毒基因组DNA限制性酶切结果表明,混合侵染后宿主域扩大病毒的基因组DNA酶切图谱较混合侵染前的SINPV福冈株没有产生明显变化,Pst Ⅰ、Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ这4种限制性酶切图谱均与混合侵染前一致。进一步对病毒多角体蛋白基因（polh）分析发现,病毒混合侵染后其polh基因序列较混合侵染前SlNPV在第281个碱基上发生突变,氨基酸序列也发生相应的变化。另还对宿主域扩大病毒细胞凋亡抑制基因（iap）进行了克隆,发现其与已报道的SpliNPV iap基因同源性达95%,与SlNPV中国株G2iap基因同源性和SlNPV日本株iap同源性均只有80%。4混合侵染和交替传代后病毒全基因组序列变化分析对混合侵染和交替传代前后三个病毒株系的全基因组序列进行了分析,研究发现,SlNPV和SeNPV经过混合侵染后产生的宿主域扩大病毒,在基因组大小上较SlNPV福冈株变小,基因数量也有变化,少了1个基因,基因总长度也有增加；再经过交替传代,基因总长度进一步变长。再从各病毒基因总长度占基因组的百分比来看,混合侵染后产生的宿主域扩大病毒较混合侵染前SlNPV基因总长度占基因组百分增加,再经交替传递20代后,百分比进一步增加。各病毒株系GC含量变化不大。病毒基因组全序列具体分析则发现混合侵染后病毒lef-8（晚期表达因子）基因产生了一个碱基的变化,另外病毒基因组内有一个255bp片段的插入,且在进一步交替传递20代后,此变化仍存在。
刘惠芬[5]（2012）在《斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型基因组DNA复制原点及ORF63基因分析》文中提出斜纹夜蛾（Spodoptera litura）属鳞翅目夜蛾科，是一种杂食性的重要农林害虫，寄主植物达100多科300余种。由于斜纹夜蛾的食性杂、繁殖能力强、抗性强，因此防治难度高。在各种化学合成杀虫剂严重污染环境以及害虫对化学合成杀虫剂抗性日益增强的情况下，生物防治愈显重要和迫切。昆虫杆状病毒由于其宿主单一，致死能力强，对环境没有危害等优点，成为了良好的生物防治武器。斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型分离株（SpltNPVⅡ）是近年来新发现的一种繁殖率和毒力极强的新的病毒变异株，该病毒株的基因组全序列已经测定完成，包含149个开放读码框。但病毒基因组的复制机制和基因功能并不清楚，本研究对SpltMNPVⅡ的基因组DNA的复制原点进行了研究，并对新型未知基因ORF63进行序列分析、克隆表达及多抗制备的基础上，进一步从启动子活性，转录时相、表达时相，亚细胞定位等方面，研究该基因的基本特征及其功能，旨在丰富杆状病毒分子生物学，为杆状病毒的遗传改良、研制更有效的基因工程载体和病毒杀虫剂提供理论基础。主要研究结果如下：1.利用生物软件对SpltMNPVⅡ基因组DNA序列进行分析，确定了7个同源重复区（hrs）的结构特征，分别包含3-8个数目不等的64bp不完全回文序列，回文基序的中心均含有一个PvuI限制性酶切位点，并且存在多个正向或反向互补的重复序列和与病毒基因组DNA复制相关的motif基序，对7个hrs中40个回文序列进行比对分析，发现其序列的核苷酸一致性高达90%以上。2.构建检测7个hrs复制、增强功能的质粒，利用脂质体介导的功能质粒在Spli221细胞系中的转染与瞬时表达实验和实时荧光定量PCR，确定了SpltNPVⅡ的7个hrs均具有基因组DNA复制起始点和增强子的双功能作用，但复制增强能力大小不一。其中hr5的复制效率最低（1.52×105copies/μg DNA），hr4的复制效率最高（4.88×106copies/μg DNA）；hr1和hr7在病毒感染的细胞中对于ie-1启动子控制下的luc基因的瞬时表达有极大的增强作用，增强效率可达11.83和13.16倍，而hr5的增强作用最小，增强效率仅为3倍左右，其余四个同源重复区的增强效率分别在6到9倍之间。3.对单一64bp不完全回文序列进行剖析，实时荧光定量PCR检测显示单一64bp的回文序列不具有复制功能；瞬时表达实验表明64bp的回文序列没有显着提高ie-1启动子的转录活性。利用Spearman分析了7个hrs的复制效率，增强效率和不完全回文序列和其他特征序列数目的相关性，结果表明SpltNPVⅡ中7个hrs的复制效率和增强能力均与顺式作用元件中的回文序列、重复序列和特征序列具有显着正相关；复制效率与重复序列的相关性最强，增强能力与特征序列相关性最强；复制效率与增强能力无显着相关性。4.对SpltMNPVⅡORF63基因结构进行了分析。ORF63基因全长1071bp，编码356aa，预测蛋白分子量为41.3kDa，该基因既有早期启动子基序CAGT，又有晚期启动子基序TAAG。对SpltMNPVⅡORF63基因的启动子活性和转录时相进行分析，发现该基因是在病毒生命周期的早期和晚期都有转录的基因。5.对SpltMNPVⅡORF63基因的部分序列进行了原核表达，表达产物经纯化和质谱鉴定后，免疫豚鼠制作了多克隆抗体。抗体效价用ELISA进行测定，该基因的表达产物制作的抗体效价在1∶3200以上。以制备的多克隆抗体为一抗，对ORF63基因在宿主细胞的表达产物进行了表达时相分析，ORF63基因产物最早在病毒感染细胞后4h出现，最早在感染虫体后8h出现，并且后期都有表达，说明该基因是早期和晚期均表达的基因，与其启动子分析和转录时相分析结果一致。6.利用免疫荧光细胞化学实验对SpltMNPVⅡORF63基因进行亚细胞定位，结果表明感染Spli221细胞24h后，在细胞质和细胞核中都能检测到ORF63基因的表达产物；到感染48h，ORF63基因产物主要分布在被感染宿主的细胞质膜上。
唐平[6]（2011）在《一株新鉴定的棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒基因组分析》文中指出杆状病毒具有闭合环状双链DNA基因组，是一类主要感染鳞翅目、膜翅目和双翅目昆虫的病原物，杆状病毒作为生物杀虫剂具有对人畜安全，不造成环境污染，宿主专一性强，能有效控制田间害虫种群密度等优点。本文对一株分离自棉铃虫的核型多角体病毒进行电镜观察，表明其为多粒包埋型的核型多角体病毒，昆虫感染实验表明其与棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒（Helicoverpa armigera single-nucleocapsid nucleopolyhedrovirus，HearSNPV）有不同的宿主域，细胞感染实验表明其与HearSNPV有不同的病理效应，因此对其基因组进行了分析，并与其它杆状病毒基因组进行了比较。对一株分离自棉铃虫的病毒纯化后进行电镜观察，发现其呈不规则多角体型，包涵体中有多个包含病毒核衣壳的囊膜，每个病毒囊膜内含有2个以上核衣壳，符合多粒包埋型核型多角体病毒特征，将其命名为棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒（Helicoverpa armigera multinucleocapsidnucleopolyhedrovirus，HearMNPV）。荧光定量PCR结果分析表明HearMNPV的DNA在棉铃虫体内复制经历了减少期、隐晦期、增长期及稳定期４个时相，表明其宿主体内复制良好。HearMNPV对其它昆虫的感染性实验表明它对东方粘虫有较好的感染性，但不能感染斜纹夜蛾及甜菜夜蛾，而HearSNPV不能感染东方粘虫，表明两者有着不同的宿主域。HearMNPV对Hz-AM1细胞系感染后没有多角体产生，也不显示明显的细胞病理效应；对棉铃虫胚胎细胞系QB-Ha-E-5细胞系感染后有大量多角体产生，呈现较好的感染性。Hz-AM1是HearSNPV的敏感细胞系,用源自HearSNPV的HaBacmid-egfp对QB-Ha-E-5细胞系感染，细胞感染后有明显的荧光产生，表明HearMNPV和HearSNPV对宿主细胞感染性存在不同。为进一步分析HearMNPV，将Sau3AⅠ部分酶切HearMNPV基因组DNA，SalⅠ完全酶切pUC19载体，以Klenow酶分别对回收的片断和载体进行半补齐反应，经连接、转化后,得到用半补齐法构建的覆盖率大于99.9％的HearMNPV基因组文库。对HearMNPV基因组全序列进行测定并分析表明基因组的大小为154,196bp，G+C含量为40.07%，推测含有162个与相邻的ORF有最小重叠且大于150bp的ORF，占基因组全序列的90.16%，4个同源重复区等非编码区序列占整个基因组的9.84%。基因对等图表明HearMNPV与HearSNPV共线性较低，HearMNPV基因组结构与披肩粘虫核型多角体病毒B株（Mamestraconfigurata nucleopolyhedrovirus-B，MacoNPV-B）有很好的共线性；系统进化分析表明HearMNPV与HearSNPV不在同一簇中，而与MacoNPV-B存在同一簇中。HearMNPV与HearSNPV在基因组的大小、内容，同源基因的排列、一致性上存在着显着的差别，结合昆虫宿主域实验确定HearMNPV是一株不同于棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒（HearSNPV）的新病毒种。与MacoNPV-B基因组结构相比，HearMNPV缺失了包含ORF54、55、56、57、58的片断，长度约为5.4kb，其基因组中HearMNPV orf66、orf17、bro基因、hr序列与MacoNPV-B存在明显的不同，表明其与MacoNPV-B的亲缘关系然很近，但在基因组的结构上存在明显的差异。
盛晔[7]（2010）在《斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型（SpltMNPV Ⅱ）BV、ODV组成型蛋白质谱分析和4种ORF的基因分析》文中研究说明斜纹夜蛾（Spodoptera litura, Spli）属鳞翅目夜蛾科,是一种杂食性农业和林业害虫,主要危害甘蓝、白菜、藕、芋、蕹菜、苋菜、马铃薯、茄子、辣椒、番茄、豆类、瓜类以及葱韭等。由于斜纹夜蛾的食性杂、世代重叠、抗性强,因此防治难度高。在各种化学合成杀虫剂严重污染环境,害虫对化学合成杀虫剂抗性日益增强的情况下,生物防治越显重要和迫切。从自然界中寻找和筛选新的高毒力的病毒株系是开发NPV生物杀虫剂的重要途径。SpltMNPVⅡ是一种繁殖率和毒力极强的新的病毒变异株。该病毒株的基因组全序列已经测定完成。但病毒BV和ODV的组成蛋白并不清楚,论文对SpltMNPVⅡBV和ODV进行了质谱分析,确定了BV和ODV蛋白组成,并对组成蛋白基因的中的ORF6、ORF13、ORF57和ORF146进行了启动子活性分析,转录时相和表达时相分析,对ORF57基因的部分功能进行了鉴定。主要研究结果与发现:1.用二级质谱分析方法对SpltMNPVⅡBV和ODV的组成蛋白进行了研究,确定了SpltMNPVⅡBV由42种蛋白组成,通过与已知杆状病毒同源基因的比较,确定了其中26种蛋白基因的部分功能;SpltMNPVⅡODV由46种蛋白组成,与已知杆状病毒同源基因的比较,确定了其中24种蛋白基因的部分功能。2.对SpltMNPVⅡORF6、ORF13、ORF57和ORF146基因结构进行了分析。ORF6基因全长1509 bp,编码502 aa,预测蛋白分子量为55.0 kDa。该基因既有早期启动子基序CAGT,又有晚期启动子基序ATAAG,推测该基因可能是一个在病毒生命周期中早晚期都表达的基因;ORF13基因读码框全长333 bp,编码110 aa,理论预测蛋白分子量为12.2 kDa。起始密码子ATG上游发现有一个TATA box和杆状病毒晚期启动子基序ATAAG,没有发现明显的早期启动子基序;ORF57基因全长1098 bp,编码365 aa,预测蛋白分子量为42.6 kDa。起始密码子ATG上游发现有一个TATA box,在起始密码子上游没有发现明显的早期和晚期启动子基序;ORF146基因涵盖了1383 bp的读码框,编码460 aa,理论预测蛋白分子量为50.2 kDa。该基因起始密码子ATG上游发现有一个TATA box,一个晚期启动子基序ATAAG。3.对SpltMNPVⅡORF6、ORF13、ORF57和ORF146基因的启动子活性和转录时相进行了分析。发现这4个基因是在病毒生命周期的早期和晚期都有转录的基因。其中ORF13和ORF146基因能被SpltMNPVⅡ病毒编码的反式作用因子所激活,在感染后期能提高转录水平。而ORF6基因也能被SpltMNPVⅡ病毒编码的反式作用因子所激活,但是为负调控,在感染后期转录水平有明显下降。4.对SpltMNPVⅡORF6、ORF13和ORF146基因的部分序列进行了原核表达,表达产物经纯化和质谱鉴定后,免疫豚鼠制作了多克隆抗体。抗体效价用ELISA进行测定,3个基因的表达产物制作的抗体效价都在1:2500以上。5.以制备的多克隆抗体为一抗,对SpltMNPVⅡORF6、ORF13和ORF146基因在宿主细胞的表达产物进行了表达时相分析。0RF6基因产物最早在病毒感染细胞后8 h出现,0RF146基因产物最早在病毒感染细胞后4 h出现,并且后期都有表达,说明这两个基因都是早期和晚期均表达的基因,与它们的启动子分析和转录时相分析结果一致。而ORF13最早在出现病毒感染细胞后12 h,并一直持续到后期,说明ORF13为晚期表达基因。但是ORF13的启动子活性分析和转录时相分析都表明该基因是个早晚期都表达的基因。可能是由于该基因在表达的初始阶段,蛋白合成量和积累水平比较低,还不足以检测出来的缘故。6.克隆和表达了SpltMNPVⅡORF57基因的完整ORF,纯化的表达产物用质谱进行了鉴定。采用同位素法和痕量磷特异检测方法（孔雀石绿检测试剂法）确定了ORF57基因是一个双功能酶基因,该基因编码的蛋白既具有多聚核苷酸激酶功能,又具有3’磷酸酶功能。
闵丹[8]（2010）在《斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF50基因的研究》文中研究指明斜纹夜蛾（Spodoptera litura）属鳞翅目夜蛾科（Lepidoptera: Noctuidae）,是严重危害包括水稻、玉米、棉花等共计109科389种农作物的害虫。现发现并鉴定出一种全新的以斜纹夜蛾为特异性宿主的杆状病毒种,命名为斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ（SpltNPVⅡ）,其繁殖率和毒性极强,杀虫时间短,而且BV在虫体内的增值速率最快,具有作为生物杀虫剂所具有的优良特性和潜力。本研究主要针对SpltNPVⅡ的ORF50进行研究。斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ（Spodoptera litura nucleopolyhedrovirusⅡ,SpltNPVⅡ）中的146个开读框（Open Reading Frame,ORF）中,ORF50最为特殊,在国内外均未见研究报道,是新型未知基因。NCBI在线BLAST比对未发现与与ORF50有相似度的基因。将ORF50编码蛋白序列在NCBI数据库中进行在线BLAST比对结果显示,ORF50的编码蛋白序列没有保守序列,目前还没有任何与之相似度大于30%的蛋白序列。本研究通过蛋白质谱分析SpltNPVⅡ的包埋型病毒（occlusionderived virions,ODV）和芽生型病毒（budded virus,BV）组成蛋白差异,结果中均可检测到ORF50的编码蛋白gp50的存在,而且相比较在BVs组成型蛋白中的gp50存在检测分值要比ODV中高,因为SpltNPVⅡ的BV在虫体内的增值速率最快,推测gp50可能与BV在虫体内对周围细胞的感染有着重要作用。以pGL3-Basic对ORF50的前导序列50P进行启动子活性分析,在未加诱导因子的情况下,重组载体能够顺利表达萤光素酶,在荧光底物的存在下,能够产生荧光,而且其光量子强度均值达到18456,与阴性对照217差异极大,由此可以确定50P启动子为SpltNPVⅡ的早期启动子。分别合成各感染时相cDNA,以引物50P1:5’ttgaaagacgacggtgtgt3’,50P2:5’ctattcgacatgagcaacaatctg3’,25μL反应体系进行RT-PCR检测,结果显示,ORF50在2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h均有转录。根据目的基因序列设计引物,50P3:5’-gtcgatgaagaggtctggcaatac-3’;50P4:5’-ctcttcgttcataatcatgtcgtgc-3’,以提取RNA稀释到等量作为本底参照,进行荧光定量PCR分析,结果与RT-PCR一致。以等量的各个时期的总蛋白为抗原,豚鼠面议纯化蛋白为一抗,羊抗豚鼠抗原为二抗,进行蛋白免疫印迹（western blotting）检测表达时相分析,结果发现2 h、4 h、12 h、24 h、36 h、48 h等时相总蛋白中均能够检测到ORF50编码蛋白gp50的存在。结合RT-PCR,荧光定量PCR、蛋白免疫印迹（western blotting）检测表达时相分析,均能够确定ORF50在病毒感染2 h后开始转录表达,进一步表明该基因是一个早期基因。有关研究为深入分析SpltNPVⅡ的ORF50功能奠定了基础。
李轶女[9]（2008）在《东方粘虫颗粒体病毒和斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ基因组全序列分析》文中提出杆状病毒是已知昆虫病毒中最大的类群,呈杆状,仅感染无脊椎动物,具有大的双链,共价闭合,环状的DNA基因组。杆状病毒基因组的测序和分析对于我们理解基因功能和它们的进化是非常重要的,正是由于已经有大量的杆状病毒基因组已经被测序,方便了我们对病毒基因组的进一步的了解而进行详细的比较分析。本研究主要对两种杆状病毒:东方粘虫颗粒体病毒（PsGV）和斜纹夜蛾核型多角体病毒II（SpltNPV II）基因组进行序列测定和分析。1. PsGV和SpltNPV II的形态学特性根据包涵体形态的不同,将杆状病毒分为NPVs和GVs两类,NPVs的包涵体呈多角体形,内有多个病毒粒子,而GVs的包涵体呈颗粒体形,内只有一个病毒粒子。通过扫描电镜可以观察到纯化的PsGV的包涵体形状规则,大小比较均一,长度约为0.5μM,直径为0.3μM。通过透射电镜可以观察到每个包涵体内部有一个杆状病毒粒子,长约310nm,宽约40nm,每个病毒粒子内只有一个核衣壳。通过扫描电镜可以观察到纯化的SpltNPV II的包涵体形状不太规则,大小也不均一,直径约1.3μM。在透射电镜下可以观察到每个包涵体内部有多个杆状病毒粒子,长约260nm,宽约50nm,每个病毒粒子内含有多个核衣壳。2. PsGV的基因组全序列分析测定了东方粘虫颗粒体病毒病毒（PsGV）基因组全序列,PsGV基因组大小为176,677bp,是目前已经测序的杆状病毒基因组中仅次于XecnGV的第二大基因组。其G+C含量为39.79%,编码183个ORFs,每个ORFs大小为150核苷酸或以上,并且与其它ORF具有最小的重叠。与已经测序的AcMNPV、XecnGV和HearGV基因组进行了比较,发现PsGV与XecnGV和HearGV基因组具有很高的序列相似性和共线性,而且这三个基因组均有9个hrs,它们的结构以及在基因组中的位置都非常保守。在183个预测的ORFs中有69个与AcMNPV具有同源性,占整个基因组的37.7%;有166和169个ORFs分别与XecnGV和HearGV具有同源性,分别占整个基因组的90.7%和92.3%。PsGV与XecnGV和HearGV的同源基因的氨基酸相似性为79%,远远高于与AcMNPV同源基因的相似性（34%）。除了PsGV基因组特有的7个ORFs以外,还确定了12个bro基因、2个helicase基因和3个enhancin基因。在PsGV基因组中有两个完全一致的反向互补的重复基因（ORF39和49）,并通过PCR扩增进行了验证。通过质谱分析,在PsGV（OB）中鉴定了12个颗粒体组成蛋白,包括6个ODVs特异性蛋白组分和1个ODVs和BVs共有的蛋白组分。其中ORF174由于它的功能至今未见报道,从本研究结果可以判定其属于一种新的颗粒体组成蛋白。3. SpltNPV II的基因组全序列分析测定和分析了斜纹夜蛾核型多角体病毒（SpltNPV II）基因组全序列,表明这是一个新的杆状病毒。该基因组大小为148,634bp,G+C含量为45%,编码149个ORFs,每个ORFs大小为150核苷酸或以上,并且与其它ORF具有最小的重叠。其中141个ORFs（94.6%）与其它的杆状病毒具有一定的同源性,包括97个与AcMNPV同源,96个与SpltNPV I同源,133个与SeMNPV同源,这些同源基因的氨基酸相似性分别为41.4%、44.6%和76.5%。在SpltNPV II基因组中有8个特有的ORFs和7个hrs。除了2个bro基因以外,在SpltNPV II基因组中还有2个重复的ORFs:p26和odv-e56,系统进化分析结果表明这两个基因的每个重复的来源都不同。SpltNPV II和SpltNPV I是从相同的宿主分离到的两种杆状病毒,对它们的基因组进行了比较,包括基因组大小、ORFs数目、G+C含量、基因内容、基因顺序和氨基酸序列相似性,发现它们之间存在非常显着的差异。结合之前的杀虫效果和限制性酶切图谱分析结果（与苏州大学朱江教授交流）,认为SpltNPV II是一种不同于SpltNPV I的新病毒。4. PsGV和SpltNPV II的系统进化分析迄今为止,已知有45种杆状病毒的基因组全序列进行了测定,它们共有29个保守的基因,被认为是杆状病毒的核心基因,这些基因通常编码最基本的功能。本研究建立了基于这29个核心基因的氨基酸序列按照一定的顺序连接后的系统进化树,这个进化树支持了将杆状病毒分为鳞翅目NPVs、鳞翅目Gvs、膜翅目杆状病毒和双翅目杆状病毒的最新建议分类系统,其中鳞翅目NPVs又分为Group I和Group II。根据这个系统进化树, PsGV属于鳞翅目GVs,PsGV与HearGV和XecnGV的进化关系最近,这与本文第四章中比较的结果是一致的。从这个系统进化树还可以看出:SpltNPV II属于鳞翅目Group II NPVs,与SeMNPV关系最近。虽然SpltNPV II与SpltNPV I共同属于鳞翅目Group II NPVs,但是关系却比较远,再次验证了SpltNPV II是一个不同于SpltNPV I的新病毒。
余倩[10]（2008）在《斜纹夜蛾核多角体病毒诱导细胞凋亡的研究》文中研究表明杆状病毒感染昆虫细胞可诱导细胞凋亡（apoptosis）,细胞凋亡作为一种宿主范围决定因子限制了杆状病毒的杀虫范围,影响杆状病毒杀虫剂在生物防治中的应用;然而,在长期进化过程中,杆状病毒获得了抗凋亡基因以阻止细胞凋亡,使其能够正常复制。在已测序的杆状病毒中绝大部分都包含两个或两个以上的抗凋亡基因,但是部分体外实验结果表明,并不是所有抗凋亡基因都具有抗细胞凋亡活性。本研究首次利用RNAi技术对斜纹夜蛾核多角体病毒（Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus, SpltNPV）中两个抗凋亡基因Splt-iap4和Splt-p49在SpltNPV受纳宿主中的抗凋亡功能进行研究,通过瞬时表达检测探讨两个基因在SpltNPV非受纳宿主中的抗凋亡功能,同时对抗凋亡基因与其宿主的进化关系进行了初步探讨。主要结果如下:PCR扩增得到Splt-p49基因和Splt-iap4基因,分别将其连接到含有两个反向T7启动子的质粒载体上,体外转录得到大片段的双链RNA （double strain RNA, dsRNA）,将dsRNA分别或同时转染至被SpltNPV病毒感染的SpLi-221细胞以沉默Splt-iap4或Splt-p49,或者同时沉默Splt-iap4和Splt-p49的转录。经光学显微镜观察、DNA ladder检测、细胞存活率计算以及病毒滴度测定,结果说明SpltNPV感染SpLi-221细胞时,Splt-P49具有抗凋亡功能,而Splt-IAP不具有这种功能。但实验中发现,SpltNPV感染SpLi-221细胞在48 h之前细胞会聚集成团,而Splt-iap4 dsRNA处理细胞未出现此现象,大部分依然是独立的单个细胞,推断Splt-iap4基因在病毒感染期间起到了某种作用使得细胞的聚集受阻,但Splt-iap4的功能与病毒产生可感染性的子代病毒无关。在vAcAnh感染Sf9系统中,分别瞬时表达Splt-iap4和Splt-p49两基因,经光学显微镜和细胞存活率计算方法检测,结果同样显示Splt-P49具有抗凋亡功能而Splt-IAP不具有抗凋亡功能,且Splt-IAP无辅助抗凋亡功能或延迟细胞凋亡功能。最后对杆状病毒中的抗凋亡基因与其来源宿主进行进化分析,结果显示亲缘关系相近的杆状病毒所含的抗凋亡类型也相近,说明抗凋亡基因与杆状病毒进化有着密切的关系,也可能发挥着重要作用。斜纹夜蛾（Spodoptera litura）和甜菜夜蛾（S. exigua）同属夜蛾科（Noctuidae）灰翅夜蛾属的昆虫,亲缘关系很近,且SpltNPV和甜菜夜蛾核多角体病毒（Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus, SeMNPV）基因组相似性很高,但这两种病毒并不能交叉感染各自宿主。本文从细胞水平和亚显微水平对SpltNPV感染非受纳宿主离体细胞Se301的过程进行了描述,并对感染失败的原因进行了初步的生化分析。光学显微镜显示,被SpltNPV感染的Se301细胞在感染后24 h至120 h期间细胞出现了明显的病理现象,包括细胞空泡,细胞聚集等,且随着时间的延长病理症状越来越严重,但感染细胞中始终没有病毒多角体。DAPI染色荧光观察和电镜观察结果,都表明从24 h至120 h各样品中均显示细胞出现了早期凋亡的特征,但未形成晚期凋亡特征的凋亡小体。TCID50检测表明病毒没有产生有感染性的芽生型子代病毒。Dot blotting显示,在被感染的Se301细胞中可完成病毒DNA的复制; RT-PCR分析也显示,感染细胞72 h时,SpltNPV的早、晚期基因都有转录;Western blotting没有检测到被感染细胞中有极晚期基因polyhedrin的表达。以上结果表明,SpltNPV的感染可导致Se301细胞出现明显的早期凋亡症状,但不能进行到凋亡的最后阶段;虽然病毒可完成DNA的复制且早、晚期基因均有转录,但病毒的感染不能发展至极晚期,说明早期细胞凋亡仍然是限制病毒完成复制周期的重要因素。
二、斜纹夜蛾核多角体病毒基因组的hr序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、斜纹夜蛾核多角体病毒基因组的hr序列分析（论文提纲范文）
（1）苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒GP64蛋白的结构与功能关系研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 生物学膜融合及病毒膜融合蛋白 |
| 1.1.1 生物学膜融合 |
| 1.1.2 病毒感染介导的膜融合 |
| 1.1.3 病毒膜融合蛋白 |
| 1.2 杆状病毒简介 |
| 1.2.1 杆状病毒结构类型 |
| 1.2.2 杆状病毒分类 |
| 1.2.3 杆状病毒粒子 |
| 1.2.4 杆状病毒的侵染过程 |
| 1.2.5 杆状病毒的感染周期 |
| 1.2.6 杆状病毒基因表达时相 |
| 1.2.7 杆状病毒主要膜融合蛋白 |
| 1.2.8 杆状病毒的应用 |
| 1.3 杆状病毒膜融合蛋白GP64 的研究进展 |
| 1.3.1 GP64在BV感染过程中的作用 |
| 1.3.2 GP64 蛋白的三级结构 |
| 1.3.3 GP64 的结构与功能关系 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第二章 GP64 结构域Ⅰ与结构域Ⅴ的结构与功能关系分析 |
| 2.1 材料与设备 |
| 2.1.1 细胞、菌株和质粒 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 生化试剂及相关溶液 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.2.2 聚合酶链式反应 |
| 2.2.3 目的片段的分离回收 |
| 2.2.4 限制性内切酶酶切反应 |
| 2.2.5 连接反应 |
| 2.2.6 化学法转化 |
| 2.2.7 克隆子的筛选 |
| 2.2.8 质粒DNA的提取 |
| 2.2.9 序列测定和分析 |
| 2.2.10 甘油菌的保存 |
| 2.2.11 GP64 突变体瞬时表达质粒的构建 |
| 2.2.12 瞬时表达质粒转染Sf9 细胞 |
| 2.2.13 蛋白质免疫印迹 |
| 2.2.14 细胞表面酶联免疫吸附 |
| 2.2.15 细胞-细胞融合实验及膜融合活性计算 |
| 2.2.16 半融合及融合孔形成检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ的氨基酸特征分析 |
| 2.3.2 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体基因的克隆及瞬时表达质粒的构建 |
| 2.3.3 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体蛋白的表达分析 |
| 2.3.4 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体蛋白的细胞表面定位分析 |
| 2.3.5 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体蛋白的膜融合活性分析 |
| 2.3.6 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体蛋白诱导半融合及融合孔形成分析 |
| 2.3.7 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体蛋白在低pH条件下的构象变化分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 GP64 结构域Ⅳ的结构与功能关系分析 |
| 3.1 材料和设备 |
| 3.1.1 材料及试剂 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 GP64 突变体瞬时表达质粒的构建 |
| 3.2.2 蛋白免疫印迹 |
| 3.2.3 细胞表面酶联免疫吸附 |
| 3.2.4 细胞-细胞融合实验及膜融合活性计算 |
| 3.2.5 半融合及融合孔形成检测 |
| 3.2.6 DH10Bac(gp64~(ko))感受态细胞的制备 |
| 3.2.7 重组病毒bacmid的构建 |
| 3.2.8 病毒bacmid的电击转化 |
| 3.2.9 病毒bacmid转染Sf9 细胞 |
| 3.2.10 病毒感染Sf9 细胞及病毒的扩增 |
| 3.2.11 病毒滴度测定 |
| 3.2.12 病毒生长曲线测定 |
| 3.2.13 病毒与细胞结合及病毒入侵分析 |
| 3.2.14 病毒出芽释放分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 GP64 结构域Ⅳ的氨基酸特征分析 |
| 3.3.2 GP64 结构域Ⅳ突变体的克隆及瞬时表达质粒的构建 |
| 3.3.3 GP64 突变体蛋白结构域Ⅳ的结构分析 |
| 3.3.4 GP64 结构域Ⅳ突变体蛋白的表达分析 |
| 3.3.5 GP64 结构域Ⅳ突变体蛋白的细胞膜表面定位分析 |
| 3.3.6 GP64 结构域Ⅳ突变体蛋白的膜融合活性分析 |
| 3.3.7 GP64 结构域Ⅳ突变体蛋白诱导半融合及融合孔形成分析 |
| 3.3.8 GP64 结构域Ⅳ突变体蛋白在低pH条件下的构象变化分析 |
| 3.3.9 表达GP64 及其突变体基因的重组bacmid的构建 |
| 3.3.10 GP64 结构域Ⅳ氨基酸突变对BV产生的影响分析 |
| 3.3.11 病毒感染条件下GP64 突变体的融合活性及构象变化分析 |
| 3.3.12 E390A,G391A,N381/K389A显着影响病毒入侵 |
| 3.3.13 E390A,G391A,N381/K389A对病毒释放没有显着影响 |
| 3.3.14 GP64 氨基酸保守性替换突变对融合活性及BV产生的影响分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 总结 |
| 4.1 主要结论 |
| 4.2 展望 |
| 4.3 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录1 克隆GP64 突变体的PCR引物 |
| 附录2 杆状病毒GP64 氨基酸序列比对 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）斜纹夜蛾核型多角体病毒研究进展（论文提纲范文）
| 1 Splt NPV概述 |
| 2 致病性研究 |
| 2.1 Splt NPV对寄主的毒力研究 |
| 2.1.1 对幼虫的毒力研究 |
| 2.1.2 对成虫及其后代的影响 |
| 2.2 Splt NPV的流行病学研究 |
| 3 分子生物学研究 |
| 3.1 Splt NPV基因组 |
| 3.2 Splt NPV部分基因的克隆及功能分析 |
| 3.2.1 Splt NPV结构蛋白基因 |
| 3.2.2 杆状病毒复制、调控相关基因 |
| 3.2.3 杆状病毒复制非必需基因 |
| 4 复配剂的筛选及田间应用 |
| 4.1 与化学农药复配 |
| 4.2 与生物农药或者仿生农药复配 |
| 4.3 与其他病毒组合 |
| 4.4 与性诱剂联合使用 |
| 4.5 添加增效剂 |
| 4.6 保幼激素类似物 |
| 5 对斜纹夜蛾天敌的影响 |
| 6 结语与展望 |
（3）我国甜菜夜蛾核型多角体病毒研究新进展（论文提纲范文）
| 1 病毒毒力 |
| 2 病毒制剂研究与生产 |
| 3 田间应用及药效试验 |
| 4 增效剂研究 |
| 5 分子生物学研究 |
| 5.1 SeNPV基因组结构分析 |
| 5.2 SeNPV部分基因的克隆及功能分析 |
| 6 讨论 |
（4）混合侵染和交替传代对斜纹夜蛾核型多角体病毒宿主域和毒力影响及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 综述 |
| 1 昆虫病毒的种类及应用现状 |
| 1.1 核型核多角体病毒 |
| 1.2 颗粒体病毒 |
| 1.3 质型多角体病毒 |
| 1.4 昆虫痘病毒 |
| 2 病毒重组拓宽病毒杀虫谱研究进展 |
| 2.1 昆虫病毒自然重组拓宽杀虫谱 |
| 2.2 运用基因工程技术扩大宿主域 |
| 3 宿主中连续传代提升病毒毒力研究进展 |
| 4 病毒宿主域和毒力及杀虫速度相关基因研究进展 |
| 4.1 与宿主域相关的基因 |
| 4.2 与毒力速度相关的基因 |
| 5 论文研究内容及目的意义 |
| 5.1 研究内容 |
| 5.2 研究目的与意义 |
| 5.3 技术路线 |
| 第二章 混合侵染和交替传代时斜纹夜蛾核型多角体病毒宿主域扩大和毒力演化 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 两种核型多角体病毒混合侵染后的宿主域扩大 |
| 2.2 宿主域扩大病毒交替传代时对斜纹夜蛾毒力的演化 |
| 2.3 宿主域扩大病毒对甜菜夜蛾毒力的演化 |
| 3 讨论 |
| 第三章 混合侵染和交替传代后病毒多角体超微结构变化 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 病毒的蔗糖密度梯度离心 |
| 1.3 超薄切片样品制备 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 透射电镜观察结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 混合侵染后宿主域扩大病毒polh和iap基因研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病毒混合侵染前后基因组DNA限制性酶切图谱比较 |
| 2.2 宿主域扩大病毒polh基因变异 |
| 2.3 宿主域扩大病毒Iap基因的克隆 |
| 3 讨论 |
| 第五章 病毒宿主域扩大和毒力提升后其全基因组变异分析 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 病毒DNA的提取 |
| 1.3 DNA浓度测定 |
| 1.4 基因组全序列测定分析 |
| 2 结果分析 |
| 2.1 全基因组序列分析和基因预测 |
| 2.2 混合侵染和交替传代后病毒基因组变异分析 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型基因组DNA复制原点及ORF63基因分析（论文提纲范文）
| 英文缩写符号及中英文对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 斜纹夜蛾及其防治 |
| 1.1.1 农林害虫斜纹夜蛾 |
| 1.1.2 斜纹夜蛾的防治 |
| 1.2 杆状病毒概述 |
| 1.2.1 杆状病毒的分类 |
| 1.2.2 杆状病毒的形态和结构 |
| 1.2.3 杆状病毒的生活周期 |
| 1.3 杆状病毒基因组研究 |
| 1.3.1 杆状病毒基因组结构 |
| 1.3.2 杆状病毒基因组 DNA 的复制机构 |
| 1.3.2.1 杆状病毒复制原点 |
| 1.3.2.2 与病毒 DNA 复制相关保守基因 |
| 1.3.3 基因组的重组 |
| 1.4 杆状病毒的基因研究 |
| 1.4.1 杆状病毒的基因结构 |
| 1.4.1.1 启动子基序 |
| 1.4.1.2 非翻译区 |
| 1.4.1.3 开放阅读框（ORFs） |
| 1.4.2 杆状病毒基因及其功能 |
| 1.5 杆状病毒的应用研究 |
| 1.5.1 杆状病毒可作为载体表达系统 |
| 1.5.2 杆状病毒可作为生物杀虫剂 |
| 1.5.3 杆状病毒可用于基因治疗 |
| 1.5.4 杆状病毒可作为表面展示系统 |
| 1.5.5 杆状病毒表达系统的不足和展望 |
| 1.6 研究目的与研究内容 |
| 1.6.1 研究目的及意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 昆虫、病毒株和细胞系 |
| 2.1.2 质粒载体和受体菌 |
| 2.1.3 酶和主要试剂 |
| 2.1.4 常用试剂配制 |
| 2.1.5 PCR 引物 |
| 2.1.6 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 生物信息学分析 |
| 2.2.1.1 生物软件资源 |
| 2.2.1.2 生物信息学网络资源 |
| 2.2.1.3 序列比对和同源性分析 |
| 2.2.2 基因组 DNA 的提取 |
| 2.2.3 基因片段的 PCR 扩增 |
| 2.2.4 PCR 产物的回收 |
| 2.2.5 连接反应 |
| 2.2.6 感受态细胞的制备（CaCl2 法） |
| 2.2.7 重组质粒的转化 |
| 2.2.8 重组质粒的筛选（快速细胞破碎法） |
| 2.2.9 碱裂解法少量制备质粒 DNA |
| 2.2.10 酶切鉴定反应 |
| 2.2.11 融合蛋白的诱导表达 |
| 2.2.12 表达产物存在形式的检测 |
| 2.2.13 SDS-PAGE 蛋白电泳 |
| 2.2.14 重组蛋白的大量诱导表达 |
| 2.2.15 包涵体蛋白样品的处理 |
| 2.2.16 融合蛋白的纯化 |
| 2.2.17 Ni 柱的再生 |
| 2.2.18 蛋白浓度的测定（Bradford 法） |
| 2.2.19 融合蛋白的质谱鉴定 |
| 2.2.20 多克隆抗体的制备 |
| 2.2.21 多克隆抗体效价的测定（ELlSA 法） |
| 2.2.22 各时相总 RNA 的提取和反转录 |
| 2.2.23 Realtime PCR 和标准曲线制作 |
| 2.2.24 昆虫细胞的传代与培养 |
| 2.2.25 细胞的冻存 |
| 2.2.26 细胞的复苏 |
| 2.2.27 脂质体介导的功能质粒在昆虫细胞系中的转染与瞬时表达 |
| 2.2.28 萤光素酶标记的启动子活性分析 |
| 2.2.29 细胞总 DNA 的抽提及定量 |
| 2.2.30 总蛋白质的提取及定量 |
| 2.2.31 Western Blot 检测 |
| 2.2.32 免疫荧光细胞化学 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 同源重复区（hrs）功能分析 |
| 3.1.1 hrs 生物信息学分析 |
| 3.1.2 hrs 功能质粒的构建 |
| 3.1.3 hrs 复制功能分析 |
| 3.1.4 hrs 增强功能分析 |
| 3.1.5 64bp 回文序列功能分析 |
| 3.1.6 hrs 特征结构与复制增强效率的相互关系 |
| 3.2 ORF63 生物信息学分析 |
| 3.2.1 序列分析 |
| 3.2.2 保守结构域分析 |
| 3.2.3 同源性分析 |
| 3.2.4 信号肽分析 |
| 3.2.5 GP63 的跨膜结构域分析 |
| 3.2.6 疏水性分析 |
| 3.2.7 功能结构域分析 |
| 3.2.8 磷酸化、糖基化位点预测 |
| 3.2.9 二级结构分析 |
| 3.2.10 卷曲螺旋分析 |
| 3.3 ORF63 启动子活性与转录时相分析 |
| 3.3.1 启动子特征基序分析 |
| 3.3.2 功能质粒的构建 |
| 3.3.3 启动子活性分析 |
| 3.3.4 ORF63 在细胞中转录时相分析 |
| 3.3.5 ORF63 在宿主中转录时相分析 |
| 3.4 ORF63 原核表达与抗体制备 |
| 3.4.1 ORF63 重组质粒构建 |
| 3.4.2 ORF63 原核表达 |
| 3.4.3 ORF63 融合蛋白的纯化 |
| 3.4.4 ORF63 融合蛋白的质谱鉴定 |
| 3.4.5 ORF63 蛋白质浓度测定 |
| 3.4.6 多克隆抗体制备及效价检测 |
| 3.5 ORF63 表达时相与亚细胞定分析 |
| 3.5.1 ORF63 在宿主中表达时相分析 |
| 3.5.2 ORF63 在细胞中表达时相分析 |
| 3.5.3 ORF63 亚细胞定位分析 |
| 3.5.4 ORF6、ORF57 和 ORF146 等亚细胞定位分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 杆状病毒基因组 DNA 复制原点分析 |
| 4.2 ORF63 转录时相分析 |
| 4.3 ORF63 表达时相分析 |
| 4.4 ORF63 亚细胞定位分析 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
| 8 攻读学位期间发表的主要论文 |
（6）一株新鉴定的棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒基因组分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 杆状病毒 |
| 1.1.1 杆状病毒分类学 |
| 1.1.2 杆状病毒对宿主的侵染过程 |
| 1.1.3 杆状病毒基因组研究 |
| 1.1.4 影响宿主功能的杆状病毒基因 |
| 1.2 研究目的和意义 |
| 1.2.1 研究目的 |
| 1.2.2 研究意义 |
| 1.3 研究内容 |
| 第二章 棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒的形态特性研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒株和多角体病毒纯化 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 扫描电镜样品的制备 |
| 2.2.2 透射电镜样品的制备 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 扫描电镜观察 |
| 2.3.2 透射电镜观察 |
| 第三章 棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒体内体外复制研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 质粒和菌种 |
| 3.1.2 昆虫细胞及病毒 |
| 3.1.3 试验昆虫 |
| 3.1.4 试剂 |
| 3.1.5 细菌培养基 |
| 3.1.6 昆虫细胞培养基 |
| 3.1.7 常用溶液及缓冲液 |
| 3.1.8 实验仪器和设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞的传代 |
| 3.2.2 细胞的冻存 |
| 3.2.3 细胞的复苏 |
| 3.2.4 病毒感染细胞 |
| 3.2.5 昆虫添食病毒 |
| 3.2.6 碱法少量快速抽提质粒 DNA |
| 3.2.7 限制性内切酶反应 |
| 3.2.8 玻璃奶法纯化回收 DNA 片段 |
| 3.2.9 DNA 的连接 |
| 3.2.10 感受态细胞的小量制备 |
| 3.2.11 感受态细胞的大量制备 |
| 3.2.12 质粒 DNA 的转化 |
| 3.2.13 快速细胞破碎法鉴定重组质粒 |
| 3.2.14 绝对定量 PCR |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 HearMNPV 对宿主细胞的感染（体外复制） |
| 3.3.2 HearMNPV 在棉铃虫体内的复制 |
| 3.3.3 HearMNPV 对其它昆虫的感染 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 半补齐法构建棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒基因组文库 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 HearMNPV 的扩增 |
| 4.2.2 多角体病毒 DNA 的提取 |
| 4.2.3 用 Sau3AⅠ酶对 HearMNPV 基因组 DNA 随机切割 |
| 4.2.4 半补齐反应 |
| 4.2.5 连接与转化 |
| 4.2.6 插入片断大小鉴定及文库覆盖率 |
| 4.2.7 DNA 测序 |
| 4.2.8 基因组序列组装 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒基因组解析 |
| 5.1 实验方法 |
| 5.1.1 ORF 的确定 |
| 5.1.2 启动子基序搜索 |
| 5.1.3 同源重复区（hrs）的寻找 |
| 5.1.4 基因组内容、组织及排列分析 |
| 5.1.5 系统进化分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 HearMNPV 基因组核苷酸序列分析 |
| 5.2.2 基因对等图分析 |
| 5.2.3 系统进化分析 |
| 5.2.4 HearMNPV 与 MacoNPV-B 基因组结构的比较 |
| 5.2.5 HearMNPV ORF6644 |
| 5.2.6 HearMNPV ORF1746 |
| 5.2.7 HearMNPV unique ORF |
| 5.2.8 bro genes |
| 5.2.9 hrs |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 6.1 棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒的形态特性研究 |
| 6.2 棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒体内体外复制研究 |
| 6.3 半补齐法构建 HearMNPV 基因组文库 |
| 6.4 棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒基因组解析 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型（SpltMNPV Ⅱ）BV、ODV组成型蛋白质谱分析和4种ORF的基因分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1、杆状病毒的生活史 |
| 2、杆状病毒的基因组 |
| 3、杆状病毒的基因结构 |
| 4. 保守基因及其功能 |
| 5. 可变基因 |
| 6. 基因组的重组 |
| 7. 杆状病毒表达系统 |
| 第二章 研究目的与研究内容 |
| 1、研究目的 |
| 2、研究内容 |
| 3、技术路线 |
| 第三章 主要试剂与常用实验方法 |
| 1、常用试剂 |
| 2、常用试验方法 |
| 第四章 SpltMNPVⅡBVs和ODVs组成型蛋白质谱分析 |
| 1、材料和方法 |
| 2、实验结果与分析 |
| 3、讨论 |
| 第五章 SpltMNPVⅡ ORF6、ORF13、ORF57 和ORF146 基因结构分析 |
| 1、材料和方法 |
| 2、实验结果与分析 |
| 3、讨论 |
| 第六章 SpltMNPVⅡ ORF6、ORF13、ORF57 和 ORF146 基因启动子活性和转录时相分析 |
| 1、材料和方法 |
| 2、实验结果与分析 |
| 3、讨论 |
| 第七章 SpltMNPVⅡ ORF6、ORF13、ORF57 和 ORF146 基因的原核表达和抗体制备 |
| 1、材料与方法 |
| 2、实验结果与分析 |
| 3、讨论 |
| 第八章 SpltMNPVⅡ ORF6、ORF13 和 ORF146 基因在宿主细胞中的表达时相 |
| 1、材料与方法 |
| 2、研究结果 |
| 3、讨论 |
| 第九章 SpltMNPVⅡ ORF57 基因的功能鉴定 |
| 1、材料和方法 |
| 2、实验结果与分析 |
| 3、讨论 |
| 第十章 结论与创新点 |
| 1、结论 |
| 2、创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表和待发表的学术论文 |
| 攻读学位期间参与的科研项目 |
| 英文缩略表 |
| 致谢 |
（8）斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF50基因的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 斜纹夜蛾与杆状病毒研究进展 |
| 1.1 农林害虫斜纹夜蛾 |
| 1.1.1 农林害虫斜纹夜蛾的习性特征 |
| 1.1.2 斜纹夜蛾对农业生产的危害 |
| 1.1.3 农业害虫的治理 |
| 1.2 生物防治 |
| 1.2.1 利用害虫天敌防治害虫 |
| 1.2.2 利用作物对病虫害的抗性防治 |
| 1.2.3 利用病原微生物防治害虫 |
| 1.3 昆虫杆状病毒 |
| 1.3.1 昆虫杆状病毒分类与命名 |
| 1.3.2 杆状病毒的感染周期 |
| 1.3.3 杆状病毒基因组 |
| 1.3.4 昆虫杆状病毒的应用 |
| 第二部分 实验研究报告 |
| 第二章 研究意义及研究方案 |
| 2.1 立题依据和意义 |
| 2.1.1 SpltNPVⅡ的基因组分析 |
| 2.1.2 SpltNPVⅡ的ORF50 序列分析 |
| 2.2 研究方案 |
| 2.3 主要研究路线 |
| 第三章 实验材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 工具酶及Kit |
| 3.1.3 主要实验试剂与配制 |
| 3.2 常用实验仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 SpltNPVⅡODVs 组成蛋白样品的制备 |
| 3.3.2 SpltNPVⅡBVs 组成蛋白样品的制备 |
| 3.3.3 SpltNPVⅡ基因组DNA 的提取 |
| 3.3.4 基因片段的PCR 扩增 |
| 3.3.5 玻璃奶法纯化回收DNA 片段 |
| 3.3.6 DNA 片段与载体连接 |
| 3.3.7 E.coli 热激感受态细胞的小量制备 |
| 3.3.8 质粒DNA 或连接产物的热转化 |
| 3.3.9 重组质粒的鉴定 |
| 3.3.10 碱法少量快速抽提质粒DNA |
| 3.3.11 DNA 和RNA 浓度测定 |
| 3.3.12 酶切 |
| 3.3.13 菌种保存 |
| 3.3.14 重组表达菌的诱导表达 |
| 3.3.15 融合表达蛋白的鉴定 |
| 3.3.16 BL21 的IPTG 诱导大量表达 |
| 3.3.17 包涵体蛋白的洗涤与变性溶解 |
| 3.3.18 Ni 柱纯化His Tag 蛋白 |
| 3.3.19 Bradford 法测定蛋白浓度 |
| 3.3.20 Ni+-NTA 树脂的再生 |
| 3.3.21 ELISA 酶联免疫吸附测定：间接法测定效价 |
| 3.3.22 酶联免疫吸附测定（Western blotting） |
| 3.3.23 萤光素酶标记的启动子活性分析 |
| 3.3.24 利用Trizol 抽提组织总RNA |
| 3.3.25 RT-PCR |
| 3.3.26 荧光定量PCR（Realtime Quantitative PCR） |
| 第四章 SpltNPVⅡODVs 与BVs 组成型蛋白比较分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 SpltNPVⅡ病毒 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 SDS-PAGE 结果 |
| 4.3.2 质谱分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 SpltNPVⅡORF50 基因的的克隆与表达 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 PCR 扩增与TA 克隆 |
| 5.3.2 重组表达载体的构建及鉴定 |
| 5.3.3 重组质粒在大肠杆菌中诱导融合表达 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 gp50 蛋白的纯化及其抗体的制备 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 实验方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 Ni+-NTA 树脂蛋白纯化结果及分析 |
| 6.3.2 纯化蛋白的质谱分析鉴定 |
| 6.3.3 Bradford 法测定浓缩纯化蛋白浓度 |
| 6.3.4 gp50 抗体的制备与鉴定 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 SpltNPVⅡORF50 基因的启动子活性分析 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 实验材料 |
| 7.2.2 实验方法 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 pMD18T-50P 克隆载体的构建与DNA 测序鉴定 |
| 7.3.2 启动子分析载体pGL3-Basic-50P 的构建及鉴定 |
| 7.3.3 SpltNPVⅡORF50 基因的启动子基因50P 活性分析 |
| 7.4 讨论 |
| 第八章 SpltNPVⅡORF50 基因的时相转录表达分析 |
| 8.1 引言 |
| 8.2 材料与方法 |
| 8.2.1 感染病毒的细胞与虫体分时相收取 |
| 8.2.2 组织总RNA 抽提 |
| 8.2.3 RT-PCR |
| 8.2.4 荧光定量PCR（Real time Quantitative PCR） |
| 8.2.5 Western blotting 时相分析 |
| 8.3 结果与分析 |
| 8.3.1 RT-PCR 时相分析 |
| 8.3.2 荧光定量PCR 时相分析 |
| 8.3.3 蛋白免疫印迹检测表达时相分析 |
| 8.4 讨论 |
| 第九章 全文总结 |
| 9.1 斜纹夜蛾与杆状病毒 |
| 9.2 斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ及其ORF50 |
| 9.3 ORF50 的转录表达时相分析 |
| 9.4 有待进一步研究内容 |
| 9.5 结束语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 研究所用载体图谱 |
| 2 测序图谱 |
| 缩略语表 |
| 在读期间发表论文 |
| 致谢 |
（9）东方粘虫颗粒体病毒和斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ基因组全序列分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 杆状病毒的生物学和分类学 |
| 1.2 杆状病毒基因组 |
| 1.2.1 杆状病毒基因组的测序概况 |
| 1.2.2 杆状病毒基因组结构 |
| 1.2.3. 杆状病毒的基因结构 |
| 1.2.4. 保守基因及其功能 |
| 1.2.5. 可变基因 |
| 1.2.6. 基因组的重组 |
| 1.3 杆状病毒的系统发生和进化 |
| 1.3.1 杆状病毒的系统发生史 |
| 1.3.2 杆状病毒的进化 |
| 第二章 本研究的立题依据、意义和研究方案 |
| 2.1 立题依据 |
| 2.2 研究意义 |
| 2.3 研究方案 |
| 第三章 东方粘虫颗粒体病毒的形态特性研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 病毒株和颗粒体病毒纯化 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 扫描电镜样品的制备 |
| 3.2.2 透射电镜样品的制备 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 扫描电镜观察 |
| 3.3.2 透射电镜观察 |
| 第四章 东方粘虫颗粒体病毒基因组全序列分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 病毒株和颗粒体纯化 |
| 4.1.2 菌株和质粒 |
| 4.1.3 工具酶 |
| 4.1.4 试剂 |
| 4.1.5 培养基及有关溶液的配制 |
| 4.1.6 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 颗粒体病毒DNA 的提取 |
| 4.2.2 碱法少量快速抽提质粒DNA |
| 4.2.3 碱法大量制备质粒DNA |
| 4.2.4 DNA 浓度测定 |
| 4.2.5 限制性内切酶反应 |
| 4.2.6 玻璃奶法纯化回收DNA 片段 |
| 4.2.7 DNA 的连接 |
| 4.2.8 质粒DNA 的转化 |
| 4.2.9 重组质粒的鉴定 |
| 4.2.10 随机文库的建立 |
| 4.2.11 DNA 测序 |
| 4.2.12 基因组序列分析 |
| 4.2.13 基因组中2 个同源基因位置的确定 |
| 4.2.14 PsGV（ODVs）颗粒体组成蛋白的制备 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 PsGV 全基因组的核苷酸序列分析 |
| 4.3.2 PsGV 的ORFs 与其它杆状病毒的比较 |
| 4.3.3 PsGV 特有的ORF |
| 4.3.4 同源区（hr） |
| 4.3.5 杆状病毒的重复基因（bro genes） |
| 4.3.6 PsGV 基因组中的两个同源基因 |
| 4.3.7 PsGV 基因组中最大的基因 |
| 4.3.8 PsGV 增效蛋白基因（enhancin） |
| 4.3.9 PsGV（OBs）颗粒体组成蛋白分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 斜纹夜蛾核型多角体病毒II 的形态特征研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 病毒株和多角体纯化 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 扫描电镜观察 |
| 5.3.2 透射电镜观察 |
| 第六章 斜纹夜蛾核型多角体病毒II 基因组全序列分析 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 病毒株和多角体纯化 |
| 6.1.2 菌株和质粒 |
| 6.1.3 工具酶 |
| 6.1.4 试剂 |
| 6.1.5 培养基及有关溶液的配制 |
| 6.1.6 主要仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 SpltNPV II 全基因组的核苷酸序列分析 |
| 6.3.2 SpltNPV II 的ORFs 与其它杆状病毒的比较 |
| 6.3.3 SpltNPV II 特有的ORFs |
| 6.3.4 同源区（hr） |
| 6.3.5 杆状病毒的重复基因（bro genes） |
| 6.3.6 SpltNPV II 中含有两个同源序列的基因 |
| 6.3.7 SpltNPV II 与SpltNPV I 比较 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 PsGV 和 SpltNPV II 的系统进化分析 |
| 7.1 实验材料 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 第八章 全文结论 |
| 8.1 东方粘虫颗粒体病毒(PsGV)的形态特性研究 |
| 8.2 东方粘虫颗粒体病毒(PsGV)基因组序列分析 |
| 8.3 斜纹夜蛾核型多角体病毒 II(SpltNPV II)的形态特性研究 |
| 8.4 斜纹夜蛾核型多角体病毒 II(SpltNPV II)基因组序列分析 |
| 8.5 PsGV 和 SpltNPV II 的系统进化分析 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）斜纹夜蛾核多角体病毒诱导细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 杆状病毒诱导的细胞凋亡及 RNAi 技术(文献综述) |
| 1.1 核多角体病毒 |
| 1.2 杆状病毒感染与宿主的关系 |
| 1.3 杆状病毒宿主专一性 |
| 1.4 细胞凋亡概念及其形态学特征 |
| 1.5 细胞凋亡与细胞坏死区别 |
| 1.6 细胞凋亡的分子机制 |
| 1.7 杆状病毒感染引起的细胞凋亡研究 |
| 1.8 抗凋亡基因 |
| 1.8.1 p35基因 |
| 1.8.2 p49基因 |
| 1.8.3 iap 基因 |
| 1.9 RNAi 技术 |
| 1.9.1 RNAi 的发现与发展 |
| 1.9.2 RNAi 作用机制 |
| 1.9.3 RNAi 机制中的主要成员 |
| 1.9.4 用RNAi 方法研究特定基因功能的技术路线 |
| 第二章 Splt-iap4 和 Splt-p49 基因转录和翻译研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 Splt-iap4转录时相 |
| 2.2.2 Splt-p49转录时相 |
| 2.2.3 Splt-iap4表达时相 |
| 2.2.4 Splt-p49表达时相 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 应用RNAi技术研究Splt-iap4和Splt-p49基因功能 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 Splt-iap4和Splt-p49基因的PCR扩增结果 |
| 3.2.2 对照cat基因的PCR扩增结果 |
| 3.2.3 重组质粒p28i-p49和p28i-iap的酶切鉴定 |
| 3.2.4 重组质粒p28i-cat的酶切鉴定 |
| 3.2.5 Splt-P49和Splt-IAP4凋亡功能检测 |
| 3.2.6 Splt-IAP4蛋白没有协同抗凋亡作用 |
| 3.2.7 Splt-IAP4对细胞有聚集作用 |
| 3.2.8 Splt-iap4 dsRNA处理对产生感染性病毒粒子的影响 |
| 3.2.9 RNAi对SpltNPV感染SpLi-221细胞的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 Splt- iap4 和 Splt-p49 瞬时表达及抗细胞凋亡活性研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 瞬时表达载体的构建 |
| 4.2.2 瞬时表达蛋白检测 |
| 4.2.3 Splt-Iap4和Splt-P49抗凋亡活性检测 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 杆状病毒与抗凋亡基因的进化关系研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 43株杆状病毒全基因组特征 |
| 5.2.2 43株杆状病毒全基因组中的抗凋亡基因 |
| 5.2.3 iap的序列比对和进化分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 SpltNPV感染诱导Se301细胞凋亡的检测与分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 光学显微镜观察SpltNPV 感染Se301细胞的形态学变化 |
| 6.2.2 电子显微镜观察SpltNPV 感染Se301细胞的形态学变化 |
| 6.2.3 DAPI染色 |
| 6.2.4 trypan blue染色 |
| 6.2.5 DNA ladder |
| 6.2.6 滴度测定 |
| 6.2.7 Dot blotting |
| 6.2.8 RT-PCR |
| 6.2.9 SDS-PAGE和Western blotting分析 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论文 |
| 国内外会议论文摘要 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
四、斜纹夜蛾核多角体病毒基因组的hr序列分析（论文参考文献）
- [1]苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒GP64蛋白的结构与功能关系研究[D]. 于乾龙. 西北农林科技大学, 2019
- [2]斜纹夜蛾核型多角体病毒研究进展[J]. 邹金城,杨勇,杨益众,苏宏华. 中国生物防治学报, 2016(06)
- [3]我国甜菜夜蛾核型多角体病毒研究新进展[J]. 邵天玉,刘兴龙,刘思竹,谢维欣,王克勤. 黑龙江农业科学, 2016(01)
- [4]混合侵染和交替传代对斜纹夜蛾核型多角体病毒宿主域和毒力影响及机制[D]. 王成燕. 南京农业大学, 2012(04)
- [5]斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型基因组DNA复制原点及ORF63基因分析[D]. 刘惠芬. 山东农业大学, 2012(03)
- [6]一株新鉴定的棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒基因组分析[D]. 唐平. 中国农业科学院, 2011(03)
- [7]斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型（SpltMNPV Ⅱ）BV、ODV组成型蛋白质谱分析和4种ORF的基因分析[D]. 盛晔. 苏州大学, 2010(06)
- [8]斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF50基因的研究[D]. 闵丹. 苏州大学, 2010(01)
- [9]东方粘虫颗粒体病毒和斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ基因组全序列分析[D]. 李轶女. 中国农业科学院, 2008(10)
- [10]斜纹夜蛾核多角体病毒诱导细胞凋亡的研究[D]. 余倩. 中山大学, 2008(06)