一、肺炎支原体血清学诊断方法的比较研究（论文文献综述）
陈芙[1]（2021）在《基于比较基因组方法挖掘Mo特异性诊断靶标》文中进行了进一步梳理绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae,Mo）是引起绵羊和山羊支原体肺炎的主要病原之一,感染后临床症状主要表现为咳嗽、喘气、渐进性消瘦以及肺间质增生性炎症等,是一种世界性的传染病。Mo菌株基因型具有多样性的特点,研究发现不同羊场的分离株之间RFLP图谱存在显着差异,且在同一个病羊的肺内可分离出多株基因结构不同的Mo,表明各菌株间基因结构有所不同。目前尚未见以全基因组水平的差异比对来分析不同菌株的蛋白编码区（CDS）序列和筛选种特异性的诊断新靶标。目的:（1）利用比较基因组方法筛选出Mo种间和种内特异的蛋白编码区（CDS）序列。（2）选择部分种特异性的蛋白编码基因作为潜在的分子诊断靶标,通过普通PCR验证靶标特异性、所建方法的敏感性和临床检测的适应性（2）选择种特异性的编码蛋白作为候选抗原靶标,分析其抗原性,构建表达载体、表达并纯化得到目的蛋白,通过WB实验初步评估抗原性和特异性。方法:（1）将14株已公布的Mo全基因组序列进行初次筛选,获得同源性较高的序列,再与精氨酸支原体（Mycoplasma arginine,Marg）、丝状支原体山羊亚种（Mycoplasma mycoides subsp.Capri,Mmc）、山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasma capricolum subsp.Capripneumoniae,Mccp）等羊呼吸道支原体基因组进行比对后获得种间特异性编码序列,最后与51株本地分离株基因组重测序数据进行比对获得Mo种内特异性蛋白编码基因。（2）将优选的Mo种内特异性蛋白编码基因,寻找与51株Mo共有的保守性片段。利用NCBI线上Primer BLAST程序设计引物,选择G/C含量较高的靶基因设计引物,通过引物筛选和反应条件优化,建立并利用核酸样品盘中53株Mo菌株、15株其它支原体和18株常见反刍动物细菌的DNA进行扩增,并检测27份临床样品DNA评估其特异性,与应用最广泛的LMF1/LMR1引物及其反应体系（PCR方法）比较,评价优选序列是否可作为Mo的核酸诊断靶标。（3）通过软件评估优选潜在的特异性编码蛋白,结合序列结构功能的预测结果,将符合要求的序列使用p ET-30a构建原核表达载体,并通过原核表达系统表达、IPTG诱导表达、Ni-IDA+亲和层析柱纯化获得重组蛋白,再通过WB评估重组蛋白的反应原性,初步评估重组蛋白是否可作为Mo新的血清学诊断靶标。结果:（1）NCBI 14个Mo基因组BLAST排除了与Marg、Mmc、Mccp同源性较高的序列,最终获得24个Mo种间特异性候选序列,将24个候选序列分别与51株本地Mo全基因组重测序结果进行BLAST,最终获得15个Mo种内特异性候选蛋白编码基因,13个Mo种内保守且特异的蛋白编码基因片段。（2）利用15个候选蛋白编码基因在51株Mo基因组中的共有保守性片段,选取4个序列的5个保守基因片段列设计11对引物。最终成功设计一对引物728 2F/2R,其对53株不同来源的Mo DNA,均能扩增出一条288 bp大小的目的条带,与预期条带大小相符,并无非特异性扩增。而反向核酸盘DNA为模板时,不能扩增出目的条带。并且728 2F/2R引物特异性优于LMF1/LMR1引物。（3）成功表达,纯化出重组蛋白258、728,WB验证发现258蛋白具有一定反应原性和特异性,728蛋白有一定反应原性但其特异性有待进一步评估。结论:（1）获得13个Mo种内保守且特异的候选蛋白编码基因片段。（2）728序列可作为Mo新分子诊断靶标,并成功设计一对新的Mo特异性引物728 2F/2R。（3）258重组蛋白具有一定反应原性及特异性,具有作为Mo新的血清学诊断靶标的潜力,但其使用条件还需优化。
刘桐[2]（2021）在《牛支原体膜蛋白DnaK、L-LDH和P48免疫原性鉴定》文中指出牛支原体（Mycoplasma bovis,M.bovis）是引起牛发病的最重要及最常分离到的支原体之一,临床上可引发牛呼吸系统疾病以及关节炎、乳腺炎和生殖障碍等相关疾病,养牛业的健康发展为此受到严重威胁。由于其特殊的结构和生物学性质以及协同致病、持续感染等特点,病原会在牛群中长期留存,造成疾病的反复流行。然而M.bovis的防治工作也一直面临很大的问题,目前既无特效药也没有安全有效的商品化疫苗。因此,研发特异、快捷的检测手段和安全有效的疫苗仍是M.bovis疾病诊治防控亟待解决的问题。由于支原体无细胞壁,胞膜上的脂质相关膜蛋白LAMPs（Lipid-associated membrane proteins）成为了其发挥黏附、侵袭等作用的关键抗原成分。LAMPs免疫原性的研究可为M.bovis疾病的诊断及预防提供重要价值,但由于LAMPs中蛋白数量多,免疫原性良好蛋白的筛选范围广且工作量大。目前对M.bovis LAMPs的认识仍然有限。因此,本研究通过提取M.bovis TJ株的LAMPs,利用AKTA分子筛将其成功分为5组,在不破坏蛋白天然构象的前提下缩小筛选范围,随后进行免疫反应原性鉴定,筛选出特异性较好的组份并质谱分析。综合质谱结果中蛋白匹配度得分排名顺序和基因注释,初步筛选出3个膜蛋白（Dna K、L-LDH和P48蛋白）,随后分别对其进行原核表达及纯化,Western blot实验显示该3种蛋白免疫反应原性良好。同时基于ELISA技术评估了该3种膜蛋白的免疫反应原性,结果表明P48蛋白的敏感性、特异性均良好,但Dnak和L-LDH蛋白能与其他常见牛呼吸道疾病阳性血清发生交叉反应。随后通过小鼠免疫实验进一步深入分析该3种膜蛋白的免疫原性,结果显示,Dna K、L-LDH和P48蛋白均可诱导小鼠机体高水平且持久的血清抗体,包括抗体Ig G1和Ig G2a亚类,其中Dna K与L-LDH蛋白免疫组诱导产生的抗体偏向Ig G1亚类,而P48蛋白偏向Ig G2a亚类;与对照相比,3种蛋白均可增强CD4+而降低CD8+T淋巴细胞亚群的应答水平。免疫剂量对于3种蛋白单独免疫后产生的抗体水平及亚类的影响差异不显着,但在L-LDH蛋白免疫组中淋巴细胞亚群分化差异显着;3种蛋白抗原混合免疫与单个蛋白抗原免疫相比,淋巴细胞亚群分化差异不显着,但可产生针对P48的高水平Ig G抗体,而Ig G2a抗体亚类水平降低。综上,本研究利用分子筛等技术初步筛选到了3种免疫原性良好且保守的M.bovis LAMPs（Dna K、L-LDH和P48）,其中L-LDH蛋白在M.bovis中为首次报道;3种蛋白诱导机体淋巴细胞反应属CD4+辅助性T淋巴细胞免疫应答;Dnak和L-LDH蛋白具Th2型优势反应,偏介导体液免疫,而P48蛋白诱导的免疫应答具Th1型优势反应,偏介导细胞免疫。本研究结果为M.bovis的早期诊断和疫苗研制的潜在抗原蛋白筛选提供更多抗原信息。
齐兆东[3]（2021）在《基于TLR-2/MyD88信号通路探讨养阴清肺汤加味调控SMPP炎症机制研究》文中研究指明目的:通过高载量肺炎支原体（MP）建立小鼠重症肺炎支原体肺炎（SMPP）模型,并应用正交设计筛选影响小鼠SMPP模型制备因素;应用养阴清肺汤加味治疗SMPP小鼠,探讨养阴清肺汤加味对SMPP小鼠模型TLR-2/My D88信号通路相关因子表达的影响,阐明养阴清肺汤加味治疗SMPP靶点的作用机制。材料与方法:用高载量MP菌液连续滴鼻3天,建立小鼠SMPP模型,通过与普通载量MP滴鼻造模小鼠对比,进行模型的鉴定与评价;采用三因素二水平的正交设计,用MP对小鼠进行感染,制备肺炎模型,并以小鼠血清中白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平为评价指标进行综合评分,观察三种不同因素及其水平对小鼠S MPP模型形成的影响。模型建立成功后,进行下一步药物干预实验。将BALB/c小鼠120只随机分为正常组、模型组、阿奇霉素组、养阴清肺汤加味组、养阴清肺汤加味联合阿奇霉素组,除正常组外,余4组均建立为小鼠SMPP模型。模型建立成功后开始予药物治疗,在第3、7、10、14天,每组各随机选取6只小鼠处死取材,采用HE染色法观察小鼠的肺部病理,运用ELISA法、q PCR检测Toll样受体（TLR-2）、髓样分化分子88（My D88）、核转录因子κB（NF-κB）m RNA表达水平,以及血清中白细胞介素8（IL-8）水平。结果:1.在各时间点两模型组小鼠的肺指数均高于正常组,高载量小鼠的肺指数在第5、7、10天高于普通载量组小鼠（p<0.05）。高载量组小鼠病理评分、IL-6、TNF-α水平在各时间点均高于普通载量组小鼠（p<0.05）,提示小鼠SMPP模型建立成功。2.正交设计优化SMPP模型制备实验中,除模型一组外,余3组皆建立SMPP模型,其中模型三组MP感染程度相对严重。直观分析结果表明,影响SMPP制备因素的重要顺序为攻毒方式>MP菌液浓度>攻毒天数。3.ELISA法检测血清中IL-8,PCR法检测肺组织中TLR-2、My D88、NF-κB结果显示,与正常组相比,MP感染后第3、7、10、14天,TLR-2、My D88、NF-κB、IL-8表达均升高（p<0.05）。其中NF-κB在第3天达到顶峰,TLR-2、IL-8在第7天达到峰值,M y D88在第10天达到峰值。4.药物干预后,3个给药组与模型组相比,TLR-2、My D88、NF-κB、IL-8的表达均有所下降,但仍高于正常组（p<0.05）;养阴清肺汤加味联合阿奇霉素组与其余治疗组相比疗效较优,差异具有统计学意义（p<0.05）。结论:1.利用1×1010CCU/ml的肺炎支原体菌液连续滴鼻3天可以建立SMPP小鼠模型,并且影响SMPP模型的重要因素为攻毒方式>MP载量>攻毒天数。2.养阴清肺汤加味可减轻SMPP模型小鼠肺部炎症,且联合阿奇霉素效果更优。3.养阴清肺汤加味可以调控TLR-2/My D88信号通路,从而抑制其相关因子TLR-2、My D88、NF-κB、IL-8的表达,可能是治疗SMPP的靶点。
王雅雯[4]（2021）在《规模化羊场肺炎支原体流行病学调查及分离鉴定》文中研究指明羊支原体肺炎,是一种高度接触性传染病,主要由支原体引起,临床表现为发烧、浆液性和纤维素性胸膜肺炎,具有较高的发病率和死亡率,目前已成为严重威胁我国养羊业发展的重要病原之一。为了了解新疆南疆地区支原体肺炎的感染情况,在5个羊场开展了绵羊支原体肺炎、丝状支原体山羊亚种、山羊支原体肺炎进行了血清抗体检测,对绵羊肺炎支原体做了PCR检测和分离鉴定。主要研究内容和结果如下:1、5个规模化羊场3种支原体肺炎的血清流行病学调查采集329份血样进行绵羊支原体肺炎、丝状支原体山羊亚种、山羊支原体肺炎的抗体检测,了解南疆地区5个规模化羊场支原体流行情况。结果发现,绵羊支原体肺炎的阳性率为14%-73.8%之间,羊场D的阳性率最低为14%;羊场A的阳性率最高为73.8%。丝状支原体山羊亚种的阳性率为8.1%-16.6%,羊场E的阳性率最低为8.1%;羊场D的阳性率最高位16.6%。山羊支原体肺炎的阳性率为8.1%-46%,羊场E的阳性率最低为8.1%;羊场D的阳性率最高阳性率为46%。结果显示,羊场的支原体肺炎存在多种支原体。2、3个规模化羊场绵羊肺炎支原体的分子流行病学调查根据血清抗体检测的结果,挑选绵羊支原体肺炎阳性率较高的3个规模化羊场采集鼻拭子119份、病羊肺脏组织6份,进行分子流行病学调查。采用PCR技术对采集的样品进行初步的鉴定,选用部分代表株进行16S r RNA基因进行序列测定,研究表明,3个规模化羊场的阳性率分别为,15%、16%、2%、4%。其中羊场A的阳性率最高。3、绵羊肺炎支原体的分离鉴定利用PPLO液体和固体培养基对鼻拭子、肺脏组织的阳性样品进行分离培养,使用光学显微镜观察其菌落形态,分离株菌落瑞氏染色后,呈现球形,菌落中心呈深蓝色。进一步采用PCR方法从分子水平确定其种属。参照MO特异性引物进行PCR鉴定并测序,遗传进化分析显示,分离株（BSZ）与注册号为NR025989.1亲缘关系较近（亲缘性关系图4-5）。运用MA GE 7.0软件的邻接法构建基于16S r RNA基因的系统发育树,分析显示,BSZ与注册号为N R025989.1在同一分支上（系统进化树图4-6）。2株培养物均扩增出大小为418bp、1021bp的目的片段,结果表明2株分离株均为绵羊肺炎支原体。
郑肖肖[5]（2021）在《儿童难治性肺炎支原体肺炎血清及肺泡灌洗液细胞因子的研究及其临床意义》文中研究指明目的本研究主要是通过对儿童难治性肺炎支原体肺炎血清及肺泡灌洗液细胞因子IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α的水平进行比较。了解细胞因子与疾病严重程度之间的关系,以及局部的免疫炎症反应,初步探索RMPP所涉及的免疫反应以及细胞因子对RMPP患儿的预测价值,做到对RMPP早期筛查和诊断,有效阻止疾病的发展。方法严格根据纳入及排除标准,选取2018年10月至2020年10月于沈阳市儿童医院病房住院治疗,根据患儿的病情对需要进行电子支气管镜检查或是治疗的64例患儿进行分组,其中MPP患儿32例,RMPP患儿32例。在疾病的急性期（病程2周内）进行电子支气管镜检查同时留取患儿的肺泡灌洗液,采用流式细胞术对患儿血浆和支气管肺泡灌洗液（BALF）中IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α的水平进行检测。并检测血清中C反应蛋白（C-reactive protein,CRP）、铁蛋白（Ferritin,FER）、乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase,LDH）等临床指标。收集患儿的各项检测指标并进行汇总,然后用SPSS22.0进行统计学分析。结果1.RMPP患儿与MPP患儿BALF中IL-4、IL-6、IFN-γ和TNF-α指标均显着高于血浆,差异有统计学意义（P<0.05）。2.RMPP患儿BALF中IL-6、IFN-γ、TNF-α高于MPP,差异有统计学意义（P<0.0 5）;RMPP患儿血浆IL-6、TNF-α的水平高于MPP,差异有统计学意义（P<0.0 5）。3.两组患儿BALF与血浆IL-4、IFN-γ、TNF-α、IL-6的水平均呈正相关。4.经ROC曲线分析得出结果BALF中TNF-α的水平对于预测RMPP更具有价值,临界值为38.78pg/ml。结论1.TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6共同参与了机体的免疫反应,并在RMPP的发生发展中起着重大作用。2.两组患儿BALF和血浆中TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6水平呈正相关。3.BALF中的TNF-α的高表达是预测RMPP的一个重要指标,特别是当BALF中的TNF-α>38.78时,随着TNF-α的升高,RMPP发生的风险显着上升。
林康[6]（2021）在《肺炎支原体P116段特异性蛋白的制备与多克隆抗体的研究及肺炎支原体小鼠模型的初步研究》文中提出目的研究肺炎支原体（MP）P116特异性的粘附蛋白的三段基因FP2,FP3,FP4的克隆表达,及其相对应三种多克隆抗体的制备。使用收集的阳性患者血清样本检测其特异性和敏感性。体外探究肺炎支原体对细胞的粘附性,及构建肺炎性支原体鼠模型。为预防和阻断肺炎支原体感染与传播提供一定的科学依据。方法P116-FP2、P116-FP3、P116-FP4蛋白的表达和ELISA培养方法的构建:首先在培养基中复苏繁殖FH-MP标准株,大量扩增培养后提取MP基因组DNA,参照相关文献,设计三段目的基因的引物。通过PCR得到目的基因。PCR产物和T载体进行双酶切,产物与T载体相互连接,转化至提前制备好的感受态细胞。涂板于内部含有IPTG与X-gal的平板上。经由蓝白斑筛查得到正确的重组载体。将挑取的菌落直接接种到培养基中,大量地扩增。将扩增后的原菌液分成两个部分,一部分用做测序分析,另一部分用双酶切方法确认。鉴定正确的重组品和菌株可提取质粒,重组品的质粒和p QE-80-L质粒载体同时进行双酶切,连接双酶切后的基因产物,将其导入没有转化过重组品的BL21（DE3）中,涂布在筛选固体平板上。挑取单个菌落接种于培养基中,大量扩增,将扩增后的菌液一半做测序分析,一半冻存备用。诱导表达构建好的三种重组质粒。对在诱导细胞表达前后的蛋白进行SDS-PAGE电泳,确认其在导入的细胞内的表达。蛋白纯化:首先对重组菌进行小规模表达,取诱导前菌液作为阴性对照,筛选出蛋白表达的最佳条件,在最适条件下,大量表达蛋白。向表达蛋白后的菌液中,加入溶菌酶和复合型蛋白酶合成抑制剂。在冰浴的条件下将已经表达好的蛋白质原料进行了一次超声波的打碎。超声后的上清细胞离心后,可保留上清部分,对于沉淀物可进行再次裂解,离心后即可取新的上清。诱导前的细菌液,诱导后的细菌液,上清中的粗蛋白,包涵体中的蛋白分别先后进行SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝R-250常温条件下对膜进行染色,脱色液脱色后,分析脱色后蛋白是如何表达的。对目的蛋白可采取不同含量的咪唑洗脱液进行咪唑洗脱,确定最佳咪唑浓度洗脱水平。最后用镍柱进行洗脱,收集洗脱后的蛋白冻存以备用。多克隆抗体的获得:新西兰大白兔分笼饲养做好标记,取血-20℃保存,配制抗原对兔子进行蛋白免疫。第一周与第二周用与弗氏完全佐剂混合的蛋白悬液对兔子进行注射,第三周与第四周用与弗氏不完全佐剂混合的蛋白悬液对兔子进行注射。兔耳缘静脉取血作琼脂扩散分析,观察多抗效果。最后对兔子进行取血,收集多克隆抗体。对所获得多克隆抗体进行Western-blot分析,检测免疫原性。利用标准蛋白绘制BCA法检测蛋白的标准曲线,测出重组蛋白的浓度。利用重组蛋白作为包被抗原,使用棋盘法得到抗原抗体反应的最佳条件。肺炎支原体鼠模型的建立:对c57小鼠进行分组,用扩大培养的FH-MP标准株菌液对小鼠进行感染,每天一次。对小鼠反复感染三天,第四、七天再进行肺部气泡灌洗,取出肺部组织。将肺泡的灌洗液分别进行DNA提取,做PCR鉴定。对肺部组织进行HE（苏木精-伊红）染色。结果成功构建了P116-FP2、P116-FP3、P116-FP4三种重组质粒载体,Western-blot实验验证了可与肺炎支原体阳性患者血清中的相应抗体反应,而与没有感染MP的血清无法发生免疫反应。利用棋盘法摸索出最佳的抗原抗体反应体系,为后续开发ELISA试剂盒给出了理论依据。小鼠的肺组织切片表明初步构建成功小鼠肺炎支原体模型,同时小鼠肺泡灌洗液也相应的佐证了鼠模型的建立。结论初步证明P116-FP2、P116-FP3、P116-FP4三种蛋白具有免疫反应性,且作为抗原的Western-blot实验的特异性。利用其作为抗原检测病人血清的方法,检测的灵敏性将得到很大的提高。为临床血清学诊断MP提供了一定帮助。肺炎支原体小鼠模型的建立为后续进一步预防与治疗肺炎支原体提供了理论依据。
吴娅琴[7]（2020）在《山羊传染性胸膜肺炎新诊断分子的筛选与评价》文中研究说明山羊传染性胸膜肺炎（Contagious Caprine Pleuropneumonia,CCPP）是由山羊支原体山羊肺炎亚种（Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp）引起的一类严重呼吸道疫病,主要危害山羊和一些野生羊,被世界动物卫生组织（OIE）列为报告动物疫病之一。CCPP流行区域横跨亚洲、中东、非洲40多个国家,主要表现为呼吸系统症状,与小反刍兽疫、巴氏杆菌病以及绵羊肺炎支原体羊肺炎等多种疫病症状相似,且临床表现多样、复杂,需要通过实验室诊断才能确诊。由于Mccp与丝状支原体簇其他成员关系密切,CCPP准确诊断一直是本病防控的关键技术难题之一,特异、敏感的诊断方法是研究工作中最具挑战性的一个方面。挖掘Mccp特异性诊断分子,进而建立准确、有效的诊断方法来研发诊断试剂,是有效防控CCPP的技术支撑条件之一。本研究主要通过两条途径挖掘CCPP新诊断分子。途径一是通过比较基因组学方法,先筛选得到Mccp理论上特异的基因序列,然后,一方面优选潜在的特异性抗原基因序列87.1,利用原核表达技术,获得该基因的重组蛋白,再通过WB、iELISA评估重组蛋白87.1的特异性和反应原性,评价重组蛋白87.1是否可作为CCPP新的血清学诊断靶标;另一方面优选特异性基因序列92.1,作为靶序列设计引物92.1F/R,通过普通PCR方法评估该引物的特异性,评价序列92.1是否可作为CCPP新的核酸诊断靶标。途径二是以Mccp以及与其亲缘关系较近的支原体作为抗原筛选特异性单抗,经过小鼠免疫、杂交瘤细胞制备、细胞筛选、腹水制备纯化等单抗制备过程,优选单抗7H11作为指示抗体,通过建立阻断ELISA（bELISA）方法评估该单抗的特异性以及应用可能性,评价单抗7H11是否可作为CCPP新的血清学诊断分子。结果表明:重组蛋白87.1在WB、iELISA中与Mccp阳性血清可发生反应,而且87.1-iELSIA能够反映血清中Mccp抗体水平的变化,不与丝状支原体山羊亚种（Mmc）、山羊支原体山羊亚种（Mcc）阳性血清产生交叉反应,检测阴性血清时存在背景值偏高的现象,这表明重组蛋白87.1可作为CCPP新诊断靶标,但其使用条件还需优化。引物92.1F/R在普通PCR中,Mccp M1801、Mccp zly-14、Mccp M1601、Mccp zly-1309F作为模板时可扩增出509 bp的目的条带,无乳支原体（Ma）PG2、Mmc PG3、Mmc（原MmmLC）YG、绵羊肺炎支原体（Mo）Y98、Mcc CKid、牛支原体（Mb）08M、李奇氏支原体（Ml）PG50作为模板时未扩增出条带,这表明序列92.1可作为CCPP新分子诊断靶标。在bELISA体系中,单抗7H11可检测出Mccp阳性血清,与Mmc、Mcc、Mo、Ma、Ml、Mb阳性血清无交叉反应,但是在检测Mccp人工感染山羊的后期血清时,出现假阴性结果,所以7H11是否可作为CCPP新诊断分子候选,还有待进一步评估。
贺凌煜[8]（2020）在《抗肺炎支原体特异性单克隆抗体的研究》文中提出肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae,MP）是能引起呼吸道感染的病原体,大约40%的社区获得性肺炎由此引起,易感人群为老人和婴幼儿,且近年来耐药菌株也逐年增加,严重危害人体健康。肺炎支原体培养产量低,给其研究带来了困难。目前尚未研发成功MP疫苗。疫苗研发工艺中,抗原的定量是疫苗研发瓶颈技术,同时,肺炎支原体的检测也依赖高质量的抗体。[目 的]获得特异性和高效性的抗MP单克隆抗体,为疫苗抗原定量和快速检测提供有力工具。[方 法]1、肺炎支原体培养方法的优化及其抗原纯化:将MP在体外大量培养,通过对培养基、培养条件、离心等工艺进行优化,获得纯度和蛋白量高的MP菌体。保存于-80℃冰箱备用。2、抗肺炎支原体特异性单克隆抗体杂交瘤株的筛选:将纯化后的抗原免疫Balb/C小鼠得到的脾细胞与SP2/0细胞融合,对培养上清呈阳性的杂交瘤细胞进行有限稀释,挑选单一、可以分泌高效性抗体的细胞株冻存。3、抗肺炎支原体特异性单克隆抗体的纯化及其鉴定:筛选出可以分泌特异性好、OD值高的杂交瘤细胞株,进行小鼠腹水培养。采用亲和层系纯化抗体;用SDS-PAGE电泳检测其纯度、BCA法测定其抗体浓度、与其他种支原体进行交叉反应检测其特异性、效价、抗体亚型、生长抑制试验（GI）和代谢抑制试验（MI）检测其对抗原的抑制程度,挑选出具有高特异性和高效价的单克隆抗体。4、肺炎支原体单克隆抗体在双抗体夹心ELISA法中的运用:采用兔抗MP多克隆抗体包被ELISA板,封闭后分别添加裂解和未裂解MP抗原,洗板后加入纯化的MP单抗,再添加羊抗鼠酶标抗体。采用棋盘试验优选出最佳抗体、酶标抗体稀释度,并进行交叉反应检测,并通过调整降低交叉反应,最后建立完善的双抗体夹心ELISA检测体系。[结 果]采用自制马血清大量培养MP,MP形态菌落未发生变化且产量较高。在离心力条件优化中发现,当采用3000 rpm和25000 rpm差速离心时,可获得杂质含量较低纯度较高的MP菌体。在制备单克隆抗体时,将抗原免疫三次后获得脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,经过有限稀释多次筛选,共获得42株能够稳定分泌抗体的细胞株。经交叉反应得到9株无交叉反应的细胞株,抗体亚型为14B1、18F1、17A1为IgG2b,38A5、5B7 为 IgG1,14H1、14A5、14A1、18A2 为 IgG2a。抗体轻链均为 k 型。经过纯化,抗体纯度达标。经过效价检测以及生长代谢抑制试验选出4株效价较高的单克隆抗体。在双抗体夹心ELISA体系建立中,发现裂解后抗原抗体能够更好的结合。通过更换抗体、酶标稀释液,使交叉反应降低,在“S”型曲线中直线范围的R2可以达到0.98,可以运用于抗原定量。[结 论]1、优化肺炎支原体大量培养技术,可以降低成本获得大量MP;采用差速离心可以获得更高质量的MP抗原。肺炎支原体单克隆抗体制备中,成功筛选出9株高特异性抗体。2、经纯化鉴定,9株杂交瘤细胞均鉴定核实,且其中4株具有较高效价。3、利用得到的单克隆抗体,建立双抗体夹心ELISA体系后,可以检测稀释128倍后的抗原含量。
余怡凡[9]（2020）在《实验室指标对儿童重症肺炎支原体肺炎的预测价值研究》文中研究表明目的:通过比较实验室指标在儿童重症肺炎支原体肺炎（severe mycoplasma pneumoniae pneumonia,SMPP）及非重症肺炎支原体肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP）中的差异,探讨常见实验室指标在SMPP预测中的价值,为SMPP临床诊断标准的不断完善提供依据。方法:从2018年11月1日至2019年10月31日于吉林大第二医院儿科收治入院的MPP或重症肺炎患儿中筛选出符合诊断标准的MPP患儿48例,SMPP患儿43例。回顾性分析各组一般资料（性别、年龄）及其他临床指标,主要为实验室指标,包括:热峰、血沉（erythrocyte sedimentation,ESR）、C反应蛋白C-reactive protein,CRP)、降钙素原（Procalcitonin,PCT）、白细胞（White Blood Cell count,WBC）、血小板（platelet count,PLT）、血红蛋白（haemoglobin,HGB）、超敏C反应蛋白（high-sensitivity c-reactive protein,hsCRP）、谷丙转氨酶（Alanine transaminase,ALT）、谷草转氨酶（aspartate transaminase,AST）、前白蛋白（prealbumin,PA）、乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase,LDH）、α-羟丁酸脱氢酶（alpha-hydroxybutyrate dehydrogenase,HBDH）、D-二聚体（D-Dimer,D-D）、纤维蛋白原降解产物（Fibrinogen degradation product,FDP）、纤维蛋白原（fibrinogen,FIB）。应用SPSS26.0统计学软件进行分析,对数据进行预处理,对各计量资料行正态性检验及方差齐性检验,对于符合正态性及方差齐性的计量资料比较,采用均数±标准差,行t检验;其它计量资料采用中位数±四分位数表示,采用Wilcoxon秩和检验;对计数资料采用频数（频率）表示,比较采用c2检验。各检验以P<0.05为差异显着。通过各项比较筛选出有显着差异的变量。经logistic回归分析,得到SMPP的有预测价值的指标,绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线对SMPP预测效能进行评价。结果:经统计,在纳入研究的18个变量中,计数资料提示:男女性别比例在SMPP组及MPP组无明显差异。在计量资料中,两组间差异有统计学意义的结果包括:年龄、热峰、ESR、CRP、PCT、WBC、hsCRP、LDH、HBDH、D-D、FDB、FIB,这些指标SMPP组均高于MPP组,PA是唯一一个重症组显着低于轻症组的指标;将通过各项比较筛选出有显着差异的变量,运用二元Logistic回归分析SMPP预测指标,得出hsCRP、WBC、D-D三个预测指标,用ROC曲线进行评价,得出三个变量的截断值分别为5.000mg/L、9.165*109/L、1.0746ug/ml,三个指标截断值分别为5.000mg/L、9.165*109/L、1.0746ug/ml,ROC曲线下面积（area under curve,AUC）值分别为0.864、0.678、0.811,敏感度依次为0.977、0.465、0.721,特异度依次为0.646、0.917、0.813,联合诊断因子的AUC值在0.9以上。结论:hsCRP、WBC、D-D可作为SMPP的预测指标;hsCRP及D-D的ROC下面积均较大,hsCRP敏感度最高,D-D敏感度及特异度都较高,表现出了很好的诊断效能,hsCRP、WBC、D-D联合预测SMPP的效能很高。
张洁[10]（2019）在《Hsp 70、EF-Tu在绵羊肺炎支原体血清学诊断的评价和基于LAMP的分子诊断研究》文中提出目的:（1）开发一种简单快速有效,适用于基层的DNA纯化分离方法。（2）建立M.ovipneumoniae核酸扩增的简单快速检测技术。（3）解决M.ovipneumoniae感染的控制预防问题,探索并建立一种简单快速、经济的适用于基层的M.ovipneumoniae检测方法。方法:（1）制备超顺磁性Fe3O4 MCNCs及Fe3O4/SiO2 MCNCs,并用MCNCs从不同样本中提取DNA,包括兔全血,兔冷冻血液和感染M.ovipneumoniae的肺组织等,对其纯度、完整性及产量进行验证。（2）针对M.ovipneumoniae heat shock protein 70（Hsp 70）和elongation factor Tu（EF-Tu）基因各设计一套特异性引物,利用环介导等温扩增（LAMP）技术进行核酸扩增,联合侧向流动试纸条技术（LFD）实现核酸扩增可目视化检测,建立M.ovipneumoniae LAMP-LFD快速检测方法,并对其特异性、敏感性及临床应用进行检测。（3）构建M.ovipneumoniae EF-Tu、Hsp 70基因原核表达载体,诱导纯化蛋白并用Western-blot法分析其免疫原性,并以Hsp 70和EF-Tu蛋白为诊断抗原,建立M.ovipneumoniae间接ELISA检测方法,并评估其特异性和灵敏性。结果:（1）制备了粒径大小为150-200 nm的Fe3O4 MCNCs,Fe3O4/SiO2 MCNCs粒径大小为195-300 nm,SiO2包裹的厚度约为25 nm,而且SiO2层完整包裹了Fe3O4 MCNCs,呈单分散状态;VSM检测Fe3O4 MCNCs饱和磁化强度（Ms）为46.2 emu/g,Fe3O4/SiO2 MCNCs测量显示饱和磁化强度（Ms）为33.6 emu/g。MCNCs用于各样本中提取的DNA条带完整,没有明显断裂,浓度和纯度良好,提取效率高。（2）Hsp 70基因LAMP在62℃反应70 min,即可特异性检测M.ovipneumoniae的存在;EF-Tu基因LAMP在62℃反应80 min,即可特异性检测M.ovipneumoniae的存在。M.ovipneumoniae Hsp 70 LAMP-LFD检测方法与病原学检测方法总符合率为94%;而建立的M.ovipneumoniae EF-Tu LAMP-LFD检测方法与病原学检测方法的总符合率为80%,说明建立的M.ovipneumoniae Hsp 70 LAMP-LFD检测方法灵敏度、与病原学检测方法的符合率都高于M.ovipneumoniae EF-Tu LAMP-LFD检测方法。（3）构建的EF-Tu间接ELISA反应条件优化显示,蛋白包被浓度为5μg/mL,一抗最佳稀释浓度为1:50,最佳孵育时间为90 min,封闭液为5%脱脂奶粉,二抗最佳稀释倍数为1:8 000,最佳孵育时间为90 min,特异性与灵敏性良好;该方法与间接血凝法对100份血清进行检测,两者符合率为81%;Hsp 70间接ELISA反应条件优化显示,蛋白包被浓度为0.25μg/mL,一抗最佳稀释浓度为1:50,最佳孵育时间为90 min,封闭液为5%脱脂奶粉,二抗最佳稀释倍数为1:8 000,最佳孵育时间为60 min,特异性与灵敏性良好;该方法与间接血凝法对100份血清进行检测,两者符合率为90%。结论:（1）建立的基于MCNCs提取核酸分离纯化方法,简单快速,不使用蛋白酶K或有毒化合物,为未来核酸的自动化提取,同时也为基层农牧区的核酸快速提取提供有效手段。（2）本研究建立的LAMP-LFD检测M.ovipneumoniae的方法特异性强、灵敏度高并且操作简便快捷等优点,为羊感染M.ovipneumoniae的预防和诊断提供了技术保障。（3）建立的M.ovipneumoniae间接ELISA检测方法对M.ovipneumoniae血清学检测提供快速有效的筛查手段,也可大面积推广使用。
二、肺炎支原体血清学诊断方法的比较研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肺炎支原体血清学诊断方法的比较研究（论文提纲范文）
（1）基于比较基因组方法挖掘Mo特异性诊断靶标（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究背景和目的意义 |
| 2 绵羊肺炎支原体研究进展 |
| 2.1 绵羊肺炎支原体概述 |
| 2.2 病原学 |
| 2.3 诊断 |
| 2.4 诊断技术现状与问题 |
| 3 比较基因组序列信息的现状 |
| 4 结语 |
| 5 研究内容 |
| 第二章 试验部分 |
| 试验一 比较基因组筛选绵羊肺炎支原体特异性蛋白编码基因 |
| 1 方法 |
| 1.1 Mo种间特异性CDS序列筛选 |
| 1.2 Mo种内特异性CDS序列筛选 |
| 1.3 Mo种内保守区域的筛选 |
| 2 结果 |
| 2.1 Mo种间特异性序列筛选 |
| 2.2 Mo种内特异性序列筛选 |
| 2.3 Mo种内保守区域的筛选 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 试验二 绵羊肺炎支原体特异性分子检测靶标筛选、鉴定及应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 靶序列筛选 |
| 2.2 引物设计 |
| 2.3 引物筛选 |
| 2.4 最优引物728 2F/2R特异性评估 |
| 2.5 最优引物敏感性评估 |
| 2.6 临床样本检测 |
| 2.7 特异性比较 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 试验三 绵羊肺炎支原体特异性抗原筛选和鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Mo特异性序列筛选 |
| 2.2 序列结构功能分析 |
| 2.3 重组质粒鉴定 |
| 2.4 诱导表达结果的SDS-PAGE分析与鉴定 |
| 2.5 重组蛋白的纯化 |
| 2.6 重组蛋白浓缩与浓度测定 |
| 2.7 重组蛋白Western Blot分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录一:主要试剂的配制 |
| 附录二:核酸样品盘菌株信息 |
| 附录三:特异性CDS序列 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在校期间主要参与的研究项目 |
| 硕士期间参与和发表的主要论文 |
| 获奖情况 |
| 在学期间申请的专利 |
| 附件 |
（2）牛支原体膜蛋白DnaK、L-LDH和P48免疫原性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 M.bovis概述 |
| 1.1.1 M.bovis的发现与流行病学 |
| 1.1.2 Mb AD的临床症状与病理变化 |
| 1.1.3 M.bovis疾病的诊断方法 |
| 1.2 M.bovis疾病的防控与疫苗研究进展 |
| 1.2.1 M.bovis灭活苗 |
| 1.2.2 M.bovis弱毒苗 |
| 1.2.3 M.bovis亚单位苗 |
| 1.3 M.bovis LAMPs研究进展 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 M.bovis免疫相关膜蛋白的筛选 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 |
| 2.1.4 主要溶液及配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 M.bovis菌株的复苏培养和收集 |
| 2.2.2 M.bovis LAMPs的提取及蛋白浓度测定 |
| 2.2.3 免疫反应原性膜蛋白的分组及鉴定 |
| 2.2.4 质谱分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 M.bovis LAMPs的浓度测定及分组 |
| 2.3.2 免疫反应原性LAMPs的鉴定 |
| 2.3.3 B组质谱结果 |
| 2.4 小结 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 M.bovis LAMPs中 DnaK,L-LDH和 P48 蛋白的原核表达与免疫反应原性鉴定分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株、血清和质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器与设备 |
| 3.1.4 主要溶液及配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 M.bovis基因组的提取及dnaK、p48 基因的克隆 |
| 3.2.2 p ET-32a(+)-MbdnaK、p ET-32a(+)-Mbl-ldh和 p ET-32a(+)-Mbp48 重组质粒的构建 |
| 3.2.3 M.bovis dnaK、l-ldh及 p48 基因的原核表达及纯化 |
| 3.2.4 M.bovis DnaK、L-LDH及 P48 重组蛋白的免疫反应原性鉴定 |
| 3.2.5 基于ELISA方法的3 个重组蛋白的免疫反应原性分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 M.bovis dnaK、p48 基因的克隆及重组质粒的鉴定 |
| 3.3.2 M.bovis dnaK、l-ldh及 p48 基因的原核表达及纯化 |
| 3.3.3 M.bovis DnaK、L-LDH及 P48 重组蛋白的免疫反应原性鉴定 |
| 3.3.4 M.bovis DnaK、L-LDH及 P48 重组蛋白的免疫反应原性分析 |
| 3.4 小结 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 M.bovis LAMPs中 DnaK,L-LDH和 P48 蛋白的免疫原性研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 重组蛋白和实验动物 |
| 4.1.2 主要试剂与材料 |
| 4.1.3 主要仪器与设备 |
| 4.1.4 主要溶液及配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 实验动物分组及免疫程序 |
| 4.2.2 血清抗体水平检测 |
| 4.2.3 血清抗体亚类检测 |
| 4.2.4 小鼠脾脏淋巴细胞分离及脾脏淋巴细胞亚群检测 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 血清抗体水平检测 |
| 4.3.2 血清抗体亚类检测 |
| 4.3.3 小鼠脾脏淋巴细胞亚群检测 |
| 4.4 小结 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）基于TLR-2/MyD88信号通路探讨养阴清肺汤加味调控SMPP炎症机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 小鼠SMPP模型的建立与优化 |
| (前言) |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 基于TLR-2/MyD88信号通路探讨养阴清肺汤加味调控SMPP炎症机制研究 |
| (前言) |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 儿童重症肺炎支原体肺炎发病机制及中西医治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在校期间科研成绩 |
| 致谢 |
（4）规模化羊场肺炎支原体流行病学调查及分离鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 支原体简述 |
| 1.1.1 支原体研究起源 |
| 1.1.2 支原体的分布与危害 |
| 1.1.3 动物支原体 |
| 1.2 羊支原体肺炎 |
| 1.2.1 绵羊肺炎支原体 |
| 1.2.2 山羊传染性胸膜肺炎 |
| 1.2.3 丝状支原体山羊亚种 |
| 1.3 羊支原体肺炎流行病学 |
| 1.4 羊支原体肺炎的临床表现及剖检变化 |
| 1.4.1 临床表现 |
| 1.4.2 支原体肺炎的病理变化 |
| 1.4.3 支原体肺炎的病料采集和处理 |
| 1.5 羊支原体的检测技术 |
| 1.5.1 羊支原体感染的血清学诊断技术 |
| 1.5.2 羊支原体感染的PCR诊断技术 |
| 1.5.3 羊支原体分离培养 |
| 1.6 防治措施 |
| 1.6.1 药物治疗 |
| 1.6.2 疫苗接种 |
| 1.7 研究目的及意义 |
| 第2章 规模化羊场支原体感染的血清学流行病学调查 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 血样采集与处理 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器表 |
| 2.1.3 绵羊支原体肺炎、丝状支原体山羊亚种、山羊支原体肺炎的抗体 ELISA检测 |
| 2.1.4 具体操作 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 绵羊支原体肺炎ELISA检测结果 |
| 2.2.2 丝状支原体山羊亚种ELISA检测结果 |
| 2.2.3 山羊支原体肺炎ELISA检测结果 |
| 2.2.4 混合感染情况 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 规模化羊场绵羊肺炎支原体感染的分子流行病学调查 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 样品来源 |
| 3.1.2 主要试剂与仪器表 |
| 3.1.3 试剂配制 |
| 3.1.4 样品DNA的提取 |
| 3.1.5 PCR检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 规模化羊场绵羊肺炎支原体的分离鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 样品来源 |
| 4.1.2 主要试剂与仪器 |
| 4.1.3 试剂配制 |
| 4.1.4 参考菌株序列 |
| 4.1.5 样品处理及分离纯化 |
| 4.1.6 形态学观察 |
| 4.1.7 样品DNA提取 |
| 4.1.8 PCR鉴定 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 分离株瑞氏染色 |
| 4.2.2 菌落形态学鉴定结果 |
| 4.2.3 PCR 鉴定结果 |
| 4.2.4 序列及系统进化树分析结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）儿童难治性肺炎支原体肺炎血清及肺泡灌洗液细胞因子的研究及其临床意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 一、综述 肺炎支原体肺炎的发病机制、诊疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 二、在学校期间科研成绩 |
| 三、致谢 |
| 四、个人简介 |
（6）肺炎支原体P116段特异性蛋白的制备与多克隆抗体的研究及肺炎支原体小鼠模型的初步研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 肺炎支原体标准株(ATCC,15531)的分离培养 |
| 3.2 P116-FP2、P116-FP3、P116-FP4基因的鉴定 |
| 3.3 构建的P116-FP2、P116-FP3、P116-FP4重组质粒鉴定 |
| 3.4 目的蛋白表达及纯化 |
| 3.5 P116-FP2、P116-FP3、P116-FP4蛋白的Western blot检测 |
| 3.6 P116-FP2、P116-FP3、P116-FP4蛋白多克隆抗体效价检测 |
| 3.7 P116-FP2、P116-FP3、P116-FP4蛋白含量测定 |
| 3.8 P116-FP2、P116-FP3、P116-FP4蛋白为包被抗原的血清学检测体系的建立 |
| 3.9 P116-FP2多克隆抗体免疫荧光结果 |
| 3.10 感染肺炎支原体小鼠肺泡灌洗液的鉴定 |
| 3.11 感染肺炎支原体小鼠肺组织的病理变化 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 肺炎支原体黏附过程的研究现状及对细胞粘附作用的研究 |
| 参考文献 |
（7）山羊传染性胸膜肺炎新诊断分子的筛选与评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 CCPP研究进展 |
| 1.2.1 病原学 |
| 1.2.2 流行病学 |
| 1.2.3 诊断 |
| 1.2.4 防治 |
| 1.3 诊断技术现状与问题 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 第二章 山羊支原体山羊肺炎亚种特异性抗原筛选和评价 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试剂与仪器 |
| 2.1.2 细菌、载体与血清 |
| 2.1.3 Mccp特异性序列筛选 |
| 2.1.4 序列结构功能分析 |
| 2.1.5 重组质粒构建与鉴定 |
| 2.1.6 原核表达条件优化 |
| 2.1.7 WB评估反应原性以及特异性 |
| 2.1.8 重组蛋白纯化 |
| 2.1.9 iELISA评估反应原性以及特异性 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 Mccp特异性序列筛选 |
| 2.2.2 序列结构功能分析 |
| 2.2.3 重组质粒鉴定 |
| 2.2.4 重组蛋白表达 |
| 2.2.5 WB评估反应原性以及特异性 |
| 2.2.6 重组蛋白纯化 |
| 2.2.7 iELISA评估反应原性以及特异性 |
| 2.3 结论与讨论 |
| 第三章 山羊支原体山羊肺炎亚种特异性核酸筛选和评价 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试剂与仪器 |
| 3.1.2 菌株、临床样本DNA |
| 3.1.3 DNA样本准备 |
| 3.1.4 靶序列筛选 |
| 3.1.5 引物设计 |
| 3.1.6 引物特异性评估 |
| 3.1.7 临床样本检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 DNA样本 |
| 3.2.2 靶序列筛选 |
| 3.2.3 引物设计 |
| 3.2.4 引物特异性评估 |
| 3.2.5 临床样本检测 |
| 3.3 结论与讨论 |
| 第四章 山羊支原体山羊肺炎亚种特异性单抗筛选和评价 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试剂与仪器 |
| 4.1.2 菌株、血清、动物和细胞 |
| 4.1.3 筛选抗原和免疫抗原准备 |
| 4.1.4 小鼠免疫 |
| 4.1.5 间接ELISA建立 |
| 4.1.6 小鼠筛选 |
| 4.1.7 细胞融合 |
| 4.1.8 细胞筛选 |
| 4.1.9 单抗制备 |
| 4.1.10 单抗质检 |
| 4.1.11 单抗特异性评估 |
| 4.1.12 单抗应用 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 免疫抗原和筛选抗原准备 |
| 4.2.2 小鼠免疫 |
| 4.2.3 小鼠筛选 |
| 4.2.4 细胞筛选 |
| 4.2.5 单抗制备 |
| 4.2.6 单抗质检 |
| 4.2.7 单抗特异性评估 |
| 4.2.8 单抗应用 |
| 4.3 结论与讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 附录B |
| 附录C |
| 附录D |
| 附录E |
| 附录F |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）抗肺炎支原体特异性单克隆抗体的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 菌株、抗原、抗体 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 耗材 |
| 1.4 仪器及设备 |
| 1.5 培养基配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 菌体的制备 |
| 2.2 单克隆抗体的制备 |
| 2.3. 肺炎支原体单克隆抗体的纯化及鉴定 |
| 2.4. 肺炎支原体单克隆抗体在ELISA体系中的运用 |
| 结果 |
| 1. 肺炎支原体大量培养条件的优化 |
| 2. 肺炎支原体单克隆抗体的制备 |
| 3. 肺炎支原体单克隆抗体的纯化及鉴定 |
| 4. 肺炎支原体单克隆抗体在ELISA体系中的运用 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 肺炎支原体检测技术的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（9）实验室指标对儿童重症肺炎支原体肺炎的预测价值研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 综述:儿童SMPP诊断现状回顾 |
| 1.2.1 SMPP的发病机制 |
| 1.2.2 儿童SMPP的诊断 |
| 1.2.2.1 MPP的诊断 |
| 1.2.2.2 MPP严重程度的判断 |
| 1.2.3 结语 |
| 第2章 资料及方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 纳入标准 |
| 2.3 排除标准 |
| 2.4 评价指标 |
| 2.5 统计方法 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 SMPP组及MPP组一般资料(年龄、性别) |
| 3.2 SMPP组及MPP组各统计指标比较 |
| 3.2.1 SMPP及 MPP组间差异性比较 |
| 3.2.2 二元LOGISTIC回归分析 |
| 3.2.3 各指标ROC曲线分析 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 MPP的流行病学特点及SMPP发病机制简述 |
| 4.2 有预测价值的实验室指标在SMPP组及MPP组间的差异 |
| 4.2.1 WBC |
| 4.2.2 HSCRP |
| 4.2.3 D-D |
| 4.2.4 WBC、HSCRP、D-D的联合预测 |
| 4.3 其它相关因素分析 |
| 4.3.1 LDH |
| 4.3.2 热峰 |
| 4.3.3 其它 |
| 4.4 结语 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（10）Hsp 70、EF-Tu在绵羊肺炎支原体血清学诊断的评价和基于LAMP的分子诊断研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 绵羊肺炎支原体的研究概况 |
| 1.1 致病机理 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 临床特征 |
| 2 绵羊肺炎支原体诊断技术 |
| 2.1 传统的病原学诊断 |
| 2.2 分子生物学方法 |
| 2.3 免疫学诊断方法 |
| 3 磁性纳米材料的研究进展 |
| 3.1 制备方法 |
| 3.2 磁性纳米材料的表面修饰 |
| 3.3 磁性纳米材料的应用 |
| 4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 超顺磁性纳米簇的合成及其用于DNA提取的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Fe_3O_4 MCNCs和 Fe_3O_4/SiO_2 MCNCs的表征结果 |
| 2.2 Fe_3O_4 MCNCs提取新鲜兔血液基因组DNA |
| 2.3 通过Fe_3O_4 MCNCs提取冷冻血样与新鲜血液样本基因组DNA比较 |
| 2.4 Fe_3O_4/SiO_2 MCNCs和 Fe_3O_4 MCNCs从新鲜兔血液中提取基因组DNA比较 |
| 2.5 用Fe_3O_4/SiO_2 MCNCs从大肠杆菌中提取DNA |
| 2.6 Fe_3O_4/SiO_2 MCNCs从金黄色葡萄球菌中提取DNA |
| 2.7 Fe_3O_4/SiO_2 MCNCs从感染绵羊肺炎支原体的肺组织中提取基因组DNA |
| 2.8 PCR检测 |
| 3 讨论 |
| 第三章 绵羊肺炎支原体环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 LAMP检测方法的条件优化 |
| 2.2 LAMP-LFD检测方法的建立 |
| 2.3 LAMP-LFD检测方法的特异性和重复性试验 |
| 2.4 LAMP-LFD灵敏度分析 |
| 2.5 临床应用性检测 |
| 3 讨论 |
| 第四章 绵羊肺炎支原体EF-Tu、Hsp70 蛋白间接ELISA方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 pMD18-T-EF-Tu和 pMD18-T-Hsp70 的鉴定 |
| 2.2 pET-28a-EF-Tu和 pET-28a-Hsp70 的构建与鉴定 |
| 2.3 IPTG最佳诱导条件以及表达形式的确定 |
| 2.4 重组蛋白的纯化 |
| 2.5 蛋白浓度测定 |
| 2.6 重组蛋白Western-blot分析 |
| 2.7 间接ELISA方法反应条件的优化 |
| 2.8 封闭液的确定以及封闭条件的确定 |
| 2.9 一抗最佳孵育时间的确定 |
| 2.10 二抗最佳稀释倍数及孵育时间的确定 |
| 2.11 阴阳判定临界值标准的确定 |
| 2.12 特异性试验 |
| 2.13 敏感性试验 |
| 2.14 重复性试验 |
| 2.15 临床样本检测 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
四、肺炎支原体血清学诊断方法的比较研究（论文参考文献）
- [1]基于比较基因组方法挖掘Mo特异性诊断靶标[D]. 陈芙. 石河子大学, 2021
- [2]牛支原体膜蛋白DnaK、L-LDH和P48免疫原性鉴定[D]. 刘桐. 中国农业科学院, 2021(09)
- [3]基于TLR-2/MyD88信号通路探讨养阴清肺汤加味调控SMPP炎症机制研究[D]. 齐兆东. 辽宁中医药大学, 2021(02)
- [4]规模化羊场肺炎支原体流行病学调查及分离鉴定[D]. 王雅雯. 塔里木大学, 2021(11)
- [5]儿童难治性肺炎支原体肺炎血清及肺泡灌洗液细胞因子的研究及其临床意义[D]. 郑肖肖. 沈阳医学院, 2021(10)
- [6]肺炎支原体P116段特异性蛋白的制备与多克隆抗体的研究及肺炎支原体小鼠模型的初步研究[D]. 林康. 安徽医科大学, 2021(01)
- [7]山羊传染性胸膜肺炎新诊断分子的筛选与评价[D]. 吴娅琴. 中国农业科学院, 2020
- [8]抗肺炎支原体特异性单克隆抗体的研究[D]. 贺凌煜. 昆明医科大学, 2020
- [9]实验室指标对儿童重症肺炎支原体肺炎的预测价值研究[D]. 余怡凡. 吉林大学, 2020(08)
- [10]Hsp 70、EF-Tu在绵羊肺炎支原体血清学诊断的评价和基于LAMP的分子诊断研究[D]. 张洁. 石河子大学, 2019(01)