一、蜘蛛多肽神经毒素研究新进展（论文文献综述）
黄立鑫[1]（2019）在《拟环纹豹蛛毒素鉴定与神经毒素PPTX-22的作用机制研究》文中指出蜘蛛是一类有超过3亿年进化历史的类群,其进化的成功很大程度上归功于对蛛丝的巧妙应用和毒液的成功进化。除捕食性甲虫外,蜘蛛是最丰富的陆地捕食者。蜘蛛主要捕食节肢动物,部分蜘蛛也能捕食小型的脊椎动物,如老鼠、鸟类、蜥蜴等。毒液是蜘蛛进行捕食的主要武器,大部分蜘蛛都具有成对的毒腺以产生毒液。蜘蛛毒液是由多种化合物组成的混合物,根据对蜘蛛毒液的化学成分和药理多样性的总结,可以将其分为六大类:小分子化合物类、酰基多胺类、线性多肽、富含二硫键的多肽毒素、高分子量蛋白质类毒素以及酶类。富含二硫键的多肽毒素是大多数蜘蛛毒液中的主要毒性物质,毒素是蜘蛛进行捕食或防御的主要活性物质。大多数富含二硫键的蜘蛛毒素作用于外周神经肌肉接头或昆虫中枢神经系统的突触处,靶向突触前离子通道或突触后受体。蜘蛛神经毒素在昆虫中的作用靶标主要包括电压门控钙通道、电压门控钠通道、电压门控钾通道和谷氨酸受体,这些多肽毒素可以减弱昆虫神经系统功能,导致弛缓性麻痹,或过度激活神经系统功能,引起惊厥性麻痹,最终使受到攻击的猎物迅速丧失活动能力。本文以害虫天敌拟环纹豹蛛为研究对象,系统地分析了其毒液的组成,并对各种类型的毒素进行了总结。为了深入研究拟环纹豹蛛神经毒素的功能,本论文建立了富含二硫键的多肽毒素的表达和纯化系统,成功地表达并纯化了包含PPTX-22在内的多个神经毒素,并对PPTX-22的杀虫活性和作用机制进行了研究。一、拟环纹豹蛛毒素鉴定与分析通过拟环纹豹蛛毒腺转录组测序,共得到了 75,980个转录本。根据序列比对及注释信息分析,共鉴定出43个富含二硫键的多肽毒素。通过结构域分析,发现其中包括38个假定的神经毒素和5个假定的非神经毒性毒素。根据半胱氨酸排列方式、系统发育和结构域分析,将32种神经毒素分为6个家族;而另外的6种神经毒素,未能进行归类,命名为未能分类的类群。根据基因组结果,我们对拟环纹豹蛛神经毒素基因的基因结构进行了分析,结果显示,除Family F中神经毒素的成熟肽序列含有2-3个外显子,剩余5个家族中的神经毒素的成熟肽序列均只含有1个外显子。除了富含二硫键的多肽毒素,拟环纹豹蛛的毒液中还含有一些其它的组分,主要有虾红素样金属蛋白酶、Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂、毒液过敏原和透明质酸等。为了探索拟环纹豹蛛毒素相关基因的组织分布和表达,我们选取了毒腺、脑和脂肪体用于组织表达谱分析。结果显示,大多数假定的神经毒素基因主要在毒腺中特异性表达或者特异高表达。此外,胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、毒液过敏原和透明质酸酶基因也在毒腺中特异性表达或者特异高表达。二、富含二硫键多肽毒素体外表达和纯化系统的建立为了建立适合富含二硫键的蜘蛛毒素的表达系统,本研究选取了的昆虫杆状病毒表达系统的载体pFastBacTM1、毕赤酵母表达系统的载体pPICZ A和pPICZα A、大肠杆菌表达系统的表达载体pET32a和pLicC-MBP。采用真核表达载体pFastBacTM1和pPICZα A表达毒素的成功率比较低,无法满足后续实验需求。采用真核表达载体pPICZA表达毒素成功率比较高,但是由于非目的条带较多,会影响后续纯化,也无法满足后续实验需求。采用原核表达载体pET32a表达毒素成功率比较高,但是由于融合蛋白不能正确折叠,多聚体严重,因此该载体也不适用于后续实验。采用原核表达载体pLicC-MBP表达毒素成功率比较高,同时目的条带比较单一,利于后期纯化,而且无二聚体。因此,在后续实验中,将采用原核表达载体pLicC-MBP表达富含二硫键的多肽毒素。采用HisTrap HP层析柱,可以得到纯度较高的融合蛋白,融合标签MBP的分子量约为42 kDa,而目的毒素的分子量通常小于10 kDa,因此需要利用TEV蛋白酶将融合标签切除。利用HiPrep 26/10 Desalting脱盐柱,可以对融合蛋白进行置换缓冲液的处理,以提供TEV蛋白酶的酶切条件。采用超滤管、分子筛、HisTrap Excel层析柱、MBPTrap HP层析柱等方法,均无法有效的将融合标签去除,无法得到较高纯度的重组毒素。最终,采用层析柱MBPTrap HP先除去酶切液中大部分的融合标签,再采用层析柱HisTrap HP将流穿液中剩余的融合标签除去,采用这种方法可以得到满足后续实验需要纯度的重组毒素。以此为基础,重组毒素的纯化系统构建成功。三、神经毒素PPTX-22的作用机制研究拟环纹豹蛛是亚洲稻区农业害虫的优势天敌,主要捕食稻飞虱、稻叶蝉等害虫,其中毒素在拟环纹豹蛛捕食过程中起到非常重要的作用。PPTX-22是拟环纹豹蛛毒液中的一种富含二硫键的神经毒素,含有109个氨基酸残基,主要由信号肽、前肽和成熟肽组成,成熟肽含有69个氨基酸残基,其中有10个半胱氨酸形成的5个二硫键。采用原核表达载体pLicC-MBP成功表达PPTX-22,切除融合蛋白后,重组毒素的分子量约为7.78 kDa。重组毒素PPTX-22可以引起褐飞虱麻痹甚至死亡,其2 h后的PD50为1402 pmol/g,95%置信区间分别为1297-1515 pmol/g,R2为0.9795。钙离子成像实验表明,无论细胞外液中是否含有钙离子,PPTX-22均能引起细胞内钙离子浓度增加;此外,在阻断细胞膜Ca2+通道的情况下,PPTX-22同样可以引起细胞内Ca2+浓度增加,说明该毒素不作用于细胞膜上的钙离子通道。进一步的实验结果表明,用IP3受体的抑制剂2-APB处理细胞后,PPTX-22依然可以引起细胞内钙离子浓度增加;而用高浓度的鱼尼丁处理细胞、阻断鱼尼丁受体后,PPTX-22不能引起细胞内钙离子浓度增加。结果表明,PPTX-22能够激活昆虫鱼尼丁受体,引起细胞内钙离子浓度增加。该研究通过拟环纹豹蛛毒腺进行转录组测序,获得了比较完整的毒素序列信息,在建立富含二硫键多肽毒素表达和纯化系统的基础上,获得了高纯度的重组毒素PPTX-22,并明确了该毒素的分子靶标为鱼尼丁受体,为第一个作用于鱼尼丁受体的生物毒素。拟环纹豹蛛是重要的农业害虫天敌,在农业生态环境中起着重要的作用,其毒素是重要的生物杀虫资源,可成为害虫防治的新资源。
吴茜[2]（2018）在《动物多肽毒素的异源表达纯化与活性研究》文中提出动物多肽毒素有很多优良的性质,其作用范围广泛,对血液系统、神经系统、免疫系统以及细菌真菌均有不同的作用,是开发新型药物和新型杀虫剂抗生素的重要资源库。其中,富含二硫键的多肽毒素多样性丰富,可以特异性地作用并调节电压门控离子通道,从而阻断或抑制细胞电信号的传导,因而有着极其重要的研究价值。针对动物毒素的异源表达和纯化,本文开展了以下两个工作,为深入研究有毒动物毒素的结构功能以及研发新型多肽类药物奠定了基础。1、蜈蚣毒素κ-SLPTX-Ssm1b的表达纯化及活性研究。κ-SLPTX-Ssm1b是蜈蚣S colopendra subspinipes mutilans完整转录产物所构建的cDNA文库中与电压敏感钾离子通道抑制剂κ-SLPTX-Ssm1a同源的多肽。且两者含三对位置相同的二硫键,因此可能存在类似的空间结构和相似的生理活性。本实验利用pET-43-His-SUMO原核表达载体,通过E.coli SHuffleTM菌种自动诱导表达重组蛋白,随后利用镍柱和RP-HPLC纯化以及Ulp1激酶酶切获得目的蛋白,最终通过MALDI-TOF质谱鉴定其分子量为5532.1870 Da,与理论值相符。本实验中该毒素多肽产量为1 mg/L,电生理活性显示其对大鼠rKv1.3和rKv1.7均无明显作用。2、蚂蚁毒素U1-PONTX-Ae1d/e/g的表达纯化。通过对蚂蚁Anochetus毒液粗毒的分离,确定了另外4种与钙通道活性毒素U1-PONTX-Ae1a毒素序列同源性很高的毒素序列（U1-PONTX-Ae1d/e/f/g）。它们含有与U1-PONTX-Ae1a相同位置的两对二硫键,因此可能有相似的活性。在本实验中,利用异源表达的方式获取U1-PONTX-Ae1d/e/f/g毒素。成功分离纯化得到U1-PONTX-Ae1d/e/g三条毒素,其产量均为0.3 mg/L左右,为进一步的活性检测和药物筛选奠定了基础。
彭晨嘉[3]（2017）在《HNTX-Ⅰ对中电导钙激活钾通道的作用机制研究》文中研究说明中电导钙激活钾通道（IK,KCa3.1）在人体内广泛分布,IK通道的激活能够产生缓解哮喘和降低血压的效果,近年来许多研究表明IK通道的数量、结构及功能的改变和异常与许多疾病甚至恶性肿瘤有关,在许多恶性肿瘤中IK通道会异常地高表达,并且与肿瘤的发生、侵袭和转移相关。在肿瘤研究中,IK通道的异常表达可作为一个重要的诊断指标和参数,因此该通道有可能是某些癌症和恶性肿瘤的治疗靶点。海南捕鸟蛛毒素-Ⅰ（HNTX-Ⅰ）是海南捕鸟蛛粗毒中丰度最高的一种神经毒素,其分子质量是3608.1 Da,含有33个氨基酸残基,序列为ECKGFGKSCVPGKNECCSGYACNS RDKWCKVLL,其中6个半胱氨酸（Cys）中有两个相邻的半胱氨酸,构成三对二硫键,配对方式是Ⅰ-Ⅳ、Ⅱ-Ⅴ、Ⅲ-Ⅵ,三股反向平行的β折叠构成非常典型的抑制胱氨酸结（Inhibitor Cystine Knot motif,ICK模体）。HNTX-Ⅰ是首次发现的IK通道的多肽类激活剂,其野生型HNTX-Ⅰ的EC50值约为26 μM。研究HNTX-Ⅰ对IK通道的作用机制,有助于寻找活性更强、选择性更好,安全性更高的IK通道激活剂。通过分子动力学模拟与分子对接技术找到和IK通道上的关键结合位点对应的HNTX-Ⅰ的关键氨基酸残基进行突变,IK通道的第54位色氨酸是关键结合位点之一,设计IK通道W54对应的五种毒素突变体（HNTX-I-F5A、HNTX-I-S8F、HNTX-I-S8A、HNTX-I-K13F、HNTX-I-W28A）,并通过原核表达和固相化学合成两种方法来表达和合成毒素突变体,研究W54与HNTX-I相应残基的疏水相互作用,实验结果显示,HNTX-Ⅰ 的突变体HNTX-I-S8F、HNTX-I-S8A、HNTX-I-K13F、HNTX-I-W28A能激活IK通道,其EC50值分别为24.10μM,26.51 μM,23.64 μM,27.02 μM与野生型HNTX-Ⅰ 的EC50值25.69μM无明显差异,而HNTX-Ⅰ-F5A对IK通道无明显激活作用,由此可知HNTX-Ⅰ的第5位的苯丙氨酸残基是对IK通道激活作用的关键作用残基;IK通道第54位的色氨酸残基为疏水性氨基酸,HNTX-Ⅰ的第5位的苯丙氨酸残基为疏水性氨基酸都具有疏水性,这两种氨基酸残基的侧链疏水性非常强,因此它们之间存在着一种非共价的相互作用,即疏水相互作用。
黄亚洲[4]（2017）在《白额巨蟹蛛毒液的生理生化研究》文中研究说明白额巨蟹蛛是广泛分布在世界各地的一种以捕食昆虫为生的蜘蛛。通过对毒液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验,除鉴定到大量多肽外,我们还鉴定到了其蛋白成分主要集中于35 kDa,50kDa,70 kDa等区域。除此之外,我们运用反相高效液相色谱技术和基质辅助激光解吸附飞行时间质谱技术,在蜘蛛粗毒中检测到了 164个峰,去掉重复出现的峰,我们从白额巨蟹蛛毒液中鉴定到了 137种分子量不同的多肽成分,这显示了白额巨蟹蛛毒液中毒素多肽的巨大多样性。实验结果显示该毒液中的多肽呈现单峰分布,大约90%的多肽分布在3000-4500 Da的范围内,而这种分布与很多目前已经鉴定到的蜘蛛多肽毒素的典型双峰分布不同。通过膜片钳实验技术,我们发现白额巨蟹蛛毒液对美洲大蠊中枢神经系统背侧不成对中间神经元（DUM）上的钠离子通道电流有强烈的抑制作用,其IC50值为6.25±0.02μg/mL（n=5）。100μg/mL能够完全抑制美洲大蠊中枢神经系统背侧不成对中间神经元上的钠电流,但对大鼠背根神经节上的电压门控钠通道电流仅能抑制27.0%±3.7%（n=5）。10 μg/mL毒液使DUM细胞上的最大电流的激活电压向去极化方向漂移了 10mV,但没有改变通道的激活和反转电压。美洲大蠊胸腔注射毒液的急性毒性实验表明:低剂量的白额巨蟹蛛粗毒能够使美洲大蠊产生弛缓性瘫痪,无力以及运动失调等一系列神经毒症状,高剂量的白额巨蟹蛛粗毒能够使美洲大蠊致死,其半致死剂量为28.18μg/g。本研究的第二部分内容是研究了从白额巨蟹蛛毒液中分离纯化的HpTx-I与电压门控钠通道亚型1.7的相互作用。MALDI-TOFTOF质谱鉴定相对分子质量为3921.5425 Da;HpTx-I序列全长为33个氨基酸残基,经过对二级质谱结果分析并进行搜库比对测得HpTx-I的序列为 DCGTIWHYCGTDQSECCEGWKCSRQLCKYVIDW。通过膜片钳实验我们检测了该毒素多肽对四种钠通道亚型的影响,这个多肽对钠通道亚型1.7作用最强（IC50=0.282±0.035 μM）,与rNav1.3和rNav1.4相比作用效果要强20倍,对hNav1.5作用较强（IC50=1.54±0.12 M）。实验结果表明HpTx-I虽然能抑制hNav1.7通道电流失活,但是对其通道的稳态失活并没有产生影响。0.5 μM HpTx-I毒素处理细胞能使hNav1.7通道的最大峰电流的激活电压向去极化方向漂移了约10mV,但是对通道的起始激活电压以及通道的翻转电位并没有产生影响,说明当HpTx-I处理细胞后使hNav1.7通道电流不易被激活。在检测的异源表达的Nav1.8与Nav1.5的嵌合体中,5μMHpTx-I毒素对其峰电流没有抑制作用。
王婧[5]（2016）在《两种动物粗毒作用于心肌离子通道的初步研究》文中指出心肌细胞上的离子通道可引发和传导动作电位,除此之外,它们还能够共同维持膜的静息电位。因此,心肌上的各种离子通道可作为治疗长QT或短QT综合征等心脏类疾病的重要靶标。已知动物毒液中包含有丰富的多肽毒素,他们能高效地、特异地与多种离子通道相结合,可用于临床上的药物开发或离子通道疾病药理学机制的研究。因而在该课题中,我们采用全细胞式膜片钳分析了家福捕鸟蛛和东亚钳蝎的粗毒对新生大鼠心室肌细胞上动作电位及各离子通道亚型的电生理影响。在本实验中我们采用胶原酶与胰蛋白酶联合消化新生大鼠的心室肌组织;采用差速贴壁法和化学抑制法共同来纯化、分离出新生大鼠的心肌细胞。据数据显示,分离的心肌细胞存活率高达90%-95%,培养4天后有75%的细胞开始搏动,搏动频率平均60次/min,心肌细胞的总体纯度在91%以上。膜片钳数据结果表明:100 μg/mL的家福捕鸟蛛能较明显的延长心肌动作电位时程（APDs）,而100μg/mL的东亚钳蝎则能明显的缩短APDs。100 μg/mL家福捕鸟蛛粗毒能明显抑制80%的INa电流;95%的IKr总电流;并能明显延缓ICaL的失活速度,但是对IKs、Ito1和IK1电流无明显影响。类似地,100μg/mL东亚钳蝎粗毒能明显阻断INa电流,但对ICaL仅有微弱的抑制效果,而对心肌钾离子通道电流（Itol、Iks、Ikr和Ikl）几乎无影响。这两种动物粗毒都表现出的多样的药理学性质证明:蜘蛛和蝎子粗毒中含有丰富的心肌离子通道拮抗剂,在研究心肌离子通道特性方面和治疗心律失常方面有较好的开发前景。目前关于蟾酥药理作用方面的研究主要集中在抗肿瘤与镇痛作用的分子药理学领域,但它在离子通道方面的研究仍有待加强。本论文主要采用细胞培养、细胞转染和全细胞膜片钳等技术手段,研究蟾酥中的分离组分CS-toxicon331与不同亚型的钠通道相互作用,揭示了该组分可能的药理学机制。研究结果显示,CS-toxicon331对Nav1.7电流的峰值有较强的抑制作用;对抑制Nav1.3电流的峰值也有较好的抑制作用;也可抑制Nav1.4亚型通道电流的峰值。
颜帅[6]（2016）在《黑寡妇蜘蛛卵粒毒素的异源表达和活性分析》文中研究指明黑寡妇蜘蛛（L.tredectimguttatus）毒素分布的一个显着特点是毒腺外（如卵粒中）也存在毒素。目前一般认为卵粒毒素存在的意义在于保护卵粒免遭某些贪食动物和病原微生物的侵袭,从而提升蜘蛛物种的存活机率和进化优势。包括蛋白质组学分析在内的一系列研究证明卵粒和毒腺毒性的分子基础存在很大差异,提示很有可能从卵粒中发现可以用作工具试剂和1临床药物开发的新型毒素和其他生物活性分子。目前,获取目标毒素或其他活性成分最常用的方法是先从天然材料中提取,然后再进行活性筛选。然而这种方法通常具有高成本、低产量以及周期长等局限性,在天然材料来源有限、材料成分复杂和目标产物丰度低时尤其是这样。基于分子生物学技术的异源表达为筛选蛋白质类生物活性成分提供了另一条不依赖于天然提取的有效途径,前提是它们的全长基因已知。由于第二代RNA测序技术的发展,使高效率、低成本的转录组测序成为可能,从而可以获得许多关于编码蛋白质和多肽的全长基因序列,包括那些由于表达丰度低而无法从天然材料中直接提取的蛋白质和多肽的基因序列,从而为不依赖于天然提取的蛋白质和多肽基因的克隆、异源表达和活性筛选提供了方便。在我们的前期工作中,我们测定了黑寡妇蜘蛛卵粒的转录组,获得了 14185个unigene,发现其中280个unigene编码的蛋白质或多肽与已知的毒素具有同源性。本研究从中选择了一个unigene序列进行克隆、异源表达和活性筛选以达到不依赖天然提取而获得毒素的目的。选择的该基因能编码一个具有ICK（inhibitor cystine knot）模体的多肽,而ICK模体是许多多肽类神经毒素共有的结构特征。我们首先从蜘蛛卵粒中提取总RNA,然后通过逆转录构建相应的cDNA文库。利用3’ RACE结合巢式PCR技术扩增出目标DNA序列后将PCR产物连接至pMD19-T载体并转化大肠杆菌DH5α。然后利用带特殊修饰的一对表达引物从重组T-载体中扩增出全部编码序列并将其克隆入表达载体pET32a。在27℃条件下利用0.5mM IPTG成功实现了蛋白质的诱导表达。利用Ni-NTA琼脂糖珠的亲和纯化优势顺利地获得了电泳纯的融合蛋白。为了得到纯化的目的多肽,利用重组的牛肠激酶裂解融合蛋白并用RP-HPLC对裂解产物进行分离。电喷雾质谱分析表明,纯化多肽的单同位素分子量为6195.61 Da,而该多肽还原状态下的单同位素分子量为6205.67 Da,提示该多肽分子中的10个Cys残基形成了 5对二硫键。膜片钳实验证明,2 μM浓度的该多肽能抑制ND 7/23细胞膜上约37%的钠离子通道电流,但是,即使是用10μM浓度的该多肽处理美洲蜚蠊DUM神经细胞,也未见对其钠离子通道电流产生影响。所以,该多肽是一种能特异性作用于哺乳动物神经细胞膜钠离子通道的神经毒素。根据其在黑寡妇蜘蛛卵粒中被发现和研究的顺序命名为Latroeggtoxin-Ⅵ。本研究不仅为该多肽毒素进一步的结构-功能关系和可能的开发应用研究奠定了基础,而且也为不依赖于天然提取的蛋白质类活性成分的筛选提供了可以借鉴的方法。
辛欣[7]（2016）在《雷氏大疣蛛毒素调控神经胶质瘤U87细胞凋亡机制的研究》文中进行了进一步梳理目的:神经胶质瘤是发生于神经外胚层的肿瘤,严重威胁人类的健康,迄今为止,尚无有效的治疗药物。各型胶质瘤中,以星形胶质细胞瘤最多,U87是其中一种胶质瘤细胞。雷氏大疣蛛是我国最近发现的蜘蛛新种,近几年大量实验研究表明雷氏大疣蛛毒素具有抗肿瘤的作用,对胃癌细胞、食管癌细胞和宫颈癌细胞等的增殖有抑制作用。但其具体抗肿瘤机制尚未完全阐明。本文探讨雷氏大疣蛛毒素诱导神经胶质瘤U87细胞凋亡的作用机制,并且分离纯化出具有抗肿瘤活性的较单一组分,使蜘蛛毒素成为抗癌药物的新靶点。方法:本研究以体外培养的胶质瘤U87细胞作为模型,用雷氏大疣蛛毒素作用于U87细胞,MTS法检测雷氏大疣蛛毒素对U87细胞的抗肿瘤作用。分别从细胞水平、分子水平来研究雷氏大疣蛛毒素对U87细胞的调控。细胞水平:通过倒置显微镜、Hoechst33258荧光染色观察U87细胞凋亡的形态学变化;利用流式细胞仪检测U87细胞凋亡情况。分子水平:Western-blot检测U87细胞凋亡过程中,MAPK通路中P-ERK、P-JNK、P-p38等各蛋白的表达,再分别加入ERK抑制剂、JNK/SAPK通路与p38通路信号转导通路阻断剂,用Western-blot检测相应蛋白的表达。分离纯化雷氏大疣蛛毒素,通过快速蛋白液相色谱方法分离雷氏大疣蛛毒素,得到A1A9组分;经MTS法检测各组分对U87细胞增殖的抑制作用。得到的各个组分经浓缩、冷冻干燥、富集。得到的各个组分再经阳离子交换分离纯化,采用MTS法检测各个蛋白组分对U87细胞的抑制作用,测其半抑制浓度。结果:雷氏大疣蛛毒素作用U87细胞,诱导U87细胞凋亡,细胞形态发生变化,变得不规则,成多形性。诱导U87细胞凋亡过程中,MAPK通路中磷酸化ERK蛋白表达降低,磷酸化p38蛋白与JNK表达上调,分别加入各通路抑制剂PD98059、SP600125和SB203580后,P-ERK表达上调,P-p38、P-JNK表达均下调。雷氏大疣蛛毒素经分离纯化得到9个组分,经MTS法检测,组分6对U87细胞具有抗肿瘤作用。组分6再经阳离子交换分离,检测到其中6-5对U87神经胶质瘤细胞抑制作用较强,经测定其IC50=10ug/mL,且毒性低,活性稳定。结论:雷氏大疣蛛毒素能明显抑制U87细胞的生长增殖,诱导细胞凋亡。激活p38-MAPK与JNK/SAPK-MAPK通路来发挥抗肿瘤作用。为其研发成为神经胶质瘤靶向调节药物提供理论依据。
孟平[8]（2015）在《两种防御性多肽的分离纯化、结构、功能及作用机制研究》文中提出生物防御性物质主要具有防御的功能,如抵抗捕食者或寄主侵袭、微生物感染或保护自己不受到环境因子的损伤以及在受到伤害时减轻自己的痛苦和尽快恢复到正常状态。抗感染和镇痛是两类最常见的防御机制,与此相关的物质基础是抗感染因子和镇痛因子,如抗菌肽和镇痛肽。抗菌肽是一种防御性的多肽,在抵御细菌、病毒和真菌侵袭中发挥着至关重要的作用。防御素是抗菌肽中研究最多最广的一类阳离子抗菌肽家族。迄今为止,有300多条防御素被发掘和鉴定出来。防御素广泛地存在于动物、植物和真菌中,为生物体提供免疫防护。本论文以福鼎蝾螈（Cynops fudingensis）为研究对象,对其皮肤中的抗微生物多肽进行分离纯化和结构功能研究。本研究运用活性追踪与分离纯化相结合的方法。依据分子量大小,通过Sephadex G-50凝胶过滤层析对福鼎蝾螈皮肤分泌物中的活性物质进行初步分离,随后运用反相高效液相色谱将Sephadex G-50分离后的活性峰进一步分离纯化。从福鼎蝾螈皮肤分泌物中分离纯化获得了一种新抗菌肽CFBD-1,并从福鼎蝾螈cDNA文库中克隆出编码CFBD-1成熟肽的完整cDNA序列。CFBD-1前体肽是由17个氨基酸残基的信号肽,41个氨基酸残基的成熟肽和3个氨基酸残基的中间肽构成。成熟肽中有6个半胱氨酸,可形成三对二硫键。序列相似度分析发现CFBD-1中的六个半胱氨酸具有高度保守性,与脊椎动物的β-防御素序列非常类似,是β-防御素家族的新成员。这也是首次从有尾类两栖动物中发现防御素抗菌肽。为便于后续研究,我们构建了 CFBD-1原核表达体系,将编码CFBD-1成熟肽的基因克隆到PET表达载体中,进行转化诱导表达,获得具有His-tag的融合蛋白产物。通过亲和层析对表达产物进行纯化,经甲酸化学裂解,Sephadex G-50和RP-HPLC分离纯化获得与天然纯化多肽活性一致的目的多肽。抗菌活性检测表明CFBD-1具有广谱的抑菌效果,对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和白色念球菌都有抑制活性。其中对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的抑菌效果较强,其最小抑菌浓度（MIC）值为65μg/ml;对革兰氏阴性菌的抑菌活性较弱,对枯草芽孢杆菌的MIC值为135 μg/ml;对大肠杆菌的MIC值为160 μg/ml;对真菌白色念球菌的MIC值为200 μg/ml。本文中我们还对另外一类防御性多肽（蜘蛛镇痛肽）进行了研究。已经发现的蜘蛛毒素多肽中,有很大一部分毒素都作用于电压门控离子通道,其中约有三分之一的毒素都作用于钠通道。蜘蛛毒素中的半胱氨酸的分布非常保守,多数蜘蛛毒素半胱氨酸的配对方式为C1-C4,C2-C5和C3-C6,形成典型的抑制剂半胱氨酸结膜体（ICK）结构。泰国金属蓝蜘蛛（Haplopelma lividum）是一种典型的穴居蜘蛛,成年蜘蛛足展长130～150 mm,生活在泰国和缅甸的热带雨林中,以蟋蟀、蜗牛等昆虫和小动物为食。泰国金属蓝蜘蛛行动迅速,具有较强毒性,被泰国金属蓝蜘蛛赏咬后会产生剧烈的疼痛,暗示着该蜘蛛毒液中可能存在神经毒素。我们通过研究泰国金属蓝蜘蛛毒腺的转录组,筛选得到一种含有4对二硫键、由39个氛基酸组成的新型多肽毒素（μ-TRTX-Hl1a）,该多肽毒素形成保守的ICK结构。本研究通过化学合成和氧化还原复性得到μ-TRTX-Hl1a多肽毒素。我们采用膜片钳技术在大鼠背跟神经节细胞上研究μ-TRTX-Hl1a对离子通道的可能活性,发现μ-TRTX-Hl1a对电压门控钾通道、钙通道及河豚毒素敏感型的钠离子通道（TTX-S）均没有作用,但能够选择性的抑制河豚毒素不敏感型钠离子通道（TTX-R）的电流。μ-TRTX-Hl1a对DRG TTX-R型钠通道电流的抑制具有浓度依赖性,其半数有效抑制浓度（IC50）为3.76士0.21 μM。钠离子通道各亚型质粒被转染到HEK293T细胞中,并检测μ-TRTX-Hl1a对这些钠通道亚型的选择性,发现该毒素能选择性抑制Nav1.8电流而对其它亚型没有作用。μ-TRTX-Hl1a 作用于 Nav1.8 的 IC50 为 2.19±0.18 μM。μ-TRTX-Hl1a 对Nav1.8离子通道的电压电流曲线、电导电压曲线没有影响,也不改变通道稳态失活。四种镇痛模型（福尔马林诱导的舔足模型、辐射热导致的甩尾模型、冰醋酸诱导的扭体模型、热板模型）被应用于研究μ-TRTX-Hl1a的镇痛活性。结果发现μ-TRTX-Hl1a能够降低冰醋酸引起的小鼠扭体反应;能显着延长小鼠在甩尾和热板模型中对热痛的反应时间;能显着地减少福尔马林在Ⅰ相和Ⅱ相时期诱导的舔足次数。这表明μ-TRTX-Hl1a能显着地抑制神经痛和炎症痛,并对热痛也有抑制作用,其具有广泛的镇痛效果。CFBD-1是从福鼎蝾螈中发现的第一个β-防御素,在蝾螈抵御外界微生物的感染中具有重要功能。μ-TRTX-Hl1a是从泰国金属蓝蜘蛛中鉴定到的钠离子通道毒素,该毒素有可能帮助蜘蛛抵御其天敌如蟾蜍、蛙、蜥蜴以及鸟的捕食。两种防御性多肽分别具有良好的抗菌和镇痛作用。该研究对理解这两类生物的生存策略具有重要意义,同时为抗菌药物和镇痛药物的开发提供了模板。
张凡[9]（2015）在《作用于疼痛相关钠通道的多肽毒素的结构与功能研究》文中研究说明电压门控钠离子通道亚型Nav1.7和Nav1.8参与炎症性和神经病理性疼痛的调节,是治疗慢性疼痛的新型药物靶点。Nav1.7和Nav1.8的抑制剂显示优于吗啡的镇痛活性,然而其非专一性的靶点活性产生严重的副作用。作用于疼痛相关钠通道专一性抑制剂的筛选和结构与功能的研究,有助于新型镇痛药物先导分子的研发和利用专一性多肽探针探究钠离子通道参与疼痛的调节。中华眼镜蛇（Naja atra）,属眼镜蛇科,主要分布于我国南方地区。本课题成功从中华眼镜蛇毒液分离纯化出Nav1.8抑制剂,命名为μ-EPTX-Na1a（Na1a）。电喷雾质谱鉴定和Edamn降解测序结果显示,Na1a相对分子质量为7053.63 Da,由62个氨基酸残基组成,含有8个半胱氨酸。结构预测符合典型的蛇毒毒素的三指结构模型,8个半胱氨酸组成的4对二硫键连接方式为I-III、II-IV、V-VI和VII-VIII。大鼠背根神经节（DRG）细胞上河豚毒素不敏感型（TTX-R）钠通道活性检测,Na1a显示对Nav1.8的强抑制活性,IC50为167 nM,1μM的浓度几乎能够抑制全部的Nav1.8钠电流。对DRG上河豚毒素敏感型（TTX-S）钠通道和非失活的Nav1.9活性检测,10μM的Na1a仅具有较弱的抑制活性。检测Na1a对DRG上Nav1.8电生理特性的影响,200 nM Na1a使得Nav1.8的最大激活电压向去极化方向漂移约+10 mV,同时使稳态激活向去极化方向漂移约+11 mV,使稳态失活的向超极化方向漂移约9 mV。洗脱实验显示Na1a能快速结合靶点通道,具有稳定结合活性,同时能够被洗脱。钠离子通道亚型选择性实验结果显示,Na1a能够抑制ND7/23细胞上表达的Nav1.8,IC50为386 nM,10μM的Na1a对Nav1.3,Nav1.7和海马神经元TTX-S钠通道（Nav1.1-1.3）具有较弱抑制活性,10μM Na1a抑制Nav1.4电流约48%,对Nav1.5有抑制作用,IC50为8.51μM,该结果显示Na1a具有较高的专一性。药效学活性实验,Na1a在醋酸扭体疼痛模型,福尔马林疼痛模型和完全弗氏佐剂疼痛模型上具有强于吗啡的镇痛活性,在热板疼痛模型和坐骨神经结扎模型上均具有类似于或略优于吗啡的镇痛活性。同时对Na1a的副作用进行评价:运动功能,30倍镇痛剂量腹腔注射小鼠显示其对其游泳运动时间无明显影响;心脏毒性,对SD新生大鼠心肌Nav1.5的毒性实验显示1μM Na1a约抑制15%的电流;溶血活性和细胞毒活性,35μM浓度下均无两种副作用的表现;心脏安全性评价,10μM Na1a抑制hERG通道电流约为18%。酿酒酵母表达体系成功获得Na1a的异源制备。Na1a的靶点专一性,显着的镇痛活性,弱副作用反应和成功异源制备使其成为一个具有巨大潜力的镇痛药物先导分子。海南捕鸟蛛（Haplopelma hainanum）,属捕鸟蛛科,一种主要分布在我国海南省通什县山区的毒性很强的大型蜘蛛。本课题成功地从海南捕鸟蛛毒液中筛选得到Nav1.8的专一性延缓失活剂,命名为δ-TRTX-Hhn1a（Hhn1a）。质谱鉴定和Edamn降解测序结果显示,Hhn1a相对分子质量为3977.62 Da,由34基酸残基组成,含有6个半胱氨酸。结构预测符合抑制剂半胱氨酸节（ICK）模体,6个半胱氨酸组成的3对二硫键连接方式为I-IV,II-V和III-VI。大鼠DRG细胞钠通道活性检测,0.5μM Hhn1a抑制DRG上Nav1.8的峰电流,而2μM Hhn1a则延缓Nav1.8的失活。Hhn1a能够抑制DRG上TTX-S钠离子通道,IC50为4.1μM。亚型选择性结果显示:对异源表达的Nav1.8,Hhn1a同样表现为低浓度抑制峰电流和高浓度延缓失活的特性;对Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5和Nav1.7均表现为抑制活性,IC50分别为3.1±0.08μM、4.2±0.08μM、5.8±0.06μM和2.9±0.03μM。亚型选择性实验证实Hhn1a为Nav1.8的专一性延缓失活剂。Hhn1a可用于探究Nav1.8参与疼痛信号通路调节的分子机制有待进一步探究。海南捕鸟蛛是我国海南省特有的大型剧毒蜘蛛,本实验室在该蜘蛛毒液中发现多种具有重要药理学活性的多肽分子。分析海南捕鸟蛛毒腺的cDNA文库发现,Nav1.7专一性抑制剂μ-theraphotoxin-Hhn2a（HNTX-III）的家族多肽在两个位点存在高突变,即Tyr20突变为His,Ser24突变为Asn。通过色谱分离技术和质谱检测,不能检测到该突变体的天然存在,而HNTX-III在毒液中的含量则可达到1%,这种基因水平存在的天然突变体的生物学活性如何以及其存在的生物学意义是什么。同时,同属HNTX-III家族的HNTX-I,Nav1.7弱抑制活性的HNTX-I的第26位酸性残基组氨酸与强抑制活性的HNTX-III相比突变为碱性天冬氨酸残基,是否这一突变改变HNTX-I对Nav1.7的抑制活性。本实验通过固相化学方法合成了HNTX-III和四个突变体HNTX-III-Y20H,-S24N,-H26D,-Y20H/S24N。通过氧化折叠使得二硫键配对,圆二色谱结果检测显示四个突变体CD谱吸收曲线与HNTX-III基本重叠,表明突变没有明显改变其二级结构。因而,正确二级结构的HNTX-III和四个突变体成功制备。本课题检测5个多肽分子对DRG上TTX-S,TTX-R钠离子通道的活性,以及对异源表达钠通道亚型Nav1.3-1.5,Nav1.7,Nav1.8的活性。结果表明,HNTX-III及其天然突变体对TTX-R钠离子通道无抑制活性,对TTX-S钠离子通道具有不同程度的抑制活性。其中,HNTX-III及其突变体HNTX-III-Y20H,-S24N,-H26D,-Y20H/S24N对DRG细胞上TTX-S钠通道的IC50分别为0.044μM,4.37μM,0.138μM,2.6μM和1.95μM。因而,Y20,S24,H26的突变降低对DRG TTX-S钠通道的亲和性分别为99.3倍,3.14倍,61.1倍,而双突变-Y20H/S24N降低亲和力仅为44.3倍。对钠离子通道亚型Nav1.7的抑制活性检测显示,HNTX-III及其突变体HNTX-III-Y20H,-S24N,-H26D,-Y20H/S24N的IC50分别为0.15μM、9.56μM、1.28μM、7.58μM和2.99μM,因而,Y20,S24,H26和-Y20H/S24N的突变分别降低亲和力为62、8.4、4.9和19.5倍。Nav1.3的抑制活性检测显示,HNTX-III的IC50为0.89μM,突变体-S24N,-Y20H/S24N的IC50则为6.31μM和10.72μM,分别降低7倍和12倍,HNTX-III-Y20H,-H26D则在50μM浓度分别抑制Nav1.3峰电流43%和49%。另外,对Nav1.4,Nav1.5和Nav1.8的抑制活性检测,HNTX-III和四个突变体在10μM浓度下均无抑制活性。同时对分别检测了HNTX-III和四个突变体对DRG-TTX-S钠通道,Nav1.7和Nav1.3的I-V,激活和失活的影响,发现均无显着改变。突变体活性的显着差异表明Try20,Ser24和His26是HNTX-III抑制钠通道的关键残基。HNTX-III的三维结构解析证实了这一结果。综上结果推测,自然选择帮助和保留了最强抑制钠离子通道活性的毒液主要组分HNTX-III,用以防卫和捕食。同时,HNTX-III的三维结构数据的测定和分析,表明其结合钠离子通道的关键残基位于C末端的2个活性区域,为基于结构和活性位点的分子改造和靶点药物设计提供了良好的的前期研究。
罗吉[10]（2014）在《敬钊缨毛蛛毒素与电压门控钠离子通道作用机制研究》文中进行了进一步梳理蜘蛛所产生的具有生物活性的多肽毒素,可以选择性地作用于不同的靶标分子,例如电压门控钠离子通道。正是因为蜘蛛多肽毒素具有作用高效性和专一性的特点,故可以用来进行药理学实验研究和药物研究开发实验,同时也可以用作研究其靶标分子结构和功能的工具试剂分子。敬钊缨毛蛛是一类地下穴居的原始蜘蛛,隶属狒蛛科、棒刺蛛亚科、缨毛蛛属,是近年在我国发现的一蜘蛛新种。从其粗毒中分离纯化得到的29个氨基酸残基构成的多肽毒素--敬钊缨毛蛛毒素V,能够有效抑制大鼠背根神经节（ratDRG）上的河豚毒素敏感型和不敏感型电流,其半有效抑制浓度分别为30.2nM和27.6nM。首先,在本课题中,我们深入地研究了敬钊缨毛蛛毒素V的结构和功能,证明了其是一种作用于电压门控钠离子通道亚型Nav1.4的强抑制剂,其对Nav1.4的半有效抑制浓度为5.12nM,强于其对大鼠背根神经节（ratDRG）上的河豚毒素敏感型和不敏感型电流的抑制作用。在对其电压门控钠离子通道亚型选择性的筛选研究过程中,我们选用了四种电压门控钠离子通道亚型,分别为Nav1.3,Nav1.4,Nav1.5和Nav1.7。实验结果表明JZTX-V对Nav1.4的抑制作用最强,而对Nav1.5的抑制作用最弱,其半有效抑制浓度分别为：hNav1.3,292±61nM；rNav1.4,5.12±0.87nM,hNav1.5,2.7±0.779μM和hNav1.7,61.7±1.2nM,同时拟合得出的时间常数值为34.01±6.81s（rNav1.4）,133.33±27.96s（hNav1.7）,48.54±11.35s（hNav1.3）和34.24±8.13s（hNav1.5）,此实验结果可以证明敬钊缨毛蛛毒素V能够高效且快速地作用于电压门控钠离子通道亚型Nav1.4。敬钊缨毛蛛毒素V（JZTX-V）可以有效地抑制Nav1.4的峰电流值,但是在其亚饱和浓度时,敬钊缨毛蛛毒素V对于Nav1.4的稳态激活和稳态失活都无明显作用,但是却可以改变稳态激活和稳态失活曲线的中点斜率。接下来,我们通过化学合成的敬钊缨毛蛛毒素V的单点突变体来研究其和Nav1.4相互作用的生物学活性位点。研究结果表明,一方面,和野生型的敬钊缨毛蛛毒素V相比,三个疏水性残基（W5,M6和W7）的甘氨酸单点突变体可以显着地降低敬钊缨毛蛛毒素V对Nav1.4的峰电流抑制作用。通过希尔方程拟合后,可以得出不同的敬钊缨毛蛛毒素V单点突变体对钠离子通道亚型Nav1.4的半有效抑制浓度为0.313±0.26（W5A）,0.252±0.45（M6A）和1.92±0.31（W7A）μM。和野生型的敬钊缨毛蛛毒素V相比,其半有效抑制浓度分别提高了61（W5A）,49（M6A）和375（W7A）倍。另一方面,和野生型的敬钊缨毛蛛毒素V相比,两个带正电荷的残基（R20和K22）的甘氨酸突变体可以显着降低敬钊缨毛蛛毒素V和Nav1.4的作用。通过希尔方程拟合后,可以得出不同的敬钊缨毛蛛毒素V单点突变体对钠离子通道亚型Nav1.4的半有效抑制浓度为2.1±0.28（R20A）和0.659±0.011（K22A）μM。和野生型的敬钊缨毛蛛毒素V相比,其半有效抑制浓度分别提高了410（R20A）和128倍（K22A）。由此可知,敬钊缨毛蛛毒素V具有两个生物学活性表面,其中一个为疏水性生物学活性表面,由三个疏水性氨基酸残基组成（W5,M6和W7）；而另一个生物学活性表面由带正电荷氨基酸的残基所组成（R20和K22）。根据其同源模建的结构来看,敬钊缨毛蛛毒素V的带正电荷生物学活性表面位于其疏水性生物学活性表面的周围。先前的关于敬钊缨毛蛛毒素V的磷脂实验表明,敬钊缨毛蛛毒素V表面的带正电荷的氨基酸残基有可能参与到毒素和离子通道的结合过程当中,这一点在本实验中得到验证。关于敬钊缨毛蛛毒素V和电压门控钠离子通道的关键位点研究结果表明,在我们突变的61个氨基酸残基中,其包括所有位于电压门控钠离子通道亚型Navl.4的不同的结构域的不同的胞外连接环,并没有鉴定到对JZTX-V的抑制作用改变特别明显的单点突变体,由此可以知道JZTX-V不作用于电压门控钠离子通道Nav1.4的胞外连接环上。其次,本论文还研究了β1亚基是否在敬钊缨毛蛛毒素V和Nav1.4的相互作用中起到一定的作用。研究结果表明,首先,β1亚基可以明显调节表达于HEK293细胞上的Nav1.4的动力学特征。再次,我们研究发现β1亚基可以降低敬钊缨毛蛛毒素V和电压门控钠离子通道亚型Nav1.4的亲和性,也就是说,β1亚基可以阻碍敬钊缨毛蛛毒素V和Nav1.4的作用。再次,本论文还研究了导致低血钾周期性麻痹疾病的单点突变Nav1.4R222W的离子通道动力学特征,研究结果表明,和野生型的钠离子通道Navl.4相比,导致低血钾周期性麻痹疾病的单点突变Nav1.4R222W可以使激活曲线向去极化方向漂移近6mV；这一单点突变体还可以使失活曲线向超极化方向漂移近5mV。这些在离子通道动力学方面的改变,可也加强钠离子通道Nav1.4的失活作用,导致在静息电位下可激活的钠离子通道数目的减少,以至于无法爆发足够的动作电位,最终导致肌肉的麻痹。据临床报道,临床常用药物乙酰脞胺对此类患者毫无疗效,乙酰脞胺的药理作用为改变细胞外的pH值。但是根据我们的研究,这种导致低血钾周期性麻痹疾病的单点突变Nav1.4R222W和之前发现的此类疾病的单点突变体所不同的是,这类突变体对胞外pH值得变化不敏感,其胞外pH值的变化对其无任何调节作用,由此导致药物乙酰脞胺的对此类患者无任何治疗效果。我们的研究结果解释了为什么突变体Nav1.4R222W会导致低血钾周期性麻痹以及为什么药物乙酰脞胺的对此类患者无疗效。综上所述,我们的研究实验数据表明,和Nav1.4相关单点突变体可以导致严重肌肉疾病的发生,以及敬钊缨毛蛛毒素V是一种可以高效且快速作用于Nav1.4的多肽分子抑制剂,一方面,为研究电压门控钠离子通道的结构和功能提供了一个新的分子试剂,另一方面也为肌肉疾病类药物的开发提供了一个先导分子。
二、蜘蛛多肽神经毒素研究新进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、蜘蛛多肽神经毒素研究新进展（论文提纲范文）
（1）拟环纹豹蛛毒素鉴定与神经毒素PPTX-22的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 蜘蛛及其毒液 |
| 1.1 蜘蛛 |
| 1.2 蜘蛛毒液的主要组份 |
| 2 蜘蛛毒素的药理学研究 |
| 2.1 抑制谷氨酸转运蛋白对谷氨酸的摄取 |
| 2.2 细胞毒性 |
| 2.3 诱导神经递质发生胞吐作用 |
| 2.4 降解生物体组织 |
| 2.5 调节离子通道 |
| 3 蜘蛛毒素的获取 |
| 3.1 电刺激法获取毒液 |
| 3.2 蜘蛛毒素体外重组 |
| 3.3 重组蛋白的纯化方法 |
| 4 鱼尼丁受体 |
| 4.1 钙离子成像技术 |
| 4.2 昆虫鱼尼丁受体的研究 |
| 5 研究目的与意义 |
| 第二章 拟环纹豹蛛毒素鉴定与分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 RNA的提取及cDNA的合成 |
| 1.4 文库制备和转录组测序 |
| 1.5 转录组组装和功能注释 |
| 1.6 实时荧光定量PCR |
| 1.7 序列和数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转录组测序、组装和功能注释 |
| 2.2 毒液多肽毒素和其它毒液成分鉴定 |
| 2.3 拟环纹豹蛛神经毒素的家族分析 |
| 2.4 神经毒素基因结构分析 |
| 2.5 非神经毒性多肽类毒素 |
| 2.6 毒液蛋白酶类 |
| 2.7 毒液蛋白酶抑制剂类 |
| 2.8 Venom allergen 5 |
| 2.9 透明质酸酶 |
| 2.10 组织表达谱分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 富含二硫键多肽毒素体外表达和纯化系统的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 拟环纹豹蛛毒腺总RNA的提取及cDNA的合成 |
| 1.4 体外表达载体构建 |
| 1.5 pFastBac~(TM)1重组质粒的构建 |
| 1.6 pPICZ A和pPICZα A重组质粒的构建 |
| 1.7 pET32a和pLicC-MBP重组质粒的构建 |
| 1.8 昆虫杆状病毒表达系统-蛋白表达 |
| 1.9 毕赤酵母表达系统-蛋白表达 |
| 1.10 大肠杆菌表达系统-蛋白表达 |
| 1.11 目的蛋白的检测 |
| 1.12 融合蛋白的诱导表达 |
| 1.13 融合蛋白的纯化 |
| 1.14 融合蛋白的酶切 |
| 1.15 重组毒素的回收 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 真核表达载体pFastBac~(TM)1表达拟环纹豹蛛毒素 |
| 2.2 真核表达载体pPICZ A表达拟环纹豹蛛毒素 |
| 2.3 真核表达载体pPICZα A表达拟环纹豹蛛毒素 |
| 2.4 原核表达载体pET32a表达拟环纹豹蛛毒素 |
| 2.5 原核表达载体pLicC-MBP表达拟环纹豹蛛毒素 |
| 2.6 融合蛋白PPTX-04的纯化及酶切 |
| 2.7 超滤管回收重组毒素 |
| 2.8 分子筛回收重组毒素 |
| 2.9 HisTrap Excel回收重组毒素 |
| 2.10 MBPTrap HP回收重组毒素 |
| 2.11 柱子联用回收重组毒素 |
| 2.12 重组毒素PPTX-22的制备 |
| 3 讨论 |
| 第四章 神经毒素PPTX-22的作用机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 重组毒素的浓度测定 |
| 1.4 重组毒素生物活性测定 |
| 1.5 神经细胞的分离 |
| 1.6 钙离子成像 |
| 1.7 序列和数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 神经毒素PPTX-22序列分析 |
| 2.2 生物活性测定 |
| 2.3 重组毒素PPTX-22对细胞膜钙离子通道的影响 |
| 2.4 重组毒素PPTX-22对细胞器膜钙离子通道的影响 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ |
| 附录Ⅱ 攻读学位期间发表的论文及申请的专利 |
| 附录Ⅲ 攻读学位期间获得的奖励 |
| 致谢 |
（2）动物多肽毒素的异源表达纯化与活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 动物毒素的介绍 |
| 1.1.1 蜈蚣毒素的多样性及应用 |
| 1.1.2 蚂蚁毒素的多样性及应用 |
| 1.2 动物毒素的表达 |
| 1.3 本文的研究思路 |
| 第二章 利用大肠杆菌异源表达系统表达蜈蚣毒素κ1b |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验器材与材料准备 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验材料与试剂 |
| 2.2.3 实验部分溶液的配制 |
| 2.3 实验方法与过程 |
| 2.3.1 重组表达质粒pET-43-His-SUMO-κ1b的构建 |
| 2.3.2 κ1b的表达与纯化 |
| 2.3.3 κ1b的电生理活性检测 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 重组表达质粒pET-43-His-SUMO-κ1b的构建 |
| 2.4.2 κ1b的表达与纯化 |
| 2.4.3 κ1b的电生理活性检测 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 利用大肠杆菌异源表达系统表达三种蚂蚁毒素 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验器材与材料准备 |
| 3.3 实验方法与过程 |
| 3.3.1 重组表达质粒pET-43-His-SUMO-Ae1d/e/g的构建 |
| 3.3.2 Ae1d/Ae1e/Ae1g的表达与纯化 |
| 3.4 实验结果与分析 |
| 3.4.1 重组表达质粒的构建 |
| 3.4.2 Ae1d/Ae1e/Ae1g的表达与纯化 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 总结与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
（3）HNTX-Ⅰ对中电导钙激活钾通道的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 中电导钙激活钾通道概述 |
| 1.1.1 钾通道概述 |
| 1.1.2 钙激活钾通道 |
| 1.2 中电导钙激活钾通道的研究进展 |
| 1.2.1 中电导钙激活钾通道的结构 |
| 1.2.2 中电导钙激活钾通道的特性 |
| 1.3 中电导钙激活钾通道的激活剂与抑制剂 |
| 1.3.1 中电导钙激活钾通道的抑制剂 |
| 1.3.2 中电导钙激活钾通道的激活剂 |
| 1.4 HNTX-Ⅰ对中电导钙激活钾通道的作用 |
| 1.4.1 蜘蛛多肽毒素在离子通道的研究 |
| 1.4.2 膜片钳在多肽毒素和离子通道研究中的应用 |
| 1.4.3 HNTX-Ⅰ对IK通道的作用及其研究意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 原核表达HNTX-Ⅰ及其突变体 |
| 2.1.1 原核表达概述 |
| 2.1.2 大肠杆菌原核表达系统 |
| 2.1.3 大肠杆菌表达系统高效表达的策略 |
| 2.1.4 实验试剂、实验材料与实验仪器 |
| 2.1.5 实验步骤 |
| 2.2 化学合成HNTX-Ⅰ及其突变体 |
| 2.2.1 固相化学合成法概述 |
| 2.2.2 实验试剂、实验材料与实验仪器 |
| 2.2.3 化学合成的实验步骤 |
| 2.3 HNTX-Ⅰ对中电导钙激活钾通道的作用机制研究 |
| 2.3.1 概述 |
| 2.3.2 实验试剂、实验材料与实验仪器 |
| 2.3.3 实验步骤 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 原核表达HNTX-Ⅰ及其五个突变体的结果 |
| 3.1.1 HNTX-Ⅰ的五个突变体载体的构建 |
| 3.1.2 HPLC纯化原核表达的HNTX-Ⅰ及其五个突变体 |
| 3.1.3 原核表达的HNTX-Ⅰ及其五个突变体的质谱分析结果 |
| 3.2 化学合成HNTX-Ⅰ的五个突变体的结果 |
| 3.2.1 化学合成的HNTX-Ⅰ的五个突变体的质谱分析结果 |
| 3.2.2 HNTX-Ⅰ的五个突变体复性后的质谱分析结果 |
| 3.3 膜片钳检测HNTX-Ⅰ的五个突变体的电生理活性 |
| 3.3.1 膜片钳检测原核表达的HNTX-Ⅰ及其五个突变体电生理活性 |
| 3.3.2 膜片钳检测化学合成的HNTX-Ⅰ及其五个突变体电生理活性 |
| 3.3.3 HNTX-Ⅰ及其突变体的EC_(50)值 |
| 第四章 讨论 |
| 参考文献 |
| 缩写表 |
| 致谢 |
（4）白额巨蟹蛛毒液的生理生化研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 蜘蛛毒素与电压门控钠离子通道的研究进展 |
| 1.1 哺乳动物电压门控钠通道及其相互作用的毒素 |
| 1.1.1 电压门控钠通道的概述 |
| 1.1.2 电压门控钠通道的分子结构 |
| 1.1.3 电压门控钠通道与神经病理性疼痛 |
| 1.1.4 电压门控钠通道与多肽毒素 |
| 1.2 昆虫动物电压门控钠通道及其相互作用的毒素 |
| 1.2.1 昆虫电压门控钠通道的概述 |
| 1.2.2 昆虫电压门控钠通道的分子结构 |
| 1.2.3 昆虫电压门控钠通道与杀虫剂开发 |
| 1.3 本研究的背景及意义 |
| 第二章 白额巨蟹蛛毒液的的生理生化研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 白额巨蟹蛛毒液的多肽和蛋白分析 |
| 2.3.2 白额巨蟹蛛毒液的分离纯化 |
| 2.3.3 白额巨蟹蛛毒液的质谱分析 |
| 2.3.4 白额巨蟹蛛毒素的多样性分析 |
| 2.3.5 美洲大蠊DUM神经元的急性分离 |
| 2.3.6 大鼠背根神经节DRG细胞急性分离 |
| 2.3.7 全细胞模式膜片钳电生理活性检测 |
| 2.3.8 加药物 |
| 2.3.9 白额巨蟹蛛毒液对美洲大蠊和大鼠的神经毒活性以及致死性分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 白额巨蟹蛛毒液的分离纯化和质谱鉴定 |
| 2.4.2 白额巨蟹蛛毒素的分子多样性 |
| 2.4.3 白额巨蟹蛛毒液对电压门控钠通道活性的影响 |
| 2.4.4 白额巨蟹蛛毒液对美洲大蠊的毒性实验 |
| 2.5 结论与进一步研究设想 |
| 第三章 HpTx-I对钠通道的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料、试剂和仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 HpTx-I的分离纯化和质谱鉴定 |
| 3.3.2 细胞的冻存和复苏 |
| 3.3.3 细胞传代培养 |
| 3.3.4 转化反应 |
| 3.3.5 质粒的提取 |
| 3.3.6 细胞转染 |
| 3.3.7 电生理实验检测 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 HpTx-I的分离纯化及质谱鉴定 |
| 3.4.2 HpTx-I作用于电压门控钠离子通道的活性分析 |
| 3.5 结论与进一步研究设想 |
| 参考文献 |
| 缩写表(中英文对照) |
| 附表一 |
| 论文发表 |
| 致谢 |
（5）两种动物粗毒作用于心肌离子通道的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 蜘蛛概述 |
| 1.1.1 蜘蛛的种类及生活习性 |
| 1.1.2 蜘蛛毒素的主要成分 |
| 1.1.3 蜘蛛毒素功能研究进展 |
| 1.2 蝎子概述 |
| 1.2.1 蝎子的种类 |
| 1.2.2 蝎毒的组成成分与性质 |
| 1.2.3 蝎子毒素与离子通道疾病的研究进展 |
| 1.3 蟾酥概述 |
| 1.3.1 蟾酥的化学成分 |
| 1.3.2 蟾酥的药理作用 |
| 1.3.3 蟾酥的研究概况 |
| 第二章 家福捕鸟蛛和东亚钳蝎粗毒对心肌细胞离子通道的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料、试剂 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 分离培养心肌细胞 |
| 2.3.2 两种粗毒的采集 |
| 2.3.3 全细胞记录(whole-cell recording模式) |
| 2.3.4 加药 |
| 2.3.5 注意事项 |
| 2.4 各项测定指标 |
| 2.4.1 心肌细胞存活率的测算 |
| 2.4.2 心肌细胞形态观察 |
| 2.4.3 纯度鉴定 |
| 2.5 结果 |
| 2.5.1 细胞成活率的鉴定 |
| 2.5.2 心肌细胞的形态学观察 |
| 2.5.3 心肌细胞纯度测定 |
| 2.5.4 两种粗毒对心肌细胞动作电位时程的影响 |
| 2.5.5 两种粗毒对心肌钠电流的影响 |
| 2.5.6 两种粗毒对心肌钾电流的影响 |
| 2.5.7 两种粗毒对心肌钙电流的影响 |
| 2.6 讨论 |
| 第三章 蟾酥对钠通道的抑制作用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 仪器材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 仪器与设备 |
| 3.2.3 试验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 与Nav1.7的作用 |
| 3.3.2 与Nav1.3的作用 |
| 3.3.3 与Nav1.4的作用 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 展望 |
| 4.1 主要研究结论 |
| 4.2 进一步研究设想 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）黑寡妇蜘蛛卵粒毒素的异源表达和活性分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 蜘蛛毒素研究进展 |
| 1.3 黑寡妇毒素研究的最新进展 |
| 1.4 本研究的目的意义 |
| 第二章 卵粒毒素基因的克隆和表达 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 Trizol法提取黑寡妇卵粒总RNA |
| 2.3.2 cDNA第一链的合成 |
| 2.3.3 基于3'RACE的巢式PCR扩增毒素基因 |
| 2.3.4 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.3.5 目的片段的胶回收 |
| 2.3.6 TA连接克隆以及转化 |
| 2.3.7 菌落PCR检测和测序 |
| 2.3.8 重组T载体质粒小提 |
| 2.3.9 利用表达引物从重组T载体上扩增目的片段 |
| 2.3.10 目的片段回收以及载体和目的片段的双酶切 |
| 2.3.11 目的片段与表达载体的连接和转化 |
| 2.3.12 原核诱导表达和融合蛋白检测 |
| 2.3.13 菌体破碎和融合蛋白可溶性检测 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 3'RACE产物 |
| 2.4.2 表达引物扩增Latroeggtoxin-VI的CDS区域 |
| 2.4.3 重组表达载体测序结果 |
| 2.4.4 融合蛋白的SDS-PAGE检测 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 Latroeggtoxin-Ⅵ的分离纯化与活性检测 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料和仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 融合蛋白的纯化以及酶切 |
| 3.3.2 Latroeggtoxin-Ⅵ的色谱分离和质谱鉴定 |
| 3.3.3 Latroeggtoxin-Ⅵ的活性检测 |
| 3.3.4 毒素处理K562细胞后的CCK8活力测试 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 Ni-NTA琼脂糖纯化后的融合蛋白SDS-PAGE检测 |
| 3.4.2 融合蛋白酶切后的反相液相色谱分离 |
| 3.4.3 MALDI-TOF和ESI质谱鉴定 |
| 3.4.4 电生理活性结果 |
| 3.4.5 CCK8细胞活力测试和统计学分析 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 进一步研究设想 |
| 参考文献 |
| 文章发表和投递情况 |
| 缩写表(中英文对照) |
| 致谢 |
（7）雷氏大疣蛛毒素调控神经胶质瘤U87细胞凋亡机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 1、生物毒素的研究 |
| 2、蜘蛛毒素和抗肿瘤 |
| 2.1 蜘蛛毒素的分离纯化 |
| 2.2 蜘蛛毒素研究现状 |
| 2.3 蜘蛛毒素对各种癌症的治疗作用 |
| 2.4 蜘蛛毒素的应用前景 |
| 3、细胞的凋亡和抗肿瘤 |
| 4、MAPK通路与抗肿瘤 |
| 4.1 ERK-MAPK通路 |
| 4.2 JNK/SAPK-MAPK通路 |
| 4.3 p38MAPK通路 |
| 5、抗肿瘤药物的研究 |
| 第一部分 雷氏大疣蛛毒素对神经质胶质瘤U87细胞生长抑制作用及诱导凋亡的研究 |
| 1.1 实验仪器与试剂 |
| 1.1.1 实验试剂及配制 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 肿瘤细胞的培养 |
| 1.2.2 MTS法检测雷氏大疣蛛毒素抗肿瘤活性 |
| 1.2.3 台盼蓝法检测雷氏大疣蛛毒素抗肿瘤活性 |
| 1.2.4 Hoechst33258 染色 |
| 1.2.5 免疫印记 |
| 1.2.6 流式细胞仪测细胞表型 |
| 1.2.7 统计学处理 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 神经胶质瘤U87 细胞形态学观察 |
| 1.3.2 Hoechst33258 染色结果 |
| 1.3.3 雷氏大疣蛛毒素对U87 细胞的生长抑制作用 |
| 1.3.4 雷氏大疣蛛毒素对U87 细胞凋亡的影响 |
| 1.3.5 流式细胞仪检测U87 细胞凋亡率 |
| 1.4 讨论 |
| 第二部分 MAPK通路在雷氏大疣蛛毒素诱导U87 细胞凋亡过程中的作用 |
| 2.1 实验仪器与试剂 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 MTS法 |
| 2.2.3 免疫印迹 |
| 2.2.4 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 雷氏大疣蛛毒素对ERK-MAPK途径的影响 |
| 2.3.2 雷氏大疣蛛毒素对JNK-MAPK途径的影响 |
| 2.3.3 雷氏大疣蛛毒素对p38MAPK途径的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第三部分 雷氏大疣蛛毒素抗癌活性蛋白组分的分离纯化 |
| 3.1 实验仪器与试剂 |
| 3.1.1 主要仪器 |
| 3.1.2 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 雷氏大疣蛛粗毒的分离纯化 |
| 3.2.2 细胞培养 |
| 3.2.3 MTS法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 雷氏大疣蛛毒素的分离纯化 |
| 3.3.2 二次分离纯化 |
| 3.3.3 组分的电泳及质谱 |
| 3.4 讨论 |
| 结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的科研成果清单 |
（8）两种防御性多肽的分离纯化、结构、功能及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略词对照表 |
| 第一部分 抗菌肽与两栖动物抗微生物感染 |
| 第一章 综述 |
| 1. 两栖动物物种多样性、生存环境、皮肤解剖学特征 |
| 2. 两栖动物的生存策略 |
| 3. 两栖动物后天和先天免疫特性 |
| 3.1. 两栖动物后天免疫特性 |
| 3.2. 两栖动物先天免疫特性 |
| 3.3. 抗菌肽特征 |
| 3.4. 两栖动物抗菌肽研究概况 |
| 第二章 福鼎蝾螈抗菌肽CFBD-1的分离纯化与功能研究 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 1. 实验材料与设备 |
| 2. 福鼎蝾螈皮肤分泌物的分离纯化 |
| 3. 福鼎蝾螈cDNA文库构建及筛选 |
| 4. 福鼎蝾螈抗菌肽CFBD-1的原核表达 |
| 5. 福鼎蝾螈抗菌肽CFBD-1的功能检测 |
| 第三节 实验结果 |
| 1. 福鼎蝾螈皮肤分泌物分离纯化 |
| 2. 福鼎蝾螈cDNA文库的构建 |
| 3. 福鼎蝾螈抗菌肽CFBD-1的原核表达 |
| 4. 福鼎蝾螈抗菌肽CFBD-1的功能检测 |
| 讨论 |
| 第四节 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 神经毒素与蜘蛛防御 |
| 第一章 综述 |
| 1. 蜘蛛的生活习性概述 |
| 1.1. 捕食 |
| 1.2. 防御 |
| 2. 蜘蛛神经毒素多样性 |
| 3. 电压门控钠离子通道结构与功能多样性 |
| 3.1. 电压门控钠离子通道的结构 |
| 3.2. 通道的状态 |
| 3.3. 钠离子通道的分类 |
| 4. 电压门控钠离子通道Nav1.8与疼痛的关系 |
| 5. 作用于Nav1.8钠通道亚型的蜘蛛神经毒素 |
| 第二章 泰国金属蓝蜘蛛镇痛肽μ-TRTX-Hl1a结构与功能研究 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 1. 实验材料与设备 |
| 2. 泰国金属蓝蜘蛛cDNA文库构建及筛选 |
| 3. 泰国金属蓝蜘蛛镇痛肽μ-TRTX-Hl1a的固相化学合成 |
| 4. 泰国金属蓝蜘蛛镇痛肽μ-TRTX-Hl1a的复性 |
| 5. 泰国金属蓝蜘蛛镇痛肽μ-TRTX-Hl1a在大鼠背根神经节(DRG)上电压门控离子通道的活性检测 |
| 6. 泰国金属蓝蜘蛛镇痛肽μ-TRTX-Hl1a在钠离子通道亚型上的活性检测 |
| 7. 泰国金属蓝蜘蛛镇痛肽μ-TRTX-Hl1a的结构分析 |
| 8. 泰国金属蓝蜘蛛镇痛肽μ-TRTX-Hl1a的镇痛动物模型检测 |
| 9. 泰国金属蓝蜘蛛镇痛肽μ-TRTX-Hl1a的昆虫毒力检测 |
| 第三节 实验结果 |
| 1. 泰国金属蓝蜘蛛cDNA文库的构建及筛选 |
| 2. 泰国金属蓝蜘蛛镇痛肽μ-TRTX-Hl1a的化学合成 |
| 3. 泰国金属蓝蜘蛛镇痛肽μ-TRTX-Hl1a的复性动力学 |
| 4. 泰国金属蓝蜘蛛镇痛肽μ-TRTX-Hl1a在DRG上的活性检测 |
| 5. 泰国金属蓝蜘蛛镇痛肽μ-TRTX-Hl1a的钠离子亚型活性检测 |
| 6. 泰国金属蓝蜘蛛镇痛肽μ-TRTX-Hl1a的结构分析 |
| 7. 泰国金属蓝蜘蛛镇痛肽μ-TRTX-Hl1a对疼痛的影响-镇痛动物模型研究 |
| 8. 泰国金属蓝蜘蛛镇痛肽μ-TRTX-Hl1a的昆虫毒性检测 |
| 讨论 |
| 第四节 本章小结 |
| 参考文献 |
| 文章总结 |
| 论文创新点 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 附录 |
（9）作用于疼痛相关钠通道的多肽毒素的结构与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 多肽毒素与疼痛相关钠通道相互作用的研究进展 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 蜘蛛毒液的主要组成与多肽类毒素的研究进展 |
| 1.2.1 蜘蛛概述 |
| 1.2.2 蜘蛛毒液的组成 |
| 1.3 蛇毒毒液的主要组成与多肽类毒素的研究进展 |
| 1.3.1 蛇概述 |
| 1.3.2 蛇毒毒液的主要组成 |
| 1.3.3 蛇毒中肽类毒素的研究进展 |
| 1.4 疼痛相关钠通道的研究进展 |
| 1.4.1 电压门控钠离子通道概述 |
| 1.4.2 电压门控钠离子通道的分布与分类 |
| 1.4.3 钠通道与疾病 |
| 1.4.4 钠通道毒素与作用位点 |
| 1.4.5 疼痛相关钠通道研究进展 |
| 第二章 中华眼镜蛇毒液多肽 μ-EPTX-Na1a阻断电压门控钠通道Nav1.8 抑制炎症性和神经病理性疼痛 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 Na1a多肽的分离纯化 |
| 2.2.2 大鼠背根神经节（dorsal root ganglia，DRG）细胞的急性分离 |
| 2.2.3 SD新生大鼠心肌细胞和小鼠海马神经元的急性分离 |
| 2.2.4 人胚胎肾细胞（HEK293T）的培养与质粒转染 |
| 2.2.5 中华眼镜蛇毒腺RNA的提取，反转录和 3’RACE扩增Na1a家族多肽的基因序列 |
| 2.2.6 谷氨酸内切酶酶解Na1a与Edman降解测序 |
| 2.2.7 炎症性和神经病理性疼痛模型的制备 |
| 2.2.8 酿酒酵母表达Na1a多肽 |
| 2.2.9 Na1a的细胞毒性测定 |
| 2.2.10 Na1a的溶血活性测定 |
| 2.2.11 Na1a对hERG通道影响的测定 |
| 2.2.12 Na1a对小鼠游泳运动影响的测定 |
| 2.2.13 膜片钳活性分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 Na1a多肽的分离纯化与对DRG上钠通道的影响 |
| 2.3.2 Na1a家族多肽的 3’RACE基因扩增 |
| 2.3.3 Na1a的谷氨酸内切酶酶解与Edman降解测序 |
| 2.3.4 Na1a多肽与DRG上钠通道的相互作用 |
| 2.3.5 Na1a对钠通道亚型的选择性 |
| 2.3.6 Na1a对炎症性和神经病理性疼痛的镇痛活性 |
| 2.3.7 Na1a的副作用分析：心肌Nav1.5， hERG， 游泳运动，细胞毒性，溶血活性 |
| 2.3.8 Na1a的酿酒酵母表达 |
| 2.4 结果讨论 |
| 2.4.1 Na1a是选择性作用于钠通道的蛇毒多肽 |
| 2.4.2 Na1a能够抑制炎症性疼痛和慢性神经病理性痛 |
| 2.4.3 Na1a具有较好的药物安全性 |
| 2.4.4 Na1a可以作为分子探针探究Nav1.8 参与疼痛调节 |
| 第三章 海南捕鸟蛛毒液多肽 δ-TRTX-Hhn1a专一性延缓电压门控钠通道Nav1.8 的失活 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 Hhn1a的分离纯化与Edman降解测序 |
| 3.2.2 大鼠背根神经元细胞的分离 |
| 3.2.3 人胚胎肾细胞（HEK293T）的培养与质粒转染 |
| 3.2.4 膜片钳活性分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 Hhn1a的纯化与序列测定 |
| 3.3.2 Hhn1a延缓DRG细胞上Nav1.8 通道的失活 |
| 3.3.3 Hhn1a延缓异源表达的Nav1.8 通道的失活 |
| 3.3.4 Hhn1a抑制DRG上TTX-S钠通道电流 |
| 3.3.5 Hhn1a与钠通道亚型的相互作用 |
| 3.4 结果讨论 |
| 3.4.1. Hhn1a是Nav1.8 通道的专一性延缓失活剂 |
| 3.4.2 Hhn1a可用于探究Nav1.8 参与疼痛调节的分子机制。 |
| 第四章 HNTX-III家族多肽的天然突变改变及其对电压门控钠通道的亲和性 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 HNTX-III及其天然突变体的化学合成与复性 |
| 4.2.2 大鼠背根神经节细胞的急性分离 |
| 4.2.3 人胚胎肾细胞（HEK293T）的培养与质粒转染 |
| 4.2.4 膜片钳活性分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 HNTX-III及突变体的合成 |
| 4.3.2 HNTX-III及其天然突变体与DRG上钠通道的相互作用 |
| 4.3.3 HNTX-III及其天然突变体与钠通道亚型的相互作用 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 主要研究结论和进一步研究设想 |
| 5.1 主要研究结论 |
| 5.2 进一步研究设想 |
| 参考文献 |
| 缩写表 |
| 攻读博士学位期间论文发表目录 |
| 致谢 |
（10）敬钊缨毛蛛毒素与电压门控钠离子通道作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 蜘蛛毒素与电压门控钠离子通道研究进展 |
| 1.1 蜘蛛毒素 |
| 1.1.1 蜘蛛简介 |
| 1.1.2 蜘蛛毒素研究进展 |
| 1.2 电压门控钠离子通道 |
| 1.2.1 电压门控钠离子通道的发现 |
| 1.2.2 电压门控钠离子通道的结构(Primary structures of soiucmchannel subunits) |
| 1.2.3 电压门控钠离子通道的多样性(Diversity of sodium channelsubunits) |
| 1.2.4 离子通道的超家族(The ion channel protein superfamily) |
| 1.2.5 钠离子通道的空间结构(Sodium channelstructure at atomicresolution) |
| 1.2.6 电压门控钠离子通道的孔道区(The pore of sodium channels) |
| 1.2.7 电压门控钠离子通道的离子选择性(Ion selectivity andconductance) |
| 1.2.8 钠离子通道上药物结合位点 |
| 1.2.9 电压门控钠离子通道激活 |
| 1.2.10 电压门控钠离子通道快失活(Fast inactivation) |
| 1.2.11 调控电压门控钠离子通道的功能 |
| 1.2.12 电压门控钠离子通道突变体的病理学特征 |
| 1.2.13 电压门控钠离子通道p亚基 |
| 第二章 JZTX-V与电压门控钠离子通道亚型NAV1.4相互作用的分子机制研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 粗毒的获取 |
| 2.2.2 试剂和仪器 |
| 2.2.3 JZTX-V的野生型和突变体的分离和纯化 |
| 2.2.4 异源表达用质粒的准备 |
| 2.2.5 电压门控钠离子通道亚型Nav1.4突变体的构建 |
| 2.2.6 HEK293细胞异源表达电压门控钠离子通道及其突变体 |
| 2.2.7 膜片钳实验 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 JZTX-V对异源表达在HEK293细胞上的不同的电压门控钠通道亚型的抑制作用 |
| 2.3.2 亚饱和浓度的JZTX-V对野生型电压门控钠离子通道亚型Nav1.4激活和失活的作用 |
| 2.3.3 JZTX-V的化学合成 |
| 2.3.4 JZTX-V单点突变体的电生理功能分析 |
| 2.3.5 JZTX-V和电压门控钠离子通道相互作用关键位点鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 JZTX-V是电压门控钠离子通道亚型Nav1.4的选择性抑制剂 |
| 2.4.2 JZTX-V对电压门控钠离子通道亚型Nav1.4的作用 |
| 2.4.3 JZTX-V和电压门控钠离子通道亚型Nav1.4相互作用的生活学活性表面的鉴定 |
| 2.4.4 JZTX-V和其他作用了电压门控钠离子通道亚型Nav1.4毒素的比较 |
| 2.4.5 JZTX-V和电压门控钠离子通道亚型Nav1.4的关键位点研究 |
| 第三章 电压门控钠离子通道B亚基对JZTX-V抑制作用的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 野生型JZTX-V的分离和纯化 |
| 3.2.2 质粒 |
| 3.2.3 试剂及试剂盒 |
| 3.2.4 仪器 |
| 3.2.5 TAKARA公司购买预制DH5α大肠杆菌感受态细胞转化方法 |
| 3.2.6 转化成功菌落测序以及菌种保存 |
| 3.2.7 质粒中量提取 |
| 3.2.8 HEK293细胞异源表达电压门控钠离子通道及其突变体 |
| 3.2.9 膜片钳实验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 β亚基对电压门控钠离子通道亚型Nav1.4的调节作用 |
| 3.3.2 β亚基对电压门控钠离子通道亚型Nav1.4和JZTX-V之间相互作用的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 低血钾周期性麻痹疾病突变体RNAV1.4 R222W的致病机理研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试剂和仪器 |
| 4.2.2 异源表达用质粒的准备 |
| 4.2.3 电压门控钠离子通道亚型Nav1.4突变体的构建 |
| 4.2.4 HEK293细胞异源表达电压门控钠离子通道及其突变体 |
| 4.2.5 膜片钳实验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 电压门控钠离子通道Nav1.4单点突变体R222W对稳态激活过程的影响 |
| 4.3.2 电压门控钠离子通道Nav1.4单点突变体R222W对稳态失活过程的影响 |
| 4.3.3 胞外pH值对电压门控钠离子通道Navl. 4稳态激活和失活过程的影响 |
| 4.3.4 胞外pH值对低血神周期性麻摸单点突变体Nav1. 4 R222W的稳态激活过程的影响 |
| 4.3.5 胞外pH值对低血钾周期性麻瘦单点突变体Navl. 4 R222W的稳态失活过程的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 主要研究结论与进一步研究设想 |
| 参考文献 |
| 缩写表 |
| 论文发表情况 |
| 致谢及基金 |
| 附录 |
四、蜘蛛多肽神经毒素研究新进展（论文参考文献）
- [1]拟环纹豹蛛毒素鉴定与神经毒素PPTX-22的作用机制研究[D]. 黄立鑫. 南京农业大学, 2019(08)
- [2]动物多肽毒素的异源表达纯化与活性研究[D]. 吴茜. 国防科技大学, 2018(02)
- [3]HNTX-Ⅰ对中电导钙激活钾通道的作用机制研究[D]. 彭晨嘉. 湖南师范大学, 2017(01)
- [4]白额巨蟹蛛毒液的生理生化研究[D]. 黄亚洲. 湖南师范大学, 2017(01)
- [5]两种动物粗毒作用于心肌离子通道的初步研究[D]. 王婧. 湖南师范大学, 2016(01)
- [6]黑寡妇蜘蛛卵粒毒素的异源表达和活性分析[D]. 颜帅. 湖南师范大学, 2016(01)
- [7]雷氏大疣蛛毒素调控神经胶质瘤U87细胞凋亡机制的研究[D]. 辛欣. 河北师范大学, 2016(04)
- [8]两种防御性多肽的分离纯化、结构、功能及作用机制研究[D]. 孟平. 南京农业大学, 2015(05)
- [9]作用于疼痛相关钠通道的多肽毒素的结构与功能研究[D]. 张凡. 湖南师范大学, 2015(05)
- [10]敬钊缨毛蛛毒素与电压门控钠离子通道作用机制研究[D]. 罗吉. 湖南师范大学, 2014(04)