一、结核分支杆菌抗原ESAT-6真核表达质粒在COS-7中的表达（论文文献综述）
吴骏杰,王辛,宋世杰,姚庆港,单炳乙,王莹,路延之,柏银兰[1]（2017）在《结核分枝杆菌Rv3586结构域基因真核表达载体的构建及鉴定》文中研究表明目的:构建结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）环二腺苷酸（cyclic diadenosine monophosphate,c-di-AMP）合成酶Rv3586结构域基因的真核表达载体,并在COS-7细胞中表达。方法:以Mtb基因组为模板PCR扩增Rv3586三个结构域基因,分别克隆入pEGFP-N3真核表达质粒,用菌落PCR、质粒酶切和测序方法对插入序列进行鉴定。通过脂质体将重组质粒转染COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因在COS-7细胞内的表达。结果:PCR成功扩增出Rv3586三个结构域基因,菌落PCR、质粒酶切和质粒测序鉴定结果表明成功插入目的片段,包含Rv3586的三个结构域基因的真核表达载体构建成功。间接免疫荧光法结果显示,Rv3586三个结构域蛋白在COS-7细胞中表达成功。结论:成功构建Rv3586三个结构域基因的真核表达载体,并在COS-7细胞中表达成功,为后续Mtb Rv3586结构域的功能和应用研究奠定了基础。
管清华[2]（2016）在《耻垢分枝杆菌EsxA、EsxB及细胞壁对BCG免疫影响的研究》文中进行了进一步梳理呈世界性分布的结核病可感染人类、多种哺乳动物和鸟类。牛结核病导致的牛奶产量、繁殖力下降以及体重、肉品的损失等每年对全球经济可产生30亿美元的影响,该病是OIE规定的必报传染病,我国的二类动物疫病;而人结核病目前仍然是单一致病因子中死亡率最高的传染病,所以结核病的存在不仅严重危害着畜牧业的健康发展,更威胁着人类的健康甚至生命。效果良好的疫苗对有效控制结核病尤为重要。BCG在预防结核病中发挥了重要作用,但在成人中的保护效果并不确定,而在研发新的结核疫苗中,几种快生长、非病原性的分枝杆菌,被作为结核疫苗的良好活载体,所以有必要研究其组分对动物机体免疫,尤其是BCG免疫效果的影响,为其进一步开发应用提供参考依据。首先为了筛选非结核分枝杆菌,复苏了母牛分枝杆菌、新金分枝杆菌和耻垢分枝杆菌,克隆到3种分枝杆菌的esx B基因以及耻垢分枝杆菌的esxA基因;分析表明,以上基因编码的蛋白均属于WXG100蛋白超家族成员;预测到4条肽链有线性B细胞表位和T细胞表位;其中耻垢分枝杆菌esxA、esxB基因编码的氨基酸序列与牛分枝杆菌相应氨基酸同源性分别为60.8和%72%;在母牛分枝杆菌、新金分枝杆菌的基因组中未发现esxA基因。然后构建了含有耻垢分枝杆菌esxA、esxB基因的重组原核表达质粒pET28a-sme-esxA、pET28a-sme-esxB,转化入E.coli BL21（DE3）中,发现二者可经诱导表达,Western blot分析显示,表达产物可以与耻垢分枝杆菌多克隆抗体发生反应。为了了解耻垢分枝杆菌的EsxA、EsxB对动物机体免疫的影响,实验又构建了重组真核表达质粒pVAX1-esxA、pVAX1-esxB和pVAX1-esxB-esxA,将三者转染至Marc-145细胞中,经间接免疫荧光技术和RT-PCR证实esxA、esxB可以在哺乳动物细胞中表达。在动物免疫实验中,用复苏的耻垢分枝杆菌噬菌体裂解耻垢分枝杆菌制备了细胞壁,与灭活的耻垢分枝杆菌、pVAX1-esxA、pVAX1-esxB、pVAX1-esxB-esxA及加有佐剂Quil A的免疫原分别免疫雌性BALB/c小鼠,再给部分实验动物接种BCG,分析耻垢分枝杆菌相应组分对BCG免疫的影响。免疫学检测结果表明,在细胞免疫方面,经PPD刺激后,灭活菌显着降低了BCG免疫的SI值;质粒组及灭活组小鼠血清中IFN-γ的浓度中均有与BCG差异不显着者,但细胞壁显着提高了BCG免疫小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ的能力。在体液免疫方面,细胞壁组和联合质粒组中均有小鼠血清中IL-4的浓度高于BCG组者,PPD刺激的脾淋巴细胞分泌IL-4的能力在细胞壁组和联合质粒组中均有高于BCG组者,尤以细胞壁组最明显;细胞壁、灭活菌可以使BCG接种的小鼠血清中特异性抗体浓度增加,而质粒使BCG接种的小鼠抗体水平略有下降,但差异均不显着。流式细胞仪检测结果说明,质粒pVAX1-esxA、pVAX1-esxB-esxA和灭活菌更有利于BCG免疫的动物向细胞免疫方向发展。
艾能,孟闯,徐正中,刘泽,陈祥,焦新安[3]（2016）在《结核分枝杆菌TB10.4真核表达质粒的构建及免疫特性鉴定》文中研究表明以卡介苗（BCG）基因组、pEGFP质粒为模板,PCR扩增分别获得TB10.4基因片段、GFP-TB10.4融合基因片段,连接pVAX1真核表达载体,测序和酶切鉴定正确,分别命名为pVAX1-TB10.4和pVAX1-GFP-TB10.4;将重组质粒分别转染COS-7和HEK293T细胞,反转录PCR表明TB10.4基因成功转录,间接免疫荧光试验显示2种蛋白均能瞬时表达;再将重组质粒pVAX1-TB10.4免疫小鼠。结果表明:该质粒能够诱导低水平的抗体应答,同时诱发IFN-γ表达,并且能够加强BCG初次免疫后的免疫应答效果。该研究构建的真核表达质粒pVAX1-TB10.4能够诱导小鼠产生抗TB10.4免疫应答,为后续TB10.4蛋白生物学功能研究提供良好的生物材料。
周美玲[4]（2016）在《新型高通量酵母双杂交体系的构建及结核主要抗原互作羊驼抗体的筛选》文中研究说明近年来,随着高通量测序技术的广泛应用和多种物种全基因组测序的完成,使得构建高通量、复杂、完整的蛋白间互作网络成为可能,酵母双杂交技术作为研究蛋白质相互作用的主要方法,经过多年的发展,在向着精确化、自动化、规模化、高通量的方向发展。但是迄今为止,酵母双杂交还不能进行文库对文库的大规模筛选工作,无法满足大规模互作网络研究的需要。结核是一种危害严重的传染性疾病,目前,受限于大规模蛋白互作网络研究规模小、通量低,使得对结核杆菌中大量蛋白质相互作用的研究难以展开。结核分枝杆菌作为一种胞内寄生菌,若治疗性抗体等能进入到细胞内发挥作用,必能对疾病的攻克起到举足轻重的作用。而纳米抗体本身具有表达稳定、分子量小、渗透性强等多种优点,本课题构建了一套依托于phiC31/att整合酶的新型高通量酵母双杂交体系,以此为研究基础,以结核分枝杆菌为研究对象,构建结核分枝杆菌中蛋白质之间相互作用的网络图谱。用上述构建的新型高通量酵母双杂交系统对几种结核杆菌抗原蛋白筛选互作羊驼抗体,以期用于结核病的诊断、治疗。本研究获得以下结论:1.构建新型高通量酵母双杂交体系重组载体整合酶Integrase phiC31（En）具有整合功能,能识别特异核苷酸序列ATTP和ATTB,并将特异核苷酸序列及其紧邻的核苷酸序列进行特异性的定向重排,连接成一段新的序列。我们将整合酶Integrase PhiC31序列和其识别的特异核苷酸序列ATTP 和ATTB 分别插入 Matchmaker GAL4 系统的载体 pGADT7 和pGBKT7（Clontech）中,构建新型高通量酵母双杂交体系重组载体pGADT7-ATTP-phiC31（简称 pmGADT7）和 pGBKT7-ATTB-phiC31（简称 pmGBKT7）。2.新型高通量酵母双杂交体系的阳性互作蛋白验证将Matchmaker GAL4系统中的阳性对照SV40 large T和小鼠p53蛋白分别克隆进重组载体pmGADT7和pmGBKT7中,观察阳性对照中蛋白表达情况与pGADT7-T和pGBKT7-p53相同,phiC31的整合效率几乎达到100%,阳性实验组互作情况和对照组相同,从而证明此方法在已知阳性互作蛋白上可用。3.运用新型高通量酵母双杂交体系构建结核分枝杆菌蛋白间的互作网络图谱构建结核分枝杆菌H37Rv株的膜蛋白、分泌蛋白、脂蛋白的诱饵文库和猎物文库,运用新型高通量酵母双杂交技术直接进行诱饵文库对猎物文库的杂交筛选,构建结核分枝杆菌蛋白之间的互作网络图谱,证明新型高通量酵母双杂交体系在蛋白互作组学中的可行性。4.构建半人工合成羊驼抗体蛋白猎物文库,筛选与结核蛋白互作的羊驼抗体ESAT6、CFP10、Ag85、HSPX是结核分枝杆菌的四种重要的抗原蛋白,利用同时表达这四种蛋白的AAV病毒,感染动物并获得针对这四种抗原的特异性抗体。从而获得对结核特异性CDR3区核酸序列。人工合成羊驼抗体FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、FR4核酸序列,并和上述获得特异性抗体的CDR3区核酸序列融合,构建半人工合成的羊驼抗体猎物文库,并筛选针对这四种结核分枝杆菌重要抗原蛋白的互作羊驼抗体。
饶桂荣,张换敬,石燕飞,黄彬,王洪敏,杨富强,陈光明[5]（2016）在《抗结核分枝杆菌DNA疫苗的构建及免疫原性研究》文中提出目的:构建抗结核分枝杆菌（TB）DNA疫苗并进行体内外的鉴定。方法:采用PCR技术分别扩增TB（H37Rv）抗原单基因Ag85a、Ag85b以及融合基因Ag85a-Esat6和Ag85b-Esat6融合基因,其5’端均含人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）信号肽,将目的基因分别亚克隆于p VAX1真核表达载体,得到Ag85a/p VAX1、Ag85b/p VAX1、Ag85a-Esat6/p VAX1和Ag85b-Esat6/p VAX1四种质粒;经酶切和测序鉴定正确后,质粒转染COS-7细胞48 h,取上清液检测目的蛋白表达情况;利用在体电脉冲技术（EP）将质粒注射BALB/c小鼠双侧胫前肌,检测特异性的体液和细胞免疫应答。结果:四种质粒基因片段方向、序列正确;Western blot检测COS-7细胞转染48 h后的上清,均有清晰特异性的目的蛋白条带,并定量检测到Esat6蛋白的表达水平可达10 ng/ml;小鼠免疫实验结果表明,仅质粒Ag85b/p VAX1和Ag85a-Esat6/p VAX1可诱导针对结核抗原分泌高水平IFN-γ的Th1型免疫应答和特异性杀伤应答,其中通过ELISA检测小鼠血清的lg G和ELISPOT检测脾细胞分泌IFN-γ的实验结果阳性率均为100%,且Ag85a-Esat6/p VAX1的效果较好些,与卡介苗具有显着性差异。结论:成功构建了抗TB的DNA疫苗,其中Ag85a-Esat6/p VAX1质粒DNA疫苗的免疫效果较好,为进一步研发治疗性的TB DNA疫苗奠定基础。
王英[6]（2013）在《结核杆菌ESAT6基因密码子优化真核载体的构建及其免疫效应的研究》文中提出目的：（1）构建结核杆菌ESAT6基因密码子优化核酸疫苗pVAX1-ESAT6-O和ESAT6天然密码子核酸疫苗pVAX1-ESAT6。（2）原核表达ESAT6重组蛋白。（3）评价ESAT6基因密码子优化核酸疫苗pVAX1-ESAT6-O和天然密码子核酸疫苗pVAX1-ESAT6的免疫效应。方法：（1）培养结核分枝杆菌H37Ra菌株。（2）从结核杆菌H37Ra菌株中提取DNA，设计引物，以此DNA为模板通过PCR技术扩增ESAT6基因。（3）ESAT6基因与pET42a（+）载体双酶切后的纯化产物在T4连接酶的作用下连接，构建原核表达质粒pET42a（+）-ESAT6，经菌落PCR、单双酶切及DNA测序鉴定重组质粒是否正确；鉴定正确的阳性菌株，转化至大肠埃希菌BL21（DE3+）中,经IPTG诱导表达重组蛋白，采用GST和镍柱亲和层析纯化重组蛋白，通过SDS-PAGE和Western blot对目的蛋白进行分析和鉴定，大量纯化蛋白,去除内毒素并用鲎试剂定性检测内毒素，便于后续试验。（4）酶切纯化的ESAT6基因和pVAX1空质粒经T4连接酶连接构建真核表达质粒pVAX1-ESAT6，经菌落PCR、单双酶切及DNA测序鉴定重组质粒是否正确。（5）按照哺乳动物密码子使用偏好，对结核分枝杆菌ESAT6基因进行优化，使用GeneOptimizer软件对ESAT6基因的氨基酸编码基因进行优化，但不改变氨基酸序列。优化后的基因序列，由南京金斯瑞生物公司合成，并插入pVAX1质粒。（6）分别大量提取pVAX1-ESAT6-O、pVAX1-ESAT6和pVAX1。首先，体外转染Hela细胞，并通过RT-PCR、间接免疫荧光检测其在真核细胞内的表达；其次，经肌肉注射并电转染免疫小鼠，免疫组化观察小鼠骨骼肌瞬时表达效果。（7） pVAX1-ESAT6-O、pVAX1-ESAT6和pVAX1肌肉注射并电转染免疫BALB/c小鼠，3次重复免疫后，取脾脏制备小鼠脾淋巴细胞经ESAT6抗原刺激培养后，以流式细胞技术检测淋巴细胞增殖水平和以ELISPOT检测分泌IFN-γ的特异性细胞免疫情况，并以间接ELISA法检测免疫后血清中IFN-γ的水平和相应的特异性抗体及特异性抗体动态变化等免疫指标。结果：（1）构建的了pET42a（+）-ESAT6重组质粒经PCR和双酶切鉴定结果与预期结果一致，DNA测序鉴定结果经BLAST比对与标准株H37Ra基因组序列及标准株H37Rv的ESAT6基因序列完全一致。pET42a（+）-ESAT6阳性菌经IPTG诱导后，蛋白在E.coli BL21（DE3）工程菌中大量表达，经SDS-PAGE分析为可溶性表达，表达量占菌体蛋白的30.5%。Western blot显示重组蛋白能与ESAT6单克隆抗体发生特异性免疫结合反应，经ToxinEraserT M去内毒素试剂盒进行去除内毒素处理后，鲎试剂检测蛋白内毒素为阴性。（2）构建的ESAT6天然密码子核酸疫苗pVAX1-ESAT6重组质粒经PCR和双酶切鉴定结果与预期结果一致，DNA测序结果经BLAST比对插入基因序列与标准H37Rv株基因序列完全一致。（3）获得了结核分枝杆菌ESAT6优化后的ESAT6基因序列，并全基因合成，构建的ESAT6基因密码子重组质粒pVAX1-ESAT6-O经PCR和双酶切鉴定结果与预期结果一致，DNA测序结果经BLAST比对插入基因序列与设计的ESAT6优化密码子序列基因序列完全一致。（4）pVAX1-ESAT6-O和pVAX1-ESAT6重组质粒真核细胞转染后RT-PCR结果显示实验组均有相应的mRNA表达，间接免疫荧光检测表明目的基因能在Hela细胞中表达蛋白，免疫组化检测结果发现空白对照和空质粒组着色不明显，转染了重组质粒的小鼠骨骼肌纤维内均有着色显着的棕黄色阳性颗粒。（5）免疫后各组小鼠淋巴细胞增殖实验结果显示pVAX1-ESAT6-O组和pVAX1-ESAT6组PI值显着高于pVAX1组和NS组（p＜0.01），pVAX1-ESAT6-O组显着高于pVAX1-ESAT6组（p＜0.05），pVAX1组和NS组无显着性差异（p＞0.05）。ELISPOT检测结果显示pVAX1-ESAT6-O组和pVAX1-ESAT6组经抗原刺激后分泌IFN-γ的淋巴细胞数与pVAX1组和NS组相比有显着性差异（p＜0.01），pVAX1-ESAT6-O组与pVAX1-ESAT6组相比有显着性差异（p＜0.05）。ELISA检测免疫后小鼠血清中分泌IFN-γ的水平与ELISPOT实验结果趋势一致。免疫后pVAX1-ESAT6-O组和pVAX1-ESAT6组小鼠血清中特异性IgG抗体水平随着免疫次数的增加而明显增高，pVAX1组和NS组则未出现此现象，而且pVAX1-ESAT6-O组和pVAX1-ESAT6组特异性抗体水平显着高于pVAX1组和NS组（p＜0.01），pVAX1-ESAT6-O组高于pVAX1-ESAT6组（p＜0.05），pVAX1组和NS组无显着性差异（p＞0.05）。结论：（1）成功构建了原核表达载体pET42a（+）-ESAT6，并且在E.coli BL21（DE3）工程菌中高效表达ESAT6蛋白。（2）成功构建了真核表达载体pVAX1-ESAT6-O和pVAX1-ESAT6，初步揭示了其均可在体内外表达，可诱导机体产生特异性细胞免疫和体液免疫，并且pVAX1-ESAT6-O诱导的免疫效应明显高于pVAX1-ESAT6。
艾能[7]（2013）在《结核分枝杆菌TB10.4蛋白调节RAW264.7细胞自噬、炎性因子分泌及其真核表达质粒构建和免疫原性的初步研究》文中研究说明结核分枝杆菌作为最古老的病原菌之一仍然威胁着人类的健康,且目前尚没有完全可靠的结核病疫苗面世。在这种情况下,了解结核分枝杆菌的致病机理、研究其逃逸宿主免疫防御的机制,对进一步提高BCG疫苗的保护效力或研发新型的疫苗具有指导意义。结核分枝杆菌侵入机体后,能够成功的生存于宿主的免疫细胞如巨噬细胞、树突状细胞中。目前,已有报道的分枝杆菌的逃逸宿主免疫防御的方式主要包括三种：1)抑制吞噬体的成熟过程,阻碍其与溶酶体的融合；2)抵抗RNI和ROI；3)抑制MHC抗原分子的加工和提呈,阻碍T细胞的识别。细胞自噬不仅作为一种维持细胞内环境稳态的机制,同时也是天然免疫防御机制的重要组成部分。此外,细胞自噬也被发现与抗原提呈、细胞因子的调控密切相关。结核分枝杆菌能够抑制自噬体的成熟过程,从而避免自噬对其的杀伤。研究发现,通过促进细胞自噬能够有效的杀灭细胞内的分枝杆菌。包括细胞因子、Vitamin-D、离子环境、ROS都在自噬的发生过程中发挥了重要的作用。TB10.4蛋白能够激发强烈的细胞免疫,是疫苗研发的重要候选抗原之一,但是TB10.4蛋白在细菌感染与免疫中发挥的功能未见系统报道。因此,本研究采用原核表达制备的TB10.4蛋白为材料,初步研究了其在RAW264.7巨噬细胞自噬发生过程中以及对细胞因子分泌所产生的影响；此外,构建了TB10.4的真核表达质粒并鉴定了其免疫原性,为进一步研究TB10.4蛋白功能奠定了基础。—TB10.4蛋白调节脂多糖诱导的RAW264.7细胞自噬和炎性因子分泌的初步研究以原核表达蛋白TB10.4作用于脂多糖自噬促进下的RAW264.7细胞,通过观察自噬相关蛋白LC3B Ⅱ和Beclin-1,发现仅需10μg/mL TB10.4就能够明显抑制LPS诱发的自噬现象,并且这一抑制现象在作用30分钟后就能观察到,表现为LC3B Ⅱ和Beclin-1表达量的降低；此外,以Bafilomycin A1抑制自噬降解途径后发现LC3BⅡ的表达含量下降,说明自噬体的合成受到了抑制。进一步检测细胞上清中的细胞因子和NO的表达含量,发现TB10.4能够降低TNF-α、NO的表达、增加IL-1p的表达,对IL-6无明显作用。此外,TB10.4能够持续激活RAW264.7中ERK、p70S6K的磷酸化,而AKT的磷酸化则表现为先升高然后回复正常。而在BCG的感染RAW264.7试验中,以IFN-y/LPS/Rapamycin分别激活细胞自噬,发现TB10.4能够明显保护BCG在Rapamycin作用下RAW264.7中的增殖活力。这些结果提示TB10.4可能在炎性条件下的细菌感染中发挥重要作用。二TB10.4蛋白真核表达质粒的构建及其免疫原性的初步鉴定以pVAX1为载体分别构建了TB10.4和GFP-TB10.4的表达质粒,通过RT-PCR和间接免疫荧光试验,证实这两种质粒在细胞中得到了成功的表达。此外,以pVAX1-TB10.4作为免疫原免疫小鼠,分别设立了pVAX1-TB10.4组、BCG组、BCG/联合免疫组和PBS对照组,测定了免疫小鼠血清中特异性抗体效价和脾细胞中IFN-γ和IL-4的分泌能力。结果显示,免疫小鼠产生了特异性抗体,但是抗体效价较低,且各对照组之间没有明显的差异。而IFN-γ的测定中,在Bovine-PPD的刺激下,BCG/pVAX1-TB10.4联合免疫组IFN-γ表达水平显着高于其余各组,而在重组蛋白刺激下,IFN-γ含量无明显差异。而在IL-4的测定中,各组值均较低。因此,成功获得了TB10.4的真核表达质粒,这种质粒能够有效激发小鼠的特异性免疫应答,为进一步研究TB10.4的功能奠定了基础。
靳志栋[8]（2011）在《PPE68/Ipr1基因的表达、鉴定及初步应用》文中进行了进一步梳理本课题将Ipr1 （Intracellular pathogen resistance 1,细胞内病原体抗性基因1）克隆入原核表达质粒pET32a（+）,构建了原核基因表达质粒pET32a（+）-Ipr1,并成功获得Ipr1重组蛋白;将Ipr1基因与结核分枝杆菌PPE68基因分别克隆入真核表达载体pBudCE4.1中,构建真核共表达质粒（pbudce4.1/ Ipr1/PPE68）,体外转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞,并在转录水平及翻译水平鉴定了Ipr1基因和PPE68基因的表达;同时构建了Ipr1基因和PPE68基因共表达穿梭质粒（pbudce4.1-Ipr1-PPE68-OriM）,并将该质粒电转到BCG中,构建Ipr1/ PPE68重组BCG,为进一步研究Ipr1/PPE68重组BCG对结核分枝杆菌感染的免疫保护作用打下基础。第一部分Ipr1基因原核表达质粒的构建及鉴定目的:构建Ipr1基因原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达和鉴定。方法: PCR扩增质粒PMD19-T simple-Ipr1中的目的基因Ipr1,将目的基因Ipr1克隆入原核质粒pET32a（+）,构建原核表达质粒pET32a（+）-Ipr1。将pET32a（+）-Ipr1转化表达菌株BL21, IPTG诱导目的基因的表达,SDS-PAGE鉴定重组蛋白表达情况。结果:原核表达质粒pET32a（+）-Ipr1经酶切测序鉴定正确。pET32a（+）-Ipr1在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导成功表达出Ipr1重组蛋白。结论:成功构建了含Ipr1基因的原核表达质粒pET32a（+）-Ipr1,并成功获得Ipr1重组蛋白。为Ipr1重组BCG的原核表达打下基础。第二部分PPE68/Ipr1真核共表达质粒的构建及鉴定目的:构建结核分枝杆菌PPE68基因和小鼠Ipr1基因的真核共表达质粒,观察两种基因在小鼠巨噬细胞株RAW264.7中的共表达。方法:将结核分枝杆菌PPE68基因和小鼠Ipr1基因分别亚克隆入含多启动子的共表达载体pBudCE4.1中,构建真核共表达质粒pBud68-Ipr1。体外转入小鼠巨噬细胞株RAW264.7, RT-PCR、Western blotting分别在转录水平及翻译水平检测PPE68基因和Ipr1基因的表达。结果:双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符,测序结果与Genbank注录的PPE68和Ipr1基因序列一致。重组真核表达质粒pBud68-Ipr1瞬时转入小鼠巨噬细胞株RAW264.7,用RT-PCR、Western-blotting法在转录水平及翻译水平鉴定发现,PPE68和Ipr1基因获得成功表达,PPE68和Ipr1基因编码产物分子量分别大约在37kD和50kD。结论:成功构建了PPE68和Ipr1真核共表达质粒pBud68- Ipr1,该重组质粒转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7,在转录及翻译水平检测到PPE68基因和Ipr1基因表达。PPE68/Ipr1共表达质粒的构建,为PPE68/Ipr1重组BCG的构建及其免疫保护作用的进一步研究奠定了基础。第三部分PPE68/Ipr1重组BCG的构建及鉴定目的:构建PPE68/Ipr1重组BCG。方法:分枝杆菌复制子OriM基因片段（1896）亚克隆入已构建好的穿梭质粒pBudCE4.1-Ipr1-PPE68的NheI位点,形成穿梭质粒pBudCE4.1- Ipr1-PPE68-OriM,然后通过酶切、PCR进行鉴定。将此重组质粒电转入BCG中,构建Ipr1/ PPE68重组BCG。用PCR方法进行鉴定。结果: pBudCE4.1-Ipr1-PPE68-OriM真核穿梭质粒经酶切和测序鉴定正确,菌落PCR成功扩增出IPR1和PPE68两个片段。结论:成功构建真核共表达穿梭质粒pBudCE4.1- Ipr1-PPE68-OriM,成功构建Ipr1/PPE68重组BCG,为进一步研究Ipr1/PPE68重组BCG对结核分枝杆菌感染的免疫保护作用鉴定了基础。
田浪[9]（2009）在《禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合DNA疫苗构建及免疫研究》文中研究说明禽传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是危害养鸡生产重要的病毒性传染病之一。由于禽传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）血清型众多,不同血清型之间交叉保护力弱,而常规疫苗常引起IB的免疫失败。因此,从基因水平上研制DNA疫苗等新型基因工程疫苗,对提高IBV免疫保护具有重要意义。在前期研究基础上,本研究对IBV肾型SAIBk株结构蛋白的抗原表位进行系统分析预测,筛选出IBV S1、S2和N蛋白的抗原表位片段,构建含鸡属特异性CpG基序的IBV多表位嵌合基因,将嵌合基因进行原核表达并建立了检测IBV抗体的间接ELISA方法,构建了多表位嵌合基因的真核表达质粒,并结合禽白细胞介素分子佐剂对其免疫效果进行了比较研究,为研制安全、高效的新型IBV DNA疫苗提供了新的方法。1、采用生物信息学软件及相关网站分析IBV S1、S2和N结构蛋白的二级结构、B细胞表位（主要是中和抗原表位）和T细胞表位（主要是CTL抗原表位）,同时结合文献研究报道,共筛选出IBV抗原表位区域7段F1-F7（S1:24-150AA、240-255AA、290-400AA、532-537AA;S2:1-65AA;N:1-120AA、N:290-410AA）。以柔性肽GP或GA作为Linker将7个抗原表位基因依次串联成一条全新的多表位嵌合基因F。嵌合基因5’端引入Kozak序列,3’端引入鸡属特异性CpG免疫刺激基序,分析表明,构建的IBV多表位嵌合基因F有良好的亲水性、柔性及抗原性等。本研究对IBV S1、S2和N蛋白的抗原表位进行系统预测分析,成功构建了含鸡属特异性CpG基序的IBV结构蛋白多表位嵌合基因,分析表明该嵌合基因编码蛋白有良好的亲水性和抗原性等,国内外未见报道,该研究丰富了IBV结构蛋白生物信息学资料,为IBV多表位嵌合基因的原核表达、ELISA方法建立,以及DNA疫苗的制备提供了基础材料。2、将IBV结构蛋白多表位嵌合基因F片段用BamHI和XhoI双酶切后亚克隆入原核表达载体pET-32a（+）,转化E.coli Rosetta,采用IPTG进行诱导,研究表明嵌合基因F编码的蛋白以包涵体形式融合表达,Western-blots显示,该融合蛋白能与抗IBV阳性血清发生特异性反应。通过优化重组质粒的表达条件,确定了嵌合基因F的重组蛋白表达的最佳IPTG诱导物浓度为1 mmol/L,诱导时间为3 h,诱导温度为30℃。以纯化的融合重组蛋白为抗原包被酶标板,筛选出重组抗原最佳包被浓度为20μg/mL,抗体最佳稀释度1∶40,酶标二抗（HRP标记兔抗鸡IgG）最佳稀释度1∶3000,血清样品阴阳性临界值为0.133,建立了以嵌合基因重组蛋白为诊断抗原的IBV抗体间接ELISA方法。本研究将IBV多表位嵌合基因进行原核表达研究,表达产物有良好免疫反应活性,建立了以IBV多表位嵌合蛋白为诊断抗原的间接ELISA方法,该方法安全、灵敏度高（血清稀释度可达1∶300）、特异性强,优于常规的IBV抗体检测方法,国内外未见报道,为IBV抗体的检测提供了新的方法。3、将IBV多表位嵌合基因F分别亚克隆进真核表达载体pcDNA3.1、pVAX1、VR1020中,构建了禽白细胞介素IL-1β、IL-2、IL-18基因的pcDNA3.1真核表达质粒。重组质粒经酶切和测序鉴定后,通过脂质体转染COS-7细胞,利用RT-PCR及间接免疫荧光检测重组真核质粒在体外的表达。重组质粒经酶切和测序表明IBV多表位嵌合基因F、禽白细胞介素的真核表达质粒构建正确。RT-PCR检测表明,转染了pcDNA-F、pVAX1-F、VR1020-F、pcDNA-IL-1β、pcDNA-IL-2和pcDNA-IL-18的COS-7细胞中均能扩增出特异性的目的基因片段;间接免疫荧光检测表明,转染了pcDNA-F、pVAX1-F、VR1020-F的COS-7细胞显示出特异性绿色荧光。本研究构建了含鸡属特异性CpG基序的IBV结构蛋白多表位嵌合基因的真核表达质粒,检测表明真核质粒表达的IBV多表位嵌合蛋白有良好的免疫反应性,国内外未见报道,为IBV多表位嵌合基因DNA疫苗的研制提供了试验材料。4、采用本课题组获得专利（专利授权号为200410081443.4）的质粒提取纯化方法制备IBV结构蛋白多表位嵌合基因及禽白细胞介素真核表达重组质粒,将纯化的重组质粒溶液（1mg/mL）与脂质体溶液（10mg/mL）等体积混合配制成DNA疫苗,通过腿部肌肉多点注射7日龄非免疫雏鸡,21日龄加强免疫一次,二免疫后7、14、21、28采血检测外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的数量和ELISA抗体效价,二免后五周用IBV强毒攻击测定免疫保护率;同时对pVAX1-F疫苗免疫组不同时间的质粒分布及整合可能性进行了检测。外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群数量检测结果显示:pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F疫苗免疫组在二免后7～21d,与PBS组和空质粒免疫组相比差异均极显着（P＜0.01）,但组间差异不显着。pcDNA-F+pcDNA-IL-1β、pcDNA-F+pcDNA-IL-2、pcDNA-F+pcDNA-IL-18疫苗免疫组在免疫后7～28d,与pcDNA-F单独免疫组相比差异均显着（P＜0.05）。ELISA抗体效价结果显示:pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F疫苗免疫组在二免后7～28d,与PBS组和空质粒免疫组相比差异均极显着（P＜0.01）,但组间差异不显着。质粒pcDNA-F分别与禽IL-1β、IL-2、IL-18共同免疫组在免疫后14～28d,与pcDNA-F疫苗组相比差异均显着（P＜0.05）。攻毒结果表明,pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F疫苗组的保护率分别为80%、80%和75%,前两者优于常规灭活疫苗（75%）。pcDNA-F+pcDNA-IL-1β、pcDNA-F+pcDNA-IL-2、pcDNA-F+pcDNA-IL-18疫苗免疫组的保护率分别为85%、90%和85%,表明禽IL-2的免疫增强效果优于IL-1β和IL-18。病理切片观察DNA疫苗免疫鸡群的肾脏正常、无病理变化。疫苗质粒分布及整合安全性检测结果显示,pVAX1-F免疫接种后24h,在血液和所有检测的组织中检测到质粒,免疫后90d可在心、脾、肺等组织检测到质粒;纯化后的组织基因组DNA经PCR扩增均呈阴性,未发现整合现象。本研究研制了含鸡属特异性CpG基序的IBV结构蛋白多表位嵌合基因的DNA疫苗,研究表明该多表位嵌合DNA疫苗能够诱导良好的细胞免疫和体液免疫,免疫鸡攻毒保护率为80%,高于常规IBV灭活疫苗（75%）;与禽IL-2分子佐剂共同免疫鸡群的攻毒保护率达到90%;该多表位嵌合基因DNA疫苗安全性好,未检测到与宿主基因组整合的现象。本论文开展的禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合DNA疫苗构建及免疫研究,在国内外未见报道,该研究为研制安全、高效的新型IBV DNA疫苗提供了新的方法。
杨恒[10]（2009）在《猪传染性胃肠炎病毒DNA疫苗的构建与免疫原性研究》文中认为猪传染性胃肠炎（TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起猪的一种高度接触性肠道传染病。该病对两周龄以内新生仔猪危害尤为严重,可导致感染仔猪发生严重的呕吐、腹泻与脱水,死亡率可达100%。该病现已遍及世界各主要养猪国家与地区,给养猪业带来了严重的经济损失。本研究以TGEV S基因及N基因为靶基因,以猪白细胞介素6（pIL-6）和猪粒细胞-巨噬细胞因子（pGM-CSF）基因为基因佐剂,进行了TGEV DNA疫苗的构建与免疫原性的研究,主要研究内容如下:1.TGEV S基因与N基因的克隆及真核表达质粒的构建采用RT-PCR扩增TGEV SC-H株S基因5′端（覆盖A、B、C、D四个抗原位点）和N基因,分别将其插入pMD19-T载体,构建重组质粒19T-S与19T-N。对19T-S和19-N的核苷酸序列测定与分析表明:克隆的TGEV SC-H株S基因长度为2127 bp,可编码708个氨基酸残基;克隆的N基因长度为1149 bp,可编码382个氨基酸残基。序列比对分析显示:TGEV SC-H株S基因编码的氨基酸序列与其它TGEV毒株的同源性在95.5%～99.7%之间,N基因编码的氨基酸序列与其它TGEV毒株的同源性在98.2%～100%之间。研究以pVAX1为载体,构建了单独表达TGEV S基因、N基因的真核表达质粒pVAX-S、pVAX-N以及融合表达TGEV S基因、N基因的真核表达质粒pVAX-S-N。以脂质体转染法将构建的三种真核表达质粒分别转染COS-7细胞,并以间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达。结果显示,转染的COS-7细胞呈现特异性荧光,表明上述构建的3种重组质粒可在体外正确表达。TGEV S基因与N基因真核表达质粒pVAX-S、pVAX-N与pVAX-S-N的成功构建为TGEV DNA疫苗的进一步研究奠定了基础。2.猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子及猪白细胞介素6基因的克隆与表达研究采用RT-PCR方法从经刀豆蛋白A（ConA）刺激的猪外周血淋巴细胞中分别扩增出猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（pGM-CSF）及猪白细胞介素6（pIL-6）基因并将其克隆至pMD-19T载体,构建重组质粒19T-GM与19T-IL6。核苷酸序列测定与分析表明:扩增的pGM-CSF基因ORF长度为435 bp,可编码144个氨基酸残基,扩增的pIL-6基因ORF长度为639 bp,可编码212个氨基酸残基。本研究一方面以pET-32a（+）为载体,分别对pGM-CSF与pIL-6的成熟蛋白编码区进行了原核表达,并制备了相应pGM-CSF与pIL-6重组蛋白的多克隆抗血清;另一方面以pVAX1为载体,分别构建了表达pGM-CSF与pIL-6的真核表达质粒pVAX-GM与pVAX-IL-6,体外将上述两种质粒转染COS-7细胞后,通过Western-blot检测到pGM-CSF与pIL-6在细胞中的表达。pVAX-GM与pVAX-IL-6的成功构建将其作为DNA疫苗佐剂的应用奠定了基础。3.TGEV DNA疫苗免疫原性的研究分别将TGEV DNA疫苗pVAX-S、pVAX-S-N、pVAX-S+pVAX-N、pVAX-S+pVAX-IL6与pVAX-S+pVAX-GM通过腿部肌肉注射6周龄NIH小鼠,间隔两周加强免疫一次,共免疫3次。分别在首疫后的14、35与42d通过间接ELISA测定免疫小鼠血清特异性TGEV IgG抗体水平。结果表明:各免疫组均可有效诱导特异性TGEV血清IgG抗体的产生,显示了TGEV DNA疫苗良好的免疫原性。pVAX-S+pVAX-N质粒混合免疫组抗体水平高于pVAX-S单基因质粒免疫组以及双基因融合表达质粒pVAX-S-N免疫组,在免疫后的35d与42d存在极显着性差异（P＜0.01）。同时,pVAX-S免疫组抗体水平在整个免疫过程中高于pVAX-S-N免疫组,在免疫后42天差异极显着（P＜0.01）。pVAX-IL6与pVAX-GM作为基因佐剂对TGEV抗体的产生均有促进作用,pVAX-S+pVAX-IL6免疫组TGEV抗体水平高于pVAX-S+pVAX-GM组,二者在免疫后的35d、42d均存在显着性差异（P＜0.05）。在首疫后的42d采集免疫小鼠外周血,采用流式细胞仪进行CD3+、CD4+与CD3+、CDS+T淋巴细胞亚群数量检测,结果显示,pVAX-S肌肉注射小鼠后可有效激发免疫小鼠的细胞免疫应答。pVAX-N、pVAX-IL6、pVAX-GM对细胞免疫应答均有不同程度的加强作用,pVAX-N对细胞免疫应答的促进作用优于pVAX-IL6,而后者优于pVAX-GM。4.减毒沙门氏菌携带TGEV S基因DNA疫苗口服免疫的研究研究将真核表达质粒pVAX-S电转化入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中,构建了携带TGEV S基因DNA疫苗的重组减毒沙门氏菌SL7207（pVAX-S）。将SL7207（pVAX-S）体外感染小鼠腹腔巨噬细胞,通过间接免疫荧光证实pVAX-S被有效传递入细胞进行了目的蛋白的表达。小鼠灌胃接种SL7207（pVAX-S）后,提取小鼠回肠末端肠道细胞总RNA为模板,通过RT-PCR检测到S基因的转录。将重组菌以5×108、1×109与2×109CFU/只的剂量灌胃接种小鼠,表明SL7207（pVAX-S）具有相对良好的安全性。将重组菌分别以1×107CFU、1×108CFU与1×109 CFU/只的剂量灌胃接种小鼠,检测小鼠免疫后特异性TGEV血清IgG以及肠道IgA抗体水平。结果表明,重组菌可有效激发免疫小鼠特异性TGEV血清IgG以及肠道IgA抗体的产生,具有良好的免疫原性。通过比较三个不同剂量免疫组间的抗体水平进一步表明,免疫剂量直接影响到激发的特异性抗体应答强度:1×107 CFU免疫剂量只能激发微弱的特异性血清IgG与肠道IgA抗体,整个免疫过程中1×109 CFU免疫剂量组的特异性TGEV血清IgG与肠道IgA抗体在三个免疫组中最高,且在免疫后第六周显着高于（P＜0.05）1×108 CFU免疫组。研究为TGEV口服DNA疫苗的研究和应用奠定了基础。
二、结核分支杆菌抗原ESAT-6真核表达质粒在COS-7中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、结核分支杆菌抗原ESAT-6真核表达质粒在COS-7中的表达（论文提纲范文）
（1）结核分枝杆菌Rv3586结构域基因真核表达载体的构建及鉴定（论文提纲范文）
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 目的基因的PCR扩增 |
| 1.2.2 真核表达载体的构建 |
| 1.2.3 真核表达载体的转染 |
| 1.2.4 目的基因表达的间接免疫荧光检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 Rv3586结构域基因的PCR扩增 |
| 2.2 Rv3586结构域基因真核表达载体的PCR鉴定 |
| 2.3 Rv3586结构域基因真核表达载体的酶切鉴定 |
| 2.4 Rv3586结构域基因在真核细胞COS-7中的表达鉴定 |
| 3 讨论 |
（2）耻垢分枝杆菌EsxA、EsxB及细胞壁对BCG免疫影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1.1 牛结核病危害、诊断及免疫进展 |
| 1.2 非结核分枝杆菌在动物和人疾病防控中的作用 |
| 1.3 耻垢分枝杆菌及其应用 |
| 1.4 分枝杆菌细胞壁及其免疫学作用 |
| 1.5 分枝杆菌EsxA、EsxB的研究进展 |
| 1.6 免疫佐剂Quil A的性质及应用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 实验一 3种非结核分枝杆菌esxB基因及耻垢分枝杆菌esxA基因的克隆与序列分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 实验二 耻垢分枝杆菌EsxA、EsxB的原核表达 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 实验三 耻垢分枝杆菌esx A、esxB真核表达载体的构建 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 实验四 耻垢分枝杆菌EsxA、EsxB及细胞壁对小鼠免疫BCG效果的影响 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）结核分枝杆菌TB10.4真核表达质粒的构建及免疫特性鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 真核表达质粒pVAX1-TB10.4、pVAX1-GFP-TB10.4的构建和鉴定 |
| 2.2 目的基因的转录水平测定 |
| 2.3 间接免疫荧光试验 |
| 2.4 重组质粒诱导小鼠脾细胞IFN-γ和IL-4水平测定 |
| 2.5 重组质粒诱导小鼠特异性抗体水平测定 |
| 3 讨论 |
（4）新型高通量酵母双杂交体系的构建及结核主要抗原互作羊驼抗体的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表(ABBREVIATION) |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 蛋白互作网络及主要研究手段 |
| 1.2 高通量测序技术 |
| 1.3 PHIC31/ATT整合酶系统 |
| 1.4 腺相关病毒 |
| 1.5 连接肽 |
| 1.6 结核 |
| 1.6.1 结核病 |
| 1.6.2 结核分枝杆菌免疫逃逸及与宿主互作 |
| 1.7 纳米抗体及其研究进展 |
| 1.8 本课题设计思路 |
| 第2章 研究目的和意义 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 质粒、菌株、细胞系和实验动物 |
| 3.1.2 主要的试剂和仪器 |
| 3.1.3 培养基及其配制 |
| 3.1.4 主要缓冲液与相关试剂及其配制 |
| 3.1.5 分子生物学分析软件 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 常用反应体系 |
| 3.2.2 DNA纯化分离的方法 |
| 3.2.3 限制性内切酶酶切反应 |
| 3.2.4 PCR产物或酶切产物的电泳检测 |
| 3.2.5 外源DNA片段与质粒载体的连接以及同源重组的方法反应 |
| 3.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) |
| 3.2.7 连接产物的转化 |
| 3.2.8 重组质粒的制备与鉴定 |
| 3.2.9 脂质体转染细胞的方法 |
| 3.2.10 腺相关病毒的包装 |
| 3.2.11 病毒的收集 |
| 3.2.12 鼠血液中淋巴细胞分离操作 |
| 3.2.13 细胞样品总RNA的提取、RT-PCR |
| 3.2.14 间接免疫荧光测定病毒效价 |
| 3.2.15 酵母双杂交筛选互作蛋白 |
| 第4章 结果与分析 |
| 4.1 构建新型高通量酵母双杂交体系重组载体 |
| 4.2 构建新型高通量酵母双杂交体系的阳性互作蛋白 |
| 4.2.1 solexa测序接头对蛋白表达的影响 |
| 4.2.2 后期高通量测序文库构建的新方法 |
| 4.3 结核分枝杆菌膜蛋白、分泌蛋白、脂蛋白诱饵文库构建以及宿主天然免疫相关猎物文库构建 |
| 4.3.1 结核分枝杆菌膜蛋白、分泌蛋白、脂蛋白诱饵文库构建 |
| 4.3.2 结核分枝杆菌H37Rv膜蛋白、分泌蛋白、脂蛋白猎物文库的构建 |
| 4.4 运用新型高通量酵母双杂交系统构建蛋白互作网络 |
| 4.4.1 诱饵蛋白文库与猎物蛋白文库杂交 |
| 4.4.2 运用新系统构建高通量测序文库 |
| 4.4.3 高通量测序及分析 |
| 4.5 构建半人工合成羊驼抗体猎物文库,筛选结核互作羊驼抗体 |
| 4.5.1 半人工合成羊驼抗体猎物文库的构建 |
| 4.5.2 筛选结核互作羊驼抗体 |
| 4.5.3 结核互作羊驼抗体的验证 |
| 第5章 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）抗结核分枝杆菌DNA疫苗的构建及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 菌株和实验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 质粒构建 |
| 1.2.1. 1 Ag85a/p VAX1和Ag85b/p VAX1单基因质粒构建 |
| 1.2.1. 2 Ag85a-Esat6/p VAX1和Ag85b-Esat6/p VAX1融合基因质粒的构建 |
| 1.2.2 4种重组质粒的细胞转染和Western blot检测 |
| 1.2.3 在体电脉冲(in vivo electroporation,EP)辅助质粒免疫健康BALB/c小鼠 |
| 1.3 统计学结果处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 TB DNA疫苗的构建 |
| 2.2 重组质粒转染细胞与蛋白表达鉴定 |
| 2.3 ELISA法测定小鼠血清特异性抗-Ag85a或抗-Ag85b的抗体水平 |
| 2.4 ELISPOT法测定小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ的活性 |
| 3 讨论 |
（6）结核杆菌ESAT6基因密码子优化真核载体的构建及其免疫效应的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 A 英中文术语缩略语对照表 |
| 附录 B 常用试剂配制 |
| 附录 C 个人简历与发表的论文 |
| 附录 D 综述 |
| 参考文献 |
（7）结核分枝杆菌TB10.4蛋白调节RAW264.7细胞自噬、炎性因子分泌及其真核表达质粒构建和免疫原性的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 结核分枝杆菌的免疫逃逸机制 |
| 1 分枝杆菌的侵入 |
| 2 分枝杆菌的免疫逃逸机制 |
| 2.1 抑制吞噬体-溶酶体的融合 |
| 2.2 抵抗活性氮中间体(RNI)和活性氧自由基(ROS) |
| 2.3 抑制MHC分子的加工和提呈 |
| 3 结核分枝杆菌与细胞自噬 |
| 3.1 自噬与自噬发生的机制 |
| 3.2 调控自噬清除分枝杆菌 |
| 参考文献 |
| 第一章 TB10.4蛋白调节脂多糖诱导RAW264.7细胞自噬和炎性因子分泌的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 TB10.4对自噬的影响 |
| 2.2 TB10.4对LPS诱导细胞中细胞因子分泌的影响 |
| 2.3 TB10.4对LPS诱导RAW264.7细胞产生NO的影响 |
| 2.4 ERK/AKT/p70S6K信号激活试验 |
| 2.5 BCG感染试验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 TB10.4蛋白真核表达质粒的构建及其免疫原性的初步鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、菌株、细胞株和实验动物 |
| 1.2 主要试剂和培养基 |
| 1.3 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 基因的扩增 |
| 2.2 真核表达质粒pVAX1-TB10.4、pVAX1-GFP-TB10.4的构建 |
| 2.3 pVAX1-TB10.4、pVAX1-GFP-TB10.4在细胞中的表达 |
| 2.4 pVAX1-TB10.4免疫原性的分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（8）PPE68/Ipr1基因的表达、鉴定及初步应用（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名称对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 Ipr1 基因原核表达质粒的构建及鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 PPE68/Ipr1 真核共表达质粒的构建及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 PPE68/Ipr1 重组BCG 的构建及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 本课题的创新之处 |
| 本课题的不足之处 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
（9）禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合DNA疫苗构建及免疫研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 选题背景 |
| 1.禽传染性支气管炎研究概况 |
| 2.禽传染性支气管炎基因工程疫苗研究概况 |
| 3.多表位DNA疫苗的研究概况 |
| 4.CpG作为免疫佐剂的研究进展 |
| 5.细胞因子作为DNA疫苗佐剂的研究进展 |
| 本研究前期工作基础 |
| 存在的问题 |
| 本研究的内容及目的意义 |
| 本研究的技术路线 |
| 第一章 禽传染性支气管炎病毒S1、S2、N蛋白抗原表位预测筛选及多表位嵌合基因克隆 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 数据库、生物信息学软件 |
| 2.1.2 质粒、宿主菌和细胞株 |
| 2.1.3 工具酶及试剂及主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 IBV S1、S2、N蛋白抗原表位的预测分析 |
| 2.2.2 IBV S1、S2、N蛋白抗原表位的确定 |
| 2.2.3 IBV S1、S2、N蛋白各抗原表位基因的获取 |
| 2.2.4 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的拼接 |
| 2.2.5 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的克隆及鉴定 |
| 2.2.6 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的生物信息学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 IBV S1、S2、N蛋白B细胞抗原表位的预测结果 |
| 3.2 IBV S1、S2、N蛋白T细胞抗原表位的预测结果 |
| 3.3 IBV S1、S2、N蛋白各抗原表位基因片段的选择及合成 |
| 3.4 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的拼接结果 |
| 3.5 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的鉴定结果 |
| 3.6 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的结构特征分析 |
| 4.讨论 |
| 4.1 关于IBV的免疫机理 |
| 4.2 IBV S1、S2、N蛋白抗原表位的分析及选择 |
| 4.3 IBV S1、S2、N蛋白各抗原表位的获取及嵌合基因的拼接 |
| 4.4 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的构建策略 |
| 4.5 IBV S1、S2、N蛋白多表位嵌合基因F的生物信息学特征 |
| 5.小结 |
| 第二章 禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合基因原核表达及ELISA方法的建立 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、宿主菌 |
| 2.1.2 工具酶及试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 IBV多表位嵌合基因原核表达载体的构建 |
| 2.2.2 IBV多表位嵌合基因的原核诱导表达 |
| 2.2.3 IBV多表位嵌合基因原核表达产物的鉴定 |
| 2.2.4 IBV多表位嵌合基因原核表达条件的优化 |
| 2.2.5 IBV多表位嵌合基因重组蛋白的分布 |
| 2.2.6 IBV多表位嵌合基因重组蛋白的纯化 |
| 2.2.7 IBV多表位嵌合蛋白间接ELISA方法的建立 |
| 3.结果 |
| 3.1 IBV多表位嵌合基因原核表达载体pET-32a-F的鉴定 |
| 3.2 IBV多表位嵌合基因表达产物的SDS-PAGE及Western blots |
| 3.3 IBV多表位嵌合基因原核表达诱导时间、浓度、温度的筛选 |
| 3.4 IBV多表位嵌合基因重组蛋白的分布及纯化 |
| 3.5 IBV多表位嵌合蛋白间接ELISA方法的建立 |
| 4.讨论 |
| 4.1 IBV多表位嵌合蛋白的表达系统 |
| 4.2 IBV多表位嵌合蛋白表达条件的优化 |
| 4.3 IBV多表位嵌合蛋白的回收及活性 |
| 4.4 关于IBV多表位嵌合蛋白的间接ELISA方法 |
| 5.小结 |
| 第三章 禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合基因DNA疫苗构建及真核表达检测 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、宿主菌和细胞株 |
| 2.1.2 工具酶及试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 IBV结构蛋白多表位嵌合基因真核表达载体的构建 |
| 2.2.2 鸡白介素IL-1β/2/18真核表达质粒的构建 |
| 2.2.3 IBV结构蛋白多表位嵌合基因真核表达检测 |
| 3.结果 |
| 3.1 pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F质粒的鉴定 |
| 3.2 pcDNA-IL-1β、pcDNA-IL-2、pcDNA-IL-18质粒的鉴定 |
| 3.3 IBV多表位嵌合基因及鸡白介素真核表达转录产物RT-PCR检测 |
| 3.4 pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F质粒表达产物的间接免疫荧光检测 |
| 4.讨论 |
| 4.1 关于多表位DNA疫苗 |
| 4.2 不同载体于体外表达IBV多表位嵌合基因 |
| 4.3 关于IBV多表位嵌合基因真核表达质粒的体外转染 |
| 4.4 影响外源基因表达的因素 |
| 4.5 IBV结构蛋白多表位嵌合基因的体外表达的检测 |
| 5.小结 |
| 第四章 禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合基因DNA疫苗配制和免疫研究 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、实验动物和攻毒用毒株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 质粒的制备与纯化 |
| 2.2.2 脂质体的制备、转染效率的检测 |
| 2.2.3 DNA疫苗的配制 |
| 2.2.4 pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F、pcDNA-F+IL-1β/IL-2/IL-18 DNA疫苗的免疫原性研究 |
| 2.2.5 IBV多表位嵌合基因DNA疫苗免疫组的攻毒保护性实验 |
| 2.2.6 IBV多表位嵌合基因DNA疫苗的分布及整合安全性检测 |
| 3.结果 |
| 3.1 质粒的鉴定 |
| 3.2 脂质体的转染效率检测 |
| 3.3 pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F质粒DNA疫苗免疫原性测定 |
| 3.3.1 免疫后CD4+T细胞亚群的检测 |
| 3.3.2 免疫后CD8+T细胞亚群的检测 |
| 3.3.3 免疫后ELISA抗体效价的检测 |
| 3.4 pcDNA-F+IL-1β/IL-2/IL-18 DNA疫苗免疫原性测定 |
| 3.4.1 免疫后CD4+T细胞亚群的检测 |
| 3.4.2 免疫后CD8+T细胞亚群的检测 |
| 3.4.3 免疫后ELISA抗体效价的检测 |
| 3.5 攻毒实验结果 |
| 3.6 IBV多表位嵌合基因DNA疫苗的分布及整合安全性检测 |
| 4.讨论 |
| 4.1 DNA疫苗的配制和免疫 |
| 4.2 pVAX1-F、pcDNA-F、VR1020-F质粒DNA疫苗的免疫效果 |
| 4.3 pcDNA-F+IL-1β/IL-2/IL-18 DNA疫苗的免疫效果 |
| 4.4 关于攻毒保护性试验 |
| 4.5 关于DNA疫苗的分布和整合可能性 |
| 5.小结 |
| 结论 |
| 文献综述 |
| 1.禽传染性支气管炎研究概况 |
| 2.禽传染性支气管炎病毒抗原表位研究进展 |
| 3.禽传染性支气管炎基因工程疫苗研究概况 |
| 4.多表位疫苗的研究概况 |
| 5.CpG作为免疫佐剂的研究进展 |
| 6.细胞因子作为基因佐剂的研究进展 |
| 7.DNA疫苗的组织分布 |
| 8.DNA疫苗的整合可能性 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录:英汉缩略名词对照表 |
| 在读博士期间发表的论文情况 |
（10）猪传染性胃肠炎病毒DNA疫苗的构建与免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.猪传染性胃肠炎病毒研究进展 |
| 1.1 TGEV的一般生物学特征 |
| 1.2 TGEV的感染与流行特点 |
| 1.3 TGEV致病机理 |
| 1.4 TGEV基因组结构、复制与表达 |
| 1.5 TGEV结构蛋白及功能研究 |
| 1.6 TGEV基因工程疫苗的研究 |
| 2.增强DNA疫苗免疫效果的研究进展 |
| 2.1 目的基因的选择与修饰 |
| 2.2 DNA疫苗载体的优化 |
| 2.3 DNA疫苗免疫接种途径与方法的优化 |
| 2.4 利用细胞因子佐剂提高DNA疫苗的有效性 |
| 3.减毒沙门氏菌作为DNA疫苗载体的研究进展 |
| 3.1 沙门氏菌简介 |
| 3.2 沙门氏菌的基因缺失减毒 |
| 3.3 减毒沙门氏菌的侵入途径 |
| 3.4 携带DNA疫苗的减毒沙门氏菌诱发免疫应答的机制 |
| 3.5 减毒沙门氏菌的作为DNA疫苗载体的优势与应用 |
| 第二章 猪传染性胃肠炎病毒S基因与N基因的克隆及真核表达质粒的构建 |
| 1.引言 |
| 2.材料 |
| 2.1 毒株、菌株、质粒和细胞 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 试剂配制 |
| 2.4 主要仪器设备 |
| 3.方法 |
| 3.1 TGEV S基因与N基因扩增用引物设计 |
| 3.2 TGEV的增殖 |
| 3.3 TGEV RNA的提取 |
| 3.4 TGEV S基因与N基因的RT-PCR扩增 |
| 3.5 TGEV S基因与N基因的克隆 |
| 3.6 TGEV S基因与N基因T-A克隆质粒的鉴定 |
| 3.7 TGEV S基因与N基因的核苷酸序列测定与分析 |
| 3.8 TGEV S基因与N基因表达质粒pVAX-S与pVAX-N的构建 |
| 3.9 TGEV S基因N基因融合表达质粒pVAX-S-N的构建 |
| 3.10 TGEV S基因与N基因真核表达质粒的体外表达 |
| 4.结果与分析 |
| 4.1 TGEV的增殖结果 |
| 4.2 TGEV S基因N基因的RT-PCR结果 |
| 4.3 TGEV S基因N基因T-A克隆质粒的鉴定结果 |
| 4.4 TGEV S基因与N基因核苷酸序列测定结果 |
| 4.5 同源性比较结果 |
| 4.6 TGEV S蛋白N端与N蛋白的亲水性、表面性与抗原性预测分析 |
| 4.7 TGEV S基因N基因真核表达质粒鉴定结果 |
| 4.8 三种构建的真核表达质粒表达检测结果 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 第三章 猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因与猪白细胞介素6基因的克隆及表达 |
| 1.引言 |
| 2.材料 |
| 2.1 菌株与质粒 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 试剂配制 |
| 2.4 主要仪器设备 |
| 3.方法 |
| 3.1 猪外周血淋巴细胞的分离与诱导培养 |
| 3.2 猪外周血淋巴细胞总RNA的提取 |
| 3.3 pGM-CSF与pIL-6基因扩增用引物设计 |
| 3.4 pGM-CSF与pIL-6基因的RT-PCR扩增 |
| 3.5 pGM-CSF与pIL-6基因的克隆 |
| 3.6 pGM-CSF与pIL-6基因T-A克隆质粒的鉴定 |
| 3.7 pGM-CSF与pIL-6基因克隆重组质粒的序列测定与分析 |
| 3.8 pGM-CSF与pIL-6原核表达质粒的构建及在大肠杆菌中的表达 |
| 3.9 pGM-CSF与pIL-6原核表达重组蛋白的纯化 |
| 3.10 pGM-CSF与pIL-6重组蛋白多克隆抗血清的制备 |
| 3.11 pGM-CSF与pIL-6真核表达质粒的构建 |
| 3.12 pGM-CSF与pIL-6真核表达质粒的体外表达 |
| 4.结果与分析 |
| 4.1 pGM-CSF及pIL-6基因的RT-PCR扩增结果 |
| 4.2 pGM-CSF及pIL-6基因克隆的鉴定结果 |
| 4.3 pGM-CSF及pIL-6基因核苷酸序列测定及氨基酸序列推导结果 |
| 4.4 pGM-CSF及pIL-6基因序列分析结果 |
| 4.5 pGM-CSF与pIL-6原核表达质粒的构建结果 |
| 4.6 pGM-CSF与pIL-6基因在大肠杆菌中的表达结果 |
| 4.7 rpGM-CSF与rpIL-6重组蛋白的纯化结果 |
| 4.8 pGM-CSF与pIL-6基因真核表达质粒的鉴定结果 |
| 4.9 pVAX-GM与pVAX-IL6表达产物的Western-blot检测结果 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 第四章 TGEV DNA疫苗免疫原性的研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料 |
| 2.1 质粒 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 试验动物 |
| 2.4 试剂配制 |
| 2.5 主要仪器设备 |
| 3.方法 |
| 3.1 TGEV DNA疫苗的制备 |
| 3.2 TGEV DNA疫苗肌肉注射小鼠免疫原性的研究 |
| 4.结果与分析 |
| 4.1 TGEV DNA疫苗用质粒纯度的鉴定结果 |
| 4.2 TGEV DNA疫苗免疫后特异性抗TGEV血清IgG抗体的检测结果 |
| 4.3 TGEV DNA疫苗免疫后外周血T淋巴细胞亚类的检测结果 |
| 5.讨论与小结 |
| 6.小结 |
| 第五章 减毒沙门氏菌携带TGEV S基因DNA疫苗口服免疫的研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料 |
| 2.1 菌株与质粒 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 3.方法 |
| 3.1 携带TGEV S基因DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建 |
| 3.2 重组沙门氏菌体外感染小鼠腹腔巨噬细胞实验 |
| 3.3 重组沙门氏菌体内感染小鼠后RT-PCR检测S基因的转录 |
| 3.4 体外重组沙门氏菌中质粒的稳定性 |
| 3.5 重组沙门氏菌对小鼠的安全性试验 |
| 3.6 重组沙门氏菌对小鼠的免疫原性试验 |
| 4.结果与分析 |
| 4.1 携带TGEV DNA疫苗减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建 |
| 4.2 沙门氏菌传递的质粒在巨噬细胞中的表达 |
| 4.3 重组沙门氏菌体内感染小鼠后RT-PCR检测S基因的转录 |
| 4.4 重组沙门氏菌对小鼠的安全性试验 |
| 4.5 体外重组沙门氏菌中质粒的稳定性 |
| 4.6 TGEV血清IgG和肠道粘膜IgA抗体的间接ELISA检测 |
| 4.7 沙门氏菌血清IgG和肠道粘膜IgA抗体的间接ELISA检测 |
| 5.讨论 |
| 6.小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附件材料 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、结核分支杆菌抗原ESAT-6真核表达质粒在COS-7中的表达（论文参考文献）
- [1]结核分枝杆菌Rv3586结构域基因真核表达载体的构建及鉴定[J]. 吴骏杰,王辛,宋世杰,姚庆港,单炳乙,王莹,路延之,柏银兰. 现代生物医学进展, 2017(18)
- [2]耻垢分枝杆菌EsxA、EsxB及细胞壁对BCG免疫影响的研究[D]. 管清华. 吉林农业大学, 2016(01)
- [3]结核分枝杆菌TB10.4真核表达质粒的构建及免疫特性鉴定[J]. 艾能,孟闯,徐正中,刘泽,陈祥,焦新安. 扬州大学学报(农业与生命科学版), 2016(02)
- [4]新型高通量酵母双杂交体系的构建及结核主要抗原互作羊驼抗体的筛选[D]. 周美玲. 华中农业大学, 2016(05)
- [5]抗结核分枝杆菌DNA疫苗的构建及免疫原性研究[J]. 饶桂荣,张换敬,石燕飞,黄彬,王洪敏,杨富强,陈光明. 中国免疫学杂志, 2016(05)
- [6]结核杆菌ESAT6基因密码子优化真核载体的构建及其免疫效应的研究[D]. 王英. 蚌埠医学院, 2013(10)
- [7]结核分枝杆菌TB10.4蛋白调节RAW264.7细胞自噬、炎性因子分泌及其真核表达质粒构建和免疫原性的初步研究[D]. 艾能. 扬州大学, 2013(04)
- [8]PPE68/Ipr1基因的表达、鉴定及初步应用[D]. 靳志栋. 重庆医科大学, 2011(11)
- [9]禽传染性支气管炎病毒多表位嵌合DNA疫苗构建及免疫研究[D]. 田浪. 四川农业大学, 2009(07)
- [10]猪传染性胃肠炎病毒DNA疫苗的构建与免疫原性研究[D]. 杨恒. 四川农业大学, 2009(07)