一、猪胸膜肺炎放线杆菌毒素I基因的克隆、表达及其ELISA检测方法的建立（论文文献综述）
冯逸雪[1]（2021）在《三种猪呼吸道病原TaqMan多重荧光定量PCR检测方法的建立和应用》文中指出胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌与猪肺炎支原体临床症状相似,且常与其他呼吸道病原形成混合感染,临床鉴别诊断十分困难。建立一种能够快速、灵敏、高特异性且可量化的检测方法,对这三种呼吸道疾病的早期诊断、预防控制及净化具有重要意义。以NCBI中已有上述3种病原基因序列为参考,针对胸膜肺炎放线杆菌的ApxⅣ基因、副猪嗜血杆菌Omp2基因、猪肺炎支原体的P46基因分别设计三对特异性引物和三条TaqMan探针,建立能够同时检测三种病原的TaqMan多重实时荧光定量PCR方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行试验。并对临床样品进行了应用检测,同时与普通PCR方法进行了对比。获得如下结果:成功建立了胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体TaqMan多重实时荧光定量PCR检测方法,通过对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪2型圆环病毒、猪伪狂犬病毒、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠埃希菌、巴氏杆菌等病原检测,不同病原之间无交叉反应,仅有胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体阳性模板有扩增信号。建立的TaqMan多重实时荧光定量PCR方法标准曲线具有良好的线性关系,胸膜肺炎放线杆菌标准曲线相关系数为0.999;副猪嗜血杆菌标准曲线相关系数为0.998;猪肺炎支原体标准曲线相关系数为1.000。建立的TaqMan多重实时荧光定量PCR方法最低检测拷贝数胸膜肺炎放线杆菌为9.14×100copies/μL、副猪嗜血杆菌1.18×101copies/μL、猪肺炎支原体1.55×101copies/μL,检测下限比常规PCR高103倍;重复试验变异系数在2%以下,重复性良好。使用本方法检测了284份临床样本,TaqMan多重实时荧光定量PCR病原检出率20.42%,其中胸膜肺炎放线杆菌28例,副猪嗜血杆菌31例,猪肺炎支原体44例,两种或三种病原同时存在28例,常规PCR病原检出率4.58%。
熊如月[2]（2020）在《猪传染性胸膜肺炎亚单位-灭活菌苗抗体检测方法建立及免疫抗体消长规律测定》文中研究说明猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）引起的猪呼吸系统传染病,急性发病时死亡率高,传染性强,给全世界养猪业造成了重大经济损失。疫苗防治仍然是预防该病的重要手段,也能减少抗生素的使用从而降低耐药性的产生。APP分泌的ApxⅠ、ApxⅡ和ApxⅢ毒素属于脂酰化蛋白质,同时是APP最主要的毒力因子和保护性抗原。本实验室已将三种重组的非脂酰化Apx毒素蛋白（rApxⅠA、rApxⅡA和rApxⅢA）与灭活的血清1型APP菌体抗原混合,制备出“猪传染性胸膜肺炎亚单位-灭活菌苗”,免疫猪产了生良好的多血清型交叉免疫保护力,且无明显副反应。本研究通过建立针对rApxⅠA、rApxⅡA、rApxⅢA的三种ELISA抗体检测方法,进行猪传染性胸膜肺炎亚单位-灭活菌苗的免疫试验,测定了其免疫后的抗体消长规律,为评价该疫苗的免疫效果及免疫程序的制定提供科学依据。主要研究结果如下:1.rApxⅠA、rApxⅡA和rApxⅢA间接ELISA方法的建立将实验室保存的重组质粒pQE-ApxⅠA、pQE-ApxⅡA和pQE-ApxⅢA分别转化入大肠杆菌M15感受态细胞,诱导表达了rApxⅠA、rApxⅡA和rApxⅢA重组蛋白,用纯化后的重组蛋白分别建立三种ELISA抗体检测方法,并进行了条件优化,重复性较好。rApxⅠA间接ELISA检测方法中,rApxⅠA抗原包被浓度22.57μg/m L,4℃过夜包被;5%BSA在37℃温箱封闭2h;血清稀释40倍,37℃孵育45min;酶标二抗1:5000稀释,37℃温箱反应30min;底物避光显色30min。在最佳反应条件下,阴阳临界值为0.267。rApxⅡA抗原包被浓度为39.88μg/m L,4℃过夜包被;1%BSA在37℃温箱封闭2h;血清稀释80倍后37℃温育45min;酶标二抗1:5000稀释,37℃温箱反应30min;底物避光室温显色30min;阴阳临界值为0.447的间接ELISA检测方法。rApxⅢA间接ELISA检测方法中,抗原稀释到11.10μg/m L,4℃过夜包被;5%BSA在37℃温箱封闭2h;血清稀释80倍,37℃孵育30min;酶标二抗1:5000稀释,37℃温箱反应30min;底物避光显色30min;阴阳临界值为0.283。2.疫苗抗体消长规律的测定在猪传染性胸膜肺炎亚单位-灭活菌苗免疫试验中,共购入9头50日龄仔猪,3头为空白对照组、6头为疫苗组,分别耳后肌肉注射本实验室制备的PBS对照和亚单位-灭活菌苗,免疫后28天加强免疫一次。首免后0、14、21、28、60、68、75、82、89、96、110天前腔静脉采血分离血清。ELISA检测结果显示,疫苗组免疫后rApxⅠA、rApxⅡA、rApxⅢA的抗体变化趋势基本一致:首免0天至28天的变化不明显,二次免疫后显着上升,疫苗组rApxⅠ抗体在首免后75天达到峰值（效价230倍）,rApxⅡ抗体在首免后60天达到峰值（效价483倍）,rApxⅢ抗体在首免后68天达到峰值（效价73倍）,而后抗体水平逐渐下降。一免后110天rApxⅠA、rApxⅡA、rApxⅢA的抗体仍维持在较高水平。本研究建立了三种间接ELISA抗体效价检测方法,重复性较好。猪传染性胸膜肺炎亚单位-灭活菌苗免疫后的抗体消长规律表明该疫苗能刺激机体产生rApxⅠA、rApxⅡA和rApxⅢA的特异性抗体,建议50日龄首免,首免后28天进行二免为宜。
朱春玲[3]（2020）在《抗菌肽MPX抵御猪胸膜肺炎放线杆菌感染的作用研究》文中指出由于抗生素不合理使用,导致细菌耐药性和超级细菌层出不穷。而抗菌肽被认为是最具潜力的抗生素替代品之一。抗菌肽是机体产生的一类小分子多肽,能够抵抗外来微生物入侵,是机体先天免疫系统的重要组成部分。抗菌肽凭借其分子量小,抗菌谱广,不易产生耐药性等优势,成为近年来研究热点。猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）是引起猪传染性胸膜肺炎的病原体,APP主要定殖在呼吸道,引起严重肺损伤,导致肺出血和坏死,临床特征从急性到慢性不等,给全球养猪业带来巨大经济损失。本研究主要围绕抗菌肽MPX与APP开展工作,具体如下:本研究首先选择了13种已报道的抗菌肽对APP进行活性测定,发现MPX对APP杀菌效果最佳（MIC=16μg/mL,显着低于其他肽）,体外研究还发现MPX可有效破坏APP细胞膜,导致菌体内容物的释放,主要表现为阳离子浓度的差异变化;利用激光共聚焦显微镜和扫描电子显微镜等技术证实抗菌肽MPX能够显着抑制APP生物被膜的形成;此外,通过qRT-PCR方法证实MPX能够调节APP毒力基因的表达,能够显着下调毒力基因黏附素Apa 1的表达,上调毒力基因PurC的表达;进一步研究发现APP毒力基因Sap A在APP抗菌肽耐受性方面发挥重要作用,以上结果表明,抗菌肽MPX具有良好的体外杀菌活性。小鼠模型上评价抗菌肽MPX的体内抗APP感染的作用效果。分别在APP鼻腔感染小鼠2 h后腹腔注射抗菌肽MPX,并以庆大霉素和抗菌肽PR-39为药物对照,结果发现抗菌肽MPX治疗后显着缓解APP对小鼠的致死性攻击,小鼠存活率高达85%,降低APP在肺脏中的定殖,减少血清中炎性因子TNF-α和IL-6的含量,此外,小鼠肺脏HE染色结果发现,抗菌肽MPX能够缓解小鼠的肺脏损伤和肺炎症状。以上结果表明,抗菌肽MPX在小鼠体内能够有效抵御APP的感染。为明确抗菌肽MPX通过调节肺脏差异基因的表达起到抗APP感染的效果,本研究采用新一代高通量测序技术对APP感染组小鼠和抗菌肽MPX治疗组以及空白对照组小鼠肺脏进行转录组学研究,结果发现:APP感染组小鼠与正常小鼠肺脏共有670个基因表达差异,其中包括618个上调基因和52个下调基因,差异表达基因主要集中在化合物和细胞大分子代谢、信号转导、细胞应激、炎症反应负调控等,差异基因主要参与在MAPK、钙离子调节等信号通路。APP感染后抗菌肽MPX治疗组与未治疗组共有63基因表达差异,其中包括上调基因35个和下调基因28个,差异基因主要集中在分子代谢,蛋白质互作,氧化应激和炎症反应等,差异基因主要参与MAPK、细胞粘附分子、NOD-样受体和钙离子调节等信号通路。本研究详细分析了抗菌肽MPX调控APP感染肺转录组差异,为抗菌肽治疗呼吸道感染研究提供理论参考。
程素芳[4]（2019）在《猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠA、ApxⅣA基因双重PCR方法的建立及多克隆抗体的制备》文中进行了进一步梳理猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia,PCP）是由猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）引起的以急性肺脏出血或慢性纤维素性胸膜粘连等为特征的一种呼吸道传染性疾病。Apx外毒素是APP最重要的致病因子,且有ApxI、ApxII、ApxⅢ和ApxⅣ4种毒素因子,其中ApxⅠ可引起疾病出现肺部典型病变,也是引起猪传染性胸膜肺炎的最强毒力因子,而ApxⅣ毒力相对较弱,但可由所有的APP分泌,且只有APP在动物体内时ApxⅣ才会被诱导表达,因此当ApxI、ApxⅣ两种毒素因子同时存在时,则会对猪传染性胸膜肺炎的诊断具有十分重要的临床价值。通过提取猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxIA和ApxIVA基因组DNA,建立双重PCR方法检测并扩增ApxIA和ApxIVA基因片段,并采用TA克隆技术获得重组质粒,然后进行生物信息学分析目的基因片段特性并进筛选,再进一步的蛋白表达、纯化及多克隆抗体制备。试验结果如下:1、成功建立了毒素ApxIA和ApxⅣA基因双重PCR体系,ApxIA和ApxⅣA在DNA模板浓度为240μmol/L和150μmol/L、引物浓度为2ng/mL、Tm值55℃条件下可同时获得两条较亮目的条带,且特异性和稳定性检测效果极佳。2、成功获得了pMD18–ApxIA、pMD18–ApxIVA重组质粒,通过基因生物信息学分析筛选出了基因片段长度为1 209 bp的ApxIA和目的基因片段长度为972bp的ApxⅣA的两段蛋白表达强基因片段。与NCBI上的基因序列进行同源性比较发现相似度均有90%以上。3、获得高效价的ApxIA和ApxⅣA多克隆抗体,经ELISA检测的效价分别可高达1:200000和1:50000;在此效价经Western Blot检测为阳性。结论:成功建了ApxI A和ApxⅣA基因双重PCR方法,其特异性、稳定性较强;获得了ApxI A和ApxⅣA基因的多克隆抗体,效价分别可高达1:200000和1:50000,为今后猪传染性胸膜肺炎的诊断防控提供了参考。
蔡瑶[5]（2019）在《传染性胸膜肺炎放线杆菌（7型）AdhE蛋白的原核表达及其免疫保护性研究》文中指出胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,App）是引起猪胸膜肺炎的病原体,胸膜肺炎是一种具有高度传染性的严重猪疾病,对全球各地的养殖业均造成了巨大的经济损失。猪胸膜肺炎以急性出血及慢性纤维素性胸膜肺炎为特征,可通过接触传染。AdhE是一种双功能酶,具有乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶的催化活性。近年来,大量研究结果表明AdhE在细菌感染宿主的过程中也发挥着重要调控作用。本试验以App 7型菌株感染小鼠肺组织后通过互作转录组分析获得的差异表达基因为前提,选取上调基因中差异表达倍数最高的基因AdhE作为研究对象。对该基因所编码的AdhE蛋白进行了基因克隆和原核表达,对该重组蛋白的免疫原性及其对小鼠的免疫保护作用进行了探究。1.App7型AdhE蛋白的原核表达及其免疫原性分析通过扩增App7型菌株的AdhE全基因,对其所编码的蛋白进行生物信息学分析,发现该蛋白高度保守。为了分析AdhE蛋白的免疫原性,本试验成功构建pET-32a（+）-AdhE大肠杆菌表达载体,于大肠杆菌BL21中表达,成功表达大小约为110kDa的蛋白。以纯化的rAdhE蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,结果显示在加强免疫后的小鼠血清中能检测到较高的IgG抗体水平,抗体滴度的对数值能达到lg=4.609,Western blot特异性检测结果显示,多克隆抗体中含有高水平抗rAdhE特异性抗体,进一步证明AdhE具有很强的免疫原性。2.App7型AdhE蛋白的免疫保护性分析本试验通过小鼠的攻毒保护性试验、肺组织病理切片分析以及监测以非致死剂量App感染小鼠前和感染后4、8、12、24、48h小鼠的细胞因子表达水平,对App的AdhE蛋白能否对App感染小鼠提供有效的免疫保护力进行评估。以致死剂量App7型或App1型菌株腹腔注射攻毒试验小鼠,结果显示PBS组小鼠均在36h内全部死亡,rAdhE组小鼠分别能获得获得90%（App7）或70%（App1）的保护力,保护力均略低于疫苗组的100%。组织病理学观察结果显示,相较于PBS组小鼠肺组织严重病变呈间质性肺炎且组织中有大量炎性细胞浸润,rAdhE组小鼠的肺组织病变较为轻微,仅肺泡壁以及支气管周围可见少量以中性粒细胞为主的炎性浸润,但是rAdhE组小鼠肺组织中的炎性细胞数量仍然略高于疫苗组免疫的小鼠肺组织。细胞因子监测结果发现,rAdhE组小鼠在感染App前即可诱导机体产生IFN-γ,激活宿主的天然免疫;在感染App初期4h内,PBS组和rAdhE组三种细胞因子相较感染前均呈现出显着高表达现象,小鼠为应对急性炎症而刺激机体产生大量炎性细胞因子;随着感染病程的发展,可明显观察到相较于PBS组小鼠,rAdhE组的小鼠IL-6、TNF-α和IFN-γ的表达显着受到了抑制,使得小鼠在感染12h内便将炎症反应控制在较低的水平,表明AdhE具有良好的免疫调节作用,通过调控小鼠体内IL-6、TNF-α和IFN-γ细胞因子的含量有效控制了细菌感染后的炎症反应。本研究证明了高度保守的AdhE蛋白具有良好的免疫原性以及免疫调节作用,具有抗App1和App7感染的交叉免疫保护作用。
田瑾[6]（2019）在《胸膜肺炎放线杆菌外毒素ApxⅠ的原核表达及其介导细胞毒性研究》文中研究指明胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）是引起猪传染性胸膜肺炎的病原菌。本研究旨在利用大肠杆菌原核表达系统获得具有生物学活性的ApxⅠ重组蛋白并对其介导的宿主细胞毒性进行初步研究。首先,进行了APP ApxⅠA基因的生物信息学分析。ApxⅠA蛋白含有1023个氨基酸,属稳定的亲水性蛋白,无跨膜螺旋和信号肽;预测其二级和三级结构,富含α螺旋结构（469,45.85%）,无规则卷曲（284,27.76%）,还有延展链（193,18.87%）和β转角（77,7.53%）;预测发现其第631-841位氨基酸为B细胞抗原表位密集区。其次,免疫制备了APP ApxⅠ多克隆鼠血清抗体。重组表达ApxⅠA’蛋白,将其皮下免疫小鼠3次获得免疫血清,间接ELISA检测其血清效价达到1:102400,通过免疫印迹证实能特异性识别ApxⅠA’重组蛋白。最后,表达并获得了具有溶血活性和介导细胞毒性的重组ApxⅠ蛋白。以大肠杆菌BL21（DE3）pLysS为表达菌,表达pET32a-ApxⅠCA质粒,获得ApxⅠ重组蛋白。90μg/ml该蛋白进行溶血实验能使1%绵羊红细胞完全溶解,证实其具有良好溶血活性;综合细胞形态学变化和CCK-8检测结果建立了以PAM为研究对象的重组ApxⅠ蛋白细胞毒性的细胞模型;50μg/ml的ApxⅠ重组蛋白刺激PAM细胞24h后,AO-EB染色可观察到细胞凋亡现象、Caspase-3的蛋白酶活力和mRNA的转录水平明显升高,证实本研究设定的低浓度该蛋白能通过细胞凋亡的方式介导细胞毒性。
曹雨柔[7]（2019）在《猪胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性脂蛋白的筛选与鉴定》文中提出猪胸膜肺炎（Porcine pleuropneumonia）是由猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）引起的猪高度传染的呼吸道疾病。APP具有18种血清型及多种毒力因子。目前市场上常见的猪胸膜肺炎疫苗为灭活疫苗和亚单位疫苗,但都存在不同程度的缺陷:灭活疫苗交叉保护力不足,亚单位疫苗免疫保护性因子有限,不能完全排阻细菌定植和持续感染。因此,有待进一步了解APP的致病特点,发掘更具有免疫保护潜力的抗原,以便开发更为有效的疫苗。研究显示,多种APP外膜脂蛋白在APP各种血清型中较为保守,被认为是潜在的疫苗候选蛋白。本实验旨在筛选并鉴定APP免疫保护性强的脂蛋白,为开发高效亚单位疫苗奠定基础。现将研究过程和主要结论简述如下:1.脂蛋白克隆表达引物的设计:本实验在前期研究中,通过生物信息学方法,从APP血清3型菌株JL03中,筛选到60个可能的脂蛋白,并对脂蛋白Lip40和PaIA的生物学特性进行了分析。因此,本研究将对余下的58个脂蛋白的免疫活性进行详细分析。经过序列分析,通过合理地去除了脂蛋白信号肽序列,引入合适的酶切位点,设计了脂蛋白克隆表达的引物。2.脂蛋白原核表达载体的构建:以APP JL03菌株基因组为模板,通过PCR扩增出58个脂蛋白基因。将58个脂蛋白基因片段连入pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,鉴定正确后提取质粒,并双酶切出正确的脂蛋白基因片段,连入原核表达载体pGEX-KG,构建重组表达质粒。最终获得了 55个表达质粒。3.重组脂蛋白的表达、纯化及免疫反应性分析:将构建成功的55个脂蛋白重组表达质粒转化E.coli BL21菌株,IPTG诱导重组脂蛋白超量表达,共有47个脂蛋白基因能够在大肠杆菌中表达。其中37个重组脂蛋白为可溶性表达,10个重组脂蛋白为非可溶性表达。用亲和层析法,纯化37个可溶性重组脂蛋白,并通过免疫印迹法,鉴定蛋白的免疫反应性。经鉴定,共有31个重组蛋白具有免疫学活性。本研究从中筛选出免疫反应性较强的5个脂蛋白（APJL 0386,APJL 0922,APJL 1380,APJL 1740和APJL 1976）,进行进一步分析。4.对小鼠的免疫保护性的鉴定:以筛选到的5个免疫学活性较好的脂蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,共免疫两次,然后用APP血清1型4074菌株对小鼠攻毒,以检验这5种脂蛋白的交叉保护作用。通过ELISA和WesternBlot检测小鼠体液免疫应答水平,发现各组免疫原能激发特异性免疫应答。APJL 1380、APJL 1976、APJL 0922、APJL 0386、APJL 1740对小鼠的保护率分别为92%、75%、75%、25%和42%。小鼠肺组织病理切片显示,以GST和PBS免疫的肺组织显示出动物急性和出血性肺炎病症,而免疫组中存活下来的小鼠显示出健康的肺切片。以主动免疫获得的免疫血清被动免疫BALB/c小鼠后,进行攻毒。针对蛋白质APJL1380、APJL1976、APJL0922、APJL0386和APJL1740的抗血清对小鼠的保护率分别为83%、92%、67%、33%和25%。病理切片结果同主动免疫结果相似,抗脂蛋白血清组小鼠显示出健康的肺切片,而抗GST和PBS血清组显示出明显的肺部病变。通过本研究,从APP菌株中,筛选出APJL0922、APJL1380和APJL1976这3个候选抗原,具有良好的免疫原性,能诱导动物产生高水平的体液免疫应答,且具有较高的免疫保护效力。这三个蛋白有望用于开发新的高效胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗,为猪胸膜肺炎的防控奠定基础。
张飞[8]（2018）在《胸膜肺炎放线杆菌GalT蛋白免疫保护与促炎功能研究》文中指出胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）是猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia,PCP）的致病菌,该病原能引起猪的纤维素性胸膜炎和出血性肺炎,给世界养猪业带来巨大的经济损失。研究证明胸膜肺炎放线杆菌具有多种毒力因子,包括Apx分泌外毒素、脂多糖、荚膜多糖等。这些毒力因子都是体外培养条件下表达的,对APP体内诱导抗原的研究并不多。体内诱导抗原是病原菌在感染过程中特异表达的抗原,这些抗原在致病过程中发挥着重要作用。鉴定胸膜肺炎防线杆菌体内诱导表达抗原,有利于进一步揭示其感染的机制。本研究运用体内诱导抗原技术筛选到APP的体内诱导抗原,证明这些抗原在感染过程中优先表达。免疫学实验证明APP体内诱导抗原半乳糖代谢相关酶（GalT）能诱导有效的体液免疫和细胞免疫应答,是良好的免疫原。研究证明GalT刺激巨噬细胞能促进促炎性细胞因子的分泌,同时揭示了此过程中的信号转导通路。具体工作如下:1、APP体内诱导抗原GalT的鉴定及转录分析本研究使用运用体内诱导抗原技术（IVIAT）鉴定了APP感染过程中体内特异表达的基因。对筛选结果的测序发现,共筛选到11个体内诱导抗原。对测序结果分析得出,这些基因分别涉及代谢、复制、转录调控和信号转导等细胞功能。此外,本研究还筛选到了3个功能未知的体内诱导抗原。运用荧光定量PCR对体内诱导抗原的表达水平分析显示,与体外培养相比,大部分体内诱导抗原在感染过程中都有不同程度的上调表达。PCR鉴定结果证明体内诱导（In vivo-induced,IVI）抗原广泛分布于APP不同的血清型。IVI抗原在APP感染过程中可能发挥重要作用。2、体内诱导抗原GalT对APP的感染提供免疫保护作用研究本研究对RnhB,GalU,GalT,Apl1061,Apl1166和HflX 6个体内诱导抗原进行了疫苗免疫保护试验。研究结果显示,不同免疫组的IgG水平均显着高于阴性对照组的水平（P<0.001）。除了RnhB,其它5个蛋白均能刺激淋巴细胞的增殖,其中rGalU和rGalT组表现为相对较高水平的刺激增殖活性（P<0.05）。在GalT免疫组,CD4+T细胞的比例显着高于阴性对照组（P<0.05）。此外,其它免疫组CD4+T细胞的含量均表现为不同程度的上调。细胞因子实验显示,不同蛋白均能刺激Th1型（IFN-g,IL-2）和Th2型（IL-4）细胞因子的分泌。免疫保护实验结果显示,蛋白rGalT,rAPL1166和rHflX能够提供较高的保护效率,分别为87.5,62.5和62.5%。其余3个免疫组表现为部分保护,保护效率均为25%。肺脏组织病理学分析结果显示,免疫组存活动物表现为相对正常的肺泡结构。本研究结果证明体内诱导抗原作为候选疫苗对于胸膜肺炎放线杆菌的感染可以提供部分保护。3、GalT对不同血清型的APP感染提供交叉免疫保护研究GalT是胸膜肺炎放线杆菌的一个重要抗原,在之前的研究种证明了其对APP的感染可以提供部分免疫保护。本研究的主要目的是研究GalT对不同血清型APP的保护作用和由GalT抗原刺激引起的免疫反应机理。生物信息学分析证明GalT在APP中为高度保守的基因,同时该基因还在多种病原菌种广泛存在。同源性分析结果显示,不同APP菌株GalT基因的相似性在78.9%到100%之间。间接ELISA结果证明胸膜肺炎放线杆菌L20和MS71全细胞灭活抗原不能诱导GalT特异性抗体的产生。免疫保护试验证明,源于APP L20的GalT重组融合蛋白,对不同血清型APP表现出交叉保护作用,APP血清1型MS71（50%,4/8）和APP血清5b型L20（75%,6/8）。组织病理学分析结果显示,与阴性对照组相比较,重组GalT蛋白免疫动物的肺组织表现出较轻微的病理变化。免疫组织化学分析结果显示,与正常对照组相比,APP感染组中性粒细胞浸润水平显着升高（P<0.001）;同时免疫组存活动物的中性粒细胞浸润水平显着低于阴性对照组。调理吞噬实验证明了GalT抗血清能促进中性粒细胞对APP的吞噬作用。在GalT抗血清的作用下,APP的存活率与阴性对照组相比显着降低（P<0.001）。本研究证明GalT是一种有效的交叉保护抗原,可作为对不同APP血清型的有交叉保护的候选疫苗进一步研究。4、APP体内诱导抗原GalT促炎功能研究GalT在革兰氏阴性菌中保守存在,研究证明其在病原菌的致病机理中发挥重要作用。APP属于巴氏杆菌科,是一种重要的呼吸系统病原菌。GalT在APP感染过程中的作用机理仍不清楚。本研究旨在分析GalT在APP感染发病机理中的作用。本研究首先重组表达了GalT蛋白,经过去内毒素处理,可作用于Raw264.7巨噬细胞系。研究结果表明,重组GalT蛋白刺激巨噬细胞Raw264.7,能够诱导促炎性细胞因子TNF-α,IL-1β和IL-6的分泌。与阴性对照组比较,GalT能显着提高巨噬细胞分泌促炎性细胞因子（P<0.05）。此外,抑制剂实验表明GalT通过P38和JNK MAPKs信号通路调节促炎性细胞因子的产生。同时,免疫印迹显示GalT刺激P38,ERK1/2和JNK MAPKs信号通路,该过程包括P38,ERK1/2,JNK MAPKs途径和NF-κB途径。TLR2和TLR4均参与了GalT的诱导过程,然而在诱导促炎性细胞因子过程中这两个受体分别正调控和负调控作用。本研究证明,GalT能诱导巨噬细胞分泌促炎性细胞因子,该过程为TLR-2和TLR-4依赖性,同时涉及P38,ERK1/2和JNK MAPKs信号通路。
朱岩昆[9]（2013）在《猪传染性胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立及OmpD15蛋白的抗原性分析》文中进行了进一步梳理猪传染性胸膜肺炎（Porcine infectious pleuropneumonia）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，App）引起猪的一种高度传染性呼吸道疾病，又称为猪接触性传染性胸膜肺炎。该致病菌引起的主要病症为肺出血、坏死和纤维素性渗出等。该病于1957年首次报道，自报道以来该病已在世界范围内广泛流行，并给许多国家的养猪产业造成了严重的经济损失。针对该病治疗的越早，经济损失也越少的特点，建立一种快速、灵敏、高效的诊断方法已成为新的研究热点。本研究根据胸膜肺炎放线杆菌表面抗原蛋白D15基因和16S rRNA分别设计一对引物，可以特异性扩增出637bp和431bp的目的片段。运用多重PCR技术，建立一种检测猪胸膜肺炎放线杆菌的方法。结果显示，已知的胸膜肺炎放线杆菌血清1型、3型、5a型、8型、10型均能扩增出特异性的目的片段。特异性检验时，血清型5a能扩增出目的片段，而其他对照细菌均未扩增出相应的目的片段；根据该多重PCR方法对临床分离的通过生理生化分析鉴定的5株疑似猪胸膜肺炎放线杆菌进行了分子鉴定，其中有4株鉴定为猪胸膜肺炎放线杆菌。以血清5a型作为待检菌进行灵敏性验证时，发现最低检出菌量为50个。表明通过表面抗原蛋白D15基因和16S rRNA建立的多重PCR方法灵敏度高，特异性强。该PCR方法的建立，为猪传染性胸膜肺炎的诊断提供了一种快捷高效的方法。为了指导临床用药，筛选出合适的临床药物，对以前分离的通过生理生化分析等鉴定和本次多重PCR确认的App进行了药敏试验和最小抑菌浓度（Minimum InhibitoryConcentration, MIC）试验，确认的4株App仅对10种临床常用药物中的头孢噻呋、阿米卡星、左旋氧氟沙星敏感，其它7种药物不敏感。对敏感药物进行MIC分析发现，左旋氧氟沙星对xx-1、xx-2、xx-3、xx-5四株菌株的MIC值分别为6.25/22、6.25/21、6.25/23、6.25/23，阿米卡星的MIC值分别为6.25/22、6.25/21、6.25/22、6.25/23，头孢噻呋的MIC值分别为37.5/22、37.5/22、37.5/23、37.5/24。通过药敏试验和最小抑菌浓度试验给临床用药及防治提供参考。App的毒力因子主要包括外毒素（Apx）、荚膜多糖（CPS）、脂多糖（LPS）、外膜蛋白（OMP）、转铁结合蛋白（TBp）等，近年的研究热点主要集中在外毒素，所以本研究克隆并构建了pMD-ApxⅠA、pMD-ApxⅡA、pMD-OmpD15载体，为序列分析及其后续研究奠定基础。ApxⅠA和ApxⅡA蛋白结构分析发现，ApxⅠA毒素蛋白α螺旋存在于1647aa，251269aa，344358aa，530546aa，β折叠分布较均匀，其亲水区域位于蛋白的后半段，ApxⅠA的主要抗原表位区域为1185aa，407979aa；ApxⅡA毒素蛋白α螺旋存在于7090aa，172190aa，248275aa，207431aa，446469aa，812834aa，β折叠除在361406aa有较大折叠外其他折叠较小，其亲水区域位于蛋白的后半段，ApxⅠA的主要抗原表位区域为418918aa。毒力因子Omp D15（Omp D15）是App一个重要的的表面抗原蛋白，蛋白结构分析表明其存在的抗原表位比较多，具有一定免疫原性，适合作为抗原抗体检测的重要靶标。因此本文以构建的pMD-D15载体为基础，构建了pET32a-OmpD15表达载体并在Rostta细胞中得到了表达，重组蛋白以包涵体的形式存在，通过梯度透析法获得纯化的重组蛋白。用初步纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠获得抗血清，以破碎的App作为抗原用ELISA方法检测抗血清，结果显示抗OmpD15血清能识别App，且3号免疫小鼠效价最高；Western-blot分析发现该重组蛋白可与抗App血清型5a血清中的抗体发生特异性反应，结果表明本实验所获得的D15重组蛋白具有良好的抗原性。用最小致死量App攻毒Balb/c小鼠，以D15重组蛋白作为抗原，ELISA方法监测小鼠体内抗体水平变化，发现攻毒后第三天即可在小鼠体内检测到OmpD15抗体的存在。通过OmpD15的原核表达、纯化及抗原性分析等的研究，为以表面抗原蛋白OmpD15开发亚单位疫苗、建立猪胸膜肺炎的ELISA诊断方法提供了理论基础及实验依据。
李本强[10]（2010）在《重组外膜蛋白抗原检测猪胸膜肺炎放线杆菌ELISA方法的建立》文中研究表明猪传染性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌引起的一种以肺脏的出血、坏死及纤维素性胸膜肺炎粘连为特征的传染病,给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失。猪胸膜肺炎放线杆菌的毒力因子很多,其中外膜蛋白被认为是该菌的重要毒力因子。本论文旨在应用分子生物学技术,对猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白基因片段在原核表达系统中表达,为建立猪传染性胸膜肺炎的诊断方法和研制高效的亚单位疫苗奠定基础。本研究以胸膜肺炎放线杆菌I型为研究对象,进行了培养和生物学特性的研究,并对小鼠进行了免疫学研究。结果表明血清I型菌株对小白鼠的半数致死量（LD50）为1.36×105.5CFU。第一次免疫小鼠两周后用试管凝集方法测得血清凝集价为4log2,第二次免疫小鼠两周后试管凝集价为6log2。首免两周后,以100 LD50菌液攻击相同血清型的小鼠,攻毒保护数5/6;二免两周后攻击相同剂量菌液,攻毒保护为6/6。根据已发表的猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型外膜蛋白基因序列设计合成了一对特异性引物,以放线杆菌血清I型菌株基因组DNA为模板,扩增出了预期约为1 319bp的目的片段,然后连接到pGEM-T-easy中,构建了重组质粒,重组质粒经酶切鉴定和序列分析鉴定为外膜蛋白基因。将所获得的猪胸膜肺炎放线杆菌血清I型的外膜蛋白基因序列,同Genbank上已报道的胸膜肺炎放线杆菌血清3、5、7型菌外膜蛋白基因序列之间进行同源性比较,同源性在97.9%-98.1%之间。运用鉴定正确的重组质粒,酶切回收外膜蛋白基因片段,插入到原核表达载体pET-15b,构建原核表达质粒。在转化大肠杆菌BL21中进行诱导,表达了重组外膜蛋白为48.766KD,经鉴定此蛋白与预期的胸膜肺炎放线杆菌的外膜蛋白大小相同。Western-blotting结果表明标准胸膜肺炎放线杆菌血清I型的外膜蛋白可与I型阳性血清发生反应,具有良好的免疫原性。将纯化后的表达产物外膜蛋白包被96孔酶标板,建立了间接ELISA方法。并对临床送检血清及APP标准阳性血清进行了检测。该方法的试验结果表明,建立的间接ELISA检测方法具有较好的敏感性和特异性,可用于初步检测。
二、猪胸膜肺炎放线杆菌毒素I基因的克隆、表达及其ELISA检测方法的建立（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪胸膜肺炎放线杆菌毒素I基因的克隆、表达及其ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
（1）三种猪呼吸道病原TaqMan多重荧光定量PCR检测方法的建立和应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 猪三种呼吸道病原及荧光定量PCR方法的研究概况 |
| 1.1 胸膜肺炎放线杆菌研究进展 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 毒力因子 |
| 1.1.3.1 外毒素 |
| 1.1.3.2 荚膜多糖 |
| 1.1.3.3 脂多糖 |
| 1.1.3.4 转铁结合蛋白 |
| 1.1.4 胸膜肺炎放线杆菌诊断方法的研究 |
| 1.2 副猪嗜血杆菌研究进展 |
| 1.2.1 病原学 |
| 1.2.2 流行病学 |
| 1.2.3 毒力因子 |
| 1.2.3.1 外膜蛋白 |
| 1.2.3.2 脂多糖 |
| 1.2.3.3 细胞致死性膨胀毒素 |
| 1.2.3.4 神经氨酸酶 |
| 1.2.4 副猪嗜血杆菌诊断方法的研究 |
| 1.3 猪肺炎支原体研究进展 |
| 1.3.1 病原学 |
| 1.3.2 流行病学 |
| 1.3.3 抗原蛋白 |
| 1.3.4 猪肺炎支原体诊断方法的研究 |
| 1.4 实时荧光定量PCR检测技术的研究进展 |
| 1.4.1 荧光染料法荧光定量PCR |
| 1.4.2 TaqMan探针法荧光定量PCR |
| 1.5 APP、HPS和 Mhp多重PCR及荧光定量PCR诊断方法的研究 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 APP、HPS及 Mhp TaqMan多重荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株,菌株和细胞株 |
| 2.1.2 试剂与耗材 |
| 2.1.3 试验仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物和探针的设计 |
| 2.2.2 细菌DNA的提取 |
| 2.3 质粒19T-APPapx IV的构建 |
| 2.3.1 Apx IV目的片段回收纯化 |
| 2.3.2 目的片段Apx IV与载体19T的连接 |
| 2.3.3 转化 |
| 2.3.4 阳性克隆的筛选和鉴定 |
| 2.3.5 19T-APPapx IV质粒的提取、浓度的测定及鉴定 |
| 2.4 质粒19T-HPSomp2 的构建 |
| 2.4.1 Omp2 目的片段回收纯化 |
| 2.4.2 目的片段Omp2 与载体19T的连接 |
| 2.4.3 转化 |
| 2.4.4 阳性克隆的鉴定 |
| 2.4.5 19T-HPSomp2 质粒的提取、浓度的测定及鉴定 |
| 2.5 质粒19T-Mhp P46 的构建 |
| 2.5.1 P46 目的片段回收纯化 |
| 2.5.2 目的片段P46 与载体19T的连接 |
| 2.5.3 转化 |
| 2.5.4 阳性克隆的鉴定 |
| 2.5.5 19T-Mhp P46 质粒的提取、浓度的测定及鉴定 |
| 2.6 TaqMan多重荧光定量PCR扩增 |
| 2.6.1 TaqMan多重荧光定量PCR反应条件优化 |
| 2.6.2 TaqMan多重荧光定量PCR特异性试验 |
| 2.6.3 TaqMan多重荧光定量PCR标准曲线建立 |
| 2.6.4 TaqMan多重荧光定量PCR灵敏性试验 |
| 2.6.5 TaqMan多重荧光定量PCR重复性试验 |
| 2.7 结果 |
| 2.7.1 阳性质粒鉴定结果 |
| 2.7.2 标准模板制备结果 |
| 2.7.3 TaqMan多重荧光定量PCR反应条件优化结果 |
| 2.7.4 TaqMan多重荧光定量PCR特异性试验结果 |
| 2.7.5 TaqMan多重荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 2.7.6 TaqMan多重荧光定量PCR灵敏性试验结果 |
| 2.7.7 TaqMan多重荧光定量PCR重复性试验结果 |
| 2.8 讨论 |
| 2.9 小结 |
| 第三章 APP、HPS及 Mhp TaqMan多重荧光定量PCR检测方法的临床应用 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A 主要仪器设备 |
| 附录 B 实验操作方法 |
| 附录 C 重组质粒测序结果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）猪传染性胸膜肺炎亚单位-灭活菌苗抗体检测方法建立及免疫抗体消长规律测定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 猪传染性胸膜肺炎及其危害 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 毒力因子 |
| 1.1.4 治疗和防控 |
| 1.2 猪传染性胸膜肺炎的检测与诊断 |
| 1.2.1 病原学诊断 |
| 1.2.2 分子生物学诊断 |
| 1.2.3 血清学诊断 |
| 1.3 猪传染性胸膜肺炎疫苗研究进展 |
| 1.3.1 灭活疫苗 |
| 1.3.2 亚单位疫苗 |
| 1.3.3 弱毒活疫苗 |
| 1.3.4 菌影疫苗 |
| 2 目的和意义 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 质粒、菌株和血清 |
| 3.1.2 主要试剂及试剂盒 |
| 3.1.3 主要培养基及溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 试验动物 |
| 3.1.6 疫苗 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 重组质粒的转化 |
| 3.2.2 重组质粒的提取 |
| 3.2.3 重组质粒的鉴定 |
| 3.2.4 重组蛋白的诱导表达 |
| 3.2.5 包涵体蛋白的纯化 |
| 3.2.6 蛋白浓度的测定 |
| 3.2.7 重组蛋白的SDS-PAGE鉴定 |
| 3.2.8 重组蛋白的Western-Blot检测 |
| 3.2.9 Apx毒素间接ELISA方法的建立 |
| 3.2.10 免疫血清的制备 |
| 3.2.11 抗体消长的测定 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 重组质粒的鉴定 |
| 4.2 重组蛋白的SDS-PAGE及 Western-blot验证 |
| 4.3 Apx毒素间接ELISA方法的建立 |
| 4.3.1 rApxIA间接ELISA检测方法 |
| 4.3.2 rApxIIA间接ELISA检测方法 |
| 4.3.3 rApxIIIA间接ELISA检测方法 |
| 4.4 猪传染性胸膜肺炎亚单位-灭活菌苗抗体消长规律 |
| 4.4.1 rApxIA-ELISA抗体消长规律 |
| 4.4.2 rApxIIA-ELISA抗体消长规律 |
| 4.4.3 rApxIIIA-ELISA抗体消长规律 |
| 5 讨论 |
| 5.1 间接ELISA抗原的选择 |
| 5.2 rApxIA、rApxIIA和 rApxIIIA重组蛋白的纯化 |
| 5.3 间接ELISA的建立 |
| 5.4 疫苗免疫消长规律对免疫程序的建议 |
| 5.5 实验动物对实验的影响 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）抗菌肽MPX抵御猪胸膜肺炎放线杆菌感染的作用研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 抗菌肽抵御炎症的途径 |
| 1.1 抑制致炎因子的释放 |
| 1.2 调节炎症相关信号通路 |
| 1.3 免疫调节活性 |
| 1.4 通过中和LPS(脂多糖)抑制炎症 |
| 2 抗菌肽在炎症性疾病中的作用 |
| 2.1 抗菌肽与胃肠道炎症 |
| 2.2 抗菌肽与呼吸系统炎症 |
| 2.3 抗菌肽与皮肤炎症 |
| 2.4 抗菌肽与口腔炎 |
| 2.5 抗菌肽与其他炎性疾病 |
| 3 抗菌肽的现状及展望 |
| 第二章 猪胸膜肺炎放线杆菌敏感杆菌的筛选与体外杀菌作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 MIC和 MBC结果 |
| 2.2 杀菌动力学结果 |
| 2.3 温度和pH对 MPX抑菌活性影响 |
| 2.4 一价盐离子对MPX抗菌活性的影响 |
| 2.5 二价盐离子对MPX抑菌活性的影响 |
| 2.6 阳离子释放检测结果 |
| 2.7 抗菌肽MPX对 APP的渗透性检测 |
| 2.8 抗菌肽MPX对 APP内外膜完整性结果 |
| 2.9 MPX对 APP生物被膜的影响结果 |
| 2.10 MPX对 APP关键毒力因子表达的影响 |
| 2.11 MPX调控APP关键耐药基因SapA的结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 抗菌肽MPX体内抵御猪胸膜肺炎肺炎放线杆菌的作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 小鼠存活率变化结果 |
| 2.2 肺脏APP菌落定殖结果 |
| 2.3 炎性因子TNF-α和IL-6 检测结果 |
| 2.4 肺脏剖检病理变化结果 |
| 2.5 肺脏HE染色结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 抗菌肽MPX调控猪胸膜肺炎放线杆菌感染肺转录组学研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 数据整理 |
| 2.2 原始测序数据的质量控制结果 |
| 2.3 比对结果分析 |
| 2.4 表达差异分析 |
| 2.5 差异表达基因富集分析 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
（4）猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠA、ApxⅣA基因双重PCR方法的建立及多克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文章综述 |
| 1 概述 |
| 1.1 猪传染性胸膜肺炎的危害及流行病学特点 |
| 1.2 猪传染性胸膜肺炎的诊断 |
| 1.3 猪传染性胸膜肺炎的防治 |
| 1.4 胸膜肺炎放线杆菌的特征 |
| 2 生物学特性 |
| 2.1 外毒素 |
| 2.2 ApxⅠ相关特性 |
| 2.3 ApxⅣ相关特性 |
| 2.4 荚膜多糖 |
| 2.5 脂多糖 |
| 2.6 外膜蛋白 |
| 2.7 转铁结合蛋白 |
| 3 研究目的意义 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxIA和 ApxⅣA基因双重PCR检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 供试菌株 |
| 1.2 培养基、酶、试剂盒及其它试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 细菌的培养及DNA的提取 |
| 2.3 单重PCR体系的建立 |
| 2.4 双重PCR特异性和灵敏性检测 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 单重PCR实验结果 |
| 3.2 双重PCR实验结果 |
| 3.3 特异性和稳定性检测结果 |
| 4 讨论 |
| 试验二 猪胸膜肺炎放线杆菌ApxIA基因克隆与生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 ApxIA基因DNA的提取 |
| 1.2.2 ApxI A 基因的 PCR 扩增 |
| 1.2.3 PCR产物经胶回收纯化 |
| 1.2.4 ApxIA基因片段与pMD18–T的连接 |
| 1.2.5 连接产物转化感受态细胞 |
| 1.2.6 p MD18–ApxIA的鉴定 |
| 1.2.7 测序分析 |
| 1.2.8 ApxIA基因的生物信息学分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ApxIA基因的扩增和T-A克隆与鉴定 |
| 2.2 ApxIA基因的生物信息学分析 |
| 2.2.1 ApxIA基因测序 |
| 2.2.2 ApxIA蛋白的理化性质分析 |
| 2.2.3 ApxIA蛋白磷酸化、糖基化位点的分析 |
| 2.2.4 ApxIA蛋白抗原肽与信号肽预测 |
| 2.2.5 ApxIA蛋白的亲/疏水性预测及跨膜结构域分析 |
| 2.2.6 ApxIA蛋白的二三级结构预测 |
| 3 讨论 |
| 试验三 猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣA基因克隆与生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病菌来源 |
| 1.1.2 酶及其试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 细菌培养 |
| 2.3 p MD18-T-ApxⅣA重组质粒构建 |
| 2.3.1 ApxⅣA DNA提取 |
| 2.3.2 ApxⅣA基因序列的PCR扩增 |
| 2.3.3 PCR反应条件及电泳检测 |
| 2.3.4 胶回收以及重组质粒 |
| 2.3.5 ApxⅣA基因的生物信息学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ApxⅣA基因片段PCR扩增、克隆与鉴定 |
| 3.2 基因测序 |
| 3.3 ApxⅣA片段基因信号肽测定 |
| 3.4 ApxⅣA基因稀有密码子的分析 |
| 3.5 ApxⅣA基因疏水性与亲水性的分析 |
| 3.6 Coil区分析 |
| 3.7 二级结构预测 |
| 4 讨论 |
| 试验四 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxIA和 ApxⅣA多克隆抗体制备 |
| 1 试验材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 ApxIA和 ApxⅣA特征性抗原肽段的合成 |
| 2.2 合成多肽的溶解和分装 |
| 2.3 抗原与佐剂的乳化 |
| 2.4 免疫兔子制备 |
| 2.5 免疫前后采血 |
| 2.6 ELISA检测抗体 |
| 2.7 Western b Iot检测抗体 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
| 附录 |
（5）传染性胸膜肺炎放线杆菌（7型）AdhE蛋白的原核表达及其免疫保护性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪胸膜肺炎放线杆菌概述 |
| 1.1 App菌株的流行病学 |
| 1.2 胸膜肺炎放线杆菌的发病机制 |
| 1.3 App感染宿主的免疫反应 |
| 1.3.1 App感染的先天免疫反应 |
| 1.3.2 App感染的体液免疫反应 |
| 1.3.3 App感染细胞介导的免疫反应 |
| 1.4 App疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 灭活疫苗 |
| 1.4.2 减毒活疫苗 |
| 1.4.3 亚单位疫苗 |
| 1.4.3.1 细菌LPS和基于多糖疫苗 |
| 1.4.3.2 基于蛋白质的疫苗 |
| 1.4.4 DNA疫苗 |
| 2 AdhE参与细菌与宿主互作的研究进展 |
| 2.1 细菌中的AdhE简介 |
| 2.2 AdhE参与细菌与宿主互作的机制研究 |
| 2.3 AdhE参与调控细菌感染宿主的致病机制 |
| 2.4 AdhE参与细菌对宿主免疫功能的调节 |
| 3 研究的目的与意义 |
| 第二章 App7型AdhE蛋白的原核表达及其免疫原性分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验菌株、质粒与实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.2.1 产品试剂 |
| 1.2.2 配制试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 AdhE基因的扩增与序列分析 |
| 2.1.1 引物设计 |
| 2.1.2 App7 的培养及其基因组DNA的提取 |
| 2.1.3 App7 AdhE基因的PCR扩增 |
| 2.1.4 AdhE基因与原核表达载体pET-32a(+)连接 |
| 2.1.5 AdhE基因扩增片段测序与基因序列分析 |
| 2.2 AdhE蛋白基因的氨基酸生物信息学分析 |
| 2.3 rAdhE的制备与纯化 |
| 2.3.1 原核表达载体pET-32a(+)-AdhE的表达 |
| 2.3.2 重组蛋白rAdhE诱导表达的条件优化 |
| 2.3.3 rAdhE的制备 |
| 2.3.4 rAdhE的纯化及内毒素去除 |
| 2.4 App7 AdhE蛋白的多克隆抗体的制备 |
| 2.5 rAdhE的特异性检测 |
| 2.6 抗体效价检测 |
| 2.7 数据分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 AdhE全基因的扩增 |
| 3.2 AdhE蛋白原核表达载体的构建及测序鉴定 |
| 3.3 AdhE基因序列比对分析 |
| 3.4 AdhE蛋白基因的氨基酸生物信息学分析 |
| 3.4.1 AdhE蛋白基因的核酸序列和氨基酸序列理化特性分析 |
| 3.4.2 AdhE蛋白氨基酸序列的结构域预测分析 |
| 3.4.3 AdhE蛋白氨基酸序列的多序列比较 |
| 3.4.4 AdhE蛋白氨基酸序列的信号肽序列预测 |
| 3.4.5 AdhE蛋白氨基酸序列的跨膜区域预测 |
| 3.5 AdhE蛋白原核表达载体rpET-32a(+)-AdhE的诱导表达、纯化及特异性鉴定 |
| 3.6 多克隆抗体的检测及其效价分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 App7型AdhE蛋白的免疫保护性分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验菌株、质粒 |
| 1.2 疫苗与实验动物 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.3.1 产品试剂 |
| 1.3.2 配制试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 rAdhE蛋白的表达及纯化 |
| 2.2 rAdhE对小鼠的免疫保护试验 |
| 2.3 细菌的回收鉴定试验 |
| 2.4 组织病理学分析 |
| 2.5 ELISA测定细胞因子 |
| 2.6 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 rAdhE对小鼠的攻毒保护结果 |
| 3.2 组织病理学分析 |
| 3.3 细菌的回收鉴定试验 |
| 3.4 细胞因子的测定 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）胸膜肺炎放线杆菌外毒素ApxⅠ的原核表达及其介导细胞毒性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 文献综述 |
| 1.猪传染性胸膜肺炎放线杆菌概述 |
| 2.APP Apx外毒素研究进展 |
| 2.1 APP毒素的种类与血清型 |
| 2.2 APP Apx毒素分子生物学特性 |
| 2.3 Apx毒素蛋白的致病机理 |
| 2.4 RTX毒素与宿主细胞互作蛋白的研究 |
| 3.细菌细胞毒性的研究进展 |
| 3.1 细胞毒性的评价指标及检测技术方法 |
| 3.2 细胞凋亡概述 |
| 研究目的与意义 |
| 第一章 APP ApxⅠA基因生物信息学分析及其多克隆抗体制备 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要生物信息数据库 |
| 1.2 生物信息学分析计算机软件 |
| 1.3 实验菌株与质粒 |
| 1.4 主要试剂耗材 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 ApxⅠA基因的氨基酸序列的生物信息学分析 |
| 2.2 重组质粒构建的引物设计 |
| 2.3 APP基因组DNA和 ApxⅠ片段模板质粒的提取 |
| 2.4 ApxⅠA'片段的扩增 |
| 2.5 重组质粒的构建 |
| 2.6 重组表达质粒向大肠杆菌表达菌的转化 |
| 2.7 重组蛋白的表达鉴定 |
| 2.8 重组蛋白的Ni-NTA提纯 |
| 2.9 小鼠免疫 |
| 2.10 间接ELISA测定抗体效价 |
| 2.11 阳性血清免疫印迹特异性分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 ApxⅠ蛋白的氨基酸序列生物信息学分析 |
| 3.2 目的片段的扩增 |
| 3.3 重组表达质粒的酶切鉴定 |
| 3.4 SDS-PAGE鉴定 |
| 3.5 间接ELISA测定抗体效价 |
| 3.6 抗体特异性免疫印迹鉴定 |
| 4 分析讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 APP ApxⅠ蛋白表达及其介导宿主细胞毒性研究 |
| 1.材料 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂耗材 |
| 2.方法 |
| 2.1 ApxⅠCA基因的核苷酸序列同源性分析 |
| 2.2 ApxⅠCA的基因扩增 |
| 2.3 ApxⅠCA的克隆 |
| 2.4 ApxⅠCA基因的核苷酸序列分析 |
| 2.5 重组蛋白的表达与提纯 |
| 2.6 重组蛋白鉴定 |
| 2.7 溶血活性检测 |
| 2.8 ApxⅠ重组蛋白的细胞毒性模型建立 |
| 2.9 AO-EB荧光染色 |
| 2.10 Caspase-3 酶活检测 |
| 2.11 Caspase-3,8,9 的实时荧光定量PCR |
| 3.结果 |
| 3.1 ApxⅠCA基因核苷酸序列同源性分析 |
| 3.2 目的片段的扩增 |
| 3.3 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.4 ApxⅠCA基因的核苷酸序列分析 |
| 3.5 SDS-PAGE鉴定 |
| 3.6 免疫印迹鉴定 |
| 3.7 溶血活性 |
| 3.8 细胞毒性模型建立 |
| 3.9 AO-EB荧光染色结果 |
| 3.10 Caspase-3 酶活检测 |
| 3.11 Caspase-3,8,9 的实时荧光定量PCR |
| 4.分析讨论 |
| 5.小结 |
| 结论与创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 作者简历 |
（7）猪胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性脂蛋白的筛选与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪胸膜肺炎的危害及预防 |
| 1.1.1 病原特征 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 致病菌毒力因子的研究进展 |
| 1.1.4 致病机理 |
| 1.1.5 防治 |
| 1.2 APP疫苗的研究进展 |
| 1.2.1 灭活疫苗 |
| 1.2.2 ghosts疫苗 |
| 1.2.3 亚单位疫苗 |
| 1.2.4 口服疫苗 |
| 1.2.5 减毒疫苗 |
| 1.2.6 DNA疫苗 |
| 1.2.7 异源疫苗 |
| 1.3 细菌脂蛋白研究进展 |
| 1.3.1 细菌脂蛋白的合成与定位 |
| 1.3.2 细菌脂蛋白的功能研究 |
| 1.3.3 APP中脂蛋白的研究 |
| 1.4 本论文研究意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验仪器与实验材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒 |
| 2.1.2 主要培养基及抗生素的配制 |
| 2.1.3 主要试剂和溶液 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组脂蛋白的表达载体构建 |
| 2.2.2 重组脂蛋白的表达与纯化 |
| 2.2.3 重组蛋白的免疫印迹分析 |
| 2.2.4 小鼠主动免疫实验 |
| 2.2.5 小鼠被动免疫实验 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 APP脂蛋白基因扩增及重组克隆质粒、表达质粒的酶切鉴定 |
| 3.1.1 APP脂蛋白基因的扩增 |
| 3.1.2 A/T克隆质粒的酶切鉴定 |
| 3.1.3 重组表达质粒的酶切鉴定 |
| 3.2 APP脂蛋白的表达纯化与WESTERN BLOT结果 |
| 3.2.1 IPTG诱导表达APP脂蛋白 |
| 3.2.2 APP脂蛋白的亲和层析纯化 |
| 3.2.3 可溶性脂蛋白免疫印迹分析 |
| 3.3 主动免疫动物实验评价脂蛋白的保护性 |
| 3.3.1 主动免疫小鼠存活率 |
| 3.3.2 主动免疫小鼠肺部带菌量分析及肺部病理切片 |
| 3.3.3 主动免疫小鼠IgG水平 |
| 3.4 被动免疫动物实验评价脂蛋白的保护性 |
| 3.4.1 被动免疫小鼠存活率 |
| 3.4.2 被动免疫小鼠肺部带菌量分析及肺部病理切片 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 实验条件改进 |
| 4.2 APP脂蛋白的研究进展 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 研究成果 |
| 致谢 |
（8）胸膜肺炎放线杆菌GalT蛋白免疫保护与促炎功能研究（论文提纲范文）
| 本论文的创新性工作 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 常用英文缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 体内诱导表达基因的鉴定和研究 |
| 1.1 体内诱导表达基因鉴定方法 |
| 1.2 体内诱导抗原的免疫保护作用 |
| 1.3 体内诱导抗原的生物标记作用 |
| 1.4 体内诱导抗原的致病机理研究 |
| 2.胸膜肺炎放线杆菌疫苗的研究进展 |
| 2.1 灭活疫苗 |
| 2.2 亚单位疫苗 |
| 2.3 重组亚单位疫苗 |
| 2.4 重组核酸疫苗 |
| 2.5 重组活载体疫苗 |
| 2.6 基因缺失疫苗 |
| 2.7 菌蜕疫苗 |
| 3 胸膜肺炎放线杆菌毒力因子与致病机理 |
| 3.1 Apx毒素 |
| 3.2 荚膜多糖 |
| 3.3 半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶 |
| 3.4 其它毒力因子 |
| 4 选题的目的和意义 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 APP体内诱导抗原GALT的鉴定及转录分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、菌株及菌株培养条件 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 体内诱导抗原筛选 |
| 1.5 动物实验 |
| 1.6 实时荧光定量PCR分析 |
| 1.7 检测IVIA在 APP菌株中的分布 |
| 2 结果 |
| 2.1 体内诱导抗原的筛选 |
| 2.2 qRT-PCR分析 |
| 2.3 IVIA在 APP菌株中的分布 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 APP体内诱导抗原GALT的免疫保护作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、菌株及菌株培养条件 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 实验动物和伦理声明 |
| 1.5 菌株,培养基和培养条件 |
| 1.6 生物信息学分析 |
| 1.6 体内诱导抗原重组表达菌株的构建 |
| 1.7 体内诱导抗原蛋白的表达和纯化 |
| 1.8 免疫印迹分析 |
| 1.9 免疫和动物攻毒实验 |
| 1.10 抗体的间接ELISA方法检测 |
| 1.11 淋巴细胞增殖实验 |
| 1.12 脾脏T淋巴细胞亚群分析 |
| 1.13 细胞因子测定 |
| 1.14 组织病理学 |
| 1.15 免疫组织化学分析 |
| 1.16 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组蛋白的表达与免疫印迹分析 |
| 2.2 IVIA特异性IgG检测 |
| 2.3 淋巴细胞增殖实验 |
| 2.4 T淋巴细胞亚群分析 |
| 2.5 细胞因子检测 |
| 2.6 组织病理学分析 |
| 2.7 免疫组织化学分析 |
| 2.8 小鼠感染实验 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 胸膜肺炎放线杆菌血清5B型 L20 株体内诱导抗原GALT对血清1型MS71株提供免疫保护 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、菌株及菌株培养条件 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 伦理声明和实验动物 |
| 1.5 菌株,培养基和生长调节 |
| 1.6 生物信息学分析 |
| 1.7 重组蛋白的表达和纯化 |
| 1.8 多克隆抗体的制备 |
| 1.9 免疫和免疫保护效果评价 |
| 1.10 间接ELISA检测抗体 |
| 1.11 组织病理学分析 |
| 1.12 免疫组织化学分析 |
| 1.13 小鼠骨髓中性粒细胞的分离 |
| 1.14 中性粒细胞杀菌实验 |
| 1.15 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 APP ApxIVA和 GalT基因的检测 |
| 2.2 生物信息学分析 |
| 2.3 GalT蛋白的表达与纯化 |
| 2.4 ELISA检测GalT特异性IgG |
| 2.5 小鼠感染实验 |
| 2.6 组织病理学分析 |
| 2.7 免疫组织化学分析 |
| 2.8 中性粒细胞杀菌实验 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 APP体内诱导抗原的GALT促炎功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、菌株及菌株培养条件 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 生物信息学分析 |
| 1.5 重组蛋白GalT的表达与纯化 |
| 1.6 细胞及培养条件 |
| 1.7 促炎性细胞因子IL-1β,IL-6和TNF-α的检测 |
| 1.8 荧光定量RT-PCR |
| 1.9 TLR2和TLR4 封闭实验 |
| 1.10 Western Blot分析 |
| 1.11 信号分子抑制剂实验 |
| 1.12 统计分析 |
| 2.结果 |
| 2.1 生物信息学分析 |
| 2.2 GalT蛋白的表达纯化 |
| 2.3 间接免疫荧光实验 |
| 2.4 ELISA检测促炎性细胞因子 |
| 2.5 qRT-PCR分析 |
| 2.6 TLR4和TLR2 受体封闭实验 |
| 2.7 Western blot分析 |
| 2.8 抑制剂实验 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 结论 |
| 第四部分 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）猪传染性胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立及OmpD15蛋白的抗原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 猪传染性胸膜肺炎 |
| 1.2 病原学 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.4 致病机理及其危害 |
| 1.4.1 致病机理 |
| 1.4.2 猪传染性胸膜肺炎的危害 |
| 1.5 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌主要毒力因子 |
| 1.5.1 溶血毒素（Apx） |
| 1.5.2 外膜蛋白（Omp） |
| 1.5.3 荚膜多糖（CPS） |
| 1.5.4 脂多糖（LPS） |
| 1.5.5 其他毒力因子 |
| 1.6 诊断方法 |
| 1.6.1 病原学方法 |
| 1.6.2 血清型方法 |
| 1.6.3 分子学诊断方法 |
| 1.7 猪传染性胸膜肺炎的防制 |
| 1.8 研究目的及意义 |
| 第二章 猪胸膜肺炎放线杆菌 PCR 检测方法的建立、药敏试验及 MIC 值的测定 |
| 2.1 PCR 诊断方法的建立 |
| 2.1.1 培养基及菌株 |
| 2.1.2 酶类及主要试剂 |
| 2.1.3 引物设计 |
| 2.1.4 App 基因组提取 |
| 2.1.5 PCR 扩增 |
| 2.1.6 App PCR 特异性检测 |
| 2.1.7 App PCR 敏感性检测 |
| 2.1.8 重复性试验 |
| 2.2 药敏试验及 MIC 值的测定 |
| 2.2.1 培养基及实验菌株 |
| 2.2.2 主要器材 |
| 2.2.3 试验用药及药敏片制备 |
| 2.2.4 药品原液制备及保存 |
| 2.2.5 菌株的活化及菌液制备 |
| 2.2.6 药敏试验 |
| 2.2.7 MIC 的测定 |
| 2.2.8 结果判定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 App 标准菌株 PCR 扩增 |
| 2.3.2 App PCR 扩增特异性试验 |
| 2.3.3 App 的敏感性试验 |
| 2.3.4 重复性试验 |
| 2.3.5 建立的 PCR 方法对临床分离菌株的鉴定 |
| 2.3.6 药敏试验 |
| 2.3.7 MIC 的测定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 PCR 诊断方法的建立 |
| 2.4.2 药敏试验及 MIC 值的测定 |
| 第三章 毒力因子 ApxⅠA、ApxⅡA、OmpD15 基因片段的克隆 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌株和载体 |
| 3.1.2 仪器及试剂 |
| 3.1.3 工具酶及主要试剂配制 |
| 3.2 ApxⅠA、ApxⅡA、OmpD15 片段的扩增与克隆 |
| 3.2.1 基因组 DNA 的提取 |
| 3.2.2 基因的扩增 |
| 3.2.3 PCR 产物电泳及纯化 |
| 3.2.4 PCR 产物与 pMD18-T 载体的连接 |
| 3.2.5 感受态细胞制备 |
| 3.2.6 连接产物的转化和阳性菌落的鉴定 |
| 3.2.7 阳性克隆质粒的提取 |
| 3.2.8 阳性克隆质粒序列测定 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 ApxⅠC、ApxⅡA、 OmpD15 基因片段的克隆结果 |
| 3.4.2 测序结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 OmpD15 的原核表达及其抗原性分析 |
| 4.1 OmpD15 基因的原核表达 |
| 4.1.1 工具酶及主要试剂配制 |
| 4.1.2 OmpD15 的基因扩增 |
| 4.1.3 目的片段和载体的酶切、电泳及回收 |
| 4.1.4 基因 OmpD15 的连接与转化 |
| 4.1.5 重组表达质粒的提取与酶切鉴定 |
| 4.1.6 pET32a-OmpD15 重组表达质粒的诱导表达 |
| 4.1.7 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物的 SDS-PAGE 分析 |
| 4.1.8 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物初步纯化 |
| 4.1.9 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物的抗原性分析 |
| 4.2 动物实验 |
| 4.2.1 实验材料及实验动物 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 最小致死量（MLD）的测定 |
| 4.2.4 抗体的监测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 OmpD15 基因的扩增 |
| 4.3.2 重组表达质粒的提取与酶切鉴定 |
| 4.3.3 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物的 SDS-PAGE 分析 |
| 4.3.4 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物初步纯化 |
| 4.3.5 pET32a-OmpD15 重组表达质粒表达产物的抗原性分析 |
| 4.3.6 最小致死量（MLD）的测定 |
| 4.3.7 抗体的监测 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文目录 |
（10）重组外膜蛋白抗原检测猪胸膜肺炎放线杆菌ELISA方法的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 1 猪胸膜肺炎放线杆菌研究的目的和意义 |
| 2 猪胸膜肺炎放线杆菌的研究现状 |
| 2.1 猪胸膜肺炎放线杆菌的生物学特性 |
| 2.2 猪胸膜肺炎放线杆菌的诊断方法 |
| 2.3 猪胸膜肺炎放线杆菌的毒力因子研究现状 |
| 2.4 猪传染性胸膜肺炎疫苗的研究进展 |
| 3 本研究的特色 |
| 第一章 猪胸膜肺炎放线杆菌血清1 型生物学特性及对小鼠的免疫原性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 药物及试剂 |
| 1.1.3 试验动物 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.1.5 培养基的制备 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 APP-1 菌株培养性状 |
| 2.2 卫星现象观察结果 |
| 2.3 生化试验结果 |
| 2.4 中草药茶多酚及抗生素药物对猪胸膜肺炎放线杆菌血清１型抑菌效果比较结果 |
| 2.5 猪胸膜肺炎放线杆菌血清1 型对小鼠的致病性及免疫原性研究结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 猪胸膜肺炎放线杆菌OMP基因的克隆和原核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 APP-1 OMP基因的PCR扩增结果 |
| 2.2 APP-1 OMP 基因的克隆与酶切鉴定 |
| 2.3 APP 1 OMP基因测序结果及核苷酸和氨基酸序列分析 |
| 2.4 表达重组质粒的鉴定 |
| 2.5 OMP基因的表达 |
| 3 讨论 |
| 第三章 APP-1 OMP蛋白的纯化及间接OMP-ELISA方法的初步建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Western-blotting 分析结果和OMP融合蛋白的纯化结果 |
| 2.2 间接ELISA操作的相应结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
四、猪胸膜肺炎放线杆菌毒素I基因的克隆、表达及其ELISA检测方法的建立（论文参考文献）
- [1]三种猪呼吸道病原TaqMan多重荧光定量PCR检测方法的建立和应用[D]. 冯逸雪. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [2]猪传染性胸膜肺炎亚单位-灭活菌苗抗体检测方法建立及免疫抗体消长规律测定[D]. 熊如月. 华中农业大学, 2020(05)
- [3]抗菌肽MPX抵御猪胸膜肺炎放线杆菌感染的作用研究[D]. 朱春玲. 河南科技学院, 2020
- [4]猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠA、ApxⅣA基因双重PCR方法的建立及多克隆抗体的制备[D]. 程素芳. 江西农业大学, 2019
- [5]传染性胸膜肺炎放线杆菌（7型）AdhE蛋白的原核表达及其免疫保护性研究[D]. 蔡瑶. 四川农业大学, 2019(01)
- [6]胸膜肺炎放线杆菌外毒素ApxⅠ的原核表达及其介导细胞毒性研究[D]. 田瑾. 四川农业大学, 2019(01)
- [7]猪胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性脂蛋白的筛选与鉴定[D]. 曹雨柔. 华中师范大学, 2019(01)
- [8]胸膜肺炎放线杆菌GalT蛋白免疫保护与促炎功能研究[D]. 张飞. 四川农业大学, 2018(03)
- [9]猪传染性胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立及OmpD15蛋白的抗原性分析[D]. 朱岩昆. 河南师范大学, 2013(S2)
- [10]重组外膜蛋白抗原检测猪胸膜肺炎放线杆菌ELISA方法的建立[D]. 李本强. 天津农学院, 2010(05)
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