一、α_1受体参与不同血供状态心肌凋亡蛋白调控的研究（论文文献综述）
贾文茜[1]（2021）在《CD73通过Wnt/β-catenin通路调节肝星状细胞的活化与增殖的研究》文中指出背景:酒精性肝纤维化（Alcoholic liver fibrosis,ALF）处于酒精性肝炎和酒精性肝硬化的转化进程中,是由于长时间过度饮酒导致的肝纤维化增生性病理过程,其特征是有大量细胞外基质（Extracellular matrixs,ECM）堆积在肝脏中。肝星状细胞（Hepatic stellate cells,HSCs）活化可致使ECM过度堆积合成和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达上调,从而加剧肝纤维增生损伤。因此抑制HSCs的活化和增殖,促进活化的HSCs大量死亡成为防治ALF的关键手段。CD73作为嘌呤信号通路的关键分子,在肝脏炎症和肝癌的作用相继被报导,然而CD73在酒精性肝纤维化中的功能与机制尚不明确。本研究首要探讨CD73在ALF中能否调控HSCs活化、增殖与凋亡及可能的作用机理。目的:（1）探讨CD73在酒精性肝纤维化中的调控作用;（2）探究CD73是否通过激活肝星状细胞的活化与增殖来调控酒精性肝纤维化进程。方法:体内采用雄性6-8周大的C57BL/6J小鼠（21-24g）通过连续酒精液体饲料饲养8周加后4周腹腔注射CCl4的方法进行酒精性肝纤维化模型的建立。小鼠自由组合共分为6组,每组12只小鼠,分别是对照喂养组（Vehicle）、酒精加CCl4喂养组（Et OH+CCl4）、3组APCP低、中、高处理组（1、3、9 mg/kg）和阳性对照秋水仙碱组（Colchicine,0.2mg/kg）。造模耗时8周,在造模的同时,从第5周起,对各给药组小鼠腹腔部位注射相应的药物,对照喂养组和Et OH+CCl4组小鼠则注射相应剂量的生理盐水。造模结束后,原位灌流提取原代HSCs,检测CD73表达变化;Sirius Red和Masson染色法用于测定病理切片纤维沉积状况;以及用Western blot、实时定量PCR法及免疫荧光双染法测定CD73表达位置和含量水平;腺苷（Adenosine）检测试剂盒测定血清中Adenosine的浓度水平。体外实验,采用乙醛活化HSC-T6细胞,Western blot及实时定量PCR法检测CD73、α-SMA与Col1a1蛋白和基因表达。分别用p EX2-CD73及CD73-si RNA转染HSC-T6细胞,流式分析手段及Western blot检测CD73是否会对HSC-T6细胞的活化、增殖和凋亡产生影响。结果:（1）体内实验中,与对照喂养组相比,酒精加CCl4喂养组血清学指标ALT和AST表达均升高,肝脏中有明显纤维组织增生及胶原沉积;CD73和纤维增生指标（α-SMA与Col1a1）的表达水平均升高。与酒精加CCl4喂养组相比,CD73抑制剂APCP组以剂量依赖的方式明显减轻了肝纤维化。（2）体外实验中,CD73在乙醛活化的HSC-T6细胞中上调;沉默CD73可抑制HSC-T6细胞的活化和增殖以及促进活化的HSC-T6细胞凋亡,表现为纤维化指标的显着下调,细胞活力下降及周期阻滞和凋亡相关蛋白的表达上调;过表达CD73则有相反的结果。沉默CD73还可明显抑制Wnt/β-catenin通路中相关增殖蛋白的表达,过表达CD73则相反。结论:（1）下调CD73的表达可以抑制HSCs活化、增殖以及促使活化的HSCs凋亡增加,从而减轻酒精性肝纤维化;（2）CD73可能通过Wnt/β-catenin通路调控肝星状细胞的活化和增殖。
朱安娜[2]（2021）在《基于网络药理学探究麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分和作用机制》文中进行了进一步梳理目的:基于网络药理学研究方法,探究麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分和作用机制。方法:（1）通过TCMSP数据库及查阅文献搜集整理麻黄附子细辛汤化学成分及相关潜在靶点信息,对未搜集到靶点的成分应用Swiss Target Prediction数据库预测补充,综合得到麻黄附子细辛汤化学成分及潜在靶点数据集;（2）于Gene Cards数据库筛选得到病态窦房结综合征相关靶点,整理得到病态窦房结综合征相关的疾病靶点数据集;（3）利用Cytoscape软件展示中药、化学成分和疾病靶点间的关系,构建“麻黄附子细辛汤药物-化学成分-靶点-病态窦房结综合征”生物网络,通过Cyto NCA拓扑分析,得到麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分及相关靶点;（4）应用Ledock软件进行分子对接验证关键化学成分与核心靶点结合的可靠性;（5）利用DAVID、Metascape数据库,分别对作用靶点进行GO功能注释和KEGG通路富集分析,预测麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的作用机制。结果:（1）通过对麻黄附子细辛汤作用于病态窦房结综合征相关靶点的生物网络进行分析,预测得到麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的199个显效成分,包括芦丁、去甲乌药碱、β-细辛醚等;（2）由拓扑分析得到网络中木犀草素、准葛尔乌头碱、山奈酚等10个关键化学成分及ADRB2、SCN5A、AR等10个核心靶点;（3）经分子对接证实了除外KCNH2的9个核心靶点与关键化学成分都具有较强结合活性,佐证了关键化学成分与核心靶点的可靠性;（4）通过GO功能注释和KEGG通路富集分析,推测麻黄附子细辛汤治疗SSS的作用机制可能为:（1）调节细胞因子活性,抑制甚逆转心肌纤维化,改善SSS发生的病理基础;（2）调节细胞对炎性刺激、缺氧、老化的反应,保护心肌细胞,减轻窦房结及其周围组织的功能单位损伤;（3）调控蛋白质活力和细胞对机械刺激的反应,诱导质膜受体表达,增强窦房结细胞“钙钟”“膜钟”活性,扩张血管,促进窦房结细胞电生理活动正常,改善心律失常和组织器官血流灌注不足症状;（4）影响可能导致SSS发生的相关疾病,限制多疾病对SSS发生的诱导、加重。结论:本研究通过对麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的网络药理学分析及分子对接验证,初步预测了麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分和作用机制,为麻黄附子细辛汤的临床应用提供了分子生物学层面的理论支持,为其治疗SSS作用机制的深入研究和复方的二次开发提供了一定量的参考信息。
虞琦[3]（2021）在《右美托咪定通过下调mircoRNA-21/PDCD4轴抑制腹主动脉瘤的发展》文中研究指明目的:腹主动脉瘤（abdominal aortic aneurysm,AAA）是一种以腹主动脉发生永久性膨胀为主的疾病,存在腹主动脉破裂的致命危险。据报道,右美托咪定（Dexmedetomidine,Dex）可通过NF-κB信号通路降低炎症反应,microRNA（miR）-21阻断NF-κB信号通路抑制炎症的发生,而miR-21参与AAA的进展,是AAA发生的负调控因子。观察SD大鼠接受Dex处理,评估AAA的扩张程度,分析miR-21、核转录因子κB（Nuclear Factor-kappa B,NF-κB）和程序性细胞死亡蛋白4（Programmed cell death protein 4,PDCD4）的关系,探讨Dex对AAA的影响规律及机制,并用miR-21抑制剂和LV-PDCD4-短发夹RNA进行干预,旨在明确这些因子在AAA治疗中的联合作用。1.研究右美托咪定对腹主动脉瘤发展的抑制作用及其下游炎性介质、MMP-2和MMP-9的调控作用;2.探讨右美托咪定对腹主动脉瘤发生过程中miR-21的表达改变及MMP-2、MMP-9及炎症水平的改变;3.阐明腹主动脉瘤发生、发展的分子机制,深入探讨右美托咪定通过mirco RNA-21/PDCD 4轴抑制腹主动脉瘤的发展。方法:1检测右美托咪定对腹主动脉瘤发展的抑制作用及其下游炎性介质、MMP-2和MMP-9的调控作用84只雄性清洁健康SD大鼠,所有大鼠同期同条件饲养,根据实验目的将84只SD大鼠随机分为七组:假手术组（Sham组）、腹主动脉瘤模型组（AAA组）、腹主动脉瘤模型+右美组（AAA+Dex组）、腹主动脉瘤模型+右美+antagomiR-NC组（Dex+control组）、腹主动脉瘤模型+右美+ant-miR-21组（Dex+ant-miR-21组）、腹主动脉瘤模型+LV-NC组（LV-NC组）、腹主动脉瘤模型+LV-PDCD4-sh RNA组（LV-PDCD4-sh RNA组）,每组12只。有实验动物除Sham组外,均经造瘤处理。模型组造瘤过程中使用30 U猪胰弹性蛋白酶灌入结扎段的腹主动脉中,使用0.5mol/LCa Cl2溶液浸润的纱布覆盖于灌注段的腹主动脉上。假手术组使用等量的生理盐水灌入结扎段的腹主动脉中,使用生理盐水溶液浸润的纱布覆盖于灌注段的腹主动脉上。所有Dex组从AAA模型建立之日起至手术后13天,AAA大鼠每天接受腹膜内注射50μg/kg Dex。术前一日用超声检查仪将肾下腹主动脉的最大直径作为基线,在手术后的第7天和第14天测量肾下腹主动脉的最大直径。测量完毕后第二日处死大鼠,取各组大鼠的腹主动脉样本,每组样本被随机分为两组,每组有6个样本。部分样品用4%多聚甲醛固定并保留用于HE和EVG染色观察腹主动脉壁的结构改变,免疫组织化学验证腹主动脉壁中MMP-2和MMP-9的阳性表达区域的变化,其余样品用于逆转录-定量聚合酶链反应（RT-q PCR）和蛋白质印迹（Western blot）分析炎性介质、MMP-2和MMP-9的表达水平。2检测腹主动脉瘤发生过程中miR-21的表达改变及MMP-2、MMP-9和炎症水平的改变分组和造瘤方法同上,所有Dex组从AAA模型建立之日起至手术后13天,AAA大鼠每天接受腹膜内注射50μg/kg Dex。Dex+ant-miR-21组大鼠手术后的第一、第二和第三天腹膜内注射65 mg/kg/d的antagomiR-21,Dex+control组注射等剂量的antagomiR-NC。术前一日用超声检查仪将肾下腹主动脉的最大直径作为基线,在手术后的第7天和第14天测量肾下腹主动脉的最大直径。测量完毕后第二日处死大鼠,取各组大鼠的腹主动脉样本,每组样本被随机分为两组,每组有6个样本。部分样品用4%多聚甲醛固定并保留用于HE和EVG染色观察腹主动脉壁的结构改变,其余样品用于逆转录-定量聚合酶链反应（RT-q PCR）和蛋白质印迹（Western blot）分析炎性介质、MMP-2、MMP-9和miR-21的表达水平。3检测PDCD4的表达水平,验证miR-21对PDCD4表达的靶向调控作用,深入探讨右美托咪定通过mirco RNA-21/PDCD 4轴抑制腹主动脉瘤的发展。分组和造瘤方法同上,LV-PDCD4-sh RNA组大鼠通过尾静脉注射5×107个含有p LKO.1质粒的重组慢病毒来干预AAA大鼠中PDCD4的表达,LV-NC组注射等剂量含有p LKO.1空载体的重组慢病毒。术前一天、术后第7天和第14天用超声检测仪测量肾下腹主动脉的最大直径,第二日取大鼠腹主动脉样本,每组样本被随机分为两组,每组有6个样本。部分样品用4%多聚甲醛固定并保留用于HE和EVG染色观察腹主动脉壁的结构改变,逆转录-定量聚合酶链反应（RT-q PCR）和蛋白质印迹（Western blot）分析MMP-2、MMP-9、PDCD4和炎症因子的表达水平,Target Scan预测miR-21与PDCD4的靶向结合位点,双荧光素酶实验验证miR-21与PDCD4的靶向关系。结果:1与AAA组比较,Dex组大鼠第7天腹主动脉的最大直径减少（p<0.05）,第14天腹主动脉的最大直径明显减小（p<0.01）。HE和EVG染色显示假手术组大鼠腹主动脉外膜光滑,结构完整,中层细胞密集,并且有大量的波浪状和层状黑色弹性纤维,AAA组有大量的浸润性炎症细胞和大量降解的弹性纤维,其余的则被严重破坏而没有波浪状排列,Dex组改善了AAA大鼠的腹主动脉结构的破坏。免疫组化表明,在AAA组大鼠腹主动脉的中膜介质中,有许多MMP-2和MMP-9表达的阳性区域,Dex组减少了这些区域;同时Dex组大鼠MMP-2和MMP-9的m RNA和蛋白水平降低（所有p<0.01）。与AAA组比较,Dex组减轻腹主动脉壁中CD68+巨噬细胞的浸润,MCP-1 m RNA和蛋白表达水平减少;此外,与AAA组比较,Dex组炎症因子（TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-1β）m RNA和蛋白表达水平减少,Dex组NF-κB p65的分布减少,腹主动脉壁核中NF-κB p65蛋白质水平表达下降（所有p<0.01）。2与Dex+control组比较,Dex+ant-miR-21组大鼠第14天腹主动脉的最大直径明显增大（p<0.01）,HE和EVG染色显示,相比Dex+control组,Dex+ant-miR-21组大鼠腹主动脉结构破坏更加严重。RT-q PCR结果显示,与AAA组比较,AAA+Dex组大鼠miR-21表达明显增高（p<0.01）,与Dex+control组比较,Dex+ant-miR-21组大鼠miR-21表达明显减少（p<0.01）。Western blot分析显示,相比Dex+control组,Dex+ant-miR-21组大鼠MMP-2和MMP-9蛋白表达水平增加（p<0.01）,炎症因子（TNF-α,IFN-γ,IL-6和IL-1β）蛋白表达水平增加（p<0.01）,NF-κB p65蛋白表达增加（p<0.01）。3与LV-NC组比较,LV-PDCD4-sh RNA组大鼠PDCD4 m RNA表达减少（p<0.01）,第7天腹主动脉的最大直径减少（p<0.05）,第14天腹主动脉的最大直径明显减少（p<0.01）,HE和EVG染色显示,相比LV-NC组,LV-PDCD4-sh RNA组大鼠的结构和弹性纤维得到改善。Western blot分析显示,相比LV-NC组,LV-PDCD4-sh RNA组大鼠MMP-2和MMP-9蛋白表达水平减少（p<0.01）,炎症因子（TNF-α,IFN-γ,IL-6和IL-1β）蛋白表达水平减少（p<0.01）,NF-κB p65蛋白表达减少（p<0.01）。使用Target Scan预测miR-21和PDCD4之间的靶标结合位点,通过双荧光素酶报告基因测定证实miR-21和PDCD4之间的靶向结合关系（p<0.01）。RT-q PCR和Western blot结果表明,与AAA组比较,AAA+Dex组和AAA+Dex+ant-miR-21组大鼠PDCD4 m RNA和蛋白表达水平明显降低（p<0.01）,与AAA+Dex组比较,AAA+Dex+ant-miR-21组大鼠PDCD4m RNA和蛋白表达水平明显升高（p<0.01）。结论:在本实验条件下,Dex对腹主动脉瘤具有一定的抑制作用,机制可能与其上调腹主动脉壁miR-21表达,从而抑制PDCD4 m RNA和蛋白表达,即Dex通过miR-21/PCDP4轴抑制了AAA的发展。但该轴在其中的确切作用有待进一步深入研究。本研究可为AAA的治疗提供参考,并为AAA的早期预防和发展提供理论指导。
李晨[4]（2021）在《电针预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及FXR/SHP通路的调控作用》文中认为目的 基于“中医治未病”思想及“心胸内关谋”经典理论,在前期研究基础上,以心肌缺血再灌注损伤模型大鼠为研究对象,从细胞凋亡、细胞焦亡以及细胞自噬的角度出发,观察电针“内关”“足三里”“关元”穴预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及其作用机制。并借用FXR/SHP凋亡信号通路激动剂GW4064及抑制剂Z-guggulsterone从FXR/SHP信号转导通路的角度探讨其作用机制,以及细胞凋亡、焦亡和自噬的联系,为电针预处理防治MIRI提供新的理论依据和治疗靶点。方法 一理论探讨:以中医学和现代医学理论为基础,从心肌细胞焦亡、自噬及凋亡角度出发,探讨电针预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及其机制;从FXR/SHP凋亡信号通路的角度出发,探讨FXR/SHP通路对心肌细胞凋亡、焦亡以及自噬的影响及其作用机制,以及三者间的联系。二动物实验:将Wistar大鼠80只（雄性,SPF级）按照“随机数字表法”进行随机分组,平均分为4组,分别是:正常组（N组）、假手术组（S组）、模型组（M组）和电针预处理组（EA组）,20只为一组。所有实验动物适应性喂养1周后,开始正式实验。通过左侧冠状动脉结扎法制备MIRI大鼠模型,每组大鼠给予相应的干预措施。再增加40只Wistar大鼠（雄性,SPF级）,随机分为2组,每组20只,分别为电针+GW4064激动剂组（EA+GW组）和电针+z-Guggulsterone抑制剂组（EA+Z组）,每组大鼠给予相应的干预措施。实验1:采用HE染色观察各组心肌组织的形态结构;采用TTC染色测量各组心肌梗死面积和心肌梗死质量;采用TUNEL染色计算各组心肌细胞凋亡指数,采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法（ELISA法）进行各组心肌损伤标志物（LDH、CK和c Tn I）的测定;从而探讨电针预处理对MIRI大鼠的保护作用。实验2:采用Western-blot法检测各组NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D蛋白等焦亡相关指标的表达,初步探讨电针预处理对MIRI大鼠心肌细胞焦亡通路的调节作用实验3:采用Western-blot法检测各组Beclin1、LC3I、LC3Ⅱ蛋白表达以及LC3Ⅱ/LC3I比值,研究电针预处理对心肌细胞的保护作用,初步探讨电针预处理对MIRI大鼠心肌细胞自噬通路的调节作用。实验4:采用Western-blot法检测各组Bcl-2、Bax蛋白表达,同时用荧光定量PCR法检测各组Caspases-9m RNA、Caspases-3m RNA表达,研究电针预处理对MIRI大鼠模型的保护作用,初步探讨电针预处理对MIRI大鼠心肌细胞凋亡通路的调节作用。实验5:采用TUNEL染色法计算各组心肌细胞凋亡指数,采用荧光定量PCR法检测凋亡相关指标FXRm RNA、SHPm RNA表达,采用Western-blot法检测各组凋亡相关指标Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白表达,焦亡相关指标Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达以及自噬相关指标Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值,探讨电针预处理对MIRI模型大鼠FXR/SHP信号通路的影响,以及FXR/SHP信号通路对细胞凋亡、焦亡、自噬的影响及三者间的联系。结果 实验1电针预处理对MIRI大鼠心肌损伤标志物、心肌细胞凋亡指数及形态学影响（1）HE染色:光镜下观察与比较各组大鼠心肌细胞形态学结果如下:N组和S组大鼠心肌纤维走向整齐,横纹清晰可见,细胞结构完整,形态正常,无炎性浸润,细胞核位置正常,无空泡样变性;M组心肌纤维走形紊乱、可见心肌纤维断裂现象,心肌细胞结构不完整,炎性细胞浸润明显,可见空泡样变性;EA组大鼠心肌组织大体形态正常,破坏减轻,心肌纤维排列稍显杂乱,少许纤维断裂,少量炎性细胞浸润,少量细胞水肿坏死。表明电针预处理能有效缓解心肌缺血再灌注模型大鼠心肌组织损伤。N组和S组大鼠心肌纤维走向整齐,横纹清晰可见,细胞结构完整,形态正常,无炎性浸润,细胞核位置正常,无空泡样变性;M组心肌纤维走形紊乱、可见心肌纤维断裂现象,心肌细胞结构不完整,炎性细胞浸润明显,可见空泡样变性;EA组大鼠心肌组织大体形态正常,破坏减轻,心肌纤维排列稍显杂乱,少许纤维断裂,少量炎性细胞浸润,少量细胞水肿坏死。表明电针预处理能有效缓解心肌缺血再灌注模型大鼠心肌组织损伤。（2）心肌梗死面积:与N组相比较,S组梗死面积变化不大,差异无统计学意义（P>0.05）;与N组相比较,M组的梗死面积显着增加（P<0.01）;与M组相比较,EA组的梗死面积显着减小（P<0.01）。（3）心肌梗死质量;与N组相比较,S组梗死质量变化不大,差异无统计学意义（P>0.05）;与N组相比较,M组的梗死质量显着增加（P<0.01）;与M组相比较,EA组的梗死质量显着减小（P<0.01）。（4）心肌细胞凋亡指数:N组和S组心肌组织中,可见极少量凋亡细胞核,M组中存在大量凋亡细胞,细胞核形态不规则,成碎片状,EA组可见少量凋亡细胞核。与N组和S组比较,M组心肌细胞凋亡指数明显上升（P<0.01）,与M组比较,EA组心肌细胞凋亡指数明显下降（P<0.01）。（5）血清LDH、CK、c Tn I含量:与N组相比较,S组血清LDH、CK、c Tn I含量变化不大,差异均无统计学意义（均P>0.05）;与N组比较,M组、EA组血清LDH、CK、c Tn I含量均上调（均P<0.01）,EA组血清LDH、CK、c Tn I含量均低于M组（均P<0.01）。实验2电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠焦亡通路的调控作用（1）心肌组织NLRP3、ASC蛋白表达情况:与N组、S组相比较,M组、EA组的NLRP3、ASC蛋白表达均升高（均P<0.05）,与M组比较,EA组NLRP3、ASC蛋白表达均显着下降（均P<0.05）。（2）心肌组织Caspase-1、Gasdermin D蛋白表达情况:与N组、S组相比较,M组、EA组的Caspase-1、Gasdermin D蛋白表达均升高（均P<0.05）,与M组比较,EA组Caspase-1、Gasdermin D蛋白表达均显着下降（均P<0.05）。实验3电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠自噬通路的调控作用（1）心肌组织Beclin-1蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组Beclin-1蛋白表达明显升高（P<0.05）,与M组相比,EA组Beclin-1蛋白表达明显降低（P<0.05）。（2）心肌组织LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值情况:与N组、S组比较,M组、EA组LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明显升高（均P<0.05）,与M组相比,EA组LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明显降低（P<0.05）。实验4电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠细胞凋亡的影响（1）心肌组织Bcl-2蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组Bcl-2蛋白表达水平均下降（均P<0.05）。与M组比较,EA组Bcl-2蛋白表达水平显着升高（P<0.05）。（2）心肌组织Caspases-9m RNA、Caspases-3m RNA及Bax蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组和EA组Caspase-9m RNA、Caspases-3m RNA及Bax蛋白表达显着升高（均P<0.05）,与M组比较,EA组的Caspase-9m RNA、Caspases-3m RNA及Bax蛋白表达水平均显着降低（均P<0.05）。实验5电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠FXR/SHP信号通路的影响（1）心肌细胞凋亡指数:与N组、S组比较,M组、EA组、EA+GW组、EA+Z组心肌细胞凋亡指数明显升高（P<0.05）;与M组比较,EA组、EA+GW组、EA+Z组心肌细胞凋亡指数均明显降低（均P<0.05）;与EA组比较,EA+Z组心肌细胞凋亡指数明显下降（P<0.05）,EA+GW组心肌细胞凋亡指数明显升高（P<0.05）。（2）心肌组织FXRm RNA、SHPm RNA表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组及EA+GW组大鼠心肌细胞FXRm RNA、SHPm RNA表达水平均明显升高（均P<0.05）;与M组比较,EA组、EA+GW组、EA+Z组的FXRm RNA、SHPm RNA表达均有显着性降低（均P<0.05）;与EA组比较,EA+Z组FXR、SHPm RNA表达水平显着降低（P<0.05）,EA+GW组FXR、SHPm RNA表达水平明显升高（P<0.05）。（3）心肌组织Bcl-2、Bax、Caspases-3蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组、EA+GM组及EA+Z组大鼠心肌细胞Bcl-2蛋白表达水平均下降（均P<0.05）,Bax、Caspase-3蛋白表达水平均显着升高（均P<0.05）。与M组比较,EA组、EA+GW组及EA+Z组的Bcl-2蛋白表达水平均明显升高（均P<0.05）,Bax、Caspase-3蛋白表达水平均明显降低（均P<0.05）,与EA组比较,EA+Z组Bcl-2蛋白表达水平显着升高（P<0.05）,EA+GW组Bax、Caspases-3蛋白表达水平均显着降低（均P<0.05）。（4）心肌组织Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值情况:与N组、S组比较,M组、EA组、EA+GW组及EA+Z组Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明显升高（均P<0.05）,与M组相比,EA组、EA+GW组及EA+Z组Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明显降低（均P<0.05）,与EA组比较,EA+Z组Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均显着降低（均P<0.05）,EA+GW组均显着升高（均P<0.05）。（5）心肌组织Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组、EA+GW组及EA+Z组大鼠心肌细胞Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达水平均明显升高（均P<0.05）;与M组比较,EA组、EA+GW组及EA+Z组的Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达均有显着性降低（均P<0.05）;与EA组比较,EA+Z组Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达水平均显着降低（均P<0.05）,EA+GW组均显着升高（均P<0.05）。结论 1.电针预处理能使MIRI模型大鼠心肌梗死面积及梗死程度明显下降,降低凋亡指数,病理形态学检测提示电针可显着改善受损心肌组织的病理损害程度。2.电针预处理能下调MIRI模型大鼠血清中LDH、CK及c Tn I的含量,保护大鼠心肌组织。3.电针预处理能抑制MIRI模型大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D蛋白表达,通过抑制细胞焦亡,保护心肌组织。4.电针预处理能抑制MIRI模型大鼠Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值过度升高,通过抑制细胞过度自噬,保护心肌组织。5.电针预处理能下调MIRI模型大鼠Bax蛋白表达、Caspases-9m RNA、Caspases-3m RNA表达,上调Bcl-2蛋白表达,通过抑制细胞凋亡,保护心肌组织。6.电针预处理能通过抑制FXR/SHP凋亡信号通路从而抑制心肌细胞凋亡,抑制凋亡,能起到抑制细胞焦亡和抑制细胞过度自噬的作用,从该角度探讨三者间的联系,进一步说明电针预处理对MIRI的保护机制可能是多层次、多途径的综合效应。
陈玲[5]（2021）在《运动预适应通过PI3K-Akt通路诱导线粒体自噬减轻心肌细胞凋亡的研究》文中研究表明[研究背景及目的]研究背景:缺血预适应（ischemic preconditioning,IPC）对缺血心肌的保护是近年来缺血性心肌病防治的研究热点之一。近年来,有大量研究证实,IPC可以保护缺血心肌,IPC即通过短暂、可逆的心肌缺血发作,来增强心肌对后续的缺血性损伤的抵抗力。而一定强度的运动作为一种应激,也能使心肌细胞缺血缺氧,反复多次短暂一定强度的运动便可诱发心肌短暂多次的缺血,从而产生IPC,保护缺血心肌,这便是运动预适应（exercise preconditioning,EP）。有研究表明,EP可以通过多种不同的方式来激活体内多条信号通路,调控凋亡相关基因的表达,从而减轻心肌细胞凋亡,保护缺血心肌。我们课题组前期的研究发现,EP可增加抗凋亡基因Bcl-2表达、减少促凋亡基因Bax的表达,减少心肌细胞凋亡。另外,有研究发现,EP后心肌细胞内线粒体自噬的数目增多了,而凋亡的细胞数却显着减少,EP可能通过诱导线粒体自噬的方式来发挥心肌细胞的自我保护效应。EP减轻心肌细胞的凋亡的具体机制目前还未完全阐明清楚,EP可能会激发机体产生诸多信号,激活体内多条信号传导通路,如磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（Akt）（PI3K-Akt）、AMPK-mTOR-UKL1 等,其中 PI3K-Akt 信号传导通路是细胞内最重要的信号传导通路之一,但目前为止,EP具体是通过什么信号通路来调控凋亡相关基因的表达、线粒体自噬与细胞凋亡之间的是否存在关联及其二者之间的具体关系是什么?目前还未完全阐明。目的:探究PI3K-Akt信号传导通路在运动预适应诱导线粒体自噬、减少心肌细胞凋亡中的作用。[方法]1、实验分组:选取40只健康SD大鼠,随机分为两组:A组为:运动预适应+急性心肌缺血组20只;B组为运动预适应+急性心肌缺血组20只+PI3K-Akt抑制剂（B组）;2、模型建立:A、B两组采用大鼠尾部负重3%体重负荷（于大鼠尾部缠绕金属丝线）进行间歇性游泳训练4周的方式建立运动预适应模型;在最后一次运动结束后,B组大鼠立即经大鼠尾静脉给药PI3K-Akt抑制剂LY294002（0.3 mg/kg）,A组同时注射等量生理盐水。30min后,A、B两组大鼠均采用腹腔注射异丙肾上腺素ISO（3mg/kg体重）的方式建立运动预适应后大鼠急性心肌缺血模型;3、心脏取材:完成上述步骤后,立即处死大鼠取心脏组织,分成若干份。一部分用于TUNEL法检测心肌细胞凋亡和免疫组化实验;一部分做成切片,电镜观察线粒体超微结构并对自噬体计数;剩下部分组织装于EP管中保存于-80℃冰箱中冷藏备检Akt、p-Akt、LC3-Ⅱ、Beciln-1蛋白的表达;4、心肌细胞凋亡检测:应用TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）法检测心肌细胞凋亡情况,并计算凋亡指数（AI）,AI（%）=凋亡细胞数/心肌细胞总数×100%;5、线粒体自噬检测:应用光镜观察心肌细胞显微结构的变化;应用透射电镜观察心肌细胞超微结构的变化及自噬小体的形成,并统计自噬小体的数目;6、相关蛋白检测:采用 Western blot 测定 Akt、p-Akt、LC3-Ⅱ、Beciln-1蛋白的表达情况;7、结果比较及分析:分别比较A、B两组大鼠心肌细胞凋亡指数（AI）、自噬小体数目及Akt、p-Akt、LC3-Ⅱ、Beciln-1蛋白的表达并分析。[结果]1、两组大鼠存活率:试验后,A组大鼠存活18只（存活率:90%）,B组大鼠存活15只（存活率:75%）;2、两组大鼠Akt、P-Akt、LC3-Ⅱ、Beciln-1蛋白表达水平:2.1两组大鼠PI3K-Akt信号通路相关蛋白表达水平:与A组大鼠相比,B组大鼠Akt蛋白表达水平显着下降（608.8±43.37 vs 435.4±50.68）,（P<0.05）;与A组相比,B组P-Akt蛋白表达水平显着下降（378.6±75.21 vs 135.6±36.79）,（P<0.05）;这表明 LY294002 可以有效抑制 PI3K-Akt信号通路中Akt及磷酸化的Akt的表达。2.2两组大鼠心肌线粒体自噬相关蛋白表达水平:与A组相比,B组LC3-Ⅱ蛋白表达水平显着下降（309.5±44.78 vs 184.2±83.49）,（P<0.05）;与A组相比,B组Beciln-1蛋白表达水平显着下降（422.7±20.56vs 209.5±67.12）,（P<0.05）;3、两组大鼠心肌细胞显微结构的变化与自噬小体的形成3.1 光镜下两组大鼠心肌细胞显微结构的变化:用TUNEL染色后的心肌组织,在光镜下可以看见呈长条状分布的粉红色心肌纤维,以及蓝色的正常细胞和呈棕褐色或棕黄色凋亡细胞。A组切片可见排列规整的心肌纤维、其间间隙较小,可见大量蓝色正常细胞核和散在分布的少量棕色凋亡细胞核;B组大鼠心肌纤维肿大变形,排列紊乱,细胞间隙较大,可见大量棕褐色凋亡细胞和炎症细胞浸润。3.2电镜下两组大鼠心肌细胞线粒体超微结构的变化与自噬小体形成:A组大鼠可见肿胀的线粒体,大小不一,排列紊乱,偶可见少量空泡化的自噬小体;B组大鼠电镜下正常形态线粒体数目明显减少,可见大量变形水肿的线粒体,线粒体双层膜结构模糊或消失、线粒体嵴突有不同程度的变形、融合,可见大量空泡化的自噬小体;与A组大鼠相比,B组大鼠自噬小体数目明显减少（23 VS 15）,（P<0.05）。4、两组大鼠心肌细胞凋亡情况:与A组相比,B组可见广泛分布的细胞核呈棕褐色的凋亡细胞;与A组相比,B组大鼠心肌细胞凋亡指数更高（0.215 ± 0.004 vs 0.327±0.003）,（P<0.05）。[结论]1、PI3K-Akt信号传导通路可能是运动预适应减轻缺血心肌细胞凋亡的关键通路之一。2、运动预适应可以增加线粒体自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beciln-1蛋白的表达,增加线粒体自噬,从而减少细胞调亡。
杨一博[6]（2021）在《MicroRNA-210/BNIP3通过影响线粒体自噬-凋亡调控缺氧条件下心肌与内皮细胞损伤的机制研究》文中研究说明研究背景心血管疾病是全世界范围内导致死亡的首要原因,而缺血性心脏病是最为常见的心血管系统疾病。在缺血性心脏病中,各种原因造成的血管狭窄、血流减少或中断会导致心脏局部组织缺血缺氧,进而造成电生理、功能、代谢和结构等方面的紊乱。线粒体是细胞能量代谢,维持生命活动的中心,是缺氧损伤的主要靶点之一。当缺氧发生时,细胞的代谢方式从氧化磷酸化向无氧糖酵解转变,能量供应不足,作为电子受体的氧分子缺乏,导致电子传递链复合物产生大量的活性氧。这些活性氧会破坏蛋白质、脂膜分子和核酸,造成线粒体损伤和功能失调。受损线粒体的内容物释放入胞浆,通过激活下游的Caspase级联反应,触发线粒体相关的细胞凋亡,进而引起细胞损伤。缺氧情况下,稳定的线粒体功能与结构是细胞存活的关键因素。线粒体损伤除了诱导细胞凋亡外,有时还会引起线粒体自噬的发生。线粒体自噬是选择性自噬的一种形式,可以通过线粒体-溶酶体途径分解功能障碍、结构损伤的线粒体,维持细胞中线粒体的功能,促进线粒体重组,参与线粒体的质量控制,在多种生物学过程中发挥重要作用。在某些情况下,线粒体自噬能清除功能失调的线粒体,减少活性氧的持续产生,减轻细胞损伤,发挥一定的细胞保护作用;但持续或严重的损伤过程可能诱发过度的线粒体自噬,引起线粒体的过度破坏,反而加重损伤,加快细胞死亡。鉴于线粒体自噬在缺氧损伤中发挥的作用尚不清楚,其机制也未完全探明,因此,进一步明确其功能和机制并寻找可能的调控因子很有必要。在线粒体自噬及细胞凋亡的相关机制研究中,BNIP3是重要的分子之一。BNIP3在缺氧条件下被激活并定位于线粒体,通过调节多种生物学反应参与多种疾病的发生发展过程。BNIP3在发现之初被认为是BH3-only亚家族的一员,通过BH3-only区域与跨膜结构域发挥促细胞凋亡的作用。但随着研究的深入,BNIP3与线粒体自噬也密切相关,它运用自身的LC3相互作用区与LC3识别,促进线粒体自噬的发生,发挥不同的效应。因此,BNIP3在缺血性心脏病中发挥的具体作用仍需进一步探索。实验室的前期工作发现,micro RNA-210（miR-210）能够抑制氧化应激损伤诱导的凋亡,发挥细胞保护作用,但其具体机制尚需进一步研究。BNIP3是miR-210的下游靶分子,研究miR-210是否通过BNIP3影响线粒体自噬和凋亡,有利于揭示miR-210保护缺氧细胞的机制,为寻找心血管疾病的治疗手段或靶点提供相应的理论基础。研究目的本实验以心肌细胞H9c2与冠状动脉内皮细胞HCAECs为研究对象,以BNIP3为切入点,探讨线粒体自噬-凋亡途径在缺氧诱导心血管细胞损伤过程中的作用和机制,明确miR-210/BNIP3在缺血性心脏病中发挥保护作用的机制,为缺血性心脏病的治疗提供理论依据。研究方法1.缺氧袋培养细胞（H9c2细胞与HCAECs）,CCK-8检测细胞存活率,比色法观察ATP的水平,DCFH-DA探针标记细胞中ROS水平,电镜下观察线粒体微观形态,评估细胞与线粒体的损伤。Western blot检测凋亡相关蛋白（Caspase-3与Caspase-9裂解片段）的水平,评估细胞凋亡。同时应用western blot检测线粒体自噬相关蛋白（LC3、TOM20、P62）水平,并应用Mito Tracker与Lyso Tracker分别标记线粒体与溶酶体,共聚焦显微镜观察它们在胞质中的共定位情况,评价线粒体自噬的水平。2.应用线粒体自噬抑制剂环孢素A（CsA）预处理缺氧细胞,western blot检测蛋白（LC3、TOM20、P62）,线粒体与溶酶体共定位染色评估线粒体自噬水平。检测应用CsA后的细胞存活率,ATP水平与凋亡相关蛋白（Caspase-3与Caspase-9裂解片段）水平,评估抑制线粒体自噬后细胞损伤与凋亡的变化。3.应用western blot与实时定量PCR检测BNIP3在缺氧细胞中的蛋白与RNA水平。利用siBNIP3质粒构建BNIP3沉默模型。CCK-8检测细胞存活率,比色法检测ATP水平,透射电镜观察线粒体微观结构,JC-1染色描述线粒体膜电位,评估BNIP3对线粒体形态与功能的影响。应用western blot检测凋亡相关蛋白（Caspase-3与Caspase-9裂解片段）的水平,TUNEL染色标记凋亡细胞共同评估凋亡的发生,探究BNIP3对细胞凋亡的影响。同时检测线粒体自噬相关蛋白（LC3、TOM20、P62）水平,线粒体与溶酶体的共定位,并应用免疫荧光染色标记P62观察其点状聚集情况并将P62和TOM20共染,研究BNIP3对线粒体自噬的调控。应用western blot观察CsA抑制线粒体自噬后BNIP3的表达变化,研究线粒体自噬水平对BNIP3表达的影响,探究BNIP3在缺氧H9c2细胞与HCAECs线粒体自噬-凋亡途径中的作用。4.实时定量PCR检测miR-210在缺氧细胞中的表达。利用慢病毒转染技术构建高、低表达miR-210模型,实时定量PCR与荧光观察检测模型的构建。Western blot检测缺氧条件下高、低表达miR-210细胞中BNIP3的水平,探究miR-210对BNIP3的作用。在高、低表达miR-210细胞中,检测细胞存活率,ATP水平,凋亡蛋白（Caspase-3与Caspase-9裂解片段）的变化,探究miR-210对缺氧细胞损伤与凋亡的作用,并检测线粒体自噬相关蛋白（LC3、TOM20、P62）的差异,探究miR-210对线粒体自噬的影响。同时,利用高表达BNIP3质粒拮抗高表达miR-210对BNIP3的抑制作用后,再次检测上述内容,探究miR-210在缺氧H9c2细胞与HCAECs中的这些作用是否通过抑制BNIP3实现。研究结果1.不同的缺氧时间引起H9c2细胞与HCAECs存活率与ATP水平呈时间依赖性的下降。随着缺氧时间的延长,Caspase-3与Caspase-9裂解片段增多,细胞凋亡增多;LC3-II/LC3-I升高,TOM20与P62水平下降,胞质线粒体与溶酶体共定位增多,线粒体自噬增强。2.缺氧条件下,H9c2细胞与HCAECs使用CsA预处理后,LC3-II/LC3-I下降,TOM20与P62升高,胞质中线粒体与溶酶体的共定位减少,线粒体自噬的发生被明显抑制。应用CsA抑制线粒体自噬后,细胞存活率与ATP水平升高,Caspase-3与Caspase-9裂解片段水平下降,细胞凋亡减少。3.缺氧H9c2细胞与HCAECs中,BNIP3的RNA与蛋白水平均显着升高,抑制线粒体自噬能够降低BNIP3的蛋白表达水平。沉默BNIP3的表达后,均可显着减轻缺氧造成的细胞存活率、ATP水平、线粒体膜电位的下降与线粒体微观结构的损伤;Caspase-3与Caspase-9裂解片段减少,TUNEL阳性细胞比例降低,凋亡减少。沉默BNIP3的表达后,LC3-II/LC3-I下降,TOM20与P62升高,线粒体与溶酶体的共定位减少,免疫荧光染色中P62的点状聚集减少,P62与TOM20的共定位减少,抑制线粒体自噬的发生。4.缺氧H9c2细胞与HCAECs中miR-210表达明显升高,miR-210增加了缺氧条件下的细胞存活率与ATP水平,降低了Caspase-3与Caspase-9裂解片段水平,抑制了细胞凋亡的发生;同时,miR-210降低了LC3-II/LC3-I,升高了TOM20与P62的含量,抑制了线粒体自噬的发生。MiR-210抑制BNIP3的蛋白表达,而高表达BNIP3后可抑制miR-210对线粒体自噬和凋亡的调控作用。结论缺氧能够诱导H9c2细胞与HCAECs损伤,激活的线粒体自噬通过促进凋亡加重损伤。BNIP3作为关键性分子,一方面与线粒体自噬具有交互调控作用,另一方面影响细胞凋亡。缺氧诱导的miR-210可通过抑制BNIP3抑制细胞凋亡与线粒体自噬,减轻缺氧诱导的细胞损伤。创新点及研究意义本研究明确了线粒体自噬及凋亡对缺氧诱导心肌和内皮细胞损伤的影响,进一步发现减轻线粒体自噬促进细胞存活,为缺血性心脏病的治疗提供新的思路。同时研究发现了BNIP3是线粒体自噬-凋亡途径的关键分子,提示BNIP3可能成为治疗缺血性心脏病的靶点。MiR-210抑制BNIP3的表达,能够减少线粒体自噬-凋亡,抑制缺氧诱导的心肌和内皮细胞损伤,揭示了其保护缺氧心肌和内皮细胞损伤的机制,为其临床应用提供理论基础。
冯天雨[7]（2021）在《白藜芦醇对奶山羊精原干细胞冷冻保存效果的影响》文中提出精原干细胞（SSCs）位于雄性动物睾丸曲细精管的基底膜,是唯一能将遗传信息传递给下一代的成体干细胞。SSCs既能自我更新以维持干细胞池的稳定,又能分化参与精子发生,因而SSCs的研究对于了解雄性生殖细胞的分化机制具有重要意义,并且在转基因动物生产和男性不育症治疗方面具有临床应用价值。细胞的冷冻保存能够保持细胞的生物学特性并保障细胞的长期供应,而SSCs冷冻保存是保存优质未成熟雄性奶山羊生殖能力的重要方法。但是,冷冻-解冻过程会增加细胞内活性氧（ROS）的产生,引起SSCs氧化应激,并导致细胞凋亡,降低冻后细胞活力,因而SSCs冷冻保存过程中所受的氧化损伤是一个亟待解决的问题。白藜芦醇是一种天然植物多酚类化合物,具有广泛的生物和药理活性,包括抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、神经保护、心血管疾病防治等作用。目前对于家畜SSCs冷冻保存的研究较少,且尚未有白藜芦醇对SSCs冷冻保存效果方面的研究报道。因此,本研究首先对不同年龄奶山羊的睾丸进行切片观察和蛋白检测,以确定SSCs的表达情况,再通过两步酶消化和差速贴壁从奶山羊睾丸分离和纯化SSCs;其次用含有不同浓度白藜芦醇的冷冻保存液重悬SSCs并利用液氮进行超低温冷冻保存,解冻后检测SSCs活力,筛选最适白藜芦醇浓度;最后通过试剂盒检测、流式细胞术、Western blot、透射电镜等方法探究冷冻-解冻细胞的抗氧化、抗凋亡以及AMPK激活情况,初步揭示白藜芦醇对奶山羊SSCs冷冻保存的保护机制。本试验主要研究结果如下:1.通过不同月龄（15日龄、1月龄、3月龄、6月龄、10月龄）奶山羊睾丸的苏木精-伊红（HE）染色和PGP9.5免疫组织化学染色观察发现,随着奶山羊年龄的增长,曲细精管直径变大,睾丸细胞种类增加,精原细胞总量增多但所占比例下降。Western blot检测不同日龄（15、30、45、60、75、90、180日龄）奶山羊睾丸中PGP9.5和THY1的蛋白表达量显示,60日龄前的奶山羊睾丸中精原细胞含量显着高于75日龄后（P<0.05）,适合用于提取SSCs。2.通过机械分离和两步酶消化分离睾丸细胞,再经差速贴壁纯化收集奶山羊SSCs。利用免疫荧光染色对细胞进行鉴定显示,纯化后的细胞高表达分子标记GFRα1、PLZF、PGP9.5和THY1,表示本研究方法可获得纯度较高的SSCs。3.在冷冻保存液中添加不同浓度（0、0.1、1、10、100μmol/L）白藜芦醇,使用缓慢冷冻法保存奶山羊SSCs,37℃解冻后对细胞的活力和抗氧化能力进行测定。利用CCK-8和台盼蓝染色检测SSCs活力,结果显示当白藜芦醇浓度为10μmol/L时冻后细胞活力显着高于对照组和其他试验组（P<0.05）。与对照组相比较,冷冻保存液中添加白藜芦醇显着提高了冷冻-解冻后SSCs的总抗氧化能力（T-AOC）、线粒体膜电位和抗氧化酶（SOD、CAT和GSH-Px）活性（P<0.05）,同时显着降低了细胞内ROS水平和丙二醛（MDA）含量（P<0.05）,其中10μmol/L白藜芦醇组SSCs的抗氧化效果显着优于其他试验组（P<0.05）,而ROS水平和MDA含量与100μmol/L组差异不显着（P>0.05）。4.选取对照组和10μmol/L白藜芦醇处理组进一步探究白藜芦醇在冷冻-解冻过程中保护SSCs的机制。Annexin V-FITC流式细胞检测结果表明,白藜芦醇组中SSCs的凋亡比例显着低于对照组（P<0.05）。白藜芦醇可极显着抑制促凋亡蛋白Bax的表达并促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达（P<0.01）;抑制细胞色素C从线粒体释放至细胞质,从而减少caspase 3和caspase 9的表达（P<0.05）。此外,白藜芦醇可激活细胞AMPK磷酸化,且此种作用可被AMPK抑制剂Compound C部分抵消。透射电镜对细胞超微结构的观察结果显示,冷冻保存液中白藜芦醇的添加显着降低了冷冻-解冻后SSCs的线粒体肿胀空泡化、膜起泡以及核变的比例（P<0.05）。以上研究结果表明,冷冻保存液中添加白藜芦醇能够有效提高冷冻-解冻后奶山羊SSCs的质量,且其最适浓度为10μmol/L。白藜芦醇通过提高细胞抗氧化能力,抑制线粒体途径凋亡,并且激活生物能量代谢调节关键因子AMPK磷酸化,从而在冷冻-解冻过程中减少损伤,发挥保护SSCs的作用。
郭蕊[8]（2019）在《醉茄素A在心肌缺血/再灌注损伤中的保护作用与尼古丁致血管内皮细胞功能紊乱的机制研究》文中指出目的:心血管疾病引起的死亡人数占全球人口死亡总数的三分之一,而罹患缺血性心脏病的死亡人数居心血管疾病死亡人数之首。冠状动脉梗阻是造成心肌缺血的主要原因,尽管心肌缺血后在最短的时间内恢复缺血心肌供血是目前临床首选的治疗方式,但是缺血心肌恢复血液灌注后,供血和供氧的恢复可能是促进心肌细胞炎症和凋亡反应增高的直接原因,造成再灌注后的心肌细胞损伤进一步加重;因此,寻找有效方式降低心肌缺血/再灌注后的心肌细胞损伤,改善心功能各项指标,将为临床提高冠状动脉介入手术的效果提供新的治疗策略。醉茄素A是从醉茄提取的主要生物活性成分,近年来研究发现醉茄素A具有抗炎、抗氧化作用,然而醉茄素A与缺血性心脏病的关系尚不明确。本文拟探讨醉茄素A在心肌缺血/再灌注损伤中的保护作用,结合在体动物模型、离体细胞培养及各项分子生物学技术,阐明醉茄素A心肌细胞保护作用中的分子调节机制,为心梗患者提高介入手术疗效提供实验依据。方法:1.利用实验动物模型模拟人体心梗后冠状动脉再通治疗:小鼠麻醉状态下进行心脏冠状动脉左前降支结扎术,30 min后打开结扎线恢复血液供应,复灌后3 h分离心脏左心室缺血/再灌注区心肌组织用于信号分析,复灌后24 h检测心功能、TUNEL凋亡分析及心肌梗死面积测定。2.实验动物分组伪手术组:除不结扎心脏冠状动脉左前降支外,其余操作同心梗/再灌注组;心梗/再灌注组:小鼠吸入麻醉状态下,行冠状动脉左前降支结扎/再通术;低浓度醉茄素A预处理组:小鼠术前1.5 h腹腔注射1 mg/kg醉茄素A;高浓度醉茄素A预处理组:小鼠术前1.5 h腹腔注射5 mg/kg醉茄素A。3.小鼠心功能测定超声测定心功能:小鼠吸入麻醉状态下,调节探头寻找两侧乳头肌短轴平面,M模式下连续记录三个收缩循环周期的左心室多普勒图像,并计算心功能指标。劲动脉插管测定左心室功能:小鼠吸入麻醉状态下,分离右侧颈总动脉,将带有导丝的探头从动脉微切口缓慢送入左心室,记录左心室压力、左心室舒张末期压力及心率等数值,计算心功能指标。4.心肌梗死面积测定:小鼠心肌缺血后再灌注24 h,使用Evans Blue-TTC染色法将心脏切片染色,计算风险面积百分比。5.TUNEL染色法检测心肌细胞凋亡:小鼠缺血心肌再灌注24 h,福尔马林固定后制作石蜡切片,TUNEL染色并拍照记录染色结果,计算心肌细胞凋亡率。6.Real Time PCR法检测线粒体凋亡相关蛋白m RNA水平变化:小鼠缺血心肌再灌注3h,提取缺血区心肌组织总RNA,反转录后用Real time PCR法检测线粒体凋亡相关基因m RNA变化。7.Western Blot法检测蛋白表达:小鼠缺血心肌再灌注3 h,提取缺血区心肌组织蛋白,Western Blot法检测蛋白表达改变。结果:1.低浓度（1 mg/kg）醉茄素A显着改善心肌缺血/再灌注损伤1.1超声多普勒法检测小鼠心肌缺血/再灌注模型构建,通过超声图像和心电图结果判定心肌缺血/再灌注损伤模型的建成。1.2心肌缺血/再灌注（MI/R）组小鼠左心室射血分数（LVEF）、左心室缩短分数（LVFS）显着低于伪手术（Sham）组（P<0.001）,而1mg/kg醉茄素A预处理组的LVEF、LVFS较MI/R组显着增高（P<0.05）,5mg/kg醉茄素A预处理组的LVEF、LVFS与MI/R组无统计学差异。1.3血流动力学检测结果显示,MI/R组心室压最大上升速率（+d P/dt max）、心室压最大下降速率（-d P/dt max）显着低于Sham组（P<0.001）,而1mg/kg醉茄素A预处理组的+d P/dt max、-d P/dt max较MI/R组显着增高（P<0.05）,5 mg/kg醉茄素A预处理组的+d P/dt max、-d P/dt max与MI/R组无统计学差异。1.4 Evans Blue-TTC染色显示,1 mg/kg醉茄素A预处理组的心肌梗死面积较MI/R组显着降低,差异有统计学意义（P<0.001）,而5 mg/kg醉茄素A预处理组心肌梗死面积与MI/R组无统计学差异。2.醉茄素A抑制线粒体凋亡降低心肌细胞缺血/再灌注损伤2.1 TUNEL染色显示1 mg/kg醉茄素A预处理组心肌细胞凋亡率显着低于MI/R组（P<0.001）,且醉茄素A组Cleaved caspase-3蛋白表达及caspase-3活性也显着低于MI/R组（P<0.001）,提示醉茄素A的心肌保护作用依赖醉茄素A抑制缺血/再灌注损伤的心肌细胞凋亡。2.2醉茄素A显着降低线粒体凋亡途径的标志Cleaved caspase-9蛋白表达（P<0.001）,而醉茄素A组外源性凋亡Cleaved caspase-8蛋白表达与MI/R组无统计学差异,提示线粒体凋亡是醉茄素A心肌保护作用的关键信号通路;醉茄素A通过促进Bcl-2活性增高,发挥其抑制凋亡作用。2.3醉茄素A抑制线粒体凋亡的作用中,AMPK是关键调节蛋白。3.醉茄素A在心肌缺血/再灌注损伤中的保护作用依赖AMPK活化利用AMPKα2心肌特异性失活小鼠构建心肌缺血/再灌注损伤模型,超声多普勒检测心功能结果显示醉茄素A组LVEF、LVFS与MI/R组相比无差异,而血流动力学检测及Evans Blue染色结果发现醉茄素A组+d P/dt max、-d P/dt max和心肌梗死面积与MI/R组无统计学差异,提示WFA心肌保护作用依赖AMPKα2。4.醉茄素A促进自噬降解维持自噬平衡降低心肌缺血/再灌注损伤4.1与sham组相比MI/R组LC3Ⅱ/Ⅰ比值增高,醉茄素A组较MI/R组LC3Ⅱ/Ⅰ比值显着降低（P<0.001）,而醉茄素A组与MI/R组相比Lamp-2蛋白表达升高、p62蛋白表达降低（P<0.001）,提示醉茄素A通过促进自噬降解降低维持自噬平衡。4.2氯喹抑制溶酶体活性后,醉茄素A组LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62蛋白表达均增高,心肌细胞凋亡水平增高。提示,自噬降解异常引起的自噬紊乱促进心肌细胞凋亡增高,而醉茄素A通过促进自噬降解、维持自噬平衡降低心肌细胞凋亡,缓解心肌缺血/再灌注损伤。4.3心肌AMPKα2失活,与MI/R组相比醉茄素A组LC3Ⅱ/Ⅰ比值显着增高,提示AMPKα2是醉茄素A促进自噬降解的关键调节蛋白。结论:1.低浓度（1 mg/kg）醉茄素A可显着改善缺血/再灌注损伤后的心功能,缩小心肌坏死区域面积。2.醉茄素A活化Bcl-2抑制线粒体凋亡、降低心肌细胞凋亡率,发挥心脏保护作用。3.AMPK的活化在醉茄素A抑制缺血/再灌注心肌损伤心肌线粒体凋亡中,起重要调节作用。4.心肌缺血/再灌注损伤中,醉茄素A促进心肌细胞自噬降解,缓解MI/R引起的LC3Ⅱ/Ⅰ比值增高,维持自噬平衡,降低心肌细胞凋亡。
肇炜博[9]（2019）在《Hippo信号通路在异丙肾上腺素所致心肌损伤中的调控作用研究》文中研究指明研究背景交感神经系统-β肾上腺素能受体（β-adrenoceptor,β-AR）激活是心肌损伤和心力衰竭的重要病理生理机制之一。β-AR激活可通过提高心肌收缩功能和心率起到功能代偿作用;然而,病理情况下长期、过度的β-AR活化则可导致心肌细胞凋亡和心肌纤维化。目前对β-AR过度活化诱导心肌损伤机制的了解还十分有限。近几年研究者们开始关注Hippo信号通路在心肌损伤和心力衰竭中的作用,但具体机制目前仍不清楚。Hippo通路是调节细胞凋亡和增殖的重要信号途径之一,其主要成员包括哺乳动物不育系20-样激酶1/2（mammalian sterile 20-like kinase 1/2,Mst1/2）、大肿瘤抑制因子同源物1/2（large tumour suppressor homolog 1/2,Lats1/2）、转录共调节因子Yes-相关蛋白（yes-associated protein,YAP）以及YAP的平行同源因子TAZ（transcriptional co-activator with PDZ-binding motif,具有PDZ结合基序的转录共激活因子）。Hippo信号通路的激活可引起Mst1表达和磷酸化水平增加,通过促进YAP/TAZ磷酸化,抑制下游细胞增殖相关基因表达,同时促进细胞凋亡相关基因的表达。最近研究发现,心肌梗死时,抑制Hippo信号通路具有心脏保护作用。但目前尚不清楚心脏β-AR过度活化是否可通过激活Hippo信号通路导致心肌细胞凋亡和心肌纤维化。本人博士联合培养指导老师,澳大利亚Baker心脏和糖尿病研究所杜晓军教授课题组前期研究发现,在β-AR激动剂异丙肾上腺素（Isoprenaline,ISO）诱导的小鼠心肌损伤模型和心肌细胞特异性β2-AR过表达小鼠心肌组织中,促凋亡蛋白Bcl-2相互作用的细胞死亡介导因子（Bcl-2 interacting mediator of cell death,BIM）和促纤维化蛋白半乳糖凝集素-3（Galectin-3,Gal-3）的表达均升高。BIM是Bcl-2家族中仅含一个BH3结构域的小分子促凋亡蛋白。作为细胞凋亡的上游启动蛋白,BIM能够激活促凋亡的Bcl-2家族蛋白（如Bax,Bak）表达,同时下调抗凋亡的Bcl-2家族蛋白（如Bcl-2,Mcl-1）表达。Gal-3是一种与细胞内外糖蛋白有高亲和力的半乳糖凝集素,具有促进组织纤维化和炎症反应的作用。既往研究发现,敲除BIM基因能够抑制ISO诱导的心肌细胞凋亡、心肌肥大和心功能异常,但Gal-3是否介导了ISO诱导的心肌纤维化和心功能异常目前仍不清楚。此外,目前对于β-AR活化调控心肌细胞中BIM和Gal-3表达的信号转导机制仍不明确。既往研究发现,心肌细胞特异性Mst1过表达小鼠的心肌细胞中Gal-3的表达升高了约40-50倍,提示Mst1-Hippo信号通路可能参与了Gal-3的表达调控。因此,我们推测:β-AR过度活化可激活心肌细胞Hippo信号通路,进而上调BIM和Gal-3的表达,导致心肌细胞凋亡和心肌纤维化。研究方法1.以C57BL/6J小鼠和心肌细胞特异性β2受体转基因小鼠（β2-TG）作为研究对象,其中C57BL/6J小鼠给予不同剂量和不同时间的ISO治疗,采用Western-Blot检测心肌组织中Mst1,YAP,磷酸化YAP（p-YAP）和BIM的表达水平,ELISA检测Gal-3表达,并检测β-AR阻滞剂对YAP,p-YAP,BIM和Gal-3表达的影响。2.以Gal-3基因敲除（Gal-3 KO）小鼠作为研究对象,并给予ISO治疗,心脏超声检测小鼠心功能,羟脯氨酸浓度测定法检测小鼠心肌组织胶原含量,ELISA检测心肌组织中Gal-3水平,RT-q PCR检测心肌纤维化和炎症相关基因,以及心肌组织中YAP靶基因（CTGF、Ankrd1和Birc5）的表达水平。3.以心肌细胞特异性Mst1转基因小鼠（Mst1-TG）和Mst1显性失活突变体转基因小鼠（dn Mst1-TG）作为研究对象,并给予ISO治疗,Western-Blot检测心肌组织中YAP,p-YAP和BIM的表达,ELISA检测心肌组织中Gal-3水平;采用生物信息学方法分析Mst1-TG小鼠心肌组织中YAP靶基因的表达,并采用RT-q PCR检测Gal-3敲除对YAP靶基因的调控作用。4.体外培养H9c2细胞（大鼠心肌细胞株）,并给予si RNA-YAP治疗,Western-Blot检测YAP、BIM和Gal-3的表达水平,明确YAP敲低对心肌细胞中BIM和Gal-3蛋白表达的影响;H9c2细胞分别给予ISO、PKA抑制剂H89或PKI 14-22、腺苷酸环化酶激活剂Forskolin治疗,研究c AMP/PKA信号转导对ISO诱导的YAP磷酸化以及BIM、Gal-3表达的影响。研究结果1.ISO通过上调心肌组织中BIM和Gal-3表达诱导心肌损伤1)ISO能够时间和剂量依赖性的上调C57BL/6J小鼠心肌组织中BIM和Gal-3表达;2)非选择性β-AR阻滞剂普萘洛尔或卡维地洛能够显着抑制ISO诱导的小鼠心肌组织中BIM和Gal-3表达;选择性β1-AR阻滞剂阿替洛尔（AT）和β2-AR阻滞剂ICI-118551（ICI）也可有效抑制ISO诱导的Gal-3表达,当联合使用AT和ICI时,Gal-3表达有进一步降低的趋势;3)β2-TG小鼠心肌组织中BIM和Gal-3水平均显着上调,其中Gal-3的表达呈年龄依赖性增加;4)正常野生型小鼠给予ISO治疗后,心肌组织中Gal-3水平显着增加,左室短轴缩短率降低40%,心肌胶原含量升高55%,纤维化和炎症相关因子m RNA水平均上调。敲除Gal-3基因后,左室短轴缩短率回升,心肌胶原含量降低,纤维化和炎症相关因子m RNA水平降低。2.ISO可激活小鼠Hippo信号通路,促进心肌组织中Mst1表达和YAP磷酸化1)ISO能够上调C57BL/6J小鼠心肌组织中Mst1,YAP和YAP Ser127位点的磷酸化水平;2)非选择性β-AR阻滞剂普萘洛尔和卡维地洛能够显着抑制ISO诱导的小鼠心肌组织中YAP的表达和磷酸化水平;3)ISO可同时上调心肌细胞核YAP（n YAP）与细胞浆YAP（c YAP）表达,其中细胞浆YAP蛋白（c YAP）的增加更明显,n YAP与c YAP的比值（n YAP/c YAP）显着降低;4)β2-TG小鼠心肌组织中Mst1表达和YAP磷酸化水平呈年龄依赖性增加。3.ISO通过激活Hippo信号通路促进BIM和Gal-3表达1)Mst1-TG小鼠心肌组织中YAP,p-YAP,BIM和Gal-3表达均显着增加,给予ISO治疗后,Gal-3表达进一步增加;2)Mst1失活突变（dn Mst1-TG）后,ISO诱导的心肌组织中YAP,p-YAP,BIM和Gal-3表达均显着抑制;3)生物信息学分析发现Mst1-TG小鼠心肌组织中存在8,619个差异表达基因,其中4,080个基因上调,4,539个基因下调。比对Cistrome DB中已发表的YAP Ch IP-seq数据,Mst1-TG小鼠心肌组织中共发现666个YAP靶基因,其中262个上调,179个下调。基因集富集分析结果表明Mst1-TG小鼠心肌组织中YAP靶基因集上调;4)降低H9c2细胞（大鼠心肌细胞株）中的YAP水平,可显着上调BIM和Gal-3表达;5)ISO治疗或心肌细胞特异性Mst1过表达（Mst1-TG）均可上调小鼠心肌组织中三种YAP靶基因（CTGF、Ankrd1和Birc5）的表达。Gal-3基因敲除可显着抑制ISO诱导的YAP靶基因表达;在Mst1-TG背景下敲除Gal-3后,Birc5表达无明显改变,而CTGF和Ankrd1却显着下调。4.ISO通过c AMP/PKA激活Hippo通路,促进BIM和Gal-3表达1)PKA抑制剂H89和PKI 14-22均可显着抑制ISO诱导的H9c2细胞中p-YAP,BIM和Gal-3的表达;2)腺苷酸环化酶激活剂Forskolin可显着上调H9c2细胞中Mst1,p-YAP,BIM和Gal-3的表达水平。研究结论心肌β肾上腺素能受体过度活化可通过c AMP/PKA信号转导激活Hippo通路,诱导Mst1表达和YAP磷酸化,通过上调BIM和Gal-3表达,促进心肌细胞凋亡和心肌纤维化。本研究首次揭示β-AR可与Hippo信号通路相偶联,并通过调节下游的促凋亡蛋白BIM和促纤维化蛋白Gal-3表达,最终导致心肌损伤和心功能异常。本研究提示β-AR/Hippo/BIM-Gal-3信号通路可能成为心肌损伤防治的新靶点。
李婷婷[10]（2019）在《LncRNA Gm2691、新型AMPK激动剂GSK621减轻心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景 急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）是世界范围内导致死亡的主要原因之一。及时再灌注策略,如药物溶栓和经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention,PCI）已大大改善了 AMI 患者的预后。然而,心肌细胞缺血一段时间后,冠状动脉血流的恢复往往会导致进一步的组织损伤,这种现象称为心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI）。心肌损伤可导致严重的临床后果,如无复流现象,心肌收缩性功能不可逆和可逆丧失,再灌注性心律失常,包括致命的室性心律失常等。另外MIRI可引起高达50%的成功实施PCI的患者出现微循环障碍,严重影响治疗效果及患者预后,因此如何减轻MIRI成为冠心病领域研究的重点及热点问题。 lncRNAs是一类长度大于200nt的非编码RNA,是继microRNA后发现的又一种细胞内源性的RNA分子。他们参与了细胞的许多生物学过程,如调控蛋白质编码基因,维护基因组的完整性,X染色体失活,基因组印记,转录后调节,细胞分化和发展等。LncRNAs在各种正常生理和病理条件中起重要作用,参与神经系统发育、新陈代谢和癌症发生发展等过程。近年的研究表明LncRNAs具有对多种心脏疾病的调节作用,如扩张型心肌病、心力衰竭、冠状动脉粥样硬化、心肌梗死等。最近一项研究利用转录组芯片技术筛选小鼠缺血后早期再灌注心肌组织lncRNAs差异表达谱,筛选出与缺血再灌注损伤相关的100多个lncRNA,其中lncRNA Gm2691在梗死心肌中表达量显着降低,提示lncRNA Gm2691可能为缺血再灌注损伤心肌保护的新靶点。本课题旨在探讨lncRNA Gm2691减轻缺血再灌注损伤,保护心肌细胞的作用及具体机制。目的1.阐明lncRNA Gm2691抗炎、抗凋亡的作用及其对缺血再灌注诱导的心肌损伤的保护作用。2.探讨lncRNA Gm2691是否通过PI3K/Akt信号通路发挥其保护作用。研究方法一、体内实验1.建立大鼠在体心肌缺血再灌注模型将雄性Wistar大鼠40只,随机分为假手术组（Sham）、缺血再灌注组（I/R）、缺血再灌注+lncRNA Gm2691过表达重组腺病毒组（I/R+Ad-Gm2691组）,缺血再灌注+空载体病毒组（I/R+Ad-con组）4组,每组10只。通过开胸结扎冠状动脉前降支30分钟,松开结扎线再灌注180分钟的方法,建立在体心肌缺血再灌注损伤模型。手术前7天心脏注射过表达lncRNA Gm2691基因重组腺病毒及阴性对照病毒。Sham组大鼠只穿线不接扎。2.TTC染色法测定缺血再灌注后大鼠的心肌梗死面积。3.检测血清LDH的含量。4.超声检测心肌动力学的改变。5.蛋白印迹法（westernblot,WB）检测凋亡相关蛋白Caspase 3、Bax、Bcl-2的表达。6.RT-PCR检测炎症因子IL-6、TNF-a和IL-8的表达。二、体外1.分离培养大鼠乳鼠心肌细胞（neonatal rat ventricular cardiomyocytes,NRCMs）,实验分为以下五组:（1）空白对照组（normoxia组）:心肌细胞在常氧条件下培养;（2）模型组（hypoxia组）:心肌细胞缺氧10小时后复氧4小时;（3）模型组+空载体组（hypoxia+Ad-con组）:心肌细胞转染阴性对照腺病毒后,缺氧10小时后复氧4小时;（4）模型组+lncRNA Gm2691腺病毒组（hypoxia+Ad-Gm2691组）:心肌细胞转染过表达lncRNAGm2691腺病毒后,缺氧10小时后复氧4小时。（5）模型组+lncRNAGm2691 腺病毒+PI3K/Akt抑制剂组（hypoxia+Ad-Gm2691+LY294002组）:心肌细胞转染过表达lncRNA Gm2691腺病毒后,加入浓度为20μmol/L LY294002,缺氧10小时后复氧4小时。2.TUNEL法检测心肌细胞凋亡水平。3.Werstern blot检测Akt、ERK1/2蛋白及凋亡相关蛋白Caspase 3、Bax、Bcl-2表达。4.qRT-PCR检测lncRNAGm2691 及炎症因子IL-6,TNF-a 和 IL-8的表达结果1.LncRNA Gm2691减少I/R大鼠心肌梗死面积与I/R组相比,I/R+Ad-Gm2691组心肌梗死面积明显减少（P=0.000）,而I/R+Ad-con组与I/R组相比心肌梗死面积无显着差异（P=0.294）。2.LncRNA Gm2691改善I/R大鼠心功能与Sham组相比,I/R组左室收缩期内径（LVIDs）、左室舒张期内径(（LVIDd）、左室舒张末期容积（LVEDV）、左室收缩末期容积（LVESV）明显增加（均P<0.01）,左室射血分数（LVEF）和左室缩短分数（FS）显着下降(（均P=0.000）。与I/R组相比,I/R+Ad-Gm2691 组LVIDs、LVIDd、LVEDV、LVESV显着降低（均P<0.01）,LVEF、FS显着升高（均P=0.000）。而I/R+Ad-con组与I/R组相比上述指标无显着差异（均P>0.05）。3.LncRNAGm2691降低I/R大鼠血清LDH水平I/R组大鼠血清LDH水平明显高于Sham组（P=0.002）,I/R+Ad-Gm2691组LDH水平显着低于I/R组（P=0.031）,I/R+Ad-con组与I/R组无显着差异（P=0.487）。4.LncRNA Gm2691降低I/R大鼠心肌组织凋亡相关蛋白表达Western-blot结果显示:相比Sham组,I/R组的Caspase-3及Bax的表达显着升高,Bcl-2的表达显着降低,相应的Bax/Bcl-2比值显着升高（均P0.01）;与I/R组相比,I/R+Ad-Gm2691组Caspase-3及Bax的表达显着降低,Bcl-2的表达显着升高,Bax/Bcl-2比值显着降低（均P<0.05）。而I/R组和I/R+Ad-con组之间几乎没有差异（均P>0.05）。5.LncRNAGm2691有效减少I/R大鼠心肌炎症因子的水平RT-PCR结果显示:与Sham组相比,I/R组心肌组织的IL-6,TNF-a和IL-8 mRNA的表达显着升高（均P=0.000）;与I/R组相比,I/R+Ad-Gm2691组上述炎症因子mRNA表达明显降低（均P<0.05）。而I/R组和I/R+Ad-con组之间几乎没有差异（均P>0.05）。6.腺病毒转染可以增加体外培养的大鼠乳鼠心肌细胞（NRVMs）中lncRNA Gm2691的表达结果提示用过表达lncRNA Gm2691腺病毒预处理6小时后,缺氧诱导的NRVMs中lncRNA Gm2691的表达呈时间依赖性变化,缺氧后3小时lncRNA Gm2691的表达即显着升高,并在缺氧后9小时达到峰值。缺氧可导致心肌细胞中lncRNA Gm2691的表达降低,而缺氧前用过表达lncRNA Gm2691腺病毒预处理6h可显着增加lncRNA Gm2691的表达（均P<0.01）。7.LncRNAGm2691有效减少缺氧/复氧造成的心肌细胞凋亡TUNEL染色显示过表达lncRNA Gm2691腺病毒预处理可明显抑制缺氧/复氧过程诱导的心肌细胞凋亡（P=0.002）;Western-blot结果显示,相比正常组,hypoxia组的Caspase-3及Bax的表达显着升高,Bcl-2的表达显着降低,相应的Bax/Bcl-2比值显着升高（均P<0.01）;与hypoxia组相比,hypoxia+Ad-Gm2691 组Caspase-3、Bax的表达显着降低,Bcl-2的表达显着升高,Bax/Bcl-2比值显着降低（均P<0.05）。而hypoxia组和hypoxia+Ad-con组之间几乎没有差异（均P>0.05）。8.LncRNA Gm2691有效减少缺氧/复氧造成的心肌细胞炎症因子的表达RT-PCR结果显示:与正常组相比,hypoxia组的IL-6、TNF-a和IL-8 mRNA的表达显着升高（均P=0.000）;与hypoxia组相比,hypoxia+Ad-Gm2691组上述炎症因子mRNA表达明显降低（均P<0.05）。而hypoxia组和hypoxia+Ad-con组之间没有显着差异（均P>0.05）。9.LncRNA Gm2691通过PI3K/Akt信号转导通路发挥其对缺氧/复氧造成的心肌细胞损伤的保护作用Western-blot结果表明,与正常组相比,hypoxia组的p-Akt的表达显着降低（P=0.000）,p-ERK1/2的表达显着升高（P=0.005）;与hypoxia组相比,lncRNA Gm2691过表达显着升高p-Akt的表达水平（P<0.01）,而对p-ERK1/2的表达无显着影响（P=0.804）。在lncRNAGm2691过表达的基础上,加入PI3K-Akt通路的抑制剂LY294002后,lncRNA Gm2691抑制缺氧/复氧造成的心肌细胞凋亡及炎症因子表达的作用明显减弱（均P<0.05）。结论1.大鼠心肌缺血再灌注可造成心肌细胞凋亡、炎症因子释放增加,lncRNA Gm2691在梗死心肌组织中表达下降,腺病毒介导的lncRNA Gm2691在心肌组织的过表达可以减少炎症因子的表达,减轻细胞凋亡,显着减少大鼠心肌缺血再灌注引起的心功能下降、心肌组织坏死。2.LncRNA Gm2691过表达可以减少体外培养的原代大鼠乳鼠心肌细胞炎症因子的表达及细胞凋亡,PI3K/Akt信号通路介导lncRNAGm2691的心肌保护作用。研究背景 腺苷酸活化蛋白激（ AMP-activated protein kinase，AMPK）是细 胞和全身能量稳态的关键调节因子，当细胞能量耗尽时，其发挥恢复能量平 衡的作用，在过去的20年里，AMPK被发现能够调控多种细胞功能。在心血管 组织中起调节心脏代谢和收缩功能，以及促进止管组织抗收缩，抗炎，抗动 脉粥样硬化等作用，被认为是未来代断性疾及心血管疾病治疗的重要靶点之 一。近年研究发现，AMPK可通过其以上作用，在心肌缺血-再灌注损伤中发 挥保护作用。因此开发出能够在心肌组织中微活AMPK的高选择性、高特异性 药物，可能成为减少缺血再灌注损伤有效地治疗策略。为了直接有效地靶向 激活AMPK，最近有研究者开发了一种噻吩啶衍生复合物一G5K621，体外实验 发玩其持续激活AMPK，在细胞分析中，乙酰酶A羧化酶（ acetyl - CaA carboxylase，ACC）磷酸化水平测定表明，GSK621相比其他AMPK激动剂如A- 769662，诱导AMPK活化的能力更强。GSK621显着增加AMPK活化的标记物 AMPKαT172的磷酸化，同时也刺激了AMPK下游因子ACC（S79）和ULK（S555）的 磷酸化，这些结果表明GSK621是直接的强效的AMPK激活剂，随后的一项研究 发现GSK621可以增加成骨细胞中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ NADPH）含量， 抑制H2O2诱导的活性氧（ROS）生成，诱导细胞保护性自噬。显着减了H2O2诱 导的细胞死亡和凋亡，然面GSK621能否对心肌细缺血再灌注损伤起到保护作 用至今向未见报道。本研究拟探讨GSK621对氧糖剥夺复氧( oxygen glucose depeivalien-re-oxygnstion，OGD/R》引起的心肌细胞损伤的保护作用及作 用机制。以期封AMPK及其新型激动剂GSK621对心肌细胞保护作用进行阐明， 为以AMPK为靶点的药物研发提供新的依据。目的1.明确GSK621能否激活心肌细胞中AMPK2.探讨GSK621能否抑制氯糖剥夺 /复氧引起的心机组胞氧化损伤及凋亡。3.阐明GSK621对氧糖剥夺/复氧引起 的心肌细胞保护作用是否通过诱导AMPK活化产生,井进一步探讨其下游信号 分子Nrf2在其中的作用.研究方法1.建立AC16人心肌组胞及大鼠乳鼠心肌细 胞氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型将上述两种细胞分为对照组、氧糖剥夺/复氧 组（OGD/R）、GSK621各种剂量组 （OGD/R +0.5 HμM GSK621、OGD/R+2μM GSK621、 OGD/R+5μM GSK621、OGD/R+10μM GSK621）。以100,000个孔铺6 孔板，用的是DMEM高糖培养基，24小时以后模型相换成DMEM无糖培界基，放 入厌氧罐内密闭，37℃恒温培养箱中孵育4小时。4小时后，将细胞取出复氧 ，并换成DMEM高糖培养基，行下一步检测。2.CCK-8法检测OGD/R后各组心肌 细胞的活力。3.通过测定培养基乳酸脱氢酶（LDH）含量，检测细胞死亡。4. 细胞段亡检测：包括caspase-3活性检测，ELISA法检测抗单链（ssDNA抗体 DNA）， TUNEL染色和 Annexin V/PI流式细胞仪细胞凋亡检测方法。5. Westerm blottiing检测AMPKα1、 p-AMPKα1 、ACC、 p-ACC.、Cle- caspase-3、Cle-caspase-9、 Cle- PARP、Nrf2、HoL、NQOL等表达。6.AMPK活性检。7.氧化应激ROS检测。8.TBASR法测定细胞内脂质过氧化物合 量。9.JC-1法测定各组心肌细胞OGD/R后线粒体的电势。10.实时定量PCR检 测Nrf-2，HO1、NQO1等mRNA的表达。11.利用AMRKα1 ?shRNA转染，沉默细 胞内AMPK表达后，再次检测细胞活力、凋亡等变化。12.利用crispr/cas9基 因编辑法敲除AMPKα1，再次检测细胞活力、调亡等变化。13.利用Nrf2 shRNA转染，沉默细胞内Nrf2表达后，再次检测下游HO1等表达及细胞活力、 凋亡等变化。结果 1.GSK621激活心肌细胞中的AMPK信号 Western blot检测证实GSK621 （2-10μM）以剂量依赖的方式诱导磷酸化AMPKa1（Thr-172）和其相关代谢通路 的下游靶分子乙酰辅酶A羧化酶（ACC，Ser79位点）表达（均P<001），SK621呈 剂量依赖性增加细胞内AMPK活性（P=0.000）2.GSK621抑制氧糖剥夺/复氧 （OGDR）锈导的心肌细胞毒性CCK-8细胞活性检测实验显示；氧糖剥夺/复氧 (0GD/R诱导心肌细存活率显着下降，LDH放量明显增加（均P=000.0）2μM和 10μM 0MGK621预处理，显着抑制OGD/R诱导的细底存活率降低及LDH释放（均 P=0.0000），进一步研究表明，OGDR组线粒体电势明显下降，caspse-3活性 增加， western blot显示caspase-3。 caspase-9和PARP剪切体显着增加， ELSA显示单链DNA（ssDNA）增加,TUNEL染色显示凋亡细胞增加（均P=0.000） GSK621（2μM和10μM）预处理显着抑制DGD/R诱导的心肌细图调亡：流式细胞 术分析结果进一步证实了GSK621可显着降低OGD/R诱导的心肌细胞亡（均 P=0.000）。3.GSK621抑制OGD/R诱导的心肌氧化损伤 OGDR显着诱导心肌细图 ROS产生和错质过氧化（均P=0.000），这种作用被GSK21（2μM和10μM）预处理 显着弱（均P＜0.01）4.AMPK活化介导GSK621诱导的心机组胞保护作用。为了 证明GSK621对OGD/R诱导的心肌细胞损伤的保护作用是通过AMPK活化介导的，Western blot证实GSK621诱导的AMPK活化或 AMPKα1-ACC磷酸化，几乎 被 AMPKα1 shRNA或AMPK1KO完全抑制，在“ sh-AMPKα1”及ko-AMPKα1细 胞，GSK621法抑制OGD/R诱导的细胞活性降低及细胞凋亡（P=0.002）。 5.GsK621激活心肌细胞核因子E2相关因子2（ nuclear facor erythroid-2-relatel factor2，Nrf2）信号通路并通过其发作用。qPCR检测结果表明在心 肌细胞，GSK621呈剂量依赖性诱导Nrf2依赖基园的mRNA表达，包括血红素氧 合伤1（ hemeoxygenase，HO1）和 NADPH氧化还原酶（ NADPH： quinoneoxidoreductase，NQO1），尽管Nrf2mRNA水平无明显变化，其蛋白水 平显着升高。HO1和NQO1的蛋白水平也显着提高。qPCR结果显示GSK621诱导 的心肌细胞中HO1和NQO1的表达完全被 AMPKα1沉默或敲除所抑制。携带 Nrf2 shRNA的慢病毒载体转染心细胞后，GSK621诱导的HO1和NQO1表达受抑 制，GSK621预处理对OGD/R诱导的细胞活性下降、凋亡增加的抑制作用消失（ 均P<0.01）.结论1.GSK621能够激活心肌细胞中的AMPK信号通路。2.氧糖剥夺/复氧较好 地模拟了在体缺血/再灌注对细胞造成的损害，GSK621能够通过抗凋亡、抗 氧化等作用对抗OGD/R诱导的心肌细胞损伤。3.AMPK活化介导GSK621诱导的 心肌细跑保护作用。4.GSK621可通过激活AMPK进一步活化下游的 Nrf2信号通路，并通过AMPKN/Nrf2/HO1轴发挥心机组胞保护作用。
二、α_1受体参与不同血供状态心肌凋亡蛋白调控的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、α_1受体参与不同血供状态心肌凋亡蛋白调控的研究（论文提纲范文）
（1）CD73通过Wnt/β-catenin通路调节肝星状细胞的活化与增殖的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与实验方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 酒精加CCl_4诱导的小鼠酒精性肝纤维化模型建立 |
| 3.2 在原代小鼠HSCs、肝组织中及活化的HSC-T6 细胞里CD73 的表达变化 |
| 3.3 CD73 抑制剂APCP可减轻酒精性肝纤维化 |
| 3.4 在HSC-T6 细胞里沉默CD73 对细胞活化、增殖与凋亡的影响 |
| 3.5 在HSC-T6 细胞里过表达CD73 对细胞活化、增殖与凋亡的影响 |
| 3.6 CD73对Wnt/β-catenin信号通路上相关增殖蛋白的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 CD39-CD73-腺苷轴在肝脏疾病中的作用 |
| 参考文献 |
（2）基于网络药理学探究麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分和作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 综述 |
| 1.1 病态窦房结综合征研究现状 |
| 1.1.1 病态窦房结综合征的发病机制研究 |
| 1.1.2 SSS的分型与临床表现 |
| 1.1.3 SSS的西医治疗 |
| 1.1.4 SSS的中医学研究现状 |
| 1.2 麻黄附子细辛汤研究现状 |
| 1.2.1 麻黄附子细辛汤的现代药理作用研究 |
| 1.2.2 麻黄附子细辛汤在SSS治疗中的应用 |
| 1.3 网络药理学简介及其在中医药研究中的应用 |
| 1.3.1 网络药理学概述 |
| 1.3.2 网络药理学常用数据库及研究方法 |
| 1.3.3 网络药理学与中医药研究 |
| 第二章 基于网络药理学探究麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分和作用机制 |
| 2.1 数据收集与研究方法 |
| 2.1.1 流程图 |
| 2.1.2 数据收集 |
| 2.1.3 网络构建与分析 |
| 2.1.4 分子对接验证 |
| 2.1.5 靶点通路注释分析 |
| 2.2 研究结果 |
| 2.2.1 构建麻黄附子细辛汤化学成分及潜在靶点数据集 |
| 2.2.2 构建SSS相关的疾病靶点数据集 |
| 2.2.3 麻黄附子细辛汤化学成分潜在靶点与SSS相关靶点的交集基因 |
| 2.2.4 麻黄附子细辛汤-化学成分-靶点-SSS网络及显效成分 |
| 2.2.5 麻黄附子细辛汤治疗SSS的关键化学成分和核心靶点 |
| 2.2.6 分子对接结果 |
| 2.2.7 靶点通路注释分析 |
| 2.3 分析与结论 |
| 2.3.1 麻黄附子细辛汤治疗SSS的显效成分分析 |
| 2.3.2 麻黄附子细辛汤治疗SSS的关键成分和核心靶点分析 |
| 2.3.3 靶点通路注释分析 |
| 2.3.4 结论 |
| 2.3.5 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）右美托咪定通过下调mircoRNA-21/PDCD4轴抑制腹主动脉瘤的发展（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 右美托咪定对腹主动脉瘤发生的抑制作用及其下游炎性介质、MMP-2和MMP-9 的调控作用 |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 麻醉药物 |
| 1.5 引物序列 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物的处理及分组 |
| 2.2 超声评价AAA扩张情况 |
| 2.3 标本采集 |
| 2.4 组织学分析 |
| 2.5 实时荧光定量定量PCR(RT-qPCR) |
| 2.6 蛋白质印迹分析(Western blot) |
| 2.7 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 Dex对大鼠腹主动脉瘤的形态学及瘤壁结构的影响 |
| 3.2 Dex对大鼠腹主动脉瘤壁MMP-2和MMP-9 表达水平的影响 |
| 3.3 Dex减轻AAA大鼠腹主动脉壁的炎症反应 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 右美托咪定对腹主动脉瘤发生过程中miR-21 表达水平的改变 |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 麻醉药物 |
| 1.5 引物序列 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物的处理及分组 |
| 2.2 超声评价AAA扩张情况 |
| 2.3 标本采集 |
| 2.4 组织学分析 |
| 2.5 实时荧光定量定量PCR(RT-qPCR) |
| 2.6 蛋白质印迹分析(Western blot) |
| 2.7 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 Dex处理AAA大鼠中miR-21 的表达和ant-miR-21 处理后Dex+AAA大鼠中miR-21 的表达 |
| 3.2 miR-21 对大鼠腹主动脉瘤的形态学及瘤壁结构的影响 |
| 3.3 miR-21 减轻AAA大鼠的MMP-2、MMP-9 的表达及炎症反应 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 右美托咪定通过mirco RNA-21/ PDCD4 轴抑制腹主动脉瘤的发展 |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 麻醉药物 |
| 1.5 引物序列 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物的处理及分组 |
| 2.2 超声评价AAA扩张情况 |
| 2.3 标本采集 |
| 2.4 组织学分析 |
| 2.5 实时荧光定量定量PCR(RT-qPCR) |
| 2.6 蛋白质印迹分析(Western blot) |
| 2.7 双荧光素酶报告基因检测(Dual-luciferase reporter gene assay) |
| 2.8 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 PDCD4 对大鼠腹主动脉瘤的形态学及瘤壁结构的影响 |
| 3.2 抑制PDCD4 的表达减轻AAA大鼠MMP-2、MMP-9 的表达及炎症反应 |
| 3.3 miR-21与PDCD4 的靶向关系验证 |
| 3.4 沉默miR-21对PDCD4 表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验总结 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 右美托咪定的器官保护作用及机制 |
| 参考文献 |
（4）电针预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及FXR/SHP通路的调控作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验一 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠心肌损伤标志物、凋亡指数和形态学的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠心肌细胞焦亡的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠心肌细胞自噬的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠心肌细胞凋亡的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验五 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠FXR/SHP通路的调控作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录一 文献综述 心肌缺血再灌注损伤相关信号通路研究进展 |
| 参考文献 |
| 附图二 |
| 附录三 读博期间发表论文、科研情况 |
| 致谢 |
（5）运动预适应通过PI3K-Akt通路诱导线粒体自噬减轻心肌细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 远程缺血预处理—减轻心肌再灌注损伤的机制探讨 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（6）MicroRNA-210/BNIP3通过影响线粒体自噬-凋亡调控缺氧条件下心肌与内皮细胞损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一章 综述 |
| 1.缺血性心脏病 |
| 1.1 缺血性心脏病的流行病学及现状 |
| 1.2 缺血性心脏病中的缺氧损伤 |
| 1.3 缺血性心脏病与microRNAs |
| 2.线粒体自噬 |
| 2.1 线粒体自噬过程及其机制 |
| 2.2 线粒体自噬的研究方法 |
| 2.3 诱导线粒体自噬的因素 |
| 2.4 线粒体自噬与心血管疾病 |
| 2.5 线粒体自噬的治疗应用 |
| 3.BNIP3 |
| 3.1 BNIP3的发现与结构特点 |
| 3.2 BNIP3与细胞死亡 |
| 3.3 BNIP3与细胞自噬 |
| 第二章 实验研究 |
| 1.缺氧诱导细胞线粒体损伤,激活凋亡与线粒体自噬 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 讨论 |
| 2.缺氧条件下抑制线粒体自噬,减少细胞凋亡减轻细胞损伤 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 3.缺氧条件下BNIP3对线粒体自噬-凋亡途径的影响 |
| 3.1 实验仪器 |
| 3.2 实验试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 4.Micro RNA-210通过靶向BNIP3调控线粒体自噬与细胞凋亡 |
| 4.1 实验仪器 |
| 4.2 实验试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第三章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）白藜芦醇对奶山羊精原干细胞冷冻保存效果的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 精原干细胞概述 |
| 1.1.1 精原干细胞与精子发生 |
| 1.1.2 精原干细胞的分离与纯化 |
| 1.1.3 精原干细胞的标记物 |
| 1.1.4 精原干细胞微环境 |
| 1.1.5 精原干细胞的体外培养 |
| 1.2 精原干细胞的冷冻保存 |
| 1.2.1 冷冻保存原理 |
| 1.2.2 冷冻及解冻方法 |
| 1.2.3 冷冻保护剂 |
| 1.2.4 冷冻保存与氧化应激 |
| 1.2.5 冷冻保存与细胞凋亡 |
| 1.2.6 冷冻保存与细胞自噬 |
| 1.3 白藜芦醇的研究进展 |
| 1.3.1 白藜芦醇的主要信号通路 |
| 1.3.2 白藜芦醇的抗氧化作用 |
| 1.3.3 白藜芦醇的抗凋亡作用 |
| 1.3.4 白藜芦醇与细胞自噬 |
| 1.3.5 白藜芦醇与AMPK |
| 1.3.6 白藜芦醇对细胞冷冻保存的研究 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 奶山羊精原干细胞的分离与鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.2.3 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 奶山羊睾丸的HE染色 |
| 2.3.2 奶山羊睾丸的PGP9.5 免疫组织化学染色 |
| 2.3.3 不同日龄奶山羊睾丸中PGP9.5和THY1 蛋白的表达 |
| 2.3.4 奶山羊SSCs的分离与纯化 |
| 2.3.5 SSCs的免疫荧光染色鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 白藜芦醇对冷冻保存奶山羊精原干细胞活力及抗氧化能力的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试验材料 |
| 3.2.2 试验方法 |
| 3.2.3 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 白藜芦醇对冷冻保存SSCs活性的影响 |
| 3.3.2 白藜芦醇对冷冻保存SSCs活率的影响 |
| 3.3.3 白藜芦醇对冷冻保存SSCs T-AOC的影响 |
| 3.3.4 白藜芦醇对冷冻保存SSCs内 ROS水平的影响 |
| 3.3.5 白藜芦醇对冷冻保存SSCs MDA含量的影响 |
| 3.3.6 白藜芦醇对冷冻保存SSCs线粒体膜电位的影响 |
| 3.3.7 白藜芦醇对冷冻保存SSCs抗氧化酶活性的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 白藜芦醇保护冷冻保存奶山羊精原干细胞机制的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试验材料 |
| 4.2.2 试验方法 |
| 4.2.3 数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 流式细胞术检测SSCs凋亡 |
| 4.3.2 SSCs凋亡相关蛋白的表达 |
| 4.3.3 SSCs自噬相关蛋白的表达 |
| 4.3.4 SSCs的 AMPK磷酸化水平 |
| 4.3.5 SSCs的超微结构观察 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）醉茄素A在心肌缺血/再灌注损伤中的保护作用与尼古丁致血管内皮细胞功能紊乱的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 第一部分 醉茄素A在心肌缺血/再灌注损伤中的保护作用 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验步骤及方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 低浓度醉茄素A显着改善心肌缺血/再灌注损伤后心功能 |
| 2.2 醉茄素A抑制线粒体凋亡降低心肌细胞缺血/再灌注损伤 |
| 2.3 醉茄素A在心肌缺血/再灌注损伤中的保护作用依赖AMPK活化 |
| 2.4 醉茄素A促进自噬降解维持自噬平衡降低心肌缺血/再灌注损伤 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 尼古丁致血管内皮细胞功能紊乱的机制研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验步骤及方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 尼古丁组ApoE小鼠主动脉动脉粥样硬化斑块形成显着增多 |
| 2.2 尼古丁致尼古丁受体与Cav-1 相互作用失衡 |
| 2.3 Cav-1 是尼古丁引起内皮细胞炎症反应的上游调控因子 |
| 2.4 雄激素受体(Androgen receptor, AR)可能是尼古丁损伤内皮细胞中,Cav-1的下游调控因子 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果 |
| 个人简历 |
（9）Hippo信号通路在异丙肾上腺素所致心肌损伤中的调控作用研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 异丙肾上腺素通过上调BIM和 Gal-3 表达诱导心肌损伤的作用研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 异丙肾上腺素激活Hippo信号通路的作用研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 异丙肾上腺素通过Hippo信号通路促进BIM和 Gal-3 表达的机制研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 异丙肾上腺素通过cAMP/PKA激活Hippo通路的机制研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 Mst1在心肌细胞凋亡中的作用 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（10）LncRNA Gm2691、新型AMPK激动剂GSK621减轻心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ LncRNA Gm2691通过激活PI3 K/AKT信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤 |
| 中文摘要 Ⅰ |
| Abstract Ⅰ |
| 符号说明 Ⅰ |
| 前言 |
| 第一部分 LncRNA Gm2691对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 LncRNA Gm2691对缺氧/复氧诱导的大鼠心肌细胞损伤的保护作用及机制 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ GSK621通过激活AMPK信号通路减轻氧糖剥夺/复氧引起的心肌细胞损伤 |
| 中文摘要 Ⅱ |
| Abstract Ⅱ |
| 符号说明 Ⅱ |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| SCI论文Ⅰ |
| SCI论文Ⅱ |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
四、α_1受体参与不同血供状态心肌凋亡蛋白调控的研究（论文参考文献）
- [1]CD73通过Wnt/β-catenin通路调节肝星状细胞的活化与增殖的研究[D]. 贾文茜. 安徽医科大学, 2021(01)
- [2]基于网络药理学探究麻黄附子细辛汤治疗病态窦房结综合征的显效成分和作用机制[D]. 朱安娜. 河北大学, 2021(11)
- [3]右美托咪定通过下调mircoRNA-21/PDCD4轴抑制腹主动脉瘤的发展[D]. 虞琦. 南昌大学, 2021(01)
- [4]电针预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及FXR/SHP通路的调控作用[D]. 李晨. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [5]运动预适应通过PI3K-Akt通路诱导线粒体自噬减轻心肌细胞凋亡的研究[D]. 陈玲. 昆明医科大学, 2021(01)
- [6]MicroRNA-210/BNIP3通过影响线粒体自噬-凋亡调控缺氧条件下心肌与内皮细胞损伤的机制研究[D]. 杨一博. 吉林大学, 2021(01)
- [7]白藜芦醇对奶山羊精原干细胞冷冻保存效果的影响[D]. 冯天雨. 西北农林科技大学, 2021
- [8]醉茄素A在心肌缺血/再灌注损伤中的保护作用与尼古丁致血管内皮细胞功能紊乱的机制研究[D]. 郭蕊. 山西医科大学, 2019(12)
- [9]Hippo信号通路在异丙肾上腺素所致心肌损伤中的调控作用研究[D]. 肇炜博. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [10]LncRNA Gm2691、新型AMPK激动剂GSK621减轻心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究[D]. 李婷婷. 山东大学, 2019(03)