一、电转化技术在噬菌体抗体库构建中的应用（论文文献综述）
曲园园[1]（2021）在《人源抗SARS-CoV-2单克隆抗体筛选与抗体功能研究》文中认为严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）是一种具有包膜的单股正链RNA病毒,属于β-冠状病毒。新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019,COVID-19）,是由SARS-CoV-2感染人体所导致的疾病。COVID-19的全球大流行对人类健康构成严重威胁,同时也为病毒突变提供了大量机会。SARS-CoV-2刺突蛋白（S）上的突变可对SARS-CoV-2的感染性、致病性产生较大影响。中和抗体可以有效阻断SARS-CoV-2的感染,但目前已有多种SARS-CoV-2突变株对已上市的单克隆抗体逃逸,因此开发具有广谱中和活性的单克隆抗体,以及研究识别不同表位的协同作用抗体,是未来SARS-CoV-2治疗性抗体开发的方向。本研究筛选得到了 12株单克隆抗体,并对抗体的亲和力、中和活性等生物学功能进行评价,同时也评价了抗体对SARS-CoV-2突变株的中和活性,最后得到了 2株高亲和力,可有效中和多种突变株的中和性抗体。本研究从COVID-19疫情早期恢复期患者的外周血淋巴细胞中扩增得到抗体基因,成功构建Fab噬菌体抗体库。抗体库库容较高,多样性良好,满足抗体筛选的基本需要。本研究使用SARS-CoV-2 S蛋白的三个片段,包括RBD（Receptor Binding Domain,RBD）、S1和S2对抗体库进行筛选。经3轮筛选过程共获得12株序列不同的特异性针对SARS-CoV-2 S蛋白的人源单克隆抗体。经ELISA鉴定,9株抗体与RBD结合,3株与S2结合,未筛选到与S1蛋白N端结构域（Nterminal domain,NTD）结合的抗体。在9株RBD特异性抗体中,两株抗体（F61、H121）具有高亲和力、高中和活性;一株抗体（A199）具有高亲和力,但无中和活性。表明结合于RBD的抗体不一定为中和抗体,RBD蛋白上存在非中和表位。9株RBD特异性抗体可根据其识别的抗原表位被分为三种类型。其中一种以F61为代表,能够识别位于位于G446-S494范围内的具有高中和活性的线性血管紧张素转换酶2（Angiotensin-converting enzyme 2,ACE-2）竞争表位。另一种以H121为代表,识别与ACE-2结合位点不重叠的位于RBD蛋白侧面的中和表位。这表明不与ACE-2竞争的抗体也可能具有中和活性。最后一种抗体A199识别一种与ACE-2结合位点的非重叠,且不具有中和活性的表位。由于目前多种SARS-CoV-2突变株带有S蛋白突变,本研究评价了9株RBD特异性抗体对SARS-CoV-2 S蛋白单氨基酸突变的中和效果,F61和F163可有效中和多种S蛋白单氨基酸突变株。F61和H121可有效中和B.1.1.7和B.1.351,可作为突变株的候选治疗抗体。F61和H121的混合物可更有效的中和SARS-CoV-2野生株、B.1.1.7株和B.1.351株,该混合物具有更广泛的中和效果,可避免免疫逃逸发生。综上所述,本研究筛选得到了2株（F61和H121）具有高亲和力、高中和活性的、识别不同抗原表位单克隆抗体。这两株抗体可有效中和包括B.1.1.7和B.1.351在内的多种突变株。二者的混合物可更有效的中和SARS-CoV-2野生株、B.1.1.7株和B.1.351株,可避免免疫逃逸的发生。这两株抗体可作为突变株的候选治疗抗体,并为当前和未来的疫苗设计、治疗性抗体开发以及SARS-CoV-2及其新变种的抗原诊断提供了指导。
李艳宁[2]（2021）在《抗人白细胞分化抗原20（CD20）纳米抗体的筛选及生物学功能的初步研究》文中研究说明目的构建天然噬菌体单域抗体展示文库,并筛选出针对抗人白细胞分化抗原20（CD20）的纳米抗体,经原核表达及纯化后,对其生物学功能包括特异性、亲和力及与细胞表面CD20分子的结合能力等进行初步研究。方法1.天然噬菌体单域抗体展示文库的构建与鉴定提取骆驼脾组织的总RNA并反转录,基于巢式PCR的方法扩增其可变区片段,构建重组载体并进行电击转化,此为初始库容,然后通过菌液PCR、序列比对等手段评估文库质量。2.抗CD20纳米抗体的生物淘筛以CD20分子为靶标,利用生物素链霉亲和素系统,从文库中进行四轮液相筛选,用phage-ELISA法对阳性克隆的重组噬菌粒初步筛选,菌体测序后获取抗CD20纳米抗体的基因序列。3.抗CD20-Fc纳米抗体的表达及鉴定将筛选到的抗CD20纳米抗体基因序列与人IgG Fc片段偶联,构建pCZN1-CD20-IgG Fc原核重组质粒,诱导表达并纯化目的蛋白（即抗CD20-Fc纳米抗体）;通过SDS-PAGE以及Western Blot等方法对其进行初步的分析与鉴定。4.抗CD20-Fc纳米抗体的生物学功能初步研究利用Western Blot和SPR方法分别验证抗CD20-Fc纳米抗体的特异性及与CD20分子的亲和力;利用量子点免疫荧光法分析抗CD20-Fc纳米抗体与表达在Daudi细胞表面的CD20分子的结合性能。结果1.天然噬菌体单域抗体展示文库的初始库容达2×107CFU/mL,抗体重组率达100%,序列比对发现均符合驼源重链抗体的特征。2.救援后的文库滴度为1×1013CFU/mL,通过四轮淘筛后,特异性吸附的噬菌粒抗体被富集,将phage-ELISA鉴定的阳性克隆进行测序,发现有2条不一致的基因序列得到富集,且均与驼源的特征性纳米抗体序列高度一致。3.成功构建重组载体pCZN1-CD20-IgG Fc,目的蛋白主要通过包涵体表达,抗CD20-Fc纳米抗体的分子量大约为40kDa,其纯度达85%以上。4.抗CD20-Fc纳米抗体能够特异性识别CD20,与CD20分子的亲和力达0.147μM;此外,能够特异性结合Daudi细胞表面的CD20分子。结论1.天然噬菌体单域抗体展示文库成功构建,且抗体重组率高,符合筛选要求,为特定纳米抗体的筛选提供了良好的筛选平台。2.成功筛选出针对CD20的纳米抗体。3.抗CD20-Fc纳米抗体具有特异性高,亲和力好,在体外能够与细胞表面的CD20分子结合等特点,可为该抗体在疾病诊疗方面的研究提供有力支撑。
张凡庆[3]（2020）在《猪源抗猪腹泻重要病原体单链抗体及其保护作用研究》文中研究说明仔猪腹泻占新生仔猪总死亡率的50%以上,是对养猪业造成经济损失的重要疾病之一。目前临床常见的仔猪腹泻病原包括猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus,TGEV）和产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）。发病仔猪表现为腹泻、脱水、生长迟缓和最终死亡。PEDV和TGEV的预防措施是将疫苗免疫母猪,初生仔猪吸吮乳汁被动获得抗体。然而疫苗不能使所有母猪产生高水平乳源抗体,每头仔猪吮乳时间长短不同,很难保证仔猪都获得足够抗体抵抗病毒感染。ETEC的防控依靠抗生素,然而抗生素的大量使用容易导致ETEC产生耐药性。鉴于此,寻求有效对抗这些病原感染的新型免疫制剂显得极为重要。对于消化道病原感染,给动物口服特异性抗体或抗体衍生物是有效的防治方式。然而传统的抗体制剂存在均一性差、抗体来源与受治动物种属不同易产生免疫排斥等问题。随着生物技术的发展,基因工程抗体成为新型抗体制剂的研究热点,基因工程抗体中最具代表性的是单链抗体（single-chain fragment variable,scFv）。人类医学领域有关scFv治疗疾病的研究已很成熟,兽医领域的相关研究则刚刚开始,特别是猪源性scFv的研究以及scFv防治猪腹泻病原的感染鲜有报道,而这方面的研究对猪腹泻病原体新型防治策略的研发具有重要意义。基于此,本研究构建了猪源噬菌体-scFv库,筛选了抗猪源腹泻病原体（PEDV、TGEV和ETEC）scFv,并研究了scFv的生物学特性和保护作用。研究内容包括五个方面:1猪源性抗猪腹泻重要病原体scFv的获得为了获得抗猪腹泻重要病原体scFv序列,构建了猪源噬菌体-scFv库,库容量为5.5×107 cfu/m L(VH-Linker-VLκ)和7.2×107 cfu/mL（VH-Linker-VLλ）。从库中随机挑取12个克隆测序,证实构建的库来源于猪抗体序列,具有多样性。分别以PEDV、TGEV全病毒以及提纯的ETEC K88ac菌毛作为抗原,对构建的猪源噬菌体-scFv库进行筛选,获得了3株高亲和力的抗PEDV scFv（PZZ 21、PZZ 24和PZZ 35）、4株抗TGEV scFv（TZZ 14、TZZ 19、TZZ 43和TZZ 46）以及2株抗ETEC K88ac scFv（EZZ 3和EZZ 24）。将scFv序列进行原核表达及纯化,获得了具有活性的可溶性蛋白。这些猪源scFv应用于仔猪时避免了因抗体与受治动物种属不同而造成机体对抗体产生免疫排斥。2 scFv的生物学特性研究2.1抗PEDV和TGEV scFv的生物学特性研究为了研发抗PEDV和TGEV的新型scFv口服制剂,对针对PEDV和TGEV scFv的生物学特性进行研究。稳定性试验发现4℃保存时添加蛋白酶抑制剂延长了scFv的活性。亲和力试验证实这些scFv的亲和力均在107-108 M-1。分析scFv结合的病毒蛋白,发现PZZ 21、PZZ 24和PZZ 35均与PEDV S蛋白的S1亚基结合,TZZ 14、TZZ 19和TZZ 46与TGEV S蛋白结合,TZZ 43与TGEV N蛋白结合。病毒中和实验证实上述针对S蛋白的scFv具有抗病毒效果,而且将PZZ21、PZZ 24和PZZ 35联合使用的抗病毒效果好于单个scFv,TZZ 14、TZZ 19和TZZ 46也显示出协同作用。分析scFv影响PEDV感染细胞的阶段,发现PZZ21、PZZ 24和PZZ 35在病毒结合细胞时发挥抗病毒作用,而在入侵阶段无作用。2.2抗ETEC K88ac菌毛scFv的生物学特性研究ETEC K88ac菌毛介导细菌对肠上皮的黏附,是引起腹泻的先决条件。细胞黏附抑制实验证实抗ETEC K88ac的scFv EZZ 3和EZZ 24能抑制ETEC黏附IPEC-J2细胞,抑制率达51.9±2.7%和46.7±2.1%,EZZ 3和EZZ 24联合使用对细菌的黏附抑制率达62.6±1.5%。进一步建立了ETEC感染小鼠的腹泻模型,使用该模型分析了EZZ 3和EZZ 24对小鼠的保护作用。结果发现,与ETEC攻毒组相比,scFv处理组小鼠感染ETEC后仅表现轻度腹泻症状,肠道结构完整。此外scFv口服不会造成小鼠组织细胞损伤,不影响小鼠生长,具有安全性。3壳聚糖纳米scFv口服制剂的研制虽然上述研究证明抗PEDV和TGEV scFv在体外中和病毒感染,抗ETEC scFv对ETEC引起的小鼠腹泻具有保护作用,但仔猪消化道环境复杂,抗体口服后可能会受到胃部酸性环境和蛋白酶影响导致疗效降低。为了提高scFv在仔猪胃肠道稳定性,本研究以羧甲基壳聚糖为原料制备了p H响应性scFv纳米口服制剂（CMCS/CS-scFv）。通过优化投入比例和反应条件,得到的CMCS/CS-scFv粒径为292±21 nm,PDI为0.24±0.12。CMCS/CS-scFv纳米制剂眼观呈光泽的乳白色,透射电镜下呈现球形,大小均一。CMCS/CS-scFv能抵抗胃酸对scFv的破坏,其释放具有p H响应性,酸性环境下少量释放,碱性环境中快速释放。此外CMCS/CS-scFv对肠道细胞和仔猪没有毒性,具有安全性。本研究为开发scFv口服制剂的新剂型提供了科学依据。4纳米口服制剂CMCS/CS-scFv对仔猪病原性腹泻的保护作用研究为了验证CMCS/CS-scFv对仔猪腹泻的保护功能,首先比较了scFv和CMCS/CS-scFv对仔猪感染单一病原体的保护效果。PEDV的仔猪保护实验发现,CMCS/CS-PZZ（PZZ包括scFv PZZ 21、PZZ 24和PZZ 35）和PZZ灌服后对仔猪感染PEDV具有保护作用,而且CMCS/CS-PZZ处理后仔猪的腹泻指数显着低于口服PZZ（p<0.05）,显示出更好的保护效果。TGEV动物实验也证实CMCS/CS-TZZ（TZZ包括scFv TZZ 14、TZZ 19和TZZ 46）处理组对仔猪腹泻的保护效果好于TZZ处理组,粪便病毒载量显着低于TZZ处理组（p<0.05）。ETEC动物实验证实CMCS/CS-EZZ对仔猪感染ETEC提供保护,而且CMCS/CS-EZZ口服后保护效果好于EZZ。针对仔猪腹泻往往是多个病原混合感染,将CMCS/CS-scFv（包括PZZ、TZZ、EZZ）联合应用,发现CMCS/CS-scFv灌胃后粪便中病毒粒子和细菌数量显着低于攻毒组（p<0.05）,存活率高于攻毒组,说明CMCS/CS-scFv联合应用对病原混合感染具有保护效果,为临床大规模应用和制剂优化奠定了基础。5分泌表达scFv的乳酸乳球菌对仔猪病原性腹泻的保护作用研究scFv治疗仔猪腹泻时,其在肠道存留时间越长效果越好,为了使scFv在肠道持续释放,受乳酸菌活载体疫苗的启发,将抗猪腹泻病原体scFv与乳酸乳球菌（Lactococcus lactis,L.lactis）表达系统结合,构建了分泌表达scFv的重组L.lactis-scFv（scFv包括PZZ 21、TZZ 19和EZZ 3）。体外实验测定了重组L.lactis-scFv的酸碱耐受性,体内实验证实重组L.lactis-scFv靶向定殖在仔猪肠道黏膜并分泌scFv。细胞保护实验证实了分泌的抗病毒scFv对PEDV、TGEV的中和效果,抗K88ac scFv对ETEC黏附细胞的抑制作用。动物保护实验证实重组L.lactis-scFv口服后对仔猪感染腹泻病原产生保护作用,PEDV、TGEV或ETEC感染引起的腹泻症状减轻。本研究为治疗仔猪腹泻的新型scFv口服投递系统研发提供了科学依据。综上所述,本研究首先构建了猪源噬菌体-scFv库,从中筛选到具有活性的抗PEDV、TGEV和ETEC K88ac scFv;然后通过细胞实验分析了抗PEDV和TGEV scFv结合的病毒蛋白及中和病毒作用,细胞黏附抑制实验和小鼠保护实验证实了抗ETEC K88ac scFv防治腹泻的功能;进一步研制了抵抗胃部酸性环境和蛋白酶的纳米口服制剂CMCS/CS-scFv,增加了scFv口服稳定性;仔猪保护实验证实了scFv和CMCS/CS-scFv对PEDV、TGEV和ETEC引起的仔猪腹泻均具有保护作用,并且口服CMCS/CS-scFv具有比scFv更好的保护效果;将CMCS/CS-scFv联合应用,证实对仔猪腹泻病原混合感染提供保护;构建了分泌表达scFv的重组L.lactis-scFv,证实了重组L.lactis-scFv口服后对仔猪感染腹泻病原体具有良好的保护作用。本研究为仔猪腹泻病原的防治探索了新的途径,也为其它动物疫病的抗体制剂防治提供了有益借鉴。
王沁芸[4]（2020）在《雌酮孕酮尿液代谢物基因工程抗体的筛选与鉴定》文中研究表明雌性激素包括雌激素与孕激素两大类,对女性发育和生殖功能至关重要。雌激素主要有雌酮、雌二醇和雌三醇,孕激素以孕酮为主。雌激素、孕激素水平是生殖监测中不可或缺的临床指标,性激素六项中就包含雌二醇和孕酮,对不孕症的病因诊断、疗效观察、预后判断及生殖生理作用机制的研究具有重要意义。国内外性激素常规检查方法以血清为样本,连续采血检测易引起病人心理压力,且存在安全风险,开发快速无创监测性激素水平方法有较大需求。近期研究发现,雌酮和孕酮的尿液代谢物,雌酮-3-葡糖苷酸（Estrone-3-glucuronide,E1G）和孕二醇-3-葡糖苷酸（Pregnanediol-3-glucuronide,PdG）浓度与血清雌酮孕酮浓度呈线性相关,使得通过尿液无创监控雌酮孕酮水平成为可能。但是E1G和PdG分子量低、免疫原性弱,是哺乳动物体内本身存在的代谢物,难以通过传统免疫方法稳定获得抗体,或高特异性和高亲和力抗体,成为此类检测产品开发的限制因素。随着基因工程和重组抗体技术的发展,第三代抗体尤其是抗原结合片段（Fragment antigen-binding,Fab）,在制备小分子抗原抗体中展现出巨大潜力。结合体外展示技术,能高通量快速筛选出高亲和力高特异性抗体,且制备工艺简单、周期短,可应用于预防、诊断、治疗、检测等领域。本研究利用噬菌体展示技术分别构建了E1G和PdG的Fab抗体库,并通过3-4轮淘筛及酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）验证获得了E1G和PdG的Fab抗体,并对获得的抗体进行了序列分析。本研究主要结果如下:1.以半抗原E1G-BSA和PdG-BSA免疫小鼠,通过效价测定动态监测了小鼠体内相应抗体产生的趋势,结果表明两种半抗原免疫小鼠后均能产生高效价抗体。两种半抗原抗体效价在第9周达到峰值,E1G-BSA效价最高达到1:32000-1:64000,PdG-BSA效价达到1:16000-1:32000,且在小鼠体内抗体产生可维持约6周。2.选取免疫第9周的小鼠取脾脏,抽提脾细胞总RNA后通过反转录获得cDNA,再以cDNA为模板,经过三轮重叠延伸PCR得到Fab片段。通过酶切和连接构建了pComb3Xλ-Fab重组噬菌粒载体,电转化XL1-Blue菌得到两个库容分别为1.13×107和1.03×106的Fab噬菌体抗体库,其重组率分别约为78.57%和92.31%,背景连接率均为0%。3.对构建好的噬菌体抗体库分别进行3-4轮淘选,从富集到的阳性克隆中随机选择克隆进行可溶性抗体片段ELISA分析,获得了多个与E1G或PdG具有高亲和力的抗体。又从中选择了亲和力较好的共9个克隆进行Sanger测序和IMGT/V-QUEST比对,表明针对E1G或PdG的抗体具有类似的结构特征。随后选取两个亲和力较好的克隆E1G-F6和E1G-F8,对于E1G差别极小的三种小分子化合物进行了交叉反应测试,结果证实Fab抗体确实能够识别分子差异极小的小分子化合物。
肖丽荣[5]（2020）在《牛冠状病毒单链抗体的筛选与鉴定》文中提出牛冠状病毒病是世界范围内的重要牛病,其病原牛冠状病毒（Bovine coronavirus,BCoV）可引起犊牛腹泻、成年牛冬痢以及呼吸系统疾病,且常与其他病原混合感染,给全球养牛业的发展造成了巨大的影响。为防止牛冠状病毒病的广泛传播,我们需要在BCoV感染的初期进行诊断并采取相应防制措施。目前,可用来检测牛冠状病毒病原的方法主要有反转录PCR技术和ELISA等,其中ELISA试剂盒主要依赖进口,成本较高且操作不方便,而反转录PCR只适用于少量样品的检测。为建立操作更方便,检测成本更低且更适合大规模检测病原的方法,本研究拟利用BCoV N基因进行表达纯化,并构建BCoV N蛋白噬菌体单链抗体库,以期获得结合活性较高的特异性单链抗体,为BCoV新型快速检测试剂的研发奠定前期基础。本研究内容及结果包括:1.BCoV N蛋白的原核表达及小鼠免疫本试验将已构建好的重组表达载体pET28a-N转入大肠杆菌BL21菌株中,成功表达出目的蛋白,经Western blot鉴定正确后分析蛋白可溶性并进行纯化。结果显示重组蛋白条带大小约54 kDa,为可溶性表达,其可被His单克隆抗体特异性识别,纯化后的N蛋白经SDS-PAGE鉴定纯度较高,蛋白浓度为1.5mg/mL。将纯化的重组N蛋白免疫BALB/C小鼠,三次免疫后分离小鼠血清,经ELISA检测其抗体效价,结果显示抗体滴度可达1/105,表明本试验制备的重组N蛋白免疫原性良好。2.BCoV N蛋白噬菌体单链抗体库的构建及筛选无菌条件下摘取小鼠脾脏,提取其脾脏淋巴细胞总RNA,RT-PCR反转录合成cDNA后,以此为模板,利用设计的小鼠抗体特异性引物经PCR分别扩增抗体的重链可变区基因（VH）和轻链可变区基因（VL）,通过Overlap-PCR将胶回收的VH与VL用短肽（linker）连接,获得单链抗体基因（ScFv）。将纯化后的ScFv基因和酶切载体连接后电转入超级感受态细胞中,经扩大培养并纯化后获得了库容为8×108的噬菌体单链抗体库。通过4轮特异性抗体的富集和建立的筛选针对N蛋白的ELISA单链抗体检测技术,最终筛选到32株阳性值较高的单链抗体。将32株阳性克隆PCR鉴定并测序,分析序列后发现有19株阳性单链抗体基因正确,选取阳性值较高的5株阳性单链抗体检测其噬菌体抗体结合活性,其中阳性单链抗体ScFv-154与N蛋白的结合活性较高,为进一步探讨单链抗体在牛冠状病毒病诊断和防控技术领域的应用奠定了前期基础。
唐诗[6]（2020）在《EGFR蛋白L858R位点突变的单链抗体筛选及鉴定》文中指出目的:构建全人源单链抗体（single chain fragment variable,SCFV）噬菌体展示文库并对其进行滴度测定及多样性分析,通过亲和筛选获得亲和力高的靶向表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）蛋白L858R位点突变单链抗体的序列。方法:1.收集10份正常人外周血,分离出外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）获取总RNA后反转录为互补DNA（complementary DNA,cDNA）,再利用PCR等方法扩增出单链抗体重链可变区（variable of heavy chain,VH）和轻链可变区（variable of light chain,VL）基因拼接成单链抗体,并克隆入噬菌粒载体pComb3后电转化入大肠杆菌TG1,在辅助噬菌体及外包装作用下,建成全人源SCFV噬菌体抗体库;2.把EGFR-L858R作为靶标抗原利用酸洗脱法,经“结合一洗脱一扩增”步骤进行多轮淘选;3.筛选出的单克隆进行酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）鉴定,阳性单克隆送至测序公司进一步分析。结果:1.成功构建出库容量约为1×109的全人源SCFV噬菌体展示文库,文库阳性率及多样性等均合格。2.以EGFR-L858R蛋白为靶标抗原,利用酸洗脱法通过2轮富集筛选及初步鉴定得到10株阳性单克隆。3.对10株阳性单克隆进行测序分析得到6条靶向EGFR蛋白L858R位点突变的人源SCFV序列。结论:本研究成功构建出全人源SCFV噬菌体抗体文库,经过富集筛选及初步鉴定获得了靶向EGFR蛋白L858R位点突变单链抗体的序列。可进一步应用于相关恶性肿瘤的免疫治疗,为CAR-T疗法治疗实体肿瘤提供了新的思路及材料基础。
许永亮[7]（2020）在《F型肉毒毒素单克隆抗体的制备及鉴定》文中研究表明肉毒毒素（Botulinum neurotoxin,BoNT）是目前已知毒性最强的天然物质之一,是一种可致死的毒素。BoNT中毒后会抑制处于神经肌肉接头处乙酰胆碱的释放,造成肌肉松弛性麻痹。BoNT根据其血清型可以分为A～G 7种血清型。人类中毒是由BoNT/A、BoNT/B、BoNT/E、BoNT/F四种血清型引起的。目前没有有效的小分子药物能够治疗BoNT中毒。本研究的目的是制备BoNT/F的单克隆抗体,为开发BoNT/F的有效治疗药物提供了一定的实验依据。本文通过杂交瘤技术和噬菌体抗体库技术来制备针对于BoNT/F的单克隆抗体。首先,以F型肉毒毒素的重链C端（heavy chain carboxy terminal of BoNT serotype F,BoNT/FHc）蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,通过酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测3次免疫后的小鼠尾血效价,取尾血效价最高小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞,在聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）的作用下进行细胞融合来制备杂交瘤细胞。细胞融合14 d后,利用间接ELISA筛选能够分泌单克隆抗体的阳性细胞孔。获得阳性细胞后,采用有限稀释法对其进行克隆化。利用试剂盒检测杂交瘤细胞上清中分泌抗体的亚型。小鼠腹腔注射杂交瘤细胞的方法制备单克隆抗体,并利用protein G柱对腹水中的抗体进行纯化。Lowry法测定抗体的浓度,小鼠中和实验测定单克隆抗体的中和效价。然后,间接ELISA测定杂交瘤细胞培养上清效价最高的单克隆抗体1F4和中和效价最高的单克隆抗体1E2（A）这两株单克隆抗体的亲和力常数。通过IgBLAST分析单克隆抗体的可变区氨基酸序列。采用酶切连接的方式将鼠源抗体1E2（A）的可变区基因连接到人源化质粒中,构建嵌合型人源化质粒。最后,利用噬菌体抗体库来筛选BoNT/F的单克隆抗体。噬菌体抗体库构建完成后,以BoNT/FHc为抗原进行筛选,获得单链抗体片段（single-chain antibody fragment,scFv）基因,并分析其序列。BALB/c小鼠经过抗原BoNT/FHc蛋白3次免疫后,小鼠尾血效价均达到1:16000,2号小鼠的效价最高,达到1:32000。细胞融合率为74.47%,阳性率为8.59%。阳性细胞孔经过克隆化之后获得了7株能稳定分泌单克隆抗体的细胞株1F4、1E2（A）、4B7（A5）、4B7（B2）、4B7（G3）、1E2（B）、4B7（F1）。7株单克隆抗体的重链均为IgG1型,轻链均为κ型。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）电泳结果表明7株杂交瘤细胞在小鼠腹腔内均产生了抗体,经protein G柱纯化后的抗体纯度均大于90%。Lowry法测定纯化后抗体的浓度分别为2.0 mg/mL、1.8 mg/mL、0.5mg/mL、2.7 mg/mL、2.1 mg/mL、2.5 mg/mL、2.8 mg/mL。动物实验结果表明单克隆抗体的中和效价分别为0 LD50/mg、1200 LD50/mg、0 LD50/mg、200LD50/mg、400 LD50/mg、200 LD50/mg、800 LD50/mg。抗体1F4的亲和力常数为1.08×10-8 mol/L,抗体1E2（A）的亲和力常数为8.45×10-5 mol/L。抗体1F4的轻链可变区CDR3序列为QQHYSTPWT,重链可变区CDR3序列为TRHGYFPSWFAY;抗体1E2（A）的轻链可变区CDR3氨基酸序列和重链可变区CDR3氨基酸序列是保密信息。利用分子生物学的方法成功构建了1E2（A）的嵌合型人源化质粒。提取1号小鼠的脾脏RNA,逆转录成cDNA,扩增出300bp左右的抗体轻重链可变区基因,并通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增出750 bp的scFv序列,获得了库容量为1.2×104的鼠源噬菌体单链抗体库。以BoNT/FHc为抗原对获得的抗体库进行筛选,获得了小鼠重链可变区的FR1序列。本研究最终获得了7株单克隆抗体。抗体1F4的亲和力常数为1.08×10-8mol/L,抗体1E2（A）的中和效价为1200 LD50/mg,这为BoNT/F的检测提供新的方法,也为BoNT/F中毒后的治疗奠定了基础;同时,构建了1E2（A）嵌合型质粒,为1E2（A）的人源化及抗体的表达提供了质粒、序列等相关实验数据。
司艳芳[8]（2020）在《天然鼠源噬菌体单链抗体库的构建及抗西马特罗单链抗体的筛选与特性研究》文中指出为了解决食品安全问题及改善非法添加物在我国明令禁止而屡禁不止的现象。利用噬菌体展示技术构建库容量大、适应性强、稳定性高的多样化重组抗体资源库,旨在筛选出特异性强、亲和力高的食品安全危害物重组抗体以应对突发食品安全事件,为建立快速高效的检测方法奠定基础。本研究选取β-兴奋剂类药物中的西马特罗（Cimaterol,CIM）进行研究。采用聚合酶链式反应技术（PCR）和逆转录PCR（RT-PCR）技术,从未经免疫的健康BALB/c小鼠脾脏中提取RNA,以经RT-PCR获得的鼠源c DNA第一链为模板,设计引物扩增鼠源抗体重链（VH）和轻链（VL）可变区基因,利用重叠延伸PCR（SOE-PCR）扩增鼠源单链抗体（Sc Fv）基因。通过DNA连接、电转等技术构建重组噬菌粒,经辅助噬菌体M13K07救援后,构建天然鼠源噬菌体Sc Fv文库。基因测序分析抗体基因的多样性和完整性。应用重氮化法制备人工免疫抗原CIM-BSA和检测抗原CIM-OVA,并用UV、SDS-PAGE、质谱三种方法进行完全抗原的鉴定。进而以人工完全抗原为靶抗原,对构建的鼠源噬菌体Sc Fv文库进行亲和淘选,使携带抗西马特罗表面抗原的特异性噬菌体抗体得到富集。最终筛选出与西马特罗抗原结合活性较高的噬菌体单克隆。将携带高灵敏高特异性Anti-CIM-Sc Fv基因的噬菌体克隆大量制备,侵染大肠杆菌HB2151后,探索用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）的最佳表达条件,并用SDS-PAGE和Western blot鉴定。收集分泌至周质腔的表达产物,用酶联免疫吸附检测法（ELISA）鉴定其对CIM的结合活性,间接竞争ELISA法分析其特性。结果显示,Sc Fv片段经凝胶电泳鉴定大小约为780bp,符合鼠源抗体基因特征。辅助噬菌体M13K07再感染后,获得鼠源噬菌体Sc Fv抗体文库,其插入率为89.47%,多样性为91.17%,库容为1.56×1010pfu,经测序鉴定和序列分析,制备的Sc Fv噬菌体展示库丰富度良好且库容符合特异性淘选要求。CIM完全抗原经SDS-PAGE鉴定相对于载体蛋白泳动速度滞后,经UV扫描鉴定相对于载体蛋白出现新的特异吸收峰,质谱测定其相对分子质量,计算得出CIM-BSA及CIM-OVA偶联比分别为8:1及10:1。随着对CIM抗体的亲和淘选的次数增加,其噬菌体回收率也不断增加,第四轮回收率达到4.2×10-3%,最终获得一株高灵敏高特异性的抗CIM噬菌体克隆,经鉴定在淘选过程中未出现基因缺失及突变的现象。抗西马特罗特异性Sc Fv在大肠杆菌中获得了可溶性表达,在IPTG的诱导下其最佳表达条件为0.1 mmol/L IPTG、30℃、16 h,该抗体效价为1:320;用此单链抗体表达产物建立间接竞争ELISA（ic-ELISA）检测方法,标准曲线为y=-0.2752x+1.0753,R2=0.9848,检测范围广,拟合程度良好。该抗体对CIM有良好的灵敏度,其半数抑制浓度(IC50)为101 ng/m L,最低检测限（LOD）为3.16ng/m L。综上所述,成功构建了天然鼠源单链抗体库,成功从该抗体库中筛选出了抗CIM单链抗体,该抗体具有良好的灵敏度,丰富了西马特罗等β2型受体激动剂的残留检测方法,为进一步制备西马特罗的抗体和抗体进化奠定物质基础,为西马特罗等非法添加物的控制使用提供参考。
秦领兄[9]（2019）在《Aβ蛋白寡聚体特异性单域抗体的筛选、表达及其鉴定》文中提出阿尔茨海默病（Alzheimers disease,AD）是一种发生在人类老年阶段的持续性高级神经功能活动障碍的原发性退行性脑病。其病理变化主要表现为大脑皮质层的萎缩,同时并伴有β-淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）沉积和神经元纤维缠结（Neurofibrillary tangles,NFT）,记忆性神经元变性坏死及数目大量减少,以致老年斑（Senile plaque,SP）的形成。Aβ蛋白在大脑皮质细胞外间隙和脑血管壁中的沉积是AD神经病理学的标志。目前,AD的发病机制和药物研发方面取得了良好的进展,特别是针对Aββ寡聚体的影像学诊断已成为AD治疗极具效果的手段。本试验研究用Aβ寡聚体免疫双峰驼,分离外周血淋巴细胞,通过RT-PCR技术,得到重链抗体的可变区（VHH）,成功构建了库容为1×107的初级Aβ单域抗体库。然后再以噬菌体展示技术对抗体库进行筛选,利用ELISA法筛选特异性识别Aβ寡聚体的阳性克隆株,在Transetta-DE3感受态细胞中加入Aβ连接pET-25b-SBP,在进行可溶性表达和蛋白纯化。SDS-PAGE分析结果显示Aβ抗体以可溶性的形式获得了正确的表达,且成功进行了纯化。ELISA结果表明,重组表达的Aβ抗体具有对Aβ寡聚体特异性结合活性。因此,本试验应用噬菌体展示技术,成功构建Aβ噬菌体抗体基因抗体库,同时获得特异性强、表达量高的Aβ寡聚体特异性单域抗体,为阿尔茨海默病的临床诊断和治疗研究提供新的途径。
孙志杰[10]（2019）在《抗人CTLA-4抗体的制备及功能研究》文中研究表明细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）是表达于T细胞表面的一种抑制T细胞活化的负调节分子,在恶性肿瘤及一些自身免疫疾病的发生发展中发挥重要作用。肿瘤细胞可以利用CTLA-4实现免疫逃逸,CTLA-4的阻断剂如单克隆抗体能够重新激活免疫系统,达到抗肿瘤的目的。本研究旨在利用鼠源及人源抗体库技术获取靶向人CTLA-4的单克隆抗体。合成人CTLA-4胞外区基因,扩增得到胞外区基因片段,插入大肠杆菌表达载体pET28a,构建了编码人CTLA-4胞外区基因的重组质粒pET28a-CTLA4。将重组质粒转化至大肠杆菌Rosseta（DE3）中,在IPTG终浓度为0.5 mmol/L、于37℃诱导4 h的条件下,实现了人CTLA-4胞外区重组蛋白的高效表达,表达产物主要为包涵体。对诱导温度、诱导时间及诱导剂IPTG终浓度三个因素进行了优化,确定重组蛋白在IPTG终浓度为1 mmol/L、于25℃诱导6 h的条件下表达量最高。利用高浓度尿素溶解包涵体蛋白,通过Ni2+亲和层析获得了纯度大于90%的重组蛋白。将包涵体蛋白复性成为可溶蛋白,制备了人CTLA-4胞外区基因重组抗原。利用人CTLA-4胞外区基因重组抗原对5只BALB/c小鼠进行了4次免疫。选取血清效价最高的小鼠分离脾脏,提取总RNA,逆转录成cDNA。以cDNA为模板分别扩增得到大小约300bp的抗体轻、重链可变区基因片段,利用重叠延伸PCR将轻、重链可变区基因拼接成大小约为750bp的单链抗体片段ScFv。将ScFv插入噬菌体载体pCANTAB-5E中,转化至大肠杆菌TG1,经PCR鉴定ScFv插入率约为93.5%,构建了库容量约为1.4×106的鼠源噬菌体单链抗体库。经过3轮富集筛选,获得2株针对人CTLA-4胞外区基因重组抗原的鼠源单链抗体基因。另一方面,利用人CTLA-4胞外区基因重组抗原,对大容量的人源噬菌体单链抗体库按照“吸附、洗脱、扩增”的顺序反复进行了4轮淘选。第4轮淘选完成后,经ELISA鉴定,获得24株阳性噬菌体克隆。对该24株阳性噬菌体克隆携带的抗体序列进行分析,其中21株噬菌体克隆携带的抗体基因完全一致,重复率达87.5%,提示其为能够与抗原特异性结合的人源单链抗体基因。利用PCR分别扩增得到大小为324 bp的轻链可变区基因和351 bp的重链可变区基因,构建重组质粒pABL-VL和293H-VH,利用共转染293 F细胞,成功表达了具有完整结构的全抗体。经Protein A亲和层析纯化,获得了纯度大于90%的人源单克隆抗体。利用ELISA、Western印迹鉴定,结果表明抗体具有良好的特异性。此外,还制备了针对人突触小体相关蛋白25（SNAP25）的鼠源单克隆抗体。利用大肠杆菌成功表达了SNAP25蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,制备杂交瘤细胞。经过两轮筛选获得12株针对SNAP25的阳性杂交瘤细胞株,同时鉴定了抗体亚型。选取与抗原结合活性最高的14号杂交瘤细胞株制备腹水单抗,经Protein G亲和层析纯化,最终获得一株纯度大于90%的单克隆抗体,可用于肉毒毒素的检测。
二、电转化技术在噬菌体抗体库构建中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、电转化技术在噬菌体抗体库构建中的应用（论文提纲范文）
（1）人源抗SARS-CoV-2单克隆抗体筛选与抗体功能研究（论文提纲范文）
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 1. COIVD19流行概况 |
| 2. SARS-CoV-2基因特征和病毒相关蛋白 |
| 2.1 SARS-CoV-2的基因特征 |
| 2.2 SARS-CoV-2相关蛋白 |
| 2.3 SARS-CoV-2的生命周期 |
| 2.4 SARS-CoV-2的组织噬性和诱发的机体免疫应答 |
| 3. SARS-CoV-2的主要突变株及其影响 |
| 3.1 SARS-CoV-2的主要突变株 |
| 3.2 突变点对SARS-CoV-2的影响 |
| 4. 现有抗体药物及其特征 |
| 4.1 现有抗体药物 |
| 4.2 单克隆抗体药物存在的问题 |
| 第一节 人源抗SARS-CoV-2 Fab噬菌体抗体库的构建与单克隆抗体筛选 |
| 绪论 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 细胞、菌株、噬菌体和质粒 |
| 1.2 抗原和单克隆抗体 |
| 1.3 Fab抗体基因扩增所用引物 |
| 1.4 试剂 |
| 1.5 培养基 |
| 1.6 仪器设备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 技术路线 |
| 2.2 人源抗SARS-CoV-2 Fab噬菌体抗体库的构建 |
| 2.3 噬菌体抗体库的富集 |
| 2.4 Fab抗体原核表达及阳性克隆筛选鉴定 |
| 3. 结果 |
| 3.1 人源抗SARS-CoV-2病毒Fab噬菌体抗体库的构建 |
| 3.2 人源抗SARS-CoV-2抗体库的富集筛选 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第二节 人源抗SARS-CoV-2 S蛋白基因工程抗体功能及表位研究 |
| 绪论 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 载体、细胞、蛋白、病毒 |
| 1.2 培养基、抗体和试剂盒 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 实验方案与技术路线 |
| 2.2 人源抗SARS-CoV-2 S蛋白IgG抗体表达载体的构建 |
| 2.3 人源抗SARS-CoV-2 IgG全抗体的功能鉴定 |
| 2.4 SARS-CoV-2 S蛋白特异性抗体抗原表位研究 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 IgG全抗体在EXPI293F中表达 |
| 3.2 人源抗SARS-CoV-2 S蛋白IgG全抗体的功能鉴定 |
| 3.3 SARS-CoV-2 S蛋白抗原表位研究 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第三节 SARS-CoV-2突变对基因工程抗体的影响研究 |
| 绪论 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 载体、细胞、蛋白、病毒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 实验方案与技术路线 |
| 2.2 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.3 微量中和试验(CPE法) |
| 2.4 假病毒中和实验 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 SARS-CoV-2 S蛋白突变位点分析 |
| 3.2 S蛋白氨基酸单点突变对抗体结合活性影响 |
| 3.3 S蛋白单点突变对抗体中和活性的影响 |
| 3.4 突变株B.1.1.7和B.1.351对F61和H121中和活性影响评价 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）抗人白细胞分化抗原20（CD20）纳米抗体的筛选及生物学功能的初步研究（论文提纲范文）
| 基金来源 |
| 摘要 |
| abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 天然噬菌体单域抗体展示文库的构建与鉴定 |
| 材料及方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 抗CD20 纳米抗体的生物淘筛 |
| 材料及方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 抗CD20-Fc纳米抗体的表达及鉴定 |
| 材料及方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 抗CD20-Fc纳米抗体的生物学功能初步研究 |
| 材料及方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 CD20分子及纳米抗体的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 个人简介 |
| 开题、中期及学位论文答辩委员组成 |
（3）猪源抗猪腹泻重要病原体单链抗体及其保护作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 仔猪腹泻的防治研究进展 |
| 1.1 PEDV的防治研究进展 |
| 1.2 TGEV的防治研究进展 |
| 1.3 ETEC的防治研究进展 |
| 2 scFv及噬菌体展示技术 |
| 2.1 抗体简介 |
| 2.2 scFv的分子结构 |
| 2.3 scFv的表达 |
| 2.4 scFv的筛选方法 |
| 2.5 scFv的应用 |
| 3 壳聚糖纳米制剂药物口服递送系统概述 |
| 3.1 口服治疗与纳米技术 |
| 3.2 壳聚糖 |
| 3.3 壳聚糖的改性 |
| 3.4 壳聚糖纳米药物载体制备方法 |
| 3.5 壳聚糖纳米制剂在生物医学领域的应用 |
| 4 乳酸菌作为口服递送载体的研究进展 |
| 4.1 LAB |
| 4.2 LAB载体系统 |
| 4.3 NICE表达系统 |
| 4.4 LAB的表达形式 |
| 4.5 LAB表达系统的应用 |
| 5 研究目的与意义 |
| 第二章 猪源噬菌体-scFv库的构建和抗猪腹泻重要病原体scFv的筛选鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒、细胞和菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 猪抗体水平检测 |
| 2.2 外周血淋巴细胞的分离 |
| 2.3 cDNA的合成 |
| 2.4 猪源scFv基因的扩增 |
| 2.5 猪源噬菌体-scFv库的构建 |
| 2.6 猪源噬菌体-scFv库的鉴定 |
| 2.7 PEDV和 TGEV全病毒抗原的制备 |
| 2.8 ETEC菌毛抗原的提取 |
| 2.9 M13KO7 辅助噬菌体的扩增 |
| 2.10 猪源噬菌体-scFv的富集筛选 |
| 2.11 噬菌体ELISA |
| 2.12 重组scFv蛋白的表达及纯化 |
| 2.13 免疫印迹 |
| 3 结果 |
| 3.1 猪抗体水平检测 |
| 3.2 scFv的获得 |
| 3.3 猪源噬菌体-scFv库的构建和鉴定 |
| 3.4 病毒的浓缩纯化 |
| 3.5 ETEC K88ac菌毛的纯化 |
| 3.6 猪源噬菌体-scFv的筛选鉴定 |
| 3.7 噬菌体ELISA鉴定 |
| 3.8 scFv的序列分析与纯化 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 抗猪腹泻重要病原体scFv的生物学功能研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒、细胞和毒株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 抗PEDV和 TGEV scFv的特性分析 |
| 2.2 真核表达质粒的构建 |
| 2.3 细胞转染 |
| 2.4 间接免疫荧光 |
| 2.5 细胞样品处理 |
| 2.6 病毒滴度的测定 |
| 2.7 scFv中和实验 |
| 2.8 scFv对 PEDV入侵Vero细胞的影响 |
| 2.9 抗K88ac菌毛多克隆抗体的制备 |
| 2.10 黏附实验和黏附抑制实验 |
| 2.11 IPEC-J2 细胞的细胞因子测定 |
| 2.12 ETEC感染小鼠腹泻模型的建立 |
| 2.13 抗k88ac scFv对感染ETEC小鼠的保护作用研究 |
| 2.14 小鼠细胞因子水平的检测 |
| 2.15 小鼠肠道病理切片制作及HE染色 |
| 2.16 小鼠肠道病理形态的定量分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 scFv的特异性实验 |
| 3.2 scFv的稳定性分析 |
| 3.3 scFv的亲和力分析 |
| 3.4 scFv的抗原结合位点分析 |
| 3.5 scFv的细胞毒性实验 |
| 3.6 scFv与病毒蛋白的结合 |
| 3.7 scFv的抗病毒作用分析 |
| 3.8 scFv对 PEDV入侵Vero细胞的影响 |
| 3.9 多克隆抗体ELISA效价检测 |
| 3.10 scFv对 ETEC黏附细胞的抑制作用分析 |
| 3.11 scFv对 ETEC诱导细胞因子表达的影响 |
| 3.12 小鼠腹泻模型的建立 |
| 3.13 scFv对小鼠腹泻的保护作用研究 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第四章 壳聚糖纳米口服scFv制剂及其生物学特性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞和实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 CMCS纳米制剂的制备 |
| 2.2 表征分析 |
| 2.3 纳米制剂的包封率及载药量的测定 |
| 2.4 scFv在纳米制剂中的完整性 |
| 2.5 纳米制剂在模拟胃酸环境中的稳定性 |
| 2.6 scFv释放实验 |
| 2.7 纳米制剂的生物安全性实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 CMCS的制备 |
| 3.2 纳米制剂的表征 |
| 3.3 载药率与包封率 |
| 3.4 scFv在纳米材料中的完整性 |
| 3.5 scFv在模拟胃酸环境中的稳定性 |
| 3.6 scFv的释放实验 |
| 3.7 纳米制剂的生物安全性 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第五章 scFv纳米口服制剂CMCS/CS-scFv对仔猪腹泻的保护作用研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 scFv的纯化制备 |
| 2.2 CMCS/CS-scFv和 scFv的口服鉴定 |
| 2.3 CMCS/CS-PZZ对仔猪感染PEDV的保护作用研究 |
| 2.4 CMCS/CS-TZZ对仔猪感染TGEV的保护作用研究 |
| 2.5 CMCS/CS-EZZ对仔猪感染ETEC的保护作用研究 |
| 2.6 scFv纳米制剂联合使用对仔猪感染腹泻病原的保护作用研究 |
| 3 结果 |
| 3.1 口服CMCS/CS-scFv和 scFv在肠道的分布 |
| 3.2 CMCS/CS-PZZ对仔猪感染PEDV的保护作用 |
| 3.3 CMCS/CS-TZZ对仔猪感染TGEV的保护作用 |
| 3.4 CMCS/CS-EZZ对仔猪感染ETEC的保护作用 |
| 3.5 纳米口服制剂CMCS/CS-scFv对腹泻病原体混合感染的保护作用 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第六章 分泌表达scFv的乳酸乳球菌制备及其保护功能研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株、细胞和实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 分泌表达scFv 的重组L.lactis-scFv 的构建 |
| 2.2 L.lactis电转化感受态细胞制备 |
| 2.3 L.lactis的电转化 |
| 2.4 重组L.lactis-scFv对模拟胃肠道环境的耐受性及生长曲线 |
| 2.5 重组L.lactis-scFv对 IPEC-J2 细胞的黏附 |
| 2.6 重组L.lactis-scFv对仔猪肠道的黏附 |
| 2.7 重组L.lactis-scFv的诱导表达 |
| 2.8 重组L.lactis-scFv分泌scFv的生物学功能分析 |
| 2.9 重组L.lactis-scFv分泌scFv的动物保护功能分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 scFv分泌表达载体的构建 |
| 3.2 重组L.lactis-scFv的生长特性 |
| 3.3 重组L.lactis-scFv的黏附特性 |
| 3.4 重组L.lactis-scFv分泌scFv的生物学功能鉴定 |
| 3.5 重组L.lactis-scFv的动物保护作用鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 常用溶液的配制 |
| 附录二 补充图 |
| 附录三 补充表 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 授权的发明专利 |
（4）雌酮孕酮尿液代谢物基因工程抗体的筛选与鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 注释表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 雌激素与孕激素 |
| 1.1.1 雌激素与孕激素的生理功能 |
| 1.1.2 雌激素孕激素检测的临床指标和意义 |
| 1.1.3 雌酮孕酮代谢物及其临床意义 |
| 1.1.4 雌激素临床检测方法 |
| 1.2 抗体 |
| 1.2.1 抗体的结构 |
| 1.2.2 抗体的识别 |
| 1.2.3 抗体的制备 |
| 1.3 基因工程抗体 |
| 1.3.1 基因工程抗体种类 |
| 1.3.2 Fab抗体及其应用 |
| 1.3.3 基因工程抗体的制备与筛选 |
| 1.4 噬菌体抗体库技术 |
| 1.4.1 噬菌体展示技术 |
| 1.4.2 噬菌体抗体库 |
| 1.4.3 噬菌体抗体库技术的优势 |
| 1.5 研究目的与研究内容 |
| 1.5.1 研究目的及研究意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.5.3 研究方法与技术路线 |
| 第二章 小鼠免疫与抗体Fab基因的扩增 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 引物序列 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 溶液配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠的免疫 |
| 2.2.2 抗体效价的动态监测 |
| 2.2.3 脾细胞的分离 |
| 2.2.4 总RNA的提取 |
| 2.2.5 cDNA的合成 |
| 2.2.6 SOE-PCR扩增Fab基因 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 抗体效价的测定 |
| 2.3.2 总RNA的提取及反转录 |
| 2.3.3 抗体基因的扩增 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第三章 抗E1G、PdG的 Fab噬菌体抗体库的构建 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 引物序列 |
| 3.1.3 试剂及溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备和耗材 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 XL1-Blue电转感受态细胞的制备 |
| 3.2.2 噬菌体抗体重组载体的构建 |
| 3.2.3 Fab噬菌体抗体库的电转化 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 XL1-Blue感受态细胞的转化效率与污染测试结果 |
| 3.3.2 Fab与 pComb3Xλ的酶切结果 |
| 3.3.3 小体系连接测试结果 |
| 3.3.4 Fab噬菌体抗体库的电转化 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第四章 抗E1G、PdG的 Fab噬菌体抗体库的筛选 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 试剂及溶液配制 |
| 4.1.3 主要耗材 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 辅助噬菌体的制备 |
| 4.2.2 噬菌体抗体库的扩增 |
| 4.2.3 噬菌体的纯化 |
| 4.2.4 抗体库的淘选 |
| 4.2.5 抗体库的第二轮扩增与淘选 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 VCSM13 辅助噬菌体的制备 |
| 4.3.2 Fab噬菌体抗体库的淘选 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第五章 抗E1G、PdG Fab抗体的分析与鉴定 |
| 5.1 材料与试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 抗体片段的表达 |
| 5.2.2 抗体片段ELISA |
| 5.2.3 DNA测序与序列分析 |
| 5.2.4 间接竞争ELISA |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 可溶性抗体片段ELISA |
| 5.3.2 Sanger测序与IMGT/V-QUEST比对结果 |
| 5.3.3 E1G抗体的交叉反应测试 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间发表的学术论文 |
（5）牛冠状病毒单链抗体的筛选与鉴定（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 牛冠状病毒研究进展 |
| 1.1.1 BCoV的病原学 |
| 1.1.2 BCoV的流行病学 |
| 1.1.3 牛冠状病毒相关疾病 |
| 1.1.4 BCoV检测方法 |
| 1.1.5 BCoV的种间传播 |
| 1.1.6 BCoV的防治 |
| 1.2 单链抗体的研究进展 |
| 1.2.1 单链抗体简介 |
| 1.2.2 单链抗体的应用 |
| 1.3 噬菌体展示技术 |
| 1.3.1 噬菌体展示技术的概念及原理 |
| 1.3.2 噬菌体展示系统分类 |
| 1.3.3 噬菌体展示技术的应用 |
| 1.4 噬菌体抗体库技术 |
| 1.4.1 噬菌体抗体库技术的产生及原理 |
| 1.4.2 噬菌体抗体库的分类 |
| 1.4.3 噬菌体抗体库的筛选 |
| 1.4.4 噬菌体抗体库的应用 |
| 1.5 研究的目的及意义 |
| 第二章 BCoV N蛋白的表达与纯化 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要生物材料 |
| 2.1.2 设备仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要溶液配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 BCoV N蛋白的表达 |
| 2.2.2 重组蛋白的鉴定 |
| 2.2.3 重组蛋白的纯化 |
| 2.2.4 小鼠免疫 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 重组BCoV N蛋白的表达鉴定 |
| 2.3.2 重组BCoV N蛋白的纯化 |
| 2.3.3 小鼠的免疫及血清抗体效价的检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 重组N蛋白作为优势抗原的原因分析 |
| 2.4.2 优势抗原重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 BCoV N蛋白噬菌体单链抗体库的构建与筛选 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要生物材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要溶液的配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 噬菌体抗体库的构建 |
| 3.2.2 噬菌体抗体库的富集淘选及鉴定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 BCoV N蛋白噬菌体抗体库的构建 |
| 3.3.2 BCoV N蛋白噬菌体抗体库的淘选及鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 BCoVN蛋白抗体库的构建 |
| 3.4.2 噬菌体抗体库的筛选及鉴定 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 论文受资助情况 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）EGFR蛋白L858R位点突变的单链抗体筛选及鉴定（论文提纲范文）
| 缩略语/符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1 表皮生长因子受体 ( epidermal growth factor receptor,EGFR)概述 |
| 2 噬菌体抗体库技术概述 |
| 3 嵌合抗原受体修饰T细胞( chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)免疫疗法概述 |
| 实验一 全人源SCFV噬菌体抗体库的构建 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 载体、菌株及血样来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液及培养基配制 |
| 1.4 主要实验仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 人外周血淋巴细胞分离和总RNA的提取 |
| 2.2 c DNA第一链的合成 |
| 2.3 抗体重链可变区VH及轻链可变区VL基因的扩增 |
| 2.4 人源SCFV片段的连接 |
| 2.5 重组质粒pComb3-SCFV的构建 |
| 2.6 噬菌体抗体库的构建 |
| 2.7 单链抗体噬菌体展示文库的鉴定 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 RNA提取结果鉴定 |
| 3.2 PCR扩增VH及 VL基因结果鉴定 |
| 3.3 SCFV片段拼接结果鉴定 |
| 3.4 噬菌粒载体pComb3 双酶切鉴定 |
| 3.5 切后载体与切后SCFV连接效率鉴定 |
| 3.6 电击转化噬菌体文库库容及滴度测定 |
| 3.7 全人源SCFV噬菌体抗体文库阳性率及多样性检测 |
| 实验二 EGFR蛋白L858R位点突变单链抗体的富集筛选及鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 大肠杆菌、抗原及辅助噬菌体 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要试剂及培养基配制 |
| 1.4 实验仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 EGFR蛋白L858R位点突变单链抗体的富集筛选 |
| 2.2 单克隆ELISA法初步鉴定重组噬菌体亲和性 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 噬菌体库2轮富集筛选结果 |
| 3.2 单克隆ELISA法初步鉴定重组噬菌体亲和性 |
| 3.3 序列分析 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历和研究成果 |
| 个人简历 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（7）F型肉毒毒素单克隆抗体的制备及鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 肉毒毒素 |
| 1.2 BoNT/F |
| 1.3 抗体 |
| 1.4 单克隆抗体 |
| 1.5 鼠源抗体的人源化 |
| 1.6 M13辅助噬菌体 |
| 1.7 噬菌体抗体库技术 |
| 1.8 本课题研究目的及意义 |
| 1.9 本课题研究内容 |
| 第2章 单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 实验动物及细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要溶液、培养基 |
| 2.1.4 主要仪器及耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠免疫 |
| 2.2.2 间接ELISA测定小鼠尾血血清效价 |
| 2.2.3 骨髓瘤细胞的处理 |
| 2.2.4 饲养层细胞的制备 |
| 2.2.5 细胞融合 |
| 2.2.6 阳性细胞的筛选 |
| 2.2.7 有限稀释法克隆化 |
| 2.2.8 抗体亚型鉴定 |
| 2.2.9 抗体的制备及纯化 |
| 2.2.10 Lowry法测定抗体的浓度 |
| 2.2.11 抗体中和效价测定 |
| 2.2.12 抗体亲和力常数测定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 小鼠尾血效价测定结果 |
| 2.3.2 细胞融合率及阳性率 |
| 2.3.3 抗体亚型鉴定结果 |
| 2.3.4 SDS-PAGE鉴定腹水中抗体的表达 |
| 2.3.5 SDS-PAGE鉴定抗体的纯化结果 |
| 2.3.6 抗体的浓度 |
| 2.3.7 抗体中和效价测定结果 |
| 2.3.8 抗体亲和力常数测定结果 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第3章 抗体人源化质粒的构建 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 培养基及溶液的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 抗体可变区基因的扩增 |
| 3.2.2 1E2(A)人源化质粒的构建 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 琼脂糖凝胶电泳鉴定抗体的可变区基因 |
| 3.3.2 琼脂糖凝胶电泳鉴定人源质粒的酶切 |
| 3.3.3 人源化质粒的鉴定结果 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第4章 噬菌体抗体库的构建及筛选 |
| 4.1 实验仪器及材料 |
| 4.1.1 菌株和质粒 |
| 4.1.2 实验材料 |
| 4.1.3 溶液的制备 |
| 4.1.4 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 小鼠脾脏RNA的提取 |
| 4.2.2 cDNA的合成 |
| 4.2.3 抗体可变区基因的扩增 |
| 4.2.4 scFv基因的制备 |
| 4.2.5 噬菌体质粒的扩增 |
| 4.2.6 scFv基因和噬菌体载体的酶切与连接 |
| 4.2.7 感受态的制备 |
| 4.2.8 感受态电转效率测定 |
| 4.2.9 质粒的电转 |
| 4.2.10 辅助噬菌体的制备 |
| 4.2.11 辅助噬菌体的滴度测定 |
| 4.2.12 噬菌体抗体库的筛选 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 小鼠脾脏RNA的提取结果 |
| 4.3.2 琼脂糖凝胶电泳鉴定抗体的可变区基因 |
| 4.3.3 琼脂糖凝胶电泳鉴定scFv基因 |
| 4.3.4 琼脂糖凝胶电泳鉴定噬菌体质粒的酶切 |
| 4.3.5 TG1感受态的电转效率 |
| 4.3.6 噬菌体抗体库库容量 |
| 4.3.7 辅助噬菌体的滴度 |
| 4.3.8 噬菌体抗体库的筛选结果 |
| 4.3.9 测序结果的比对与分析 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况 |
（8）天然鼠源噬菌体单链抗体库的构建及抗西马特罗单链抗体的筛选与特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 西马特罗国内外研究概况 |
| 1.1.1 西马特罗研究概况 |
| 1.1.2 西马特罗的危害 |
| 1.1.3 西马特罗残留的检测方法 |
| 1.2 噬菌体抗体库的研究进展及应用 |
| 1.2.1 噬菌体抗体库的类型 |
| 1.2.2 噬菌体抗体库技术的特点与优势 |
| 1.2.3 噬菌体抗体库技术的应用 |
| 1.2.4 噬菌体抗体库技术的应用前景及存在的问题 |
| 第二章 鼠源天然单链抗体库的构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 噬菌体和菌株 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要使用仪器 |
| 2.1.4 主要试剂及试剂盒 |
| 2.1.5 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 鼠RNA的提取及鉴定 |
| 2.2.2 鼠cDNA第一链的合成 |
| 2.2.3 引物设计与合成 |
| 2.2.4 VH与VL的合成 |
| 2.2.5 SOE-PCR拼接Sc Fv抗体基因及扩增 |
| 2.2.6 噬菌体抗体库的构建 |
| 2.2.7 抗体库的构建及救援 |
| 2.2.8 抗体库滴度的测定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 RNA鉴定结果 |
| 2.3.2 VH与VL的电泳结果 |
| 2.3.3 ScFv扩增的电泳结果 |
| 2.3.4 Sc Fv全长片段及p CANTAB-5E的酶切结果 |
| 2.3.5 重组质粒的菌液PCR鉴定结果 |
| 2.3.6 重组质粒的酶切鉴定结果 |
| 2.3.7 ScFv基因的序列分析 |
| 2.3.8 ScFv抗体库的滴度测定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 ScFv基因的拼接 |
| 2.4.2 辅助噬菌体的使用 |
| 2.4.3 噬菌体的富集方式 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 西马特罗完全抗原的制备及鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要使用试剂与仪器 |
| 3.1.2 溶液体系 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 免疫原的制备 |
| 3.2.2 包被原的制备 |
| 3.2.3 抗原的表征与鉴定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 完全抗原的SDS-PAGE鉴定 |
| 3.3.2 完全抗原的UV鉴定 |
| 3.3.3 完全抗原的MALDI-TOF-MS鉴定及高分辨质谱鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 西马特罗单链抗体的筛选及鉴定 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要菌株 |
| 4.1.2 主要使用试剂及仪器 |
| 4.1.3 主要溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 对数生长期大肠杆菌TG1的制备 |
| 4.2.2 辅助噬菌体M13K07的制备及滴度测定 |
| 4.2.3 噬菌体ScFv抗体库的富集筛选 |
| 4.2.4 噬菌体ScFv抗体库的筛选结果的初步鉴定 |
| 4.2.5 高亲和力阳性噬菌体克隆的筛选 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 噬菌体ScFv抗体库的富集筛选 |
| 4.3.2 高亲和力阳性噬菌体克隆的分析鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 抗西马特罗单链抗体在大肠杆菌中的可溶性表达及性质鉴定 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 主要菌株及阳性噬菌体单链抗体克隆 |
| 5.1.2 主要试剂与仪器 |
| 5.1.3 主要溶液配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 对数生长期大肠杆菌HB2151的制备 |
| 5.2.2 阳性克隆重组噬菌体的制备 |
| 5.2.3 阳性克隆重组噬菌体感染HB2151 |
| 5.2.4 13-CIM-Sc Fv的可溶性表达 |
| 5.2.5 可溶性13-CIM-Sc Fv的 SDS-PAGE检测 |
| 5.2.6 可溶性13-CIM-Sc Fv的 Western blot检测 |
| 5.2.7 可溶性13-CIM-Sc Fv的竞争抑制ELISA分析方法的初步建立 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 可溶性13-CIM-ScFv的SDS-PAGE检测结果 |
| 5.3.2 可溶性13-CIM-ScFv的Westernblot检测结果 |
| 5.3.3 可溶性13-CIM-ScFv的效价检测结果 |
| 5.3.4 可溶性13-CIM-ScFv的竞争抑制ELISA标准曲线 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 关于ScFv的可溶性表达 |
| 5.4.2 关于单链抗体在非法添加剂酶联免疫分析上的应用前景 |
| 5.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
（9）Aβ蛋白寡聚体特异性单域抗体的筛选、表达及其鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 阿尔茨海默病概述 |
| 1.1.1 致病机理 |
| 1.1.2 临床症状 |
| 1.1.3 诊断与预防 |
| 1.1.4 国内外AD免疫治疗的研究现状和发展趋势 |
| 1.2 抗体概述 |
| 1.2.1 抗体结构 |
| 1.2.2 单域抗体 |
| 1.3 噬菌体展示技术与噬菌体抗体库 |
| 1.3.1 噬菌体展示技术 |
| 1.3.2 噬菌体抗体库的筛选 |
| 1.3.3 噬菌体抗体库技术展望 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 2 试验一 抗Aβ寡聚体单域抗体库构建 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 Aβ_(1-42)肽 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 培养基和缓冲液的配制 |
| 2.1.5 试验仪器和设备 |
| 2.1.6 PCR引物 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 骆驼的免疫 |
| 2.2.2 血清抗体效价的测定 |
| 2.2.3 采集骆驼全血 |
| 2.2.4 外周血淋巴细胞分离 |
| 2.2.5 总RNA提取 |
| 2.2.6 反转录合成cDNA |
| 2.2.7 单域抗体基因的扩增 |
| 2.2.8 VHH片段的酶切 |
| 2.2.9 pCANTAB5e载体的制备 |
| 2.2.10 VHH片段与pCANTAB5e载体连接 |
| 2.2.11 电转化感受态大肠杆菌TG1 |
| 2.2.12 抗体库的初步鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 血清抗体效价ELISA鉴定结果 |
| 2.3.2 Aβ单域抗体基因的扩增结果 |
| 2.3.3 pCANTAB5e质粒酶切结果 |
| 2.3.4 抗体库的鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 3 试验二 Aβ特异性单域抗体的富集和筛选 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 主要培养基和缓冲液配制方法 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 Aβ单域抗体的富集和筛选 |
| 3.2.2 Phage ELISA鉴定阳性克隆 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 辅助噬菌体M13K07复壮滴度结果 |
| 3.3.2 Aβ特异性单域抗体的富集和筛选结果 |
| 3.3.3 重组噬菌体单域抗体ELISA鉴定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 4 试验三 Aβ特应性单域抗体的诱导表达、纯化及鉴定 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 Aβ单域抗体 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 培养基和缓冲液的配制 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 重组质粒的构建 |
| 4.2.2 Aβ单域抗体的表达及纯化 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 Aβ单域抗体基因扩增结果 |
| 4.3.2 表达质粒和表达载体质粒的酶切结果 |
| 4.3.3 重组质粒菌落鉴定结果 |
| 4.3.4 菌体破碎SDS-PAGE结果 |
| 4.3.5 菌体破碎ELISA结果 |
| 4.3.6 纯化蛋白SDS-PAGE结果 |
| 4.3.7 纯化蛋白ELISA检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（10）抗人CTLA-4抗体的制备及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 0.1 细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4) |
| 0.2 单克隆抗体 |
| 0.3 噬菌体抗体库技术 |
| 0.4 突触小体相关蛋白25(SNAP25) |
| 0.5 研究目的及意义 |
| 第1章 人CTLA-4 胞外区基因重组抗原的制备 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与试剂 |
| 1.2.1 菌株 |
| 1.2.2 主要试剂 |
| 1.2.3 主要溶液、培养基 |
| 1.2.4 主要仪器及耗材 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 原核表达质粒的构建 |
| 1.3.2 重组蛋白的表达 |
| 1.3.3 重组蛋白表达条件的优化 |
| 1.3.4 重组蛋白的大量制备 |
| 1.3.5 重组蛋白的复性及鉴定 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 重组表达质粒的构建 |
| 1.4.2 重组蛋白的表达 |
| 1.4.3 重组蛋白表达条件的优化 |
| 1.4.4 重组蛋白的纯化 |
| 1.4.5 重组蛋白的复性及鉴定 |
| 1.5 讨论 |
| 第2章 鼠源噬菌体单链抗体库的构建及筛选 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 2.2.1 动物、菌株、噬菌粒 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要溶液、培养基 |
| 2.2.4 仪器及耗材 |
| 2.2.5 引物合成 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 小鼠免疫 |
| 2.3.2 小鼠脾脏总RNA的提取及cDNA第一链的合成 |
| 2.3.3 单链抗体片段ScFv的制备 |
| 2.3.4 ScFv片段和噬菌粒载体pCANTAB-5E的酶切消化、连接 |
| 2.3.5 连接产物转化大肠杆菌TG1 |
| 2.3.6 噬菌体单链抗体库的富集筛选 |
| 2.3.7 噬菌体ELISA鉴定阳性克隆 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 小鼠血清效价 |
| 2.4.2 脾脏总RNA的提取 |
| 2.4.3 单链抗体片段ScFv的制备 |
| 2.4.4 抗体库容量 |
| 2.4.5 抗体库的富集筛选 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 人源噬菌体抗体库的筛选及抗体制备 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与试剂 |
| 3.2.1 菌株、细胞 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要溶液、培养基 |
| 3.2.4 仪器及耗材 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 人源噬菌体抗体库的生物淘选 |
| 3.3.2 阳性噬菌体克隆的鉴定 |
| 3.3.3 真核表达质粒构建 |
| 3.3.4 细胞转染及全抗体表达 |
| 3.3.5 抗体的亲和纯化 |
| 3.3.6 抗体特异性检测 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 阳性噬菌体克隆分析 |
| 3.4.2 抗体真核表达质粒的构建 |
| 3.4.3 抗体的表达及纯化 |
| 3.4.4 抗体特异性检测 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 人突触小体相关蛋白25单克隆抗体的制备及初步鉴定 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与试剂 |
| 4.2.1 动物、质粒、菌株、细胞 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要溶液、培养基 |
| 4.2.4 仪器及耗材 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 SNAP25 抗原的制备 |
| 4.3.2 小鼠免疫及效价检测 |
| 4.3.3 细胞融合 |
| 4.3.4 阳性杂交瘤细胞筛选 |
| 4.3.5 杂交瘤细胞抗体亚型分析 |
| 4.3.6 腹水单抗制备及纯化 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 SNAP25 抗原的制备 |
| 4.4.2 小鼠血清效价 |
| 4.4.3 阳性杂交瘤细胞筛选 |
| 4.4.4 抗体亚型分析 |
| 4.4.5 抗体的纯化 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录一 溶液、培养基配制一览表 |
| 附录二 主要仪器与耗材一览表 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况 |
四、电转化技术在噬菌体抗体库构建中的应用（论文参考文献）
- [1]人源抗SARS-CoV-2单克隆抗体筛选与抗体功能研究[D]. 曲园园. 中国疾病预防控制中心, 2021(02)
- [2]抗人白细胞分化抗原20（CD20）纳米抗体的筛选及生物学功能的初步研究[D]. 李艳宁. 宁夏医科大学, 2021(02)
- [3]猪源抗猪腹泻重要病原体单链抗体及其保护作用研究[D]. 张凡庆. 上海交通大学, 2020(01)
- [4]雌酮孕酮尿液代谢物基因工程抗体的筛选与鉴定[D]. 王沁芸. 江苏大学, 2020(02)
- [5]牛冠状病毒单链抗体的筛选与鉴定[D]. 肖丽荣. 河北科技师范学院, 2020
- [6]EGFR蛋白L858R位点突变的单链抗体筛选及鉴定[D]. 唐诗. 西安医学院, 2020(08)
- [7]F型肉毒毒素单克隆抗体的制备及鉴定[D]. 许永亮. 辽宁大学, 2020(01)
- [8]天然鼠源噬菌体单链抗体库的构建及抗西马特罗单链抗体的筛选与特性研究[D]. 司艳芳. 郑州大学, 2020(02)
- [9]Aβ蛋白寡聚体特异性单域抗体的筛选、表达及其鉴定[D]. 秦领兄. 内蒙古农业大学, 2019(01)
- [10]抗人CTLA-4抗体的制备及功能研究[D]. 孙志杰. 辽宁大学, 2019(01)