一、重组人肝再生增强因子的纯化及生物学活性研究（论文文献综述）
黄文祺[1]（2020）在《15KD-肝再生增强因子单克隆抗体制备及其对骨髓瘤影响的研究》文中认为背景:多发性骨髓瘤是常见的血液系统恶性肿瘤,虽然近年对多发性骨髓瘤的治疗取得到较大的进展,但MM仍然是无法治愈的疾病,大多数患者会出现复发并需要进一步的治疗,而此时的由于药物的不良反应以及耐药问题会使得复发的多发性骨髓瘤疗效不佳,因此需要寻找新的药物和靶点对多发性骨髓瘤进行治疗。单克隆抗体是由B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体,目前已广泛用于疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究。肝再生增增强因子（ALR）,也称为GFER,是参与各种生命过程的重要蛋白质。ALR有两种亚型,分子量分别为23 k D和15 k D,23KDALR主要定位于细胞线粒体,参与氧化磷酸化等能量代谢等,是细胞存活所必须的。15KDALR主要分泌到细胞外,与细胞生长、增殖相关。课题组在前期实验发现骨髓瘤细胞中ALR高表达,对骨髓瘤细胞有保护作用,但是具体机制还不清楚。但是采用过表达或沉默方式从基因层面进行干预会同时影响到23KDALR和15KDALR,无法区分究竟是哪种亚型ALR发挥作用。而且从基因层面上干预还会影响到正常组织中的23KDALR。利用单克隆抗体抗体特异结合细胞外的15KDALR则不会影响到存在于线粒体中的23KDALR,有利于单独研究15KDALR的作用,还减少了对正常组织的影响。因此我们拟通过使用单克隆抗体阻断分泌到细胞外的ALR以研究15KDALR在骨髓瘤中的作用,并探讨相应机制,希望为多发性骨髓瘤的治疗提供新的思路和靶点。方法:课题组前期合成了15KDALR重组蛋白,运用杂交瘤技术制备15KDALR单克隆抗体,应用ELISA和western blot方法对制备的单克隆抗体进行验证。在骨髓瘤细胞系中加入15KDALR单克隆抗体,以阴性杂交瘤腹水和PBS作为对照,采用细胞计数、CCK8方式观察细胞存活率以明确单克隆抗体是否对骨髓瘤细胞有影响,采用流式检测凋亡,western blot检测凋亡相关蛋白,采用edu方式检测细胞增殖情况以明确单克隆抗体是从增殖方面还是凋亡方面影响骨髓瘤细胞。在体内实验方面,建立小鼠皮下移植瘤模型,分为单克隆抗体治疗组,阴性腹水治疗组和PBS组,分别在肿瘤中心后周围皮下注射15KDALR单克隆抗体腹水、阴性腹水和PBS,观察肿瘤的生长速度,治疗结束后观察肿瘤的体积、质量。为了进一步研究15KDALR单克隆抗体对骨髓瘤影响的机制,采用RNA-seq技术分析15KDALR单克隆抗体处理骨髓瘤细胞后与阴性腹水处理骨髓瘤细胞后的基因表达的差异,将差异基因与数据库中已注释功能的基因,可以分别从功能、参与的生物途径及细胞中的定位对差异基因进行简单注释,了解差异基因富集在哪些生物学功能、途径或者细胞定位。通过KEGG数据库功能注释可以寻找差异基因富集的信号通路,寻找15KDALR单克隆抗体影响骨髓瘤细胞的可能机制。在RNA-seq分析的基础上采用RT-PCR、western blot、细胞周期检测方式对RNA-seq的结果进行验证,进一步证实单克隆抗体影响骨髓瘤的机制。结果:在使用15KD重组人肝再生增强因子免疫小鼠后,通过ELISA检测小鼠血清中的抗体效价达到104,经过细胞融合及多次检测,对筛选出的阳性杂交瘤细胞进行有限稀释单克隆培养,最终成功筛选出2株能稳定分泌15KDALR单克隆抗体的杂交瘤细胞,将杂交瘤注射到小鼠腹腔产生含有单克隆抗体的腹水,经ELISA验证腹水中抗体效价106,western blot证实了单克隆抗体能特异结合15KDALR重组蛋白,经单克隆抗体亚型鉴定制备单克隆抗体亚型为Ig M。通过western blot检测发现在3种人多发性骨髓瘤细胞系中U266细胞系的15KDALR的表达量最高,因此选取U266细胞系作为后续实验细胞系。在U266细胞中加入15KDALR单克隆抗体处理,以阴性杂交瘤产生的腹水和PBS作为对照,CCK8结果表明15KDALR单克隆抗体能抑制U266细胞的活性,抑制程度与抗体浓度和作用时间呈正相关,在腹水与培养基比例为1:10,作用时间为72h时,细胞活性将至正常对照的50%,因此选用腹水浓度为1:10,作用时间72h为后续实验条件。在此条件下进行流式凋亡检测,与阴性腹水组和PBS组相比,单克隆抗体腹水组的凋亡率并未明显增加,差异无统计学意义。行western blot检测凋亡相关蛋白,Bax/Bcl-2比例,Caspase3和Cleaved-Caspase3的表达量也无显着差异。但是在使用15KDALR单抗抗体处理的同时加入表阿霉素刺激细胞诱导凋亡后,15KDALR单克隆抗体腹水组的凋亡率较阴性腹水组和PBS组明显升高,差异有统计学意义。使用小鼠骨髓瘤SP2/0细胞建立Balb/c普通鼠皮下移植瘤模型后,用15KDALR单克隆抗体腹水治疗组的肿瘤生长速度与阴性腹水和PBS组相比明显延缓,治疗结束后单克隆抗体腹水治疗组的肿瘤体积和质量也明显小于对照组。运用RNA-Seq技术对15KDALR单克隆抗体腹水治疗组和阴性腹水对照的U266细胞进行转录组测序,通过对差异基因进行分析,共发现289个显着上调和138显着下调的基因。基因富集分析结果显示生物进程方面差异基因主要集中在核有丝分裂、细胞周期、细胞分裂方面。分子功能部分差异基因主要集中在核酸结合、DNA结合方面,细胞定位部分差异基因主要分布在中心体,细胞内。对差异基因表达的蛋白进行了蛋白质-蛋白质相互作用网络分析筛选出的10个hub genes分别是CDK1,SMC3,KIF11,SMC4,NDC80,NCAPG,TTK,CENPE,NUF2和CENPU。这些基因均与细胞周期有关。Pathway分析发现在显着性信号通路中,MAPK通路,Jak-STAT信号通路和cell cycle信号通路在这处于相对核心的地位。运用PCR验证了15KDALR单克隆抗体治疗组、阴性腹水组和PBS组中10个hub genes,结果表明hub genes的变化情况与RNA-Seq分析结果趋势一致,但是TTK和CENPU的变化在不具有统计学差异。Western blot验证了MAPK、Jak-STAT和cell cycle信号通路中的关键蛋白,结果与阴性腹水组和PBS组相比,单克隆抗体腹水治疗组p44/42和p-p44/42的表达下调,p38和p-p38的表达无显着差异。单克隆抗体腹水治疗组JNK表达下调,而p-JNK表达上调STAT3的表达轻微下调,而p-STAT3则显着下调,细胞周期相关蛋白CDK1和cyclin D1表达下调。结果表明ERK1/2、JNK、STAT3和Cell Cycle是15KDALR单克隆抗体影响U266细胞的主要通路。结论:15KDALR单克隆抗体通过阻断分泌到细胞外的ALR能抑制骨髓瘤U266细胞活性,阻断ALR后主要是抑制增殖的作用,而在合并有其他导致细胞损伤因素的情况下,阻断ALR能增加U266细胞的凋亡。15KDALR单克隆抗体能抑制Balb/c普通鼠SP2/0细胞皮下移植瘤的生长。单克隆抗体阻断分泌到细胞外的ALR后,可能是通过ERK1/2,JNK,STAT3和Cell cycle通路发挥作用。
李鹏飞[2]（2017）在《重组肝再生增强因子（rALR）的50L发酵与高效分离纯化研究》文中进行了进一步梳理肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration,ALR）在肝脏损伤和肝再生过程中发挥着重要的作用,是一种潜在的肝脏疾病靶向药物。目前国内外研究主要针对其作用机理进行研究,利用生物工程制备重组ALR（recombinant augmenter of live regeneration,rALR）也停留在实验室规模,尚未大规模应用。本论文选用毕赤酵母为表达宿主,并针对rALR的高效表达、规模放大和纯化等过程中的关键技术进行了研究,并在纯化过程中首次引入双水相萃取技术,最终获得了高表达量、高纯度和高活性的rALR。主要研究内容包括:（1）rALR的高效表达工程菌的构建及筛选:优化ALR基因序列并构建至3种毕赤酵母表达载体（pPIC9、pPIC9K、pPICZα-A）,分别转入3种宿主菌（X-33、GS115和SMD1168）,对得到的7种载体-宿主组合进行鉴定、诱导表达,最终筛选得到rALR的高效表达菌株。结果表明,pPICZα-A/X-33组合的表达量高于pPIC9/GS115、pPIC9K/GS115、pPICZα-A/GS115组合,显着高于pPIC9/SMD1168、pPIC9K/SMD1168、pPICZα-A/SMD1168组合。（2）rALR的表达条件优化和规模放大:本研究对表达过程中的关键因素进行了优化和规模放大,包括pH、诱导温度、甲醇浓度、溶氧条件等,结果表明rALR在pH=5.5,诱导温度26℃,诱导甲醇浓度0.25%,溶氧20%的最佳条件下时,诱导6d的表达量达到最高,且发酵规模成功放大至50L中试规模。（3）rALR的分离纯化条件优化及纯化体系放大:以rALR 50L规模的发酵液为研究对象,进行分离纯化条件摸索。结果表明,双水相萃取技术具有显着的纯化效果,经双水相偶联离子交换层析两步纯化,获得了纯度高于95%,收率高于85%的rALR。（4）rALR的生物学活性测定:主要对rALR的体外、体内生物学活性进行测定。首先测定了rALR的巯基氧化酶酶活性,同时用MTT法测定rALR对HepG2细胞的活性影响,结果表明rALR具有较好的酶学活性,并能够促进肝癌细胞系HepG2的增殖;其次利用CCl4急性肝衰竭模型对rALR的作用进行测定,结果发现,rALR对于肝损伤具有明显的促进和修复作用,说明rALR具有良好的生物学活性。结论:本文建立了rALR的中试规模高效表达及纯化生产工艺。其中,rALR在50L规模下表达量达到545mg/L,较现有水平[1]（424mg/L）提高了28.5%,建立了相应规模的纯化工艺,获得了纯度大于95%,收率高于85%且具有良好的生物学活性的rALR。为阐明ALR的作用机制、临床研究以及产业化奠定了良好的基础。
吴贻琛,辛绍杰[3]（2012）在《肝再生增强因子研究进展》文中进行了进一步梳理肝再生增强因子是一种新型的肝细胞刺激因子。本文从分子生物学特性、生物活性与作用机制等方面对肝再生增强因子的研究进展进行综述。
吴贻琛[4]（2010）在《重组人肝再生增强因子基因转染肝细胞系的生物学活性研究》文中进行了进一步梳理人肝再生增强因子（human augmenter of liver regeneration, hALR）是目前已知唯一可以特异性刺激肝源性细胞增殖的细胞因子,是早期表达的肝再生增强因子之一。它能促进肝细胞增殖和肝脏再生,还能够保护肝脏、预防肝纤维化以及提高肝移植的成功率。目的：研究人肝再生增强因子（hALR）对HepG2细胞增殖的影响,探讨其促进肝细胞增殖的机制,为生物人工肝细胞反应器提供合适的细胞材料。方法：本研究采用转染重组质粒pcDNA3.1（-）hALR的HepG2细胞（前期研究构建）,经G418筛选,在体外培养、传代后,进行Western blot免疫印迹试验及免疫荧光实验,检测细胞中hALR的表达,并与未转染重组质粒的HepG2细胞进行比较;采用蛋白免疫印迹和ELISA方法，检测两组细胞培养液中hALR的分泌情况;使用流式细胞仪检测细胞中增殖细胞相关核抗原Ki-67,了解重组质粒转染前后HepG2细胞的增殖状况;以蛋白免疫印迹试验检测两组肝细胞及培养液中转化生长因子α（TGFα）、表皮生长因子受体（EGFR）的表达情况,研究hALR是否通过影响TGFα、EGFR的表达促进肝细胞的增殖。结果：转染重组质粒pcDNA3.1（-）hALR的HepG2细胞功能稳定,形态良好,细胞胞浆中有大量hALR表达,较未转染重组质粒的HepG2细胞为多,细胞培养液中亦有hALR分泌,且随着培养时间的延长,细胞培养液中的hALR含量迅速升高,优于未转染重组质粒的HepG2细胞;转染重组质粒的HepG2细胞中Ki-67阳性细胞计数明显高于未转染重组质粒的HepG2细胞，说明转染重组质粒使肝细胞增殖活跃。转染重组质粒pcDNA3.1（-）hALR使得肝细胞及培养液中TGFα含量升高,肝细胞中EGFR含量升高。结论：本研究结果表明,前期研究构建的转染了hALR基因的肝细胞系能较高表达hALR,且细胞增殖活跃;根据结果推测,hALR可能通过上调TGFα及其受体EGFR的表达来促进肝细胞的再生;生物人工肝细胞反应器中应用该细胞系,在完成肝细胞的合成、代谢和解毒功能的同时,还可补充hALR、TGFα等可促进肝细胞生长的细胞因子,为研制生物活性更强的生物人工肝细胞反应器提供物质基础。
陈罡[5]（2009）在《人肝再生增强因子生物活性的研究》文中指出人肝再生增强因子（human augmenter of liver regeneration, hALR）是从人胎肝组织中克隆到的一种新型的促肝细胞增殖因子,除促进肝细胞增殖外,还能保护肝脏,预防肝纤维化。本实验的目的是克隆人肝再生增强因子ALR205基因并研究其对大鼠急性肝损伤的治疗作用。方法利用RT-PCR技术从人肝癌细胞HepG2中扩增ALR205基因编码区,构建真核表达载体pCDNA3.1-ALR205。将重组质粒以200μg/kg剂量尾静脉注射给CCL4致急性肝损伤大鼠,检测血清AST、ALT水平,肝组织病理学变化、肝组织增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen PCNA）并对照pCDNA3.1-ALR125基因治疗来观察ALR205基因对急性肝损伤的疗效。结合RT-PCR检测肝组织ALR205 mRNA表达情况。结果克隆出ALR205基因,测序结果与文献报道一致。两种重组质粒用于急性肝损伤大鼠后,血清酶学检查结果表明外周血AST（谷草转氨酶）、ALT（谷丙转氨酶）水平显着降低（P<0.01）,肝组织病理损害情况大幅度减轻,治疗组肝PCNA指数均明显高于其它组（P<0.01）且ALR205比ALR125在促肝细胞增殖方面有明显差异（P<0.05）,只有ALR205基因治疗组检测出阳性条带。结论。ALR205重组质粒体内表达产物通过促进肝细胞增殖,降低血清AST、ALT水平发挥抗急性肝损伤作用。
陈俊杰,孔祥平,佟明华,李茹冰,杨联萍,游松[6]（2007）在《人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达、纯化和生物学活性的研究》文中进行了进一步梳理肝再生增强因子（ALR）是一类胞源性肝细胞生长因子。为在毕赤酵母中分泌表达人肝再生增强因子（rhALR）,以色谱法分离纯化后进行体外活性研究,构建表达载体pPICZαA-ALR,经电穿孔转入毕赤酵母中,用0.5%甲醇诱导表达;重组酵母培养上清经SDS-PAGE电泳和western blot鉴定后表明,rhALR以分子量为30kDa的二聚体为主;定量分析结果表明,重组酵母培养上清中rhALR约占总蛋白的66%,表达量约为40mg/L;经DEAE柱和G75柱纯化后,获得的rhALR纯度大于95%,得率为52%;体外生物学活性实验表明,rhALR能明显促进HepG2、SMMC-7721和NIH-3T3细胞的增殖。
陈俊杰[7]（2007）在《重组人肝再生增强因子的表达和活性研究》文中研究说明人肝再生增强因子（human augmenter of liver regeneration，hALR）是从人胎肝组织中克隆到的一种新型的促肝细胞增殖因子，除促进肝细胞增殖外，还能保护肝脏，预防肝纤维化。本实验采用毕赤酵母表达系统，以分泌方式高效表达重组hALR（rhALR），通过色谱法分离纯化获得高纯度rhALR，并对rhALR的生物学活性进行了研究。设计引物从pBV220-hALR上扩增hALR基因片断，构建重组酵母表达质粒pPICZαA-hALR；经验证正确后，表达质粒pPICZαA-hALR线形化浓缩，转化P．pastoris GS115形成重组转化子；重组酵母菌经PCR鉴定、高浓度Zeocin抗性筛选得多拷贝子，经0.5％甲醇诱导培养后，在培养上清中发现rhALR；Western-blot分析表明，在酵母培养上清中rhALR以二聚体形式存在，分子量为30kD；扫描分析结果表明，酵母培养上清中rhALR占总蛋白的66％，总量约为100mg／L。酵母培养上清经70％饱和硫酸铵沉淀、Sephadex G25柱脱盐和低盐透析两种方法处理，用Sepharose DEAE Fast Flow柱和Sephadex G75柱两步纯化，可得纯度约为90％的rhALR，回收率约为26％。体外细胞活性实验表明，rhALR能明显促进HepG2、SMMC-7721和NIH-3T3细胞增殖；在大鼠1／3肝切模型中，rhALR明显促进肝细胞再生，使有丝分裂指数（MI）、细胞增殖核抗原（PCNA）增多；在大鼠D-氨基半乳糖急性肝损伤模型中，100μg／L rhALR能提高D-氨基半乳糖所致肝损伤大鼠的存活率。通过上述实验，成功构建了人肝再生增强因子重组毕赤酵母表达菌，并获得高纯度有活性的rhALR。
潘艳[8]（2007）在《人肝再生增强因子结构与功能的初步研究》文中研究表明人肝再生增强因子（hALR）兼有生长因子和巯基氧化酶活性,在促进肝再生、预防肝损伤和调节细胞增殖、分化等多方面发挥重要作用。为了探讨hALR结构与功能之间的关系,本研究成功的构建了hALR三个突变体（C65A、Q88C、C85S）及一个缺失体（hALR-5）的原核表达载体,并获得相应蛋白。研究了hALR及其突变体、缺失体促进HL-7702细胞增殖、抗HepG2细胞损伤、巯基氧化酶活性及其与Na+,K+-ATPase相互作用的异同。结果表明,hALR的CXXC结构是hALR发挥巯基氧化酶活性的重要结构,但该结构对hALR促进肝细胞增殖、抗肝细胞损伤、与Na+,K+-ATPase相互作用均无明显影响;通过比较hALR及其突变体、缺失体的活性,探讨了hALR结构与功能间的相互关系;本研究还深入探讨了hALR的巯基氧化酶活性,为其在体内参与氧化还原调控的研究提供了实验依据。本研究结果将为hALR结构与功能的深入研究奠定实验基础,并为hALR的开发应用提供理论依据,有重要的理论意义及潜在应用价值。
李茹冰,王治伟,傅泳航,易学瑞,曾平鲁,邹清雁,佟明华,潘韵,杨联萍,孔祥平[9]（2006）在《重组人肝再生增强因子的纯化及生物学活性分析》文中认为目的对在大肠杆菌中表达的重组人肝再生增强因子（rhALR）进行分离纯化及生物学活性分析。方法以大肠杆菌DH5α发酵表达重组人肝再生增强因子,经包涵体洗涤、变性、目的蛋白复性,以离子交换、分子筛等技术纯化,并进行一系列检定。结果目的蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性及柱层析纯化,纯度大于98%,SDS-PAGE测定相对分子质量为30000,MOLDI-TOF-MS测定其相对分子质量为30780·522,N-末端15个氨基酸与理论序列一致。Western blot证实rhALR正确表达,等电点5·856·85,氨基酸含量与理论值基本符合。动物实验证实rhALR具有明显的促进CCl4毒性肝损伤小鼠肝细胞修复活性。结论经柱层析纯化的rhALR具有促进小鼠CCl4肝损伤肝细胞修复的活性。
邓建川[10]（2006）在《人肝再生增强因子相互作用蛋白的研究》文中指出目的:肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration, ALR）是近年来发现的一种促肝细胞再生的细胞因子。ALR的生物学作用主要表现在直接刺激肝细胞增殖和再生、对肝脏的保护作用、参与组织器官的形成与发育、免疫调控作用以及促肝癌细胞增殖等效应。尽管有上述重要生物学作用,但ALR究竟如何发挥生物学作用目前仍知之较少。如果能获得与ALR发生相互作用的蛋白,并且鉴定出ALR受体,将有助于深刻理解ALR的生物学功能,特别是为深入了解ALR与肝癌发生、发展的关系奠定基础。本实验拟从人肝癌细胞的cDNA噬菌体表面展示文库中筛选与人肝再生增强因子（human augmenter of liver regeneration, hALR）相互作用的特异噬菌体克隆,通过序列分析及生物学活性检测确认hALR相互作用蛋白,构建原核表达载体,为进一步鉴定ALR受体提供实验基础。方法:1.以hALR为靶蛋白,从人肝癌细胞cDNA噬菌体展示文库中筛选与hALR相互作用的特异噬菌体克隆;对获得的特异噬菌体克隆cDNA插入片段进行序列测序及生物信息学分析;利用3H-TdR掺入法测定hALR联合阳性噬菌体展示肽及单独阳性噬菌体展示肽对QGY肝癌细胞株的增殖效应。
二、重组人肝再生增强因子的纯化及生物学活性研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、重组人肝再生增强因子的纯化及生物学活性研究（论文提纲范文）
（1）15KD-肝再生增强因子单克隆抗体制备及其对骨髓瘤影响的研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 15KD肝再生增强因子单克隆抗体制备 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法与步骤 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 15KD肝再生增强因子单克隆抗体对骨髓瘤的影响 |
| 前言 |
| 实验一 15KD肝再生增强因子单克隆抗体对人多发性骨髓瘤细胞的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验方法和步骤 |
| 3 结果 |
| 实验二 15KD肝再生增强因子单克隆抗体对小鼠多发性骨髓瘤的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法和步骤 |
| 3 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 15KD肝再生增强因子单克隆抗体影响骨髓瘤的机制研究 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法和步骤 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述:肝再生增强因子在肿瘤中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（2）重组肝再生增强因子（rALR）的50L发酵与高效分离纯化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 肝再生增强因子（ALR） |
| 1.1.1 ALR的发现 |
| 1.1.2 ALR的分子结构和理化性质 |
| 1.1.3 ALR的生物学功能 |
| 1.1.4 ALR与疾病 |
| 1.2 毕赤酵母表达系统 |
| 1.2.1 毕赤酵母表达系统 |
| 1.2.2 影响外源蛋白的表达因素 |
| 1.3 重组蛋白的分离纯化 |
| 1.4 本文的目的与意义 |
| 1.4.1 目的 |
| 1.4.2 意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验器材 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.1.3 常用试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 rALR基因序列的设计、载体构建及鉴定 |
| 2.2.2 转化毕赤酵母X-33、GS115及SMD1168及阳性克隆鉴定 |
| 2.2.3 摇瓶中的最佳表达条件试验 |
| 2.2.4 中试规模诱导表达 |
| 2.2.5 分离纯化条件优化 |
| 2.2.6 ALR的双向电泳（IEF/SDS-PAGE，2D） |
| 2.2.7 ALR的 2D/MS定性： |
| 2.2.8 rALR巯基氧化酶活性检测 |
| 2.2.9 体外活性测定 |
| 2.2.10 体内活性测 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 rALR表达质粒的鉴定结果 |
| 3.2 阳性克隆的筛选、诱导表达及鉴定 |
| 3.3 rALR的摇瓶表达条件优化 |
| 3.4 rALR的3L规模发酵 |
| 3.4.1 不同起始诱导菌体密度优化 |
| 3.4.2 溶氧体积分数优化 |
| 3.4.3 甲醇浓度优化 |
| 3.4.4 诱导时间优化 |
| 3.5 10L和50L中试结果 |
| 3.6 rALR分离纯化条件优化 |
| 3.6.150mL双水相优化结果 |
| 3.6.2 双水相体系放大 |
| 3.6.3 rALR分离纯化结果 |
| 3.6.4 质谱鉴定结果 |
| 3.7 rALR蛋白巯基氧化酶活性 |
| 3.7.1 体外活性 |
| 3.7.2 体内活性 |
| 第四章 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间参加的科研项目及已发表的论文 |
（3）肝再生增强因子研究进展（论文提纲范文）
| 1 ALR的分子生物学特性 |
| 1.1 基因克隆 |
| 1.2 分子结构和功能 |
| 1.3 组织表达定位 |
| 1.4 受体分布 |
| 2 ALR的生物活性及作用机制 |
| 2.1 信号转导途径 |
| 2.2 促进肝细胞再生 |
| 2.3 促进线粒体基因表达与氧化磷酸化作用 |
| 2.4 巯基氧化酶的作用 |
| 2.5 免疫调控功能 |
| 2.6 其他作用 |
| 3 结语 |
（4）重组人肝再生增强因子基因转染肝细胞系的生物学活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 正文 |
| 1.实验材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器与设备 |
| 1.1.3 主要试剂的配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 hALR肝细胞系的建立 |
| 1.2.2 hALR肝细胞的复苏及培养 |
| 1.2.3 免疫荧光检测ALR在hALR肝细胞系中的表达 |
| 1.2.4 Western blot免疫印迹试验检测ALR在hALR肝细胞系、HepG2细胞系中的表达 |
| 1.2.5 流式细胞仪检测hALR重组质粒转染前后肝细胞系的增殖 |
| 1.2.6 ELISA检测细胞系分泌ALR的情况 |
| 1.2.7 Western blot免疫印迹试验检测TGFα、EGFR在hALR肝细胞系、HepG2细胞系中的表达 |
| 2.实验结果与分析 |
| 2.1 转染重组质粒后肝细胞的形态 |
| 2.2 转染hALR重组质粒前后肝细胞系中hALR免疫荧光表达情况 |
| 2.3 Western blot检测转染hALR重组质粒前后肝细胞系中hALR的表达 |
| 2.4 流式细胞仪检测转染hALR重组质粒前后肝细胞系的增殖状况 |
| 2.5 ELISA检测转染hALR重组质粒前后肝细胞系分泌ALR的情况 |
| 2.6 Western blot检测转染质粒前后肝细胞系中TGFα、EGFR的表达 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 参考文献 |
| 综述 肝再生增强因子研究进展 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读学位期间发表文章 |
| 致谢 |
（5）人肝再生增强因子生物活性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 特异性刺激肝细胞增殖因子的发现 |
| 1.2 人肝再生增强因子(ALR205)的克隆 |
| 1.3 ALR125的基因结构 |
| 1.4 ALR205的组织表达定位 |
| 1.5 ALR205的生物学活性和作用机制 |
| 1.6 本研究的意义和主要内容 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 试验动物与细胞株 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器和设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 ALR205基因的克隆 |
| 2.2.2 酵母高表达ALR125蛋白工程菌最佳表达时间的确定 |
| 2.2.3 ALR125的纯化 |
| 2.2.4 pCDNA3.1-ALR205与pCDNA3.1(+)-ALR125重组质粒的大量提取 |
| 2.2.5 ALR125活性检测 |
| 2.2.6 肝再生增强因子基因治疗及纯化蛋白的体内活性检测 |
| 第三章 实验结果及分析 |
| 3.1 ALR205基因片段的扩增、克隆及序列分析 |
| 3.1.1 ALR205基因的PCR扩增结果 |
| 3.1.2 重组载体pCDNA3.1(+)-ALR205的酶切和PCR鉴定结果 |
| 3.1.3 DNA序列测定 |
| 3.1.4 高表达工程菌ALR125最佳表达时间的确定 |
| 3.2 ALR125的纯化 |
| 3.2.1 (NH_4)_2SO_4沉淀法处理重组酵母工程菌发酵液上清 |
| 3.2.2 Sepharose DEAE Fast Flow纯化ALR125 |
| 3.2.3 sephadex G-75凝胶层析精制ALR125 |
| 3.3 ALR125活性实验结果 |
| 3.3.1 ALR125体外促进细胞增殖的活性 |
| 3.3.2 大鼠的一般情况 |
| 3.3.3 肝组织形态学改变 |
| 3.3.4 肝组织PCNA指数 |
| 3.3.5 ALR205基因在大鼠肝组织中的表达情况 |
| 3.3.6 血清ALT和AST水平变化 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达、纯化和生物学活性的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材 料 |
| 1.2 重组载体的构建 |
| 1.3 构建酵母表达菌 |
| 1.4 重组蛋白的表达及鉴定 |
| 1.5 rhALR的纯化 |
| 1.6 rhALR体外活性检测 |
| 2 结 果 |
| 2.1 PCR扩增及重组质粒鉴定结果 |
| 2.2 重组蛋白的表达鉴定结果 |
| 2.3 重组蛋白纯化结果 |
| 2.4 rhALR体外活性检测 |
| 3 讨 论 |
（7）重组人肝再生增强因子的表达和活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 特异性刺激肝细胞增殖因子的发现 |
| 1.2 人肝再生增强因子(hALR)的克隆 |
| 1.3 hALR的基因结构 |
| 1.4 hALR的组织表达定位和受体的确定 |
| 1.5 hALR的生物学活性 |
| 1.6 hALR的作用机制 |
| 1.7 本研究的意义和主要内容 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 试验动物与细胞株 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器和设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 克隆载体的构建 |
| 2.2.2 表达载体的构建 |
| 2.2.3 酵母表达菌pPICZaA-hALR/GS115的构建及诱导表达 |
| 2.2.4 rhALR的纯化 |
| 2.2.5 rhALR活性检测 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 重组载体pPICZaA-hALR构建结果 |
| 3.1.1 hALR的PCR扩增结果 |
| 3.1.2 克隆载体pMD-18T-hALR的菌落PCR和酶切鉴定结果 |
| 3.1.3 表达载体pPICZaA-hALR菌落PCR和酶切鉴定结果 |
| 3.1.4 DNA测序结果 |
| 3.2 酵母表达菌pPICZaA-hALR/GS115的构建及诱导表达 |
| 3.2.1 pPICZaA-hALR电穿孔法转化毕赤酵母GS115 |
| 3.2.2 pPICZaA-hALR原生质球法转化毕赤酵母GS115 |
| 3.2.3 酵母工程菌基因组DNA的提取与PCR检测 |
| 3.2.4 酵母工程菌pPICZaA-hALR/GS115的表型鉴定 |
| 3.2.5 转化菌株诱导表达筛选检测 |
| 3.2.6 重组酵母表达上清的Westernblot分析 |
| 3.2.7 高表达工程菌rhALR最佳表达时间的确定 |
| 3.3 rhALR的纯化 |
| 3.3.1 (NH_4)_2SO_4沉淀法处理重组酵母工程菌发酵液上清 |
| 3.3.2 Sepharose DEAE Fast Flow纯化rhALR |
| 3.3.3 SephadexG-75凝胶层析精制rhALR |
| 3.4 rhALR活性实验结果 |
| 3.4.1 rhALR体外促进细胞增殖的活性 |
| 3.4.2 rhALR促进1/3肝切除大鼠肝细胞增殖 |
| 3.4.3 rhALR对D-氨基半乳糖所致肝损伤大鼠存活率的影响 |
| 3.4.4 rhALR对D-氨基半乳糖所致肝损伤大鼠肝细胞修复作用 |
| 第四章 讨论 |
| 一、hALR在毕赤酵母中的分泌表达 |
| 二、rhALR的纯化 |
| 三、rhALR的活性研究 |
| 第五章 总结 |
| 一、本论文的结果 |
| 二、论文的进一步研究设想 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（8）人肝再生增强因子结构与功能的初步研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 缩略语 |
| 第一章 绪论 |
| 1 肝再生 |
| 1.1 调控肝再生的基因 |
| 1.2 调控肝再生的生长因子和细胞因子 |
| 1.3 肝再生的抑制因子 |
| 1.4 刺激因子和抑制因子的相互作用 |
| 2 肝再生增强因子 |
| 2.1 研究概况 |
| 2.2 ALR基因 |
| 2.3 ALR的分子结构与理化特性 |
| 2.4 ALR的体内分布表达 |
| 2.5 ERV1/ALR蛋白超家族 |
| 2.6 ALR及其异构体 |
| 2.7 ALR与HSS |
| 2.8 ALR蛋白质晶体结构 |
| 2.9 ALR的生物学活性及作用机制 |
| 2.10 ALR可能的信号传导途径 |
| 3 蛋白质的结构与功能 |
| 4 基因的点突变 |
| 5 重组ALR及其变异体的基础研究与开发前景 |
| 6 立题依据 |
| 第二章 材料和方法 |
| 1 主要实验材料 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 器材 |
| 2 主要仪器 |
| 3 rhALR蛋白 |
| 4 促肝细胞生长素 |
| 5 质粒与菌株 |
| 6 细胞株 |
| 7 分子生物学实验方法 |
| 7.1 hALR突变体与缺失体的设计 |
| 7.2 引物的设计与合成 |
| 7.3 基因的点突变 |
| 7.4 表达载体的构建与鉴定 |
| 8 蛋白质制备 |
| 8.1 目的蛋白表达 |
| 8.2 包涵体的分离、纯化 |
| 8.3 包涵体的变性、复性 |
| 8.4 蛋白复性液的纯化 |
| 8.5 蛋白质的后处理 |
| 8.6 蛋白质浓度测定 |
| 8.7 SDS-PAGE |
| 9 细胞生物学方法 |
| 9.1 细胞培养及冻存 |
| 9.2 细胞存活实验 |
| 10 巯基氧化酶活性研究 |
| 10.1 FAD标准曲线建立 |
| 10.2 蛋白质与FAD的结合与鉴定 |
| 10.3 蛋白质与FAD的结合比例 |
| 10.4 巯基氧化酶活性研究 |
| 11 蛋白质与蛋白质间相互作用研究 |
| 11.1 GST和GST-Na~+,K~+-ATPase融合蛋白的诱导表达 |
| 11.2 谷胱甘肽偶联琼脂糖珠的预处理 |
| 11.3 GST和GST-Na~+,K~+-ATPase融合蛋白的纯化与鉴定 |
| 11.4 GST-pulldown证实蛋白质与蛋白质间的相互作用 |
| 12 统计学方法 |
| 第三章 实验结果 |
| 1 hALR变异体表达载体的构建与鉴定 |
| 1.1 hALR突变体的构建与鉴定 |
| 1.2 hALR缺失体的构建与鉴定 |
| 2 hALR变异体蛋白的制备 |
| 2.1 hALR变异体的蛋白表达 |
| 2.2 hALR变异体蛋白的分离纯化 |
| 3 hALR及其变异体的生物学活性研究 |
| 3.1 hALR及其变异体促进HL-7702 细胞增殖 |
| 3.2 hALR及其变异体预防D-Gal所致HepG_2 细胞慢性损伤 |
| 3.3 hALR及其变异体预防CCl_4 所致HepG_2 细胞急性损伤 |
| 4 hALR及其变异体巯基氧化酶活性研究 |
| 4.1 FAD标准曲线的建立 |
| 4.2 hALR及其变异体与FAD的结合与鉴定 |
| 4.3 底物的选择 |
| 4.4 hALR及其变异体巯基氧化酶活性 |
| 5 hALR及其变异体与Na~+,K~+-ATPase的相互作用 |
| 5.1 pGEX-4T-1-Na~+,K~+-ATPase表达载体的构建与鉴定 |
| 5.2 GST和GST-Na~+,K~+-ATPase融合蛋白的诱导表达 |
| 5.3 GST和GST-Na~+,K~+-ATPase融合蛋白的纯化与鉴定 |
| 5.4 hALR及其变异体与GST-Na~+,K~+-ATPase的相互作用 |
| 第四章 讨论 |
| 1 基因的点突变 |
| 2 hALR变异体的蛋白表达与纯化 |
| 3 hALR及其变异体的生物学活性差异 |
| 4 hALR的酶活性结构域及巯基氧化酶活性 |
| 5 hALR巯基氧化酶活性与生物学活性的关系 |
| 6 hALR及其变异体与Na~+,K~+-ATPase的相互作用 |
| 7 hALR结构与功能的关系 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表的文章 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
（10）人肝再生增强因子相互作用蛋白的研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文正文：人肝再生增强因子相互作用蛋白的研究 |
| 研究背景 |
| 第一章 从人肝癌细胞CDNA 表达文库筛选HALR 相互作用蛋白及活性初步鉴定 |
| 前言 |
| 第一节 从人肝癌细胞CDNA 表达文库筛选HALR 相互作用蛋白 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 第二节 噬菌体展示HALR 相互作用肽对人肝癌细胞株QGY 增殖效应的观察 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二章 利用RACE 技术进行人肝再生增强因子相互作用肽CDNA 末端快速扩增 |
| 前言 |
| 第一节 利用3’-RACE 技术进行HALRIP CDNA 5’末端快速扩增 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 第二节 利用5’-RACE 技术进行HALRIP CDNA 5’末端快速扩增 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三章 HALR 相互作用肽－PQE30 表达载体的构建、鉴定及表达 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文小结 |
| 本课题的创新点 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
四、重组人肝再生增强因子的纯化及生物学活性研究（论文参考文献）
- [1]15KD-肝再生增强因子单克隆抗体制备及其对骨髓瘤影响的研究[D]. 黄文祺. 重庆医科大学, 2020(01)
- [2]重组肝再生增强因子（rALR）的50L发酵与高效分离纯化研究[D]. 李鹏飞. 河南师范大学, 2017(02)
- [3]肝再生增强因子研究进展[J]. 吴贻琛,辛绍杰. 传染病信息, 2012(01)
- [4]重组人肝再生增强因子基因转染肝细胞系的生物学活性研究[D]. 吴贻琛. 中国人民解放军军医进修学院, 2010(10)
- [5]人肝再生增强因子生物活性的研究[D]. 陈罡. 沈阳药科大学, 2009(S1)
- [6]人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达、纯化和生物学活性的研究[J]. 陈俊杰,孔祥平,佟明华,李茹冰,杨联萍,游松. 中国生物工程杂志, 2007(06)
- [7]重组人肝再生增强因子的表达和活性研究[D]. 陈俊杰. 沈阳药科大学, 2007(05)
- [8]人肝再生增强因子结构与功能的初步研究[D]. 潘艳. 吉林大学, 2007(04)
- [9]重组人肝再生增强因子的纯化及生物学活性分析[J]. 李茹冰,王治伟,傅泳航,易学瑞,曾平鲁,邹清雁,佟明华,潘韵,杨联萍,孔祥平. 中国生物制品学杂志, 2006(05)
- [10]人肝再生增强因子相互作用蛋白的研究[D]. 邓建川. 重庆医科大学, 2006(01)