一、Bcl-2和C-fos基因蛋白在胃癌中的表达及临床病理研究（论文文献综述）
杨宝玉[1]（2021）在《EZH2表达调控对胃癌生长及化疗敏感性的影响》文中指出目的:1.通过公共数据库、胃癌组织和胃癌细胞三方面分析EZH2在胃癌的表达情况及与临床病理参数、化疗疗效、无进展生存时间的关系。2.通过体内外实验探讨EZH2基因对胃癌生长和化疗敏感性的影响。3探索EZH2介导胃癌生长和耐药的相关分子生物学机制。方法:1.利用公共数据库生物信息学方法分析胃癌组织中EZH2基因的表达;用定量逆转录聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测胃癌细胞株中EZH2 m RNA和蛋白的表达;免疫组化法检测胃癌组织中EZH2蛋白的表达,并分析其与临床病理参数、化疗有效率和无进展生存期的相关性。2.构建慢病毒载体sh EZH2,慢病毒感染EZH2高表达人胃癌细胞株MGC803,并筛选出稳转株,应用Real-time Q-PCR和Western blot检测干扰效果。3.体外细胞学试验,采用CCK-8增殖试验、Transwell侵袭试验和划痕试验研究人胃癌细胞株MGC803在EZH2沉默前后增殖、侵袭和迁移的变化;通过CCK-8毒性实验对比EZH2沉默前后对紫杉醇、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶化疗敏感性的改变及EZH2小分子抑制剂GSK126与这些化疗药物是否具有协同作用。体内研究,构建EZH2沉默人胃癌细胞株裸鼠移植瘤模型,腹腔灌注紫杉醇,研究EZH2下调对胃癌生长和化疗敏感性的影响。4.首先我们以胃腺癌TCGA（The Cancer Genome Atlas,TCGA）转录组数据集进行KEGG信号通路富集分析,探讨受EZH2激活调节的下游途径;接着通过细胞转录组测序分析,进一步探索EZH2在胃癌的相关分子机制和信号通路;然后利用Western blot实验验证信号通路关键蛋白表达;最后通过Real-time Q-PCR技术检测EZH2下调对信号通路下游生长和耐药相关分子的影响,探索胃癌生长和耐药的分子机制。结果:1.公共数据库结果表明,胃癌中EZH2的表达高于正常组织或相应癌症相邻的组织;MGC803、BGC823、AGS和HGC27胃癌细胞株EZH2 m RNA和蛋白均有表达,其中MGC803表达最高;免疫组化结果显示:EZH2基因在晚期胃癌中呈现高表达,EZH2蛋白表达与病理类型及化疗疗效相关,且EZH2蛋白的表达与化疗疗效呈现负相关。EZH2高表达组中位TTP低于EZH2低表达组,具有统计学差异。2.EZH2-sh RNA慢病毒载体成功构建并转染人胃癌细胞系MGC803,应用Real-time Q-PCR和Western blot检测干扰效果,证明成功构建了稳定沉默EZH2的胃癌细胞株MGC803。3.体外细胞学实验:CCK-8增殖实验结果显示,EZH2沉默组的OD值和细胞增殖率较对照组显着下降,差异有统计学意义;Transwell实验表明,EZH2沉默组的转移细胞数量显着减少,具有统计学意义;划痕损伤实验表明,与对照组MGC803-Vector对比,MGC803-sh EZH2细胞划痕愈合率从12小时就有所下降,到36小时出现明显下降,差异均具有统计学意义。CCK8毒性实验表明,EZH2沉默使MGC803细胞对紫杉醇、奥沙利铂和5-氟尿嘧啶的敏感性提高,IC50值明显下降,具有明显统计学差异;转化为抑制率曲线图,可以看出EZH2基因沉默后紫杉醇、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶作用于MGC803-sh EZH2细胞的抑制效果增强。药物协同研究发现,EZH2抑制剂GSK126和紫杉醇、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶均具有协同作用;其中GSK126联合紫杉醇的CI值随着紫杉醇剂量的增加而增大,说明小剂量的紫杉醇与GSK126表现出更好的协同作用。体内裸鼠移植瘤实验发现,沉默EZH2使胃癌细胞株MGC803的裸鼠皮下成瘤能力减弱,对紫杉醇的化疗敏感性提高。4.公共数据库KEGG信号通路富集分析结果显示,EZH2通过m TOR信号传导途径、MAPK信号传导途径、P53信号传导途径及ERBB信号传导途径介导胃癌的生物学特性。细胞转录组测序分析结果显示,EZH2沉默前后筛选鉴定出1735个DEGs,其中表达上调的1131个,表达下调的604个。GO功能富集分析显示上调的DEGs主要与靶向膜蛋白翻译、细胞质翻译、核糖核酸代谢、线粒体电子传递等有关,下调的DEGs主要与生长发育的调控、信号通路的调控、磷酸化的调控、蛋白激酶C活性的调节等有关。KEGG信号通路富集分析显示具有显着性意义的信号通路有19条,其中与胃癌相关的信号通路有肿瘤途径、PI3K-Akt信号通路、Fox O信号通路、Erb B信号通路、HIF-1信号通路、TGF-β信号通路等;蛋白印迹实验证实EZH2沉默使MGC803胃癌细胞PI3K和p-Akt蛋白的表达下调,而AKT的表达总量无明显变化,说明EZH2的下调可阻断AKT的磷酸化过程,从而抑制P13K-Akt信号通路的过度活化。Real-time Q-PCR技术检测EZH2参与调控胃癌生长和耐药的相关分子机制,结果显示EZH2沉默使胃癌凋亡分子P53 m RNA表达上调、Bcl-2 m RNA表达下调;胃癌耐药相关分子MDR-1、MRP-1、LRP、BCRP、GST-πm RNA表达下调,差异均具有统计学意义。结论:1.EZH2在胃癌中呈现高表达,且高表达的EZH2可能与肿瘤进展、预后不良及化疗敏感性差有关。2.成功构建了EZH2稳定沉默的人胃癌细胞株MGC803,为后来实验奠定了基础。3.体内外实验证实EZH2沉默使胃癌生长减慢、侵袭迁徙能力下降,对化疗药物的敏感性提高。4.EZH2抑制剂GSK126与紫杉醇、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶具有协同作用,EZH2基因有可能成为胃癌新的治疗靶点。5.EZH2激活PI3K-AKT信号通路是胃癌的重要机制之一;EZH2通过调控凋亡相关分子和耐药相关分子的表达介导胃癌的生长和耐药性。
黄超[2]（2021）在《DGKI与胃癌预后相关性分析及其调控MAPK/ERK通路促进胃癌进展的机制研究》文中认为研究内容:本研究分为四个章节:1、基于TCGA数据库对DGKI基因与胃癌预后的关系研究;2、DGKI基因与胃癌临床病理特征的关系研究;3、DGKI基因对胃癌细胞生物学行为的影响;4、DGKI基因调控MAPK/ERK通路促进胃癌进展的机制研究。第一章基于TCGA数据库对DGKI基因与胃癌预后的关系研究目的:DGKI基因在多种癌症中过表达,且与结肠癌预后差有关。本研究使用从癌症基因组图谱（TCGA）获取的数据来评估DGKI基因在胃癌中的预后价值。方法:从TCGA数据库（https://portal.gdc.cancer.gov）获取胃腺瘤和腺癌样品的RNA测序结果和临床资料。通过Kaplan-Meier分析来比较胃癌患者DGKI基因高、低表达之间的生存时间。采用Wilcoxon或Kruskal-Wallis检验和logistic回归分析DGKI基因与患者临床病理参数的关系。采用Cox回归分析患者的临床病理参数和DGKI基因与总生存期的关系且找出影响患者预后的高危因素。利用TCGA数据集进行基因集富集分析（GSEA）。结果:DGKI基因在胃肿瘤中过表达且与患者预后差有关（P=0.003）。DGKI基因在胃癌中的过表达与高等级（OR=1.71 for G3 vs.G2）、分期（OR=2.08 for II vs.I）和 T 分期（OR=4.64 for T4 vs.T1;OR=3.99 for T3 vs.T1;OR=3.37 for T2 vs.T1）显着相关（P均<0.05）。DGKI基因（OR=7.34;P=0.000）是影响患者生存的高危因素。MAPK 信号通路在DGKI基因高表达表型中差异性富集。结论:DGKI基因过表达可能是胃癌预后不良的潜在分子标志物。MAPK信号通路可能是胃癌中DGKI基因调控的关键途径之一。第二章 DGKI基因与胃癌临床病理特征的关系研究目的:分析DGKI基因在胃癌组织中的表达及与胃癌患者临床病理特征的相关性。方法:收集2017年1月至2018年1月我院50例行D2根治性切除胃腺癌患者的术后病理资料及癌和癌旁组织成对标本。采用免疫组化、Western blot和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测胃癌和癌旁组织中DGKI蛋白和mRNA表达情况并分析癌组织中DGKI的mRNA表达水平与胃癌患者临床病理参数的相关性和预后的关系。结果:胃癌组织中DGKI蛋白和mRNA表达水平高于癌旁组织（P均<0.0001）;DGKI的mRNA表达水平与肿瘤血管浸润（P=0.025）、神经浸润（P=0.048）、组织学分级（P=0.000）、分期（P=0.036）和T分期（P=0.018）有关;DGKI的mRNA高表达的胃癌患者具有较差的预后（P=0.003）。结论:胃癌组织中DGKI蛋白和mRNA表达水平显着升高。DGKI的mRNA表达越高,则肿瘤血管浸润、神经浸润可能性高,组织分化程度越低,肿瘤分期越晚,浸润深度越深且预后较差。第三章DGKI基因对胃癌细胞生物学行为的影响目的:探讨DGKI基因沉默及过表达对胃癌细胞体外增殖、迁移、侵袭能力和细胞周期的影响。方法:培养 GES-1、AGS、MKN-45、MGC-803 和 HGC-27 细胞系。利用慢病毒介导的基因沉默和过表达技术构建DGKI基因沉默和过表达的稳转细胞株。qRT-PCR和Western blot检测各细胞系中DGKI蛋白的表达情况及DGKI基因过表达和沉默效率。平板克隆形成、EdU增殖、划痕和Transwell实验检测DGKI基因沉默和过表达后对胃癌细胞体外增殖、迁移及侵袭能力的影响。流式细胞术检测DGKI基因沉默和过表达后对胃癌细胞周期的影响。结果:胃癌细胞系中DGKI蛋白表达水平高于胃黏膜细胞,且MGC-803表达最低,HGC-27表达最高。成功构建了 DGKI基因沉默胃癌细胞系HGC-27和过表达胃癌细胞系MGC-803的稳转株。DGKI基因沉默后胃癌细胞系HGC-27的增殖、迁移和侵袭能力减弱;而DGKI基因过表后胃癌细胞系MGC-803的增殖、迁移和侵袭能力增强。结论:DGKI基因沉默抑制胃癌细胞系体外增殖、迁移和侵袭能力,而DGKI基因过表达则促进胃癌细胞系体外增殖、迁移和侵袭能力。第四章DGKI基因调控MAPK/ERK通路促进胃癌进展的机制研究目的:探讨DGKI基因促进胃癌细胞体外增殖、迁移和侵袭能力的分子机制。方法:提取DGKI基因过表达的胃癌细胞系MGC-803和沉默的胃癌细胞系HGC-27稳转株的总蛋白,采用Western blot分别检测DGKI基因过表达胃癌细胞系MGC-803和沉默胃癌细胞系HGC-27稳转株的ERK信号通路的相关分子（Raf、ERK1/2、p-ERK1/2、Fos、c-Myc）、EMT 相关分子（E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、Vimentin）和 MMPs 相关分子（MMP2、MMP9）蛋白的表达并采用细胞免疫荧光实验检测β-catenin的表达。结果:DGKI基因过表达MGC-803细胞系中的ERK信号通路的相关分子（Raf、ERK1/2、p-ERK1/2、Fos、c-Myc）、EMT 相关分子（N-cadherin、β-catenin、Vimentin）和MMPs相关分子（MMP2、MMP9）的蛋白表达均增加,E-cadherin的蛋白表达降低（P均<0.05）。DGKI基因沉默HGC-27细胞系中的ERK信号通路的相关分子（Raf、ERK1/2、p-ERK1/2、Fos、c-Myc）、EMT相关分子（N-cadherin、β-catenin、Vimentin）和 MMPs 相关分子（MMP2、MMP9）的蛋白表达均降低,E-cadherin的蛋白表达增加（P均<0.05）。DGKI基因过表达后增强了 β-catenin的表达和核累积,而DGKI基因沉默后抑制了 β-catenin的表达和核累积。结论:DGKI基因可能通过影响EMT、上调MMPs及增强MAPK/ERK通路促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
林建姣[3]（2021）在《HOXA6与PBX2在胃癌侵袭转移中相互作用的研究》文中进行了进一步梳理研究目的:HOXA6是重要的转录因子,对DNA的转录过程起着调控作用,HOXA6基因在许多癌症中起致癌基因的作用。然而,HOXA6在胃癌发生发展中的作用尚不清楚。同时,利用生物信息学方法,我们发现HOXA6蛋白可能与PBX2相互作用以发挥致癌作用。已有研究证实,转录因子PBX2在胃癌中表达上调,并能促进肿瘤的侵袭、转移。HOXA6与PBX2能否相互作用,它们在胃癌转移的分子机制尚不清楚。本课题旨在阐明HOXA6在胃癌细胞发生过程中的作用,明确HOXA6对胃癌细胞侵袭与转移潜能的促进作用,并进一步揭示HOXA6通过何种途径作用于PBX2,进而促进肿瘤细胞侵袭迁移,为胃癌的诊断和治疗提供新的重要线索和可能的药物靶点。方法:1、Western blot检测HOXA6在胃癌组织和细胞中的表达情况。2、组织芯片进行免疫组化观察HOXA6在正常组织和胃癌组织中的表达,收集相应的临床病理资料,利用Kaplan-Meier生存曲线分析,观察HOXA6（+）或高表达/HOXA6（-）或低表达病人的预后。3.采用EdU、CCK8及平板克隆实验,检测HOXA6过表达表达胃癌细胞增殖。罗丹明-鬼笔环肽染色,共聚焦激光显微镜观察F-微丝的分布。采用划痕、Transwell及Matrigel侵袭小室等评估HOXA6的表达对肿瘤细胞侵袭转移。4.构建HOXA6 siRNA干扰慢病毒载体,建立裸鼠尾静脉肺转移模型,观察HOXA6 siRNA转移瘤的大小及数目,q-RT-PCR方法及免疫组化观察转移瘤中 HOXA6、E-Cadherin 表达。5.通过免疫共沉淀观察HOXA6与PBX2在细胞内的相互作用;通过放线菌酮实验检测PBX2与HOXA6稳定性。6.Western blot检测多种胃癌细胞PBX2和HOXA6的表达水平;免疫组化组化检测PBX2和HOXA6的表达;Spearman检验癌旁胃粘膜和胃癌组织中相关分析。7.体内检测PBX2和HOXA6过表达或敲低后q-RT-PCR及免疫组化观察转移瘤中 HOXA6、PBX2、E-Cadherin 表达。结果:1.HOXA6在胃癌组织和细胞中表达量均上调。2.HOXA6表达与胃癌患者的分化、淋巴结转移、AJCC分期、TNM分期及不良生存结局密切相关,与年龄、性别无关。3.过表达HOXA6可促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭;反之,HOXA6敲低则抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。4.HOXA6可以与PBX2发生相互作用并使其稳定。5.HOXA6和PBX2在胃癌细胞和胃癌组织中的表达均呈正相关,敲低HOXA6可逆转PBX2诱导的胃癌细胞迁移和侵袭能力;敲低PBX2可逆转HOXA6诱导的胃癌细胞迁移和侵袭能力。6.在体内,HOXA6可以促进胃癌细胞肺转移,敲低PBX2可逆转HOXA6诱导的肺转移的能力。结论:HOXA6在胃癌中表达明显上调,HOXA6高表达的患者与不良生存结局密切相关,HOXA6发挥致癌基因的作用;HOXA6过表达促进细胞增殖、迁移和侵袭,HOXA6可以与PBX2协同作用并使其稳定,HOXA6-PBX2轴可能是胃癌发生发展过程中的重要靶点,可能为胃癌的诊断和治疗提供新的重要线索和可能的药物治疗靶点。
夏红[4]（2020）在《DADS下调DJ-1对人胃癌SGC7901细胞EMT、侵袭和抗药性的影响及其作用机制》文中进行了进一步梳理二烯丙基二硫（diallyl disulfide,DADS）是大蒜中烯丙基硫化物的一种疏水性的有效药用成分,对多种肿瘤有明显的抑制作用,是一种很有开发潜力的抗肿瘤候选药物。人类DJ-1基因,又名RS/PARK7/CAP1,是PARK7基因编码的属于肽酶C56的蛋白质家族的一个成员。参与转录调控、氧化应激反应、线粒体调节、炎症以及糖基化损伤等许多生物学过程,在多种肿瘤中高表达,调控肿瘤进展、临床侵袭性、分化、癌细胞形态和药物敏感性,在癌症中扮演着关键角色。我们前期在鉴定二烯丙基二硫（diallyl disulfide,DADS）诱导白血病HL-60细胞分化的差异蛋白质中,发现DJ-1蛋白明显下调。本研究在DADS抑制人胃癌细胞增殖与迁移侵袭的基础上,进一步探讨DADS下调DJ-1负调控PTEN/Akt通路抑制人胃癌细胞EMT与侵袭和抗药性,证实DJ-1是DADS抑制人胃癌细胞EMT与侵袭和抗药性的作用靶点之一,为临床胃癌分子靶向治疗提供理论依据。第一部分:DJ-1、PTEN与p-Akt在胃癌中的表达及临床病理意义目的:探讨DJ-1、PTEN与p-Akt在胃癌中的表达及相应的临床病理意义。方法:采用免疫组织化学方法分别检测组织芯片中胃癌组织、癌旁组织以及正常胃粘膜组织中DJ-1、PTEN与p-AKT的表达。结果:DJ-1和p-Akt在胃癌组织中均呈高表达,与正常胃黏膜与癌旁组织相比,差异具有显着性意义（P<0.05）。并且,在癌旁组织表达明显高于正常胃黏膜（P<0.05）。在淋巴结转移组表达明显高于无淋巴结转移组（P<0.05）。在Ⅰ+Ⅱ期表达明显低于Ⅲ+Ⅳ期（P<0.05）。但在高分化、中分化、低分化胃腺癌中表达无显着性差异（P>0.05）。PTEN在正常胃粘膜组织中表达明显高于癌旁组织与胃癌组织（P<0.05）,在癌旁组织表达显着高于胃癌组织（P<0.05）。在淋巴结转移组明显低于无淋巴结转移组（P<0.05）。在Ⅰ+Ⅱ期表达明显高于Ⅲ+Ⅳ期（P<0.05）。而在高分化、中分化、低分化胃腺癌的表达具有显着差异（P<0.05）。三种蛋白在不同年龄和性别间表达无显着性差异（P>0.05）。Kaplan-Meier生存分析表明,DJ-1高表达与胃癌患者的5年总体生存率呈负相关（P<0.05）。而PTEN高表达与胃癌患者的5年总体生存率呈正相关（P<0.05）。小结:1.DJ-1与p-Akt蛋白在胃癌组织中的表达与胃癌发生、淋巴结转移和TNM分期有关。2.PTEN在胃癌组织中的表达与胃癌分化、淋巴结转移和TNM分期有关。3.DJ-1在胃癌组织中的表达与胃癌患者的生存率呈负相关;PTEN在胃癌组织中的表达与胃癌患者的生存率呈正相关。第二部分:DADS下调DJ-1负调控PTEN/Akt通路抑制SGC-7901细胞增殖、EMT与侵袭目的:探讨DADS对DJ-1高表达人胃癌SGC-7901细胞系增殖、EMT和侵袭的影响。方法:建立DJ-1稳定高表达的SGC-7901细胞系,分别采用CCK-8、划痕实验、侵袭实验、q RT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光等分析DADS对DJ-1高表达人胃癌SGC-7901细胞增殖、EMT和侵袭的作用。结果:Western blot检测发现,经DADS 30mg/l处理24h后的各组胃癌细胞,和对照组相比,DJ-1的表达显着降低,其中,以SGC7901细胞差异最明显,以此选定SGC7901为后续试验的研究对象。进一步通过q RT-PCR与Western blot证实成功构建DJ-1稳定高表达的SGC-7901细胞系。CCK8检测发现,处理前,DJ-1高表达组24h、48h、72h与96h的增殖活性分别为0.579±0.082、0.886±0.153、1.138±0.124与1.344±0.194,较Vector组0.436±0.045、0.557±0.059、0.667±0.057与0.715±0.075呈时间依赖性增加（P<0.05）,表明高表达DJ-1可显着提高SGC7901细胞的增殖能力。而用DADS30mg/L处理24h、28h、72h与96h后,DJ-1高表达组的增殖活性分别为0.560±0.031、0.873±0.017、0.910±0.014与0.936±0.019,较DADS处理前显着降低（P<0.05）,表明DADS可部分抑制DJ-1的表达从而抑制SGC 7901细胞的增殖能力。划痕实验表明,DJ-1高表达能增强SGC-7901细胞的迁移能力。而用30 mg/l DADS处理48h后,DJ-1高表达组和空载体组细胞迁移能力均减弱,表明DADS能减弱DJ-1高表达对SGC7901细胞迁移的影响。Transwell侵袭实验发现,未加DADS组,DJ-1高表达组和空载体组穿过Matrigel基质胶的细胞数分别为179.7±6.0,251.3±4.0（P<0.05）,表明DJ-1高表达可明显促进S G C 7 9 01细胞的侵袭,而DADS 30mg/l处理24h后穿过基质胶的细胞数分别为87.3±7.1,130.0±8.5（P<0.05）,与未处理组相比明显减少。表明DADS能拮抗DJ-1高表达对SGC7901细胞侵袭能力的影响。Western blot证实,与空载体组相比,DJ-1高表达组中DJ-1和p-AKT蛋白表达显着增高,而PTEN表达显着降低,AKT表达无明显差异,EMT相关蛋白E-cadherin、TIMP3显着降低,Vimentin、Snail和MMP-9的表达则显着升高,提示DJ-1可通过抑制PTEN表达促进Akt的活化,进而启动EMT进程。而经DADS30mg/l处理24h后,DJ-1高表达组和空载体组的DJ-1表达明显下调,PTEN表达显着升高,p-Akt显着降低,而Akt水平无明显改变,EMT相关蛋白E-cadherin和TIMP3显着升高,Vimentin、Snail和MMP-9表达显着降低。证实DADS下调DJ-1可调控PTEN/Akt通路抑制人胃癌细胞EMT。进一步的免疫荧光试验发现,与空载体组相比,DJ-1、Vimentin、TIMP3、MMP-9蛋白在DJ-1高表达组的荧光强度显着增强,表明DJ-1高表达促进EMT相关蛋白Vimentin、TIMP3、MMP-9的表达,而PTEN、E-cadherin在DJ-1高表达组的荧光强度显着减弱,表明DJ-1高表达可抑制PTEN、E-cadherin这两种蛋白的表达;而经DADS 30mg/l处理24h后,与未处理组相比较,各组DJ-1、Vimentin、MMP-9、TIMP3蛋白的细胞染色减弱,而PTEN、E-cadherin蛋白染色增加,表明DADS通过抑制DJ-1的表达从而影响PTEN及EMT相关蛋白表达的变化。小结:DADS可通过下调DJ-1负调控PTEN/Akt通路从而抑制SGC-7901细胞增殖、EMT与侵袭。第三部分DADS下调DJ-1抑制SGC7901细胞对5-Fu的抗药性目的:探讨DADS下调DJ-1对SGC7901细胞增殖、凋亡与5-Fu敏感性的作用。方法:MTT分析与流式细胞术分别检测DADS在5-Fu不同浓度的情况下,对SGC7901细胞增殖与凋亡能力的影响。q RT-PCR、Western blot与免疫荧光分别检测DADS对各组SGC7901细胞中Bcl-2、XIAP、Caspase-3、MDR-1、P-gp表达水平的变化。结果:在不同浓度5-Fu处理24h后,DADS 30mg/l处理后的各组细胞其增殖抑制率分别较处理前明显提高（P<0.05）。但SGC7901/DJ-1细胞增殖抑制程度没有SGC7901与SGC7901/VCR细胞明显。表明DADS可抑制SGC7901与SGC7901/VCR细胞增殖能力和提高对5-Fu的敏感性。流式细胞术检测显示SGC7901/DJ-1细胞凋亡水平分别低于SGC7901与SGC7901/VCR（P<0.05）,SG C7901凋亡率高于SGC7901/VCR（P<0.05）。DADS处理后,各组凋亡水平分别较对照组凋亡水平均明显升高（P<0.05）。q RT-PCR与Western blot显示,SGC7901/DJ-1细胞MDR-1、P-gp、Bcl-2、XIAP较SGC7901及SGC7901/VCR细胞明显提高（P<0.05）,Caspase-3明显抑制（P<0.05）,DADS处理后,SGC7901、SGC7901/VCR和SGC 7901/DJ-1细胞中MDR-1、P-gp、Bc l-2及XIA P明显降低（P<0.05）。Caspase-3明显上调（P<0.05）。免疫荧光显示,在对照组中,SGC7901/DJ-1细胞P-gp、Bcl-2、XIAP的荧光强度较SGC7901及SGC7901/VCR细胞明显增强,而Caspase-3荧光强度则显着减弱;DADS处理后,三组细胞中P-gp、Bcl-2及XIAP蛋白与相对应的未处理组相比细胞染色降低,而Caspase-3染色增强。结果与q RT-PCR、Western Blot结果一致。小结:DADS下调DJ-1可促进SGC7901细胞对5-Fu的敏感性,与抑制P-gp、MDR-1、Bcl-2及XIAP和促进Caspase-3有关。结论:1.DJ-1、PTEN、p-Akt蛋白在胃癌组织中的表达与胃癌发生、淋巴结转移和TNM分期有关。2.DADS通过下调DJ-1负调控PTEN/Akt通路抑制SGC-7901细胞增殖、EMT与侵袭。3.DADS下调DJ-1促进SGC7901细胞对5-Fu的敏感性,与抑制P-gp、MDR-1、Bcl-2及XIAP和促进Caspase-3有关。4.DJ-1可能是DADS抑制人胃癌细胞EMT与侵袭和抗药性的作用靶点之一。
陈刚[5]（2020）在《MicroRNA-155介导Rictor/Fos基因促进胃癌细胞对顺铂耐药的机制研究》文中研究表明目的:胃癌是影响人们健康的重大疾病,我国是胃癌高发地区之一。胃癌的综合治疗已取得很大进步,但化疗多药耐药严重降低了化疗效果,因此需要寻找多药耐药的原因并研究其发生机制,并寻找有针对性的逆转耐药性或延缓其发生的方法。MicroRNA是一类非编码RNA,在肿瘤发生、进展、侵袭、转移过程中发挥重要作用。MicroRNA-155在胃癌等多种肿瘤中均有异常表达,其主要功能是对下游靶基因进行转录后调控,在免疫、炎症、肿瘤的发生进展和化疗耐药等病理过程中起作用。本研究通过建立对顺铂耐药的胃癌细胞株,将microRNA-155敲除和过表达并检测其靶基因表达水平的变化来探索microRNA-155在胃癌细胞对顺铂耐药过程中的作用及其机制。方法:（1）收集胃癌患者的癌组织和对应癌旁组织,用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）法检测microRNA-155的表达水平,用生物信息学方法筛选出microRNA-155的靶基因Rictor和Fos,用western blot实验、免疫组化实验检测靶基因和自噬相关蛋白（Beclin1、LC3II）、凋亡相关蛋白（Caspase3、Caspase9）的表达水平,探索microRNA-155对其靶基因的表达水平以及自噬和凋亡的影响。（2）运用顺铂大剂量冲击法建立耐药胃癌细胞株,通过慢病毒转染法对耐药细胞株进行microRNA-155、Rictor和Fos敲除和过表达,建立相应的过表达和敲除细胞株,用CCK8法对新建立的细胞株进行耐药性验证。用CCK8法、Transwell侵袭实验、高内涵细胞成像分析实验、克隆形成实验等方法观察细胞生物学行为的改变。以野生型胃癌细胞、耐药胃癌细胞、microRNA-155过表达的野生型胃癌细胞、microRNA-155敲除的耐药胃癌细胞、Rictor/Fos过表达的耐药胃癌细胞、Rictor/Fos敲除的野生型胃癌细胞为实验对象,用western blot实验检测Rictor、Fos、Beclin1、LC3II、Caspase3和Caspase9的表达水平,用透射电镜、高内涵细胞成像分析实验、流式细胞仪检测细胞内自噬、凋亡水平。（3）用皮下注射成瘤法建立NOD-SCID小鼠移植瘤模型,观察成瘤率、瘤体生长速度、化疗效果等,用免疫组化方法检测小鼠瘤体内Rictor、Fos、Beclin1、LC3II、Caspase3和Caspase9的表达水平。结果:（1）生信分析结果表明microRNA-155有多个靶基因,按照Target score评分结合研究目的以及最新文献报道筛选出Rictor和Fos作为研究对象。在早期胃癌中microRNA-155低表达,Rictor和Fos高表达,Beclin1、LC3II低表达,Caspase3、Caspase9高表达;在进展期胃癌中microRNA-155高表达,Rictor、Fos低表达,Beclin1、LC3II高表达,Caspase3、Caspase9低表达。（2）用顺铂大剂量冲击法建立对顺铂耐药的胃癌细胞株,耐药胃癌细胞株发生明显的形态改变。耐药胃癌细胞中microRNA-155高表达,Rictor、Fos低表达,Beclin1、LC3II高表达,Caspase3、Caspase9低表达,细胞内自噬小体增多,细胞凋亡减少。耐药胃癌细胞增殖减慢,细胞周期被阻滞在G1期,侵袭能力增强,细胞骨架发生改变。将Rictor过表达时自噬水平降低,将Rictor敲除后在药物干预条件下自噬水平增高。将Fos过表达时在药物干预作用下凋亡水平升高,将Fos敲除时凋亡减少。（3）耐药胃癌细胞在NOD-SCID小鼠皮下注射成瘤率低,瘤体生长缓慢,对顺铂敏感性降低。瘤体组织内各基因表达水平的变化趋势同细胞实验结果一致。结论:MicroRNA-155在进展期胃癌和耐药胃癌细胞中高表达并抑制Rictor和Fos的表达,Rictor和Fos是其靶基因。其中Rictor参与对细胞内自噬的调控,Fos参与对凋亡的调控。MicroRNA-155可能通过抑制Rictor和Fos的表达来诱导自噬并抑制凋亡,参与胃癌细胞对顺铂耐药性的产生。
杨晓燕[6]（2020）在《MiR-4295和lncRNA HOTAIR在胃癌中的表达及其功能研究》文中研究指明背景与目的:胃癌（gastric cancer,GC）是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤,位于全球第三大癌症死亡原因。胃癌具有发病隐匿和早期症状不明显等特点,多数患者首诊时疾病已进入进展期,且伴有淋巴结或远处器官的转移,这已成为胃癌防治的难点。因此,通过各种研究技术和手段深入研究胃癌发生、发展、转移以及耐药的分子机制,寻找早期诊断的分子标志物以及药物靶标已迫在眉睫。最近的研究表明,非编码RNAs参与了肿瘤转移和恶性转化的过程。MiR-4295是一个新发现的微小RNA（microRNA）分子,通过生物信息学分析,我们发现miR-4295与lncRNA HOTAIR存在结合位点。因此,我们的研究就从非编码RNAs入手,研究微小RNA（miR-4295）和长链非编码RNA（lncRNA HOTAIR）在胃癌生长增殖和侵袭迁移中的功能及其机制。第一部分miR-4295通过PTEN/PI3K/AKT通路调控胃癌生长和侵袭迁移的研究方法:本研究采用qRT-PCR检测胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28和人胃粘膜上皮细胞系GES-1中及胃癌组织中miR-4295的表达情况。构建miR-4295真核质粒过表达载体及其抑制剂载体（miR-4295 inhibitor）;采用瞬时转染法将构建好的载体转染至胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中,qRT-PCR检测转染细胞系中miR-4295的表达。CCK-8法检测miR-4295和miR-4295 inhibitor及miR-4295联合AKT抑制剂对胃癌细胞增殖活力的影响;流式细胞术检测miR-4295联合AKT抑制剂对胃癌细胞凋亡率的影响;平板克隆法检测miR-4295和miR-4295 inhibitor对胃癌细胞克隆能力的影响;划痕实验检测miR-4295和miR-4295 inhibitor对胃癌细胞迁移能力的影响;transwell法检测miR-4295和miR-4295 inhibitor及miR-4295联合AKT抑制剂对胃癌细胞的侵袭迁移能力的影响。采用生物信息学软件miRanda、TargetScan、Pictar2、RNAhybrid、miRDB、RNA22-HAS、Targetminer、EMBL-EBI、miRWalk、DIANA-microT、mirbridge、miRNAMap和PITA在线预测miR-4295的靶基因。结合DAVID与KOBAS对miR-4295的靶基因进行GO分析及KEGG信号通路分析,分析miR-4295在胃癌细胞生物学过程中可能的分子机制。通过STRING在miR-4295的潜在靶基因中筛选出蛋白作用网络（protein-protein interaction,PPI）起关键作用的核心基因（hub gene）。通过TCGA数据库GEPIA对miR-4295靶向hub gene在胃癌中的相关性及其与胃癌患者的生存分析。利用qRT-PCR、Western blot检测miR-4295的靶基因及PI3K/AKT信号通路中相关基因的表达水平。最后采用双荧光素酶报告系统实验对miR-4295的靶基因进一步验证,明确目的miR-4295与其靶基因在胃癌中的关系。结果:1.胃癌细胞和组织中miR-4295表达水平检测。qRT-PCR结果显示（定量表达结果用Means±SD表示,SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28分别为:1.832±0.120、2.421±0.187、1.328±0.102、1.000±0.040）,与人胃粘膜上皮细胞系GES-1（0.962±0.070）比较,SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28胃癌细胞系miR-4295表达水平均升高,以SGC-7901、MGC-803表达水平升高最为显着;31例胃癌患者中,与正常胃粘膜组织相比,胃癌组织中miR-4295表达显着上调80.6%（25/31）;miR-4295的表达水平与胃癌的肿瘤大小及远端转移相关具有显着性（p<0.05）,而与胃癌患者的年龄、性别、组织学分级及淋巴结转移无显着相关性（p>0.05）。2.构建miR-4295过表达质粒载体和和miR-4295 inhibitor质粒载体。测序结果显示,重组的miR-4295及其inhibitor序列插入准确无误,说明重组的miR-4295和miR-4295 inhibitor质粒载体构建成功。qRT-PCR检测转染胃癌细胞中miR-4295的表达水平,结果显示:相较于miR-NC转染组,miR-4295转染后的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达水平显着上调（p<0.05）;miR-4295inhibitor转染组与Anti-miR-NC转染组相比,miR-4295 inhibitor转染的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达水平显着下调（p<0.05）。3.CCK-8法检测转染后胃癌细胞增殖活力。结果显示:相较于miR-NC转染组,miR-4295转染后的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的增殖活力显着增加（p<0.05）;miR-4295 inhibitor转染组与Anti-miR-NC转染组相比,miR-4295 inhibitor转染的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的增殖活力显着降低（p<0.05）;相较于miR-4295转染组,miR-4295联合AKT抑制剂组细胞增殖活力显着降低（p<0.05）。4.流式细胞术检测miR-4295联合AKT抑制剂处理胃癌细胞后的凋亡率。结果显示:相较于miR-NC转染组,miR-4295转染后的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的凋亡率显着降低（p<0.05）;相较于miR-4295转染组,miR-4295联合AKT抑制剂处理的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的凋亡率显着增加（p<0.05）。5.平板克隆形成实验检测转染后胃癌细胞的克隆能力。结果显示:相较于miR-NC转染组,miR-4295转染后的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的克隆数量显着增加（p<0.05）;miR-4295 inhibitor转染组与Anti-miR-NC转染组相比,miR-4295 inhibitor转染的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的克隆数量显着减少（p<0.05）。6.划痕实验检测转染后对胃癌细胞迁移的影响。划痕实验结果显示:上调胃癌细胞SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,SGC-7901、MGC-803细胞在24 h时,相较于miR-NC组,miR-4295组细胞迁移间距小（p<0.05）;而下调胃癌细胞SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,SGC-7901、MGC-803细胞在24 h时,相较于Anti-miR-NC组,miR-4295 inhibitor组细胞迁移间距大（p<0.05）。7.Transwell实验检测转染后对胃癌细胞迁移、侵袭的影响。结果显示:相较于miR-NC组,miR-4295组细胞迁移和侵袭数显着增加（p<0.05）;而下调胃癌细胞SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,相较于Anti-miR-NC组,miR-4295 inhibitor组细胞迁移和侵袭数显着减少（p<0.05）;相较于miR-4295,miR-4295联合AKT inhibitor组细胞迁移和侵袭数显着减少（p<0.05）。8.miR-4295的潜在功能及其机制。通过14个预测软件,结果共筛选出15353个miR-4295候选靶基因。选取同时由7个生物软件预测阳性结果,共选出600个miR-4295靶基因进行后续GO、pathway分析及靶基因分子网络分析。GO功能富集分析,结果显示24条信号通路显着富集于生物学过程中（p<0.01）;12条信号通路显着富集于细胞组成中（p<0.01）;12条信号通路显着富集于细胞组成中（p<0.01）。KEGG信号通路分析,结果显示miR-4295靶基因显着富集于23条信号通路信息（p<0.01）。miR-4295靶基因蛋白互作（PPI）网络,共筛出15个hub genes,包括CUL3、PPARG、UBE2D1、FMR1、SUV39H1、RAB5A、AGO4、RNF2、PTEN、RUNX2、KMT2A、ITPKB、ESR1、DICER1和LDLR。miR-4295 hub gene PTEN与BCL2L11具有显着相关性。利用生物信息学软件预测miR-4295与PTEN及BCL2L11 3’UTR靶位点情况,结果显示:PTEN 3’UTR靶位点位于其3’UTR 412-418 bp,序列（5’-3’）为UUGCACU;BCL2L11 3’UTR靶位点位于其3’UTR4093-4099 bp,序列（5’-3’）为UUGCACU。PTEN 3’UTR及其突变体双荧光素酶质粒载体阳性克隆的测序结果显示,重组的PTEN 3’UTR及其突变体序列插入准确无误,说明psiCHECK2-PTEN-3’UTR与psiCHECK2-PTEN-mut-3’UTR重组质粒构建成功;BCL2L11 3’UTR及其突变体双荧光素酶质粒载体阳性克隆的测序结果显示,重组的BCL2L11 3’UTR及其突变体序列插入准确无误,说明GV272-BCL2L11-3’UTR与GV272-BCL2L11-mut-3’UTR重组质粒构建成功。双荧光素酶活性检测结果显示:相较于PTEN-3’UTR+miRNA-NC共转染组,PTEN 3’UTR+miR-4295共转染组的荧光素酶活性显着降低,说明miR-4295能够结合PTEN 3’UTR,抑制其表达;PTEN-3’UTR+miRNA-NC共转染组与PTEN mut-3’UTR+miR-4295共转染组相比,两组的荧光素酶活性无显着性差异,说明miR-4295不能与靶位点突变的PTEN 3’UTR结合,不能抑制其表达;PTEN3’UTR+miR-4295共转染组与PTEN mut-3’UTR+miR-4295共转染组相比,PTEN mut-3’UTR+miR-4295共转染组的荧光素酶活性显着增加,进一步说明PTEN 3’UTR靶位点突变后,miR-4295不能与其结合,进而不能抑制靶基因表达。以上结果说明miR-4295能够直接结合靶基因PTEN 3’UTR并抑制其表达。相较于BCL2L11-3’UTR+miRNA-NC共转染组,BCL2L11 3’UTR+miR-4295共转染组的荧光素酶活性显着降低,说明miR-4295能够结合BCL2L11 3’UTR,抑制其表达;BCL2L11-3’UTR+miRNA-NC共转染组与BCL2L11 mut-3’UTR+miR-4295共转染组相比,两组的荧光素酶活性无显着性差异,说明miR-4295不能与靶位点突变的BCL2L11 3’UTR结合,不能抑制其表达;BCL2L11 3’UTR+miR-4295共转染组与BCL2L11 mut-3’UTR+miR-4295共转染组相比,BCL2L11 mut-3’UTR+miR-4295共转染组的荧光素酶活性显着增加,进一步说明BCL2L11 3’UTR靶位点突变后,miR-4295不能与其结合,进而不能抑制靶基因表达。以上结果说明miR-4295能够直接结合靶基因BCL2L11 3’UTR并抑制其表达。采用qRT-PCR检测miR-4295对胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中靶基因及其相关基因mRNA表达的影响。结果显示:相较于miR-NC转染组,miR-4295转染组中PTEN、BCL2L11基因mRNA的水平显着降低（p<0.05）,而PI3K、AKT、mTOR基因mRNA表达水平无显着性差异;而下调胃癌细胞SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,与Anti-miR-NC转染组相比,miR-4295 inhibitor转染组中PTEN、BCL2L11基因mRNA的水平显着增加（p<0.05）,而PI3K、AKT、mTOR基因mRNA表达水平无显着性差异。采用Western blot检测miR-4295对胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中靶基因PTEN、BCL2L11及其相关蛋白表达水平的影响。结果显示:相较于miR-NC转染组,miR-4295转染组中PTEN、BCL2L11蛋白的水平显着降低,而PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显着增加（p<0.05）;而下调胃癌细胞SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,与Anti-miR-NC转染组相比,miR-4295 inhibitor转染组中PTEN、BCL2L11蛋白的水平显着上调,而PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显着降低（p<0.05）。第二部分lncRNA HOTAIR在胃癌中的表达及其功能研究方法:本研究采用qRT-PCR检测胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28和人胃粘膜上皮细胞系GES-1中HOTAIR的表达情况。通过基于TCGA与GTEx公共数据库的GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）分析HOTAIR在408例胃癌中的表达水平。化学合成siHOTAIR,采用瞬时转染法将构建好的siHOTAIR转染至胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中,qRT-PCR检测转染细胞系中HOTAIR的表达;CCK-8法检测siHOTAIR对胃癌细胞增殖活力的影响;划痕实验检测siHOTAIR对胃癌细胞迁移能力的影响;transwell法检测siHOTAIR对胃癌细胞的侵袭迁移能力的影响。利用信息学软件UCSC（Version 2009）和StarBase v2.0预测miR-4295与HOTAIR的结合位点;采用双荧光素酶报告基因系统实验检测验证miR-4295与HOTAIR的位点结合情况。结果:1.胃癌细胞系（SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28）分别进行HOTAIR表达水平分析。qRT-PCR检测结果显示（定量表达结果用Means±SD表示,SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28分别为:1.000±0.1000、0.370±0.040、0.280±0.030、0.310±0.040）,与人胃粘膜上皮细胞系GES-1（0.190±0.070）比较,SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28胃癌细胞系HOTAIR表达水平均升高。以SGC-7901、MGC-803表达水平升高最为显着。利用GEPIA分析HOTAIR在胃癌组织中的表达比正常胃粘膜组织中的表达显着升高。2.将siHOTAIR与siNC分别瞬时转染胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803。转染48 h后,采用qRT-PCR法检测HOTAIR的表达水平。结果显示:相较于siNC转染组,siHOTAIR转染组的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中HOTAIR的表达水平显着下调（p<0.05）。3.CCK-8法检测转染后胃癌细胞增殖活力。结果显示:相较于siNC转染组,siHOTAIR转染后的胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803的增殖活力显着降低（p<0.05）。4.划痕实验检测转染后对胃癌细胞迁移的影响。划痕实验结果显示:下调胃癌细胞SGC-7901、MGC-803中HOTAIR的表达,SGC-7901、MGC-803细胞在24 h时,相较于siNC转染组,siHOTAIR转染组细胞迁移间距大（p<0.05）。5.Transwell实验检测转染后对胃癌细胞迁移、侵袭的影响。结果显示:相较于siNC转染组,siHOTAIR转染组细胞迁移和侵袭数显着减少（p<0.05）。6.StarBase v2.0 software预测miR-4295与HOTAIR位点结合情况,结果显示,HOTAIR结合位点序列（5’-3’）为UUGCACU。HOTAIR及其突变体双荧光素酶质粒载体阳性克隆的测序结果显示,重组的HOTAIR及其突变体序列插入准确无误,说明psiCHECK2-HOTAIR与psiCHECK2-HOTAIR-mut重组质粒构建成功。双荧光素酶活性检测结果显示:相较于HOTAIR+miR-NC共转染组,HOTAIR+miR-4295共转染组的荧光素酶活性显着降低,且差异具有统计学意义,说明miR-4295能够结合HOTAIR;HOTAIR mut+miR-NC共转染组与HOTAIR mut+miR-4295共转染组相比,两组的荧光素酶活性无显着性差异,说明miR-4295不能与靶位点突变的HOTAIR结合。以上结果说明miR-4295能够直接结合HOTAIR。结论:1.miR-4295、HOTAIR在胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803、BGC-823、MKN-28和胃癌组织中均高表达,miR-4295的表达水平与胃癌的肿瘤体积大小及远端转移呈正相关。2.miR-4295可促进胃癌细胞的生长增殖和侵袭迁移,而下调miR-4295的表达可抑制胃癌细胞的生长增殖和侵袭迁移;miR-4295联合AKT抑制剂能够降低胃癌细胞的增殖和侵袭迁移能力,增加胃癌细胞凋亡率。3.PTEN、BCL2L11是miR-4295的直接靶基因;上调胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显着增加;下调胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803中miR-4295的表达,PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显着降低。4.下调HOTAIR可抑制胃癌细胞增殖和侵袭迁移,且发现miR-4295与HOTAIR存在结合位点。
李乾赫[7]（2020）在《Ezrin蛋白和c-fos蛋白在皮肤鳞癌中的表达》文中进行了进一步梳理研究背景:由皮肤鳞状上皮细胞异常增生引起的皮肤鳞状细胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma,CSCC）是当前最常见的皮肤恶性肿瘤之一。在已知的非恶性黑色素瘤皮肤癌中,皮肤鳞癌发病率仅次于皮肤基底细胞癌[1]。在欧美的皮肤肿瘤的研究中,皮肤鳞癌发病率占据皮肤恶性肿瘤的20%,男、女比例约为3:1[2]。皮肤鳞癌发病原因比较复杂,根据近年来的研究,与人种[3]、年龄[4]、长期紫外线的照射[5]等因素有关,也有文献报道,上述原因导致部分基因的异常表达,使皮肤的鳞状细胞发生癌变[6]。在最近的研究中,皮肤鳞癌有侵袭性增强、转移和恶化程度增加的趋势,一旦有神经血管的侵袭,会引起重要脏器的转移,甚至危及生命[7]。在皮肤鳞癌侵袭和转移的过程中,蛋白的相关研究报道比较少,其作用机制目前仍然在研究中。Ezrin蛋白分布于各类上皮细胞的细胞膜内,可以起到支架作用,协助连接细胞骨架的肌动蛋白和细胞的膜蛋白,使肌动蛋白和膜蛋白两者之间相互作用,从而可以维持细胞的正常运动和正常形态[8]。近年来的研究中发现,Ezrin蛋白在多种肿瘤中,利用与细胞黏附分子的作用、介入信号传输过程,参与到肿瘤的发生、侵袭和转移等过程中,是部分肿瘤中一个重要的靶分子[9]。c-fos基因是一类原癌基因,它所表达的产物c-fos蛋白呈现在细胞核内,它可以对癌基因进行重新编码,并产生出各种转录因子,通过调控其它基因的表达及转录来调节正常细胞的生长、发育和分化[10]。近年来研究发现,c-fos蛋白多数是在肿瘤的早期细胞周期中发挥作用,诱导上皮性肿瘤细胞向间充质肿瘤细胞转变,导致肿瘤行为的变化[11]。研究目的:本文通过研究Ezrin蛋白和c-fos蛋白在皮肤鳞癌中的表达,以及两种蛋白的表达与皮肤鳞癌分化程度的关系,来阐述这两种蛋白在皮肤鳞癌发生侵袭和转移过程中的变化。探讨Ezrin蛋白、c-fos蛋白在皮肤的鳞癌细胞中的表达及这两种蛋白与肿瘤病理分化之间的相关性,进一步明确Ezrin蛋白和c-fos蛋白是否可以作为皮肤鳞癌进展和预后的影响因子,最终为研究蛋白在皮肤鳞癌的早期诊断、肿瘤转归中的作用提供理论依据。研究方法:收集2015年1月到2019年1月四年内,来自大连医科大学附属第二医院皮肤科病理确诊为皮肤鳞癌,并接受肿瘤组织切除术的患者的组织样本,其中包括皮肤鳞癌组织23例、配对的癌旁组织23例,以及正常的皮肤组织20例作为空白对照。采用免疫组织化学染色SP法分别检测Ezrin蛋白、c-fos蛋白在23例皮肤鳞癌的癌组织、癌旁组织以及20例正常皮肤组织中的表达。通过使用Image-J软件,分析Ezrin蛋白、c-fos蛋白的光密度的平均表现值和阳性颗粒表达面积的大小。采用χ2检验对两种蛋白在皮肤鳞癌的癌组织、癌旁组织和正常皮肤组织、以及在不同分化皮肤鳞癌中阳性表达率进行比较。采用r检验对两种蛋白在皮肤鳞癌中的表达相关性进行比较。研究结果:Ezrin蛋白、c-fos蛋白在正常的皮肤组织中阴性表达或者表达较低。研究中发现,Ezrin蛋白在皮肤鳞癌的癌组织中,阳性颗粒的表达率可达到78.3%,明显超出癌旁组织（阳性表达率为4.3%）和正常皮肤组织（阳性表达率为5%）（P<0.05）。Ezrin蛋白在低分化皮肤鳞癌组织中的表达高于在高分化和中分化皮肤鳞癌组织中的表达,在中分化皮肤鳞癌组织中的表达高于在高分化皮肤鳞癌组织中的表达。以上结果说明,皮肤鳞癌组织分化的程度越低,Ezrin蛋白的表达水平越高。在皮肤鳞癌的癌组织中,c-fos蛋白的阳性表达率检测结果可达73.9%,这个表达结果显着高于癌旁组织（阳性表达率为4.3%）,以及正常的皮肤组织（阳性表达率为0%）（P<0.05）。c-fos蛋白在高分化皮肤鳞癌组织中的表达高于在中分化和低分化皮肤鳞癌组织中的表达,在进一步分析中,发现c-fos蛋白在中、低分化皮肤鳞癌中的表达并无明显差异（P>0.05）。本研究还发现,在皮肤鳞癌的癌组织中,Ezrin蛋白和c-fos蛋白的表达结果呈正相关（r=0.887,P<0.05）,即Ezrin蛋白表达越高,c-fos蛋白表达越高。研究结论:Ezrin蛋白、c-fos蛋白在皮肤鳞癌组织中的表达水平,显着高于在癌旁组织和正常皮肤组织中的表达水平（P<0.05）。二者在皮肤鳞癌组织中表达呈正相关（r=0.887,P<0.05）,且Ezrin蛋白、c-fos蛋白的表达率和皮肤鳞癌分化程度有一定的关系,说明这两种蛋白可能在皮肤鳞癌的产生、侵袭、转移等过程中有协同性,可能影响皮肤鳞癌的进展和预后,为评估皮肤鳞癌的肿瘤转归提供一定的理论依据。
汪文杰[8]（2020）在《长链非编码RNA CASC19在胃癌中的作用和机制研究》文中提出背景和目的:胃癌（Gastric cancer,GC）是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率分别位于全球癌症的第四位和第五位。中国的GC发病率和死亡率占到了全世界一半以上。总的来说,GC的发生是遗传因素和环境因素交互作用的结果。目前,手术切除仍然是GC治疗的主要方式。在中国,通常超过80%的患者在初诊时就被诊断为进展期GC,术后5年生存率不到30%。尽管近年来在GC的治疗方面取得了很大的进步,但GC患者的生存率仍然很低。因此,亟需寻找GC新的分子生物标记物和特异的治疗靶点。随着高通量测序技术的发展,以往被认为是转录“噪音”和“垃圾”的长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）引起了许多科学家的关注。研究发现lncRNA具有高度的组织特异性,并且参与了肿瘤细胞的多种生物学过程。此外,lncRNA可以通过表观遗传修饰、转录调控、转录后调控等多种方式参与肿瘤的发生和发展。尽管lncRNA在GC的研究中仍然属于探索阶段,但还是发现了一些lncRNA可能在GC的病变过程中起关键作用,这也为GC的诊断和治疗提供了新思路。因此,lncRNA具有成为GC诊断生物标记物和治疗靶标的巨大潜力。本研究选择lncRNA癌症易感候选物19（Cancer susceptibility candidate 19,CASC19）作为研究对象,CASC19位于被称为基因沙漠的染色体8q24.21区域,目前在GC中的功能未见报道。我们前期对癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库进行深入挖掘,发现CASC19在GC中上调,并且与GC的浸润深度、TNM分期、远处转移和总体生存期（Overall survival,OS）显着相关。然后,利用cDNA末端快速扩增（Rapid amplification of cDNA ends,RACE）实验获得了CASC19在GC细胞中存在的717bp全长序列,并通过UCSC确认这是个新的转录本。我们在临床样本,细胞模型和动物模型中对CASC19在GC中作用和调控机制进行一系列实验验证,以期为GC的诊断和治疗提供参考。研究方法:1.通过TCGA数据库获取了375位GC患者的RNA测序和临床性状数据,利用加权基因共表达网络分析（Weighted gene co-expression network analysis,WGCNA）和差异基因表达分析相结合的方法,筛选与GC进展和预后相关的lncRNA。然后,分析目的lncRNA表达与临床病理参数和预后的关系。最后,进行基因集富集分析（Gene set enrichment analysis,GSEA）探索lncRNA相关的信号通路。2.收集了联勤保障部队第九四〇医院普通外科和兰州大学第一医院肿瘤外科从2019年9月1日至2020年1月30日手术切除的80对新鲜GC组织和癌旁对照组织。利用实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR,qRT-PCR）检测CASC19在GC组织和癌旁对照组织中的表达水平,并分析CASC19的表达与患者临床病理参数之间的关系以及与下游靶基因NPM1的相关性。采用受试者工作特征（Receiver operator characteristic,ROC）曲线评估CASC19在GC诊断中的意义。3.采用qRT-PCR检测CASC19在人GC细胞系（AGS,BGC-823,MGC-803,HGC-27和MKN-45）和正常胃粘膜上皮细胞系（GES-1）中的表达水平。采用RACE实验鉴定CASC19在GC细胞中的全长序列。制备CASC19 shRNA和过表达慢病毒,shRNA慢病毒感染MKN-45和BGC-823细胞,过表达慢病毒感染HGC-27和AGS细胞,用qRT-PCR检测敲减和过表达效率。采用CCK-8实验、细胞克隆形成实验和EdU细胞增殖实验检测CASC19对GC细胞增殖能力的影响。采用细胞划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验检测CASC19对GC细胞迁移和侵袭能力的影响。采用流式细胞术和蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）实验检测CASC19对GC细胞凋亡的影响。采用WB实验检测CASC19对上皮间质转换（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白E-cadherin,Vimentin和N-cadherin表达的影响。4.用带有Luciferase标签的CASC19 shRNA慢病毒和MKN-45细胞构建稳转细胞株。选用4-5周龄BALB/c-nu雄性裸鼠用于动物实验,将10只裸鼠随机分为sh-CASC19组和sh-NC组两个组,每组5只。将两组细胞注射于裸鼠肩胛下构建裸鼠皮下移植瘤模型,每天测量肿瘤体积,期间利用小动物活体成像仪监测肿瘤生长状态。饲养4周处死裸鼠,取下肿瘤后一半用10%中性福尔马林溶液固定,另一半放入液氮罐保存。采用qRT-PCR实验检测移植瘤中HDAC1和NPM1mRNA的表达。采用IHC实验和WB实验检测移植瘤中Ki-67,PCNA,HDAC1和NPM1蛋白的表达。5.通过基因芯片技术检测CASC19敲减后下游功能基因的表达,进而鉴定CASC19可能调控的下游靶基因,并结合创新途径分析（Ingenuity pathway analysis,IPA）软件进行经典通路分析,上游调控分析,疾病和功能分析,调控效应分析和相互作用网络分析。然后选择30个差异表达的基因（Differentially expressed gene,DEG）进行qRT-PCR验证。6.通过核质分离实验来确定CASC19在GC细胞中的亚细胞定位。采用RNA pull-down实验检测与CASC19相互作用的蛋白质。采用RNA纯化染色质分离（Chromatin Isolation by RNA Purification,ChIRP）实验检测与CASC19同时作用的蛋白质和基因,分别用质谱分析（Mass spectrometry,MS）和测序（Sequencing,Seq）鉴定下游蛋白质和基因。采用WB实验检测RNA pull-down洗脱产物中HDAC1蛋白的表达。采用RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA-binding protein immunoprecipitation,RIP）实验来反向验证HDAC1蛋白与CASC19的相互作用。采用HDAC1的染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）实验检测与HDAC1相互作用的基因。采用ChIP-qPCR实验验证HDAC1与NPM1启动子的结合。采用双荧光素酶报告基因实验验证CASC19和HDAC1同时与NPM1启动子的结合。采用ChIP-qPCR实验验证MYC与CASC19启动子的结合。研究结果:1.通过WGCNA方法确定CASC19作为核心lncRNA用于接下来的分析和验证。CASC19在TCGA数据库GC样本中上调,其过表达与T分期（P=0.034）,TNM分期（P=0.022）和淋巴结转移（P<0.001）显着相关。CASC19过表达GC患者的OS明显短于CASC19低表达的患者（P=0.015）。Cox分析显示CASC19过表达是影响GC患者OS的独立危险因素（HR=1.524,95%CI=1.003-2.316,P=0.049）。GSEA分析显示CASC19过表达引起变化的下游大多数基因富集在癌症相关信号通路和经典信号通路上。2.CASC19在GC组织中显着上调,其表达量是癌旁对照组织中的4.2倍。CASC19表达与GC肿瘤大小（P<0.001）,浸润程度（P=0.011）,TNM分期（P<0.001）和淋巴结转移（P=0.003）呈正相关。CASC19的结合蛋白HDAC1在GC组织中上调,而CASC19的下游靶基因NPM1在GC组织中下调,并且NPM1的表达与CASC19负相关（R=-0.361,P=0.001）。相对于癌旁对照组织,HDAC1mRNA和蛋白在GC组织中过表达,而NPM1 mRNA和蛋白在GC组织中低表达。CASC19在ROC曲线下的面积（Area under the curve,AUC）为0.952（95%CI:0.920-0.984,P?<?0.0001）,提示CASC19对GC的诊断效果较好。3.CASC19在人GC细胞系中表达上调,其在GC细胞中的全长为717bp。UCSC网站、CPAT工具和ORFfinder网站均显示CASC19不具备蛋白质编码能力。shRNA慢病毒在MKN-45和BGC-823细胞中成功下调CASC19的表达,过表达慢病毒在AGS和HGC-27细胞中成功上调CASC19的表达。CASC19下调会抑制MKN-45和BGC-823细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而促进MKN-45和BGC-823细胞的凋亡。相反,CASC19上调会促进HGC-27和AGS细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而抑制HGC-27和AGS细胞的凋亡。此外,CASC19下调后MKN-45和BGC-823细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和间质蛋白Vimentin和N-cadherin表达降低,而凋亡蛋白Casepase-3,Casepase-7和Casepase-9以及上皮蛋白E-cadherin表达升高。CASC19上调后HGC-27和AGS细胞中Bcl-2,Vimentin和N-cadherin蛋白表达升高,而Casepase-3,Casepase-7,Casepase-9和E-cadherin蛋白表达降低。4.sh-CASC19组裸鼠皮下移植瘤的体积和重量明显小于sh-NC组,HE染色发现sh-NC组肿瘤细胞出现的核体积增大、核分裂像增多、瘤巨细胞等恶性增殖现象明显多于sh-CASC19组。Ki-67和PCNA蛋白在sh-CASC19组移植瘤中的表达水平明显低于sh-NC组。HDAC1 mRNA和蛋白在sh-CASC19组移植瘤中的表达水平与sh-NC组无显着差异。NPM1 mRNA和蛋白在sh-CASC19组移植瘤中的表达水平明显高于sh-NC组。5.CASC19敲减引起1,433个DEG上调,369个DEG下调。IPA分析显示CASC19可能与THBS1和TGFBR2作用,进而影响GC细胞的增殖和凋亡。选择30个DEG进行qRT-PCR验证,与芯片实验结果一致。6.CASC19主要分布于GC细胞核内,提示CASC19可能通过表观遗传调控起作用。RNA pull-down和ChIRP-MS实验确定了96个与CASC19可能结合的蛋白,生物信息学预测到CASC19与组蛋白修饰蛋白HDAC1之间存在结合区域。WB和RIP实验证明HDAC1可直接与CASC19结合,上下调CASC19后HDAC1mRNA和蛋白的表达没有显着差异,证明HDAC1不受CASC19的调控。ChIRP-seq和HDAC1的ChIP-seq实验确定了281个HDAC1与CASC19在基因组上可能共同调控的基因。生物信息学分析表明NPM1基因启动子区域出现peak-calling峰,提示CASC19可能结合在NPM1启动子上。ChIP-qPCR实验发现下调CASC19降低了HDAC1与NPM1启动子的结合。上下调CASC19和HDAC1,qRT-PCR和WB实验证明NPM1受CASC19和HDAC1的调控。双荧光素酶报告基因实验确认CASC19通过招募HDAC1共同结合到NPM1启动子上,从而抑制NPM1的表达。此外,ChIP-qPCR实验表明MYC可结合在CASC19启动子上,qRT-PCR实验证明MYC增加CASC19的表达。结论:本课题通过挖掘TCGA数据库,发现位于染色体8q24.21区域的lncRNA CASC19在GC中上调,并且与GC的进展和预后相关。通过RACE发现CASC19在GC细胞中存在717bp的长度。我们在GC细胞系,GC临床样本和动物模型中对CASC19进行了一系列体外体内验证,证明了CASC19在GC中是一个癌基因。CASC19主要分布于GC细胞核内。在机制上,CASC19通过募集HDAC1至NPM1的启动子区域,使NPM1的启动子区域组蛋白去乙酰化,抑制了NPM1的转录活性,从而降低进NPM1的表达。此外,我们还发现CASC19在上游受到转录因子MYC的调控。我们的研究发现了CASC19通过表观修饰抑制NPM1表达的一种新机制,为更好地理解lncRNA在GC中的作用和机制增加了新的证据。CASC19有望成为GC潜在的诊断标志物和治疗靶点。
谷泽慧[9]（2020）在《miRNA-7-5p靶向调控RAF1/MEK/ERK信号转导通路影响胃癌细胞SGC-7901增殖及迁移的研究》文中研究指明目的研究miR-7-5p基因对胃癌细胞SGC-7901增殖、迁移的影响,并进一步探讨miR-7-5p在胃癌中的作用与RAF1/MEK/ERK通路有关,从而进一步阐明胃癌的发病机制、并为胃癌的治疗提供新的理论依据。方法（1）利用NCBI-pubmed、Targetscan、Star Base和miRBase等数据库和生物信息学技术找到相关的miRNAs,预测并从中筛选出它的靶基因。（2）实时定量PCR检测人胃癌SGC-7901细胞中miR-7-5p表达水平。（3）SGC-7901细胞分别转染miR-7-5p mimics、miR-7-5p mimics NC、miR-7-5p inhibitor、miR-7-5p inhibitor NC,应用Real-time PCR法检测miR-7-5p转染是否成功、对比24、36、48h转染效率选取最佳转染时间并检测靶基因RAF1表达情况。（4）应用MTT法检测不同条件下人胃癌细胞SGC-7901增殖活力。（5）Hoechst33258核染色实验观察不同条件下人胃癌细胞凋亡情况。（6）流式细胞术检测人胃癌细胞周期变化及凋亡情况。（7）细胞划痕实验检测不同条件下人胃癌细胞迁移情况。（8）Western-blot检测人胃癌细胞中RAF1、p-RAF1、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK、Bax、Bcl-2、caspase3和caspase9蛋白表达水平。结果一、miRNA及靶基因的筛选及验证1.通过NCBI-Pubmed数据库发现:胃癌组织及细胞中27个miRNA和66个基因存在于MAPK家族当中;Targetscan分析得出:其中四对miRNA与基因靶标关系及遗传保守性良好(Context++Score percentile≥80,PCT>0.4)。KEGG通路富集得出:RAF1作为miR-7-5p的靶基因通过MAPK-ERK信号转导通路影响胃癌的发生与发展。2.人胃癌细胞SGC-7901中miR-7-5p显着低表达（P<0.05）,SGC-7901细胞转染miR-7-5p mimics后,miR-7-5p表达水平显着升高,其48h的转染效率为最高。3.分别用miR-7-5p mimics及RAF1 inhibitor处理细胞后,细胞中过表达miR-7-5p基因的RAF1表达水平明显下调（P<0.05）,沉默的RAF1基因miR-7-5p表达水平明显上调（P<0.05）,证明RAF1与miR-7-5p存在互靶关系。二.miR-7-5促进人胃癌细胞SGC-7901的凋亡1.过表达miR-7-5p的细胞,G0/G1期细胞百分率为75.94%,G2/M期细胞百分率为5.40%,细胞分裂进程较对照组比较明显减慢（P<0.05）。2.过表达miR-7-5p组细胞迁移速度减慢,而miR-7-5p沉默组迁移速度明显加快（P<0.05）。3.过表达miR-7-5p组细胞凋亡率明显增加,而沉默后的miR-7-5p组凋亡率明显降低（P<0.05）。4.过表达miR-7-5p组caspase3与caspase9蛋白表达水平明显升高,Bcl-2/Bax、P-RAF1/RAF1比值明显降低（P<0.05）,而miR-7-5p沉默组与之相反。三.miR-7-5p通过RAF1/MEK/ERK信号通路诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡1.miR-7-5p mimics及ERK抑制剂分别干预SGC-7901细胞24h后,细胞凋亡率为18.71%和27.3%,联合作用后凋亡率为30.7%,细胞凋亡明显加快,联合作用后效果为最强（P<0.05）。2.转染及给药24h后,细胞迁移速度减慢;miR-7-5p mimics与ERK抑制剂联合干预,细胞迁移速度最慢。3.转染及给药24h后,人胃癌SGC-7901细胞中caspase3、caspase9蛋白表达水平明显升高,Bcl-2/Bax、P-RAF1/RAF1、P-MEK/MEK、P-ERK/ERK比值明显降低（P<0.05）,以联合干预组作用最强。结论1.miR-7-5p在抑制人胃癌细胞SGC-7901的增殖及迁移方面发挥着十分重要的作用。2.过表达miR-7-5p与miR-7-5p沉默后,两种条件下的表现完全相反,说明胃癌中miR-7-5p可能通过靶向调控RAF1的表达发挥抑制细胞增殖和迁移的作用。3.miR-7-5p mimics与ERK抑制剂均可抑制胃癌细胞增殖及迁移作用,联合作用后作用最强,凋亡相关蛋白表达水平升高,负凋亡相关蛋白表达水平则降低;而miR-7-5p沉默后所有指标恰恰相反。说明miR-7-5p可能通过负向调节RAF1抑制MEK/ERK信号转导通路的激活,从而抑制人胃癌细胞SGC-7901的增殖及迁移。
赵一鸣[10]（2019）在《HPIP对胰腺癌恶性生物学行为的调控作用及相关机制研究》文中研究表明研究背景及目的胰腺癌是恶性程度很高的实体肿瘤,5年生存率不足9%,缺少有效的辅助治疗措施,胰腺癌的分子机制研究是提高胰腺癌综合疗效的基础。造血前B细胞白血病转录因子相互作用蛋白（hematopoietic pre-B-cell leukemia transcription factor interactingprotein,HPIP）,是一种细胞骨架支架蛋白,目前发现HPIP在多种恶性肿瘤中发挥促癌基因作用,HPIP能够参与肿瘤细胞包括增殖、迁移、侵袭、凋亡、化疗敏感性、细胞粘附形成在内的多种生物学行为,而关于HPIP与胰腺癌的关系,目前国内外尚无报道。本研究旨在探讨HPIP表达水平与胰腺癌患者预后及胰腺癌细胞恶性生物学行为之间的关系,并初步探索其潜在分子机制。研究方法1.应用免疫组织化学染色方法检测胰腺癌组织及对应癌旁组织中HPIP的表达水平,并研究其与胰腺癌患者临床病理特征及预后的关系。2.用慢病毒转染方法构建HPIP稳定敲低及稳定过表达的BxPC-3及MIA PaCa-2细胞系。在HPIP敲低组、HPIP过表达组及其对照组的BxPC-3及MIAPaCa-2细胞中,使用CCK8法检测HPIP对胰腺癌细胞增殖能力的影响,平板克隆形成实验检测HPIP对胰腺癌细胞克隆形成能力的影响,PI单染及流式细胞术检测细胞周期变化,Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡变化,Transwell迁移侵袭实验检测HPIP对胰腺癌细胞迁移侵袭能力的影响。Western blotting方法检测HPIP敲低及过表达时细胞周期蛋白、cleaved caspase 7、cleaved PARP、上皮间质转化标志物及FAK/Src的表达情况。3.应用HPIP稳定敲低的MIAPaCa-2细胞株构建裸鼠皮下移植瘤模型,检测HPIP表达水平对皮下移植瘤生长速度的影响。4.应用转录组测序检测HPIP稳定敲低的MIAPaCa-2细胞株中mRNA表达谱变化,构建HPIP相关的蛋白质相互作用网络,推测分子网络中核心节点蛋白,通过KEGG分析推测HPIP相关的信号通路,通过GO分析推测与HPIP相关的细胞组分、分子功能及生理进程。研究结果1.HPIP在胰腺癌组织中表达水平显着高于对应癌旁组织（P=0.031）,HPIP高表达提示肿瘤分化不良（P=0.044）,在年龄55岁及以上患者群体中HPIP的高表达提示预后不良（P=0.028）。2.敲低HPIP后,MIAPaCa-2和BxPC-3细胞的增殖及克隆形成能力受到抑制（P<0.05）。过表达HPIP后,MIAPaCa-2和BxPC-3细胞系的增殖及克隆形成能力显着增强（P<0.05）。敲低HPIP后,MIAPaCa-2及BxPC-3细胞中S期细胞的比例减少（P=0.008;P<0.001）,同时G0/G1期细胞比例增加（P<0.001;P=0.001）。过表达HPIP后,MIA PaCa-2和BxPC-3细胞中S期细胞的比例增加（P=0.011;P<0.001）,同时G0/G1期细胞比例减少（P=0.034;P<0.001）。敲低HPIP后,MIAPaCa-2及BxPC-3细胞中总凋亡率上升（P<0.001;P=0.034）。过表达HPIP后,MIAPaCa-2及BxPC-3细胞中总凋亡率下降（P=0.023;P=0.035）。BxPC-3及MIAPaCa-2细胞中HPIP过表达组细胞迁移侵袭能力均明显高于阴性对照组（P<0.05）,BxPC-3及MIA PaCa-2细胞中HPIP敲低组细胞迁移侵袭能力均明显低于阴性对照组（P<0.05）。过表达HPIP后,胰腺癌细胞中p27表达水平下降、cyclin D1表达水平升高、Src活化程度增加、E-cadherin表达水平下降,N-cadherin、Vimentin及磷酸化FAK表达水平升高、cleaved caspase 7及cleaved PARP表达水平下降。3.皮下移植瘤模型中,HPIP敲低组的移植瘤体积及湿重明显低于对照组（P<0.001;P=0.002）。4.对HPIP稳定敲低的MIA PaCa-2细胞株及其对照稳转株进行转录组测序及KEGG富集分析发现与HPIP关系最为密切的信号通路依次是TGF-β通路、FOXO 信号通路、Hippo 信号通路。CDKN1B、MYC、CCND2、BCL2L1、TGFBR1、TGFBR2、PPP2CA可能是HPIP蛋白质相互作用网络中的核心节点。GO分析发现敲低HPIP后,差异基因富集程度最高的生理学过程、细胞内组分及分子功能分别是细胞对于层流液体剪切力的反应、β-catenin解聚复合体和跨膜丝氨酸及苏氨酸激酶受体的激活过程。研究结论HPIP在胰腺癌组织中表达水平显着高于对应癌旁组织,HPIP高表达与肿瘤低分化呈正相关,55岁以上胰腺癌患者中HPIP高表达提示预后不良。HPIP可以下调p27表达水平并增加cyclin D1表达水平和Src活化程度,促进细胞周期由G0/G1期向S期转化。HPIP可以抑制caspase 7的活化及其对PARP的剪切过程,从而抑制凋亡。HPIP还通过提高FAK磷酸化水平,促进EMT过程,促进胰腺癌细胞的迁移侵袭。HPIP在胰腺癌中发挥促癌基因作用。转录组测序发现:TGF-β通路、FOXO通路、Hippo通路与HPIP密切相关。在HPIP相关的蛋白质相互作用网络中,CDKN1B、MYC、CCND2、BCL2L1、TGFBR1、TGFBR2 和 PPP2CA基因是核心节点。
二、Bcl-2和C-fos基因蛋白在胃癌中的表达及临床病理研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Bcl-2和C-fos基因蛋白在胃癌中的表达及临床病理研究（论文提纲范文）
（1）EZH2表达调控对胃癌生长及化疗敏感性的影响（论文提纲范文）
| 英文略缩词 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 EZH2 基因在胃癌组织和胃癌细胞的表达 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 慢病毒介导沉默EZH2 基因稳转细胞株的构建和鉴定 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 EZH2 基因沉默对胃癌生长和化疗敏感性的影响 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部份EZH2 基因对人胃癌细胞生长及耐药性的相关机制探讨 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 问题和展望 |
| 参考文献 |
| 综述 EZH2基因与胃癌相关性研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）DGKI与胃癌预后相关性分析及其调控MAPK/ERK通路促进胃癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 基于TCGA数据库对DGKI基因与胃癌预后的关系研究 |
| 前言 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 数据下载和处理 |
| 1.2 基因富集分析 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 患者的临床特征 |
| 2.2 DGKI基因的表达与生存的关系 |
| 2.3 DGKI基因的表达和临床特征的关系 |
| 2.4 单因素和多因素Cox回归分析 |
| 2.5 GSEA确定与DGKI基因相关的信号通路 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 参考文献 |
| 第2章 DGKI基因与胃癌临床病理特征的关系研究 |
| 前言 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 纳入标准和排除标准 |
| 1.3 主要试剂与仪器 |
| 1.4 方法 |
| 2.统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 免疫组化检测胃癌和癌旁组织中DGKI蛋白的表达 |
| 3.2 实时荧光定量PCR检测胃癌和癌旁组织中 DGKI 的mRNA表达 |
| 3.3 Western blot检测胃癌和癌旁组织中DGKI蛋白的表达 |
| 3.4 DGKI表达与胃癌患者临床病理参数的关系 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 参考文献 |
| 第3章 DGKI基因对胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 前言 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 细胞系和培养基 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要设备 |
| 1.4 细胞复苏 |
| 1.5 细胞传代 |
| 1.6 细胞冻存 |
| 1.7 细胞计数 |
| 1.8 提取胃癌细胞总RNA |
| 1.9 RNA逆转录成c DNA与第二部分相类似 |
| 1.10 实时荧光定量PCR与第二部分相类似 |
| 1.11 慢病毒介导DGKI基因稳定过表达和沉默 |
| 1.12 琼脂糖凝胶电泳 |
| 1.13 平板克隆实验 |
| 1.14 Ed U细胞增殖实验 |
| 1.15 划痕愈合实验 |
| 1.16 流式细胞周期检测 |
| 1.17 细胞总蛋白提取 |
| 1.18 BCA法检测蛋白浓度 |
| 1.19 Western Blot |
| 1.20 Transwell迁移实验 |
| 1.21 Transwell侵袭实验 |
| 2.统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 DGKI蛋白在胃癌细胞中高表达 |
| 3.2 慢病毒介导DGKI基因过表达和沉默的胃癌细胞稳转株的筛选和效率的检测 |
| 3.3 DGKI基因促进体外胃癌细胞增殖 |
| 3.4 DGKI基因促进体外胃癌细胞迁移和侵袭能力 |
| 3.5 DGKI基因对胃癌细胞周期分布的影响 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 参考文献 |
| 第4章 DGKI基因调控MAPK/ERK通路促进胃癌进展的机制研究 |
| 前言 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器见第三章 |
| 1.4 Western Blot见第三章 |
| 1.5 免疫荧光染色 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 DGKI基因调控MAPK/ERK通路促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力 |
| 3.2 过表达DGKI基因增强了wnt/β-catenin通路的激活 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 参考文献 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 MAPK信号通路与胃癌侵袭和转移的研究进展 |
| 参考文献 |
（3）HOXA6与PBX2在胃癌侵袭转移中相互作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 HOXA6促进胃癌细胞的增殖、侵袭和转移 |
| 1.1. 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 HOXA6-PBX2相互作用,促进胃癌的侵袭和转移 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 中英文缩写 |
| 学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（4）DADS下调DJ-1对人胃癌SGC7901细胞EMT、侵袭和抗药性的影响及其作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩略语索引 |
| 第一部分 DJ-1、PTEN、p-Akt在胃癌中的表达及临床病理意义 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病例资料 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 免疫组化染色 |
| 2.2.2 结果判定 |
| 2.2.3 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 DJ-1 蛋白在胃癌中的表达及临床病理意义 |
| 3.1.1 DJ-1 蛋白在胃正常组织、癌旁组织与胃癌中的表达 |
| 3.1.2 DJ-1 表达与胃癌临床病理指标的关系 |
| 3.1.3 DJ-1 表达与胃癌预后的关系 |
| 3.2 PTEN蛋白在胃癌中的表达及临床病理意义 |
| 3.2.1 PTEN在在胃正常组织、癌旁组织与胃癌中的表达 |
| 3.2.2 PTEN表达与临床胃癌病理指标的关系 |
| 3.2.3 PTEN表达与胃癌预后的关系 |
| 3.3 p-Akt蛋白在胃癌中的表达及临床病理意义 |
| 3.3.1 p-Akt在胃正常组织、癌旁组织与胃癌中的表达 |
| 3.3.2 p-Akt表达与胃癌临床病理指标的关系 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 DADS下调DJ-1 负调控PTEN/Akt通路抑制人胃癌SGC-7901 细胞EMT与侵袭 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 实验质粒、载体、细胞株、菌株及慢病毒系统 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 关键试剂的配置 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养与传代 |
| 2.2.2 DJ-1 过表达慢病毒载体构建及病毒包装 |
| 2.2.3 慢病毒转染SGC-7901 细胞以及稳定转染细胞株的筛选 |
| 2.2.4 q RT-PCR(荧光定量PCR) |
| 2.2.5 Western blot检测 |
| 2.2.6 CCK8 增殖实验 |
| 2.2.7 划痕愈合实验 |
| 2.2.8 Transwell侵袭实验 |
| 2.2.9 细胞免疫荧光 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 DADS对各胃癌细胞系DJ-1 表达的影响 |
| 3.2 慢病毒载体构建及病毒包装 |
| 3.3 DJ-1 高表达稳定细胞系的构建 |
| 3.4 qPCR检测DADS处理和转染细胞DJ-1 的表达水平 |
| 3.5 DJ-1与DADS对人胃癌SGC7901 细胞增殖能力的影响 |
| 3.6 DJ-1与DADS对人胃癌SGC7901 细胞迁移能力的影响 |
| 3.7 DJ-1与DADS对人胃癌SGC7901 细胞侵袭能力的影响 |
| 3.8 DADS与 DJ-1 高表达对人胃癌细胞DJ-1/PTEN/AKt信号通路的影响 |
| 3.8.1 DADS与 DJ-1 高表达对SGC7901 细胞PTENm RNA表达的影响 |
| 3.8.2 DADS 与DJ-1高表达对SGC7901细胞PTEN/AKt信号通路蛋白表达的影响 |
| 3.9 DADS与 DJ-1 高表达对人胃癌SGC7901 细胞EMT相关分子的影响 |
| 3.9.1 DADS与 DJ-1 高表达对SGC7901 细胞EMT相关分子m RNA的影响 |
| 3.9.2 DADS与 DJ-1 高表达对SGC7901 细胞EMT相关分子蛋白表达的影响 |
| 3.10 细胞免疫荧光检测DJ-1、PTEN及 EMT相关蛋白的定位与表达 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 DADS下调DJ-1 抑制人胃癌SGC7901 细胞对5-Fu的抗药性 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 常用试剂的配置 |
| 2.1.4 主要仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养与传代 |
| 2.2.2 qRT‐PCR(荧光定量 PCR) |
| 2.2.3 Western Blot检测 |
| 2.2.4 MTT法检测细胞增殖能力 |
| 2.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.2.6 细胞免疫荧光实验 |
| 2.2.7 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 DADS与 DJ-1 高表达对各种SGC7901 细胞增殖的影响 |
| 3.2 DADS与 DJ-1 高表达对人胃癌细胞SGC7901 凋亡的影响 |
| 3.3 DADS与 DJ-1 高表达对各组细胞凋亡相关分子表达的影响 |
| 3.3.1 DADS 与 DJ‐1 高表达对各组细胞 Bcl‐2 表达的影响 |
| 3.3.2 DADS 与 DJ‐1 高表达对各组细胞 XIAP 表达的影响 |
| 3.3.3 DADS 与 DJ‐1 高表达对各组细胞 Caspase‐3 表达的影响 |
| 3.4 DADS与 DJ-1 高表达对人胃癌细胞抗药性的影响 |
| 3.5 免疫荧光检测P-gp、Bcl-2、XIAP及 Caspase-3 定位与表达 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 小结 |
| 参考文献 |
| 全部结论 |
| 综述 Role of DJ-1 in cancer: Recent advance |
| References |
| 攻读博士期间的主要科研成果 |
| 致谢 |
（5）MicroRNA-155介导Rictor/Fos基因促进胃癌细胞对顺铂耐药的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 前言 |
| 第一章 胃癌组织中microRNA-155 表达水平及意义 |
| 1.1 研究内容 |
| 1.1.1 研究目的 |
| 1.1.2 材料方法 |
| 1.2 统计分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 MicroRNA-155 生信分析结果 |
| 1.3.2 临床样本及相关病例信息 |
| 1.3.3 qRT-PCR检测microRNA-155 等基因表达水平 |
| 1.3.4 Western blot和免疫组化实验检测蛋白表达水平 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第二章 MicroRNA-155 对胃癌细胞顺铂耐药性的影响及其机制 |
| 引言 |
| 2.1 研究内容 |
| 2.1.1 研究目的 |
| 2.1.2 材料方法 |
| 2.2 统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 用大剂量冲击法成功诱导胃癌细胞耐药 |
| 2.3.2 耐药细胞的形态发生变化 |
| 2.3.3 将病毒原液按照1:5稀释后转染细胞效果稳定 |
| 2.3.4 各株细胞IC50和耐药指数 |
| 2.3.5 耐药细胞中耐药相关蛋白表达水平增高 |
| 2.3.6 耐药细胞增殖减慢 |
| 2.3.7 耐药胃癌细胞相同条件下形成细胞克隆的数目少 |
| 2.3.8 耐药胃癌细胞侵袭能力增强 |
| 2.3.9 耐药胃癌细胞的细胞周期被阻滞在G1期 |
| 2.3.10 耐药胃癌细胞的细胞骨架发生显着改变 |
| 2.3.11 细胞内自噬检测结果 |
| 2.3.12 细胞凋亡检测结果 |
| 2.3.13 Rictor、Fos敲除或过表达对自噬和凋亡的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 动物实验 |
| 引言 |
| 3.1 研究内容 |
| 3.1.1 研究目的 |
| 3.1.2 材料方法 |
| 3.2 统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 NOD-SCID小鼠成瘤实验 |
| 3.3.2 成瘤率和瘤体生长曲线 |
| 3.3.3 免疫组化实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 Effects of MicroRNA-155 and Autophagy on Gastric Cancer |
| References |
| 在学期间研究成果 |
| 致谢 |
| 附录 |
（6）MiR-4295和lncRNA HOTAIR在胃癌中的表达及其功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词简表 |
| 前言 |
| 第一部分 miR-4295 通过PTEN/PI3K/AKT通路调控胃癌生长和侵袭迁移的研究 |
| 第1章 miR-4295在胃癌细胞系和组织中的表达 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 材料 |
| 1.2.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 细胞总RNA的提取、质量和完整性鉴定 |
| 1.3.2 胃癌细胞中miR-4295表达水平检测 |
| 1.3.3 胃癌组织中miR-4295表达水平检测 |
| 1.3.4 miR-4295与胃癌临床病理特征相关性 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 miR-4295对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 miR-4295阳性克隆的测序结果 |
| 2.3.2 qRT-PCR检测转染胃癌细胞中miR-4295的表达水平 |
| 2.3.3 miR-4295表达水平改变对胃癌细胞增殖活力、生长能力的影响 |
| 2.3.4 划痕及Transwell实验检测miR-4295 及其inhibitor对胃癌细胞迁移的影响 |
| 2.3.5 Transwell实验检测miR-4295 及其inhibitor对胃癌细胞侵袭的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 miR-4295的潜在靶基因筛选 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 miR-4295潜在靶基因的功能通路和蛋白分子互作(PPI)网络关系 |
| 3.3.2 通过TCGA数据库GEPIA分析miR-4295 靶向hubgene在胃癌中的相关性分析 |
| 3.3.3 通过TCGA数据库GEPIA分析miR-4295 靶向hubgene与胃癌患者的生存分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 miR-4295促进胃癌细胞增殖和侵袭转移的分子机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 双荧光素酶报告系统验证miR-4295 分别与PTEN及BCL2L11基因的靶向调控关系 |
| 4.3.2 q RT-PCR检测靶基因m RNA及其下游基因m RNA表达水平的影响 |
| 4.3.3 miR-4295对PTEN蛋白及其下游蛋白表达水平的影响 |
| 4.3.4 miR-4295 联合AKT抑制剂对胃癌细胞增殖的影响 |
| 4.3.5 miR-4295 联合AKT抑制剂对胃癌细胞凋亡的影响 |
| 4.3.6 miR-4295 联合AKT抑制剂对胃癌细胞迁移的影响 |
| 4.3.7 miR-4295 联合AKT抑制剂对胃癌细胞侵袭的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第二部分 lncRNA HOTAIR在胃癌中的表达及其功能研究 |
| 第1章 lncRNA HOTAIR在胃癌细胞系和组织中的表达 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 材料 |
| 1.2.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 细胞总RNA提取、质量及完整性鉴定 |
| 1.3.2 胃癌细胞中HOTAIR表达水平检测 |
| 1.3.3 HOTAIR在 TCGA数据库胃癌组织中表达情况 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 lncRNA HOTAIR对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 qRT-PCR检测转染胃癌细胞中HOTAIR的表达水平 |
| 2.3.2 下调HOTAIR对胃癌细胞增殖活力、生长能力的影响 |
| 2.3.3 划痕及Transwell实验检测HOTAIR对胃癌细胞迁移的影响 |
| 2.3.4 Transwell实验检测HOTAIR对胃癌细胞侵袭的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 miR-4295与lncRNA HOTAIR相关性分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 双荧光素酶报告系统验证miR-4295与HOTAIR的结合情况 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间主要的研究成果 |
| 基金资助 |
| 致谢 |
（7）Ezrin蛋白和c-fos蛋白在皮肤鳞癌中的表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Ezrin蛋白和c-fos蛋白在皮肤恶性肿瘤的表达 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）长链非编码RNA CASC19在胃癌中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 胃癌流行病学 |
| 1.2 胃癌治疗现状 |
| 1.3 LncRNA的分类与功能 |
| 1.4 LncRNA在胃癌发病中的作用 |
| 1.5 本课题的研究目的和意义 |
| 第二章 生物信息学鉴定CASC19与胃癌进展和预后相关 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 数据的来源与获取 |
| 2.1.2 差异lncRNA筛选过程 |
| 2.1.3 加权基因共表达网络构建过程 |
| 2.1.4 临床重要模块与核心lncRNA的鉴别 |
| 2.1.5 核心lncRNA与 GC临床性状之间的联系 |
| 2.1.6 核心lncRNA的预后分析 |
| 2.1.7 核心lncRNA的 GSEA分析 |
| 2.1.8 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 患者的基线资料 |
| 2.2.2 差异lncRNA筛选结果 |
| 2.2.3 加权基因共表达网络构建结果 |
| 2.2.4 临床重要模块与核心lncRNA的鉴别 |
| 2.2.5 CASC19与GC临床性状之间的联系 |
| 2.2.6 CASC19 过表达GC患者预后差 |
| 2.2.7 CASC19相关的信号通路 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 CASC19在人胃癌组织中的表达及临床意义 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 临床样本收集 |
| 3.1.2 纳入与排除标准 |
| 3.1.2.1 纳入标准 |
| 3.1.2.2 排除标准 |
| 3.1.3 临床病理参数 |
| 3.1.4 组织总RNA提取及质检 |
| 3.1.4.1 组织总RNA提取 |
| 3.1.4.2 组织总RNA质检 |
| 3.1.5 qRT-PCR实验 |
| 3.1.5.1 反转录合成cDNA |
| 3.1.5.2 qRT-PCR检测 |
| 3.1.5.3 qRT-PCR引物 |
| 3.1.6 HE染色 |
| 3.1.6.1 石蜡包埋 |
| 3.1.6.2 切片 |
| 3.1.6.3 HE染色步骤 |
| 3.1.7 IHC实验 |
| 3.1.7.1 石蜡包埋 |
| 3.1.7.2 切片 |
| 3.1.7.3 IHC步骤 |
| 3.1.8 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 患者临床病理资料 |
| 3.2.2 CASC19在GC组织和癌旁组织中的表达 |
| 3.2.3 CASC19 表达与GC患者临床病理参数之间的关系 |
| 3.2.4 CASC19 表达与NPM1 表达之间的关系 |
| 3.2.5 CASC19在GC诊断中的意义 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 CASC19对胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞培养 |
| 4.1.1.1 细胞复苏 |
| 4.1.1.2 细胞传代 |
| 4.1.1.3 细胞冻存 |
| 4.1.2 慢病毒制备 |
| 4.1.2.1 CASC19 shRNA慢病毒制备 |
| 4.1.2.2 CASC19过表达慢病毒制备 |
| 4.1.3 慢病毒感染细胞 |
| 4.1.4 细胞总RNA提取及质检 |
| 4.1.4.1 细胞总RNA提取 |
| 4.1.4.2 细胞总RNA质检 |
| 4.1.5 qRT-PCR实验 |
| 4.1.5.1 反转录合成cDNA |
| 4.1.5.2 qRT-PCR检测 |
| 4.1.5.3 qRT-PCR引物 |
| 4.1.6 cDNA末端快速扩增实验 |
| 4.1.6.1 CASC19 PCR扩增及回收 |
| 4.1.6.2 3 ’RACE获取CASC19的3’全长 |
| 4.1.6.3 5 ’RACE获取CASC19的5’全长 |
| 4.1.7 CCK-8细胞增殖实验 |
| 4.1.8 细胞克隆形成实验 |
| 4.1.9 EdU细胞增殖实验 |
| 4.1.10 细胞划痕实验 |
| 4.1.11 Transwell迁移实验 |
| 4.1.12 Transwell侵袭实验 |
| 4.1.13 流式凋亡实验 |
| 4.1.14 蛋白质免疫印迹实验 |
| 4.1.14.1 细胞总蛋白提取 |
| 4.1.14.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 4.1.14.3 电泳 |
| 4.1.14.4 电转 |
| 4.1.14.5 显色 |
| 4.1.15 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 CASC19在GC细胞系中的表达水平 |
| 4.2.2 RACE获得CASC19在GC细胞中的全长 |
| 4.2.3 CASC19的非编码分析 |
| 4.2.4 CASC19慢病毒敲减和过表达效率检测 |
| 4.2.5 CCK-8 实验检测CASC19对GC细胞增殖的影响 |
| 4.2.6 克隆形成实验检测CASC19对GC细胞增殖的影响 |
| 4.2.7 EdU实验检测CASC19对GC细胞增殖的影响 |
| 4.2.8 划痕实验检测CASC19对GC细胞迁移的影响 |
| 4.2.9 Transwell迁移实验检测CASC19对GC细胞迁移的影响 |
| 4.2.10 Transwell侵袭实验检测CASC19对GC细胞侵袭的影响 |
| 4.2.11 流式细胞实验检测CASC19对GC细胞凋亡的影响 |
| 4.2.12 WB实验检测CASC19对GC细胞凋亡的影响 |
| 4.2.13 WB实验检测CASC19对GC细胞EMT的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 CASC19表达对胃癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞培养 |
| 5.1.2 CASC19 shRNA慢病毒制备 |
| 5.1.3 慢病毒感染细胞 |
| 5.1.4 实验动物 |
| 5.1.5 实验分组 |
| 5.1.6 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 5.1.7 裸鼠活体成像实验 |
| 5.1.8 组织总RNA提取及质检 |
| 5.1.8.1 组织总RNA提取 |
| 5.1.8.2 组织总RNA质检 |
| 5.1.9 qRT-PCR实验 |
| 5.1.9.1 反转录合成cDNA |
| 5.1.9.2 qRT-PCR检测 |
| 5.1.9.3 qRT-PCR引物 |
| 5.1.10 移植瘤HE染色 |
| 5.1.11 移植瘤IHC实验 |
| 5.1.12 移植瘤WB实验 |
| 5.1.12.1 组织总蛋白提取 |
| 5.1.12.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 5.1.12.3 电泳 |
| 5.1.12.4 电转 |
| 5.1.12.5 显色 |
| 5.1.13 统计学方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 CASC19 在稳转MKN-45 细胞株中的表达水平 |
| 5.2.2 CASC19下调可抑制裸鼠皮下移植瘤的生长 |
| 5.2.3 CASC19 下调对移植瘤HE染色的镜下改变 |
| 5.2.4 CASC19 下调对移植瘤中Ki-67 蛋白表达的影响 |
| 5.2.5 CASC19 下调对移植瘤中PCNA蛋白表达的影响 |
| 5.2.6 CASC19 下调对移植瘤中HDAC1 表达的影响 |
| 5.2.7 CASC19 下调对移植瘤中NPM1 表达的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 基于芯片技术鉴定CASC19调控的下游靶基因及信号通路 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验设计及样本的制备 |
| 6.1.1.1 细胞培养与感染 |
| 6.1.1.2 细胞总RNA提取 |
| 6.1.1.3 细胞总RNA质检 |
| 6.1.2 芯片的制备 |
| 6.1.3 芯片实验 |
| 6.1.3.1 反转录合成cDNA |
| 6.1.3.2 体外转录合成标记cRNA |
| 6.1.4 芯片的杂交 |
| 6.1.5 芯片的洗染和扫描 |
| 6.1.6 差异分析 |
| 6.1.7 IPA分析 |
| 6.1.8 qRT-PCR验证芯片结果 |
| 6.1.9 统计学分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 芯片数据的质量评估 |
| 6.2.2 差异分析结果 |
| 6.2.3 IPA分析结果 |
| 6.2.3.1 IPA的经典通路分析结果 |
| 6.2.3.2 IPA的上游调控分析结果 |
| 6.2.3.3 IPA的疾病和功能分析结果 |
| 6.2.3.4 IPA的调控效应分析结果 |
| 6.2.3.5 IPA的相互作用网络分析结果 |
| 6.2.4 qRT-PCR验证结果 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 CASC19 通过募集HDAC1 来抑制NPM1 表达的机制研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 细胞培养 |
| 7.1.1.1 细胞复苏 |
| 7.1.1.2 细胞传代 |
| 7.1.1.3 细胞冻存 |
| 7.1.2 慢病毒制备 |
| 7.1.2.1 CASC19 shRNA慢病毒制备 |
| 7.1.2.2 HDAC1 shRNA慢病毒制备 |
| 7.1.2.3 MYC shRNA慢病毒制备 |
| 7.1.2.4 CASC19过表达慢病毒制备 |
| 7.1.2.5 HDAC1过表达慢病毒制备 |
| 7.1.2.6 MYC过表达慢病毒制备 |
| 7.1.3 慢病毒感染细胞 |
| 7.1.4 细胞总RNA提取及质检 |
| 7.1.4.1 细胞总RNA提取 |
| 7.1.4.2 细胞总RNA质检 |
| 7.1.5 qRT-PCR 实验 |
| 7.1.5.1 反转录合成cDNA |
| 7.1.5.2 qRT-PCR检测 |
| 7.1.5.3 qRT-PCR引物 |
| 7.1.6 核质分离实验 |
| 7.1.6.1 分离细胞核和细胞质 |
| 7.1.6.2 RNA抽提及反转录 |
| 7.1.6.3 qRT-PCR检测 |
| 7.1.7 WB 实验 |
| 7.1.7.1 细胞总蛋白提取 |
| 7.1.7.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 7.1.7.3 电泳 |
| 7.1.7.4 电转 |
| 7.1.7.5 显色 |
| 7.1.8 RNA pull-down 实验 |
| 7.1.8.1 准备细胞裂解物 |
| 7.1.8.2 制备生物素标记的RNA |
| 7.1.8.3 标记RNA探针 |
| 7.1.8.4 进行 RNA pull-down 实验 |
| 7.1.8.5 蛋白质谱鉴定 |
| 7.1.9 RNA 纯化染色质分离实验 |
| 7.1.9.1 准备细胞裂解物 |
| 7.1.9.2 超声处理 |
| 7.1.9.3 进行 Ch IRP 实验 |
| 7.1.9.4 DNA分离鉴定 |
| 7.1.9.5 蛋白质分离鉴定 |
| 7.1.10 RNA 结合蛋白免疫沉淀实验 |
| 7.1.10.1 准备细胞裂解物 |
| 7.1.10.2 准备磁珠 |
| 7.1.10.3 RNA结合蛋白免疫沉淀 |
| 7.1.10.4 RNA纯化 |
| 7.1.10.5 qRT-PCR检测 |
| 7.1.11 染色质免疫共沉淀实验 |
| 7.1.11.1 细胞交联 |
| 7.1.11.2 染色质片段化 |
| 7.1.11.3 DNA纯化 |
| 7.1.11.4 免疫沉淀 |
| 7.1.11.5 解交联 |
| 7.1.11.6 qPCR或者测序 |
| 7.1.12 双荧光素酶报告基因实验 |
| 7.1.13 统计学分析 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 CASC19的亚细胞定位 |
| 7.2.2 RNA pull-down实验检测与CASC19 相互作用的蛋白质 |
| 7.2.3 ChIRP实验检测与CASC19 相互作用的蛋白质和基因 |
| 7.2.4 CatRAPID验证CASC19与HDAC1 蛋白相互作用 |
| 7.2.5 WB检测RNA pull-down富集蛋白中HDAC1 的表达 |
| 7.2.6 RIP实验证明CASC19 可以结合HDAC1 蛋白 |
| 7.2.7 HDAC1 的表达不受CASC19 的调控 |
| 7.2.8 ChIP-seq实验检测与HDAC1 相互作用的基因 |
| 7.2.9 CASC19 下调抑制HDAC1与NPM1 启动子的结合 |
| 7.2.10 NPM1 的表达受HDAC1 的调控 |
| 7.2.11 CASC19 通过募集HDAC1 抑制NPM1 的表达 |
| 7.2.12 CASC19上游的调控转录因子预测 |
| 7.2.13 CASC19 的表达受MYC的调控 |
| 7.3 讨论 |
| 第八章 全文结论 |
| 8.1 主要结论 |
| 8.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 综述 染色体8q24.21 区域的lncRNA在癌症中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（9）miRNA-7-5p靶向调控RAF1/MEK/ERK信号转导通路影响胃癌细胞SGC-7901增殖及迁移的研究（论文提纲范文）
| 中文论着摘要 |
| 英文论着摘要 |
| 英文缩略语表 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 microRNA 通过调节 MAPK/ERK 信号转导通路在胃癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（10）HPIP对胰腺癌恶性生物学行为的调控作用及相关机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 HPIP蛋白表达水平与胰腺癌患者临床病理特征及预后的关系 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 HPIP基因对胰腺癌细胞恶性生物学行为的影响及机制研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 应用转录组测序方法初探HPIP下游分子机制 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间科研成果 |
| 综述 Hedgehog信号通路与胰腺癌研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、Bcl-2和C-fos基因蛋白在胃癌中的表达及临床病理研究（论文参考文献）
- [1]EZH2表达调控对胃癌生长及化疗敏感性的影响[D]. 杨宝玉. 福建医科大学, 2021(02)
- [2]DGKI与胃癌预后相关性分析及其调控MAPK/ERK通路促进胃癌进展的机制研究[D]. 黄超. 南昌大学, 2021(01)
- [3]HOXA6与PBX2在胃癌侵袭转移中相互作用的研究[D]. 林建姣. 南方医科大学, 2021
- [4]DADS下调DJ-1对人胃癌SGC7901细胞EMT、侵袭和抗药性的影响及其作用机制[D]. 夏红. 南华大学, 2020
- [5]MicroRNA-155介导Rictor/Fos基因促进胃癌细胞对顺铂耐药的机制研究[D]. 陈刚. 兰州大学, 2020(04)
- [6]MiR-4295和lncRNA HOTAIR在胃癌中的表达及其功能研究[D]. 杨晓燕. 南华大学, 2020
- [7]Ezrin蛋白和c-fos蛋白在皮肤鳞癌中的表达[D]. 李乾赫. 大连医科大学, 2020(03)
- [8]长链非编码RNA CASC19在胃癌中的作用和机制研究[D]. 汪文杰. 兰州大学, 2020(01)
- [9]miRNA-7-5p靶向调控RAF1/MEK/ERK信号转导通路影响胃癌细胞SGC-7901增殖及迁移的研究[D]. 谷泽慧. 锦州医科大学, 2020(05)
- [10]HPIP对胰腺癌恶性生物学行为的调控作用及相关机制研究[D]. 赵一鸣. 北京协和医学院, 2019(02)