一、乙型肝炎病毒新型免疫原性多肽的设计、合成及免疫原性研究（论文文献综述）
丛佳南[1]（2021）在《SARS-CoV-2重组痘苗病毒载体疫苗的构建、筛选和免疫原性研究》文中进行了进一步梳理新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019,COVID-19）是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）引起的严重急性呼吸综合征。SARS-CoV-2属于冠状病毒科冠状病毒属中的β类型冠状病毒,是一种有包膜的单股正链RNA病毒。SARS-CoV-2主要有4个结构蛋白（棘突糖蛋白S、囊膜蛋白E、膜蛋白M、衣壳蛋白N）和16个非结构蛋白（nsp1-nsp16）。其中结构蛋白S是最主要的,包含S1和S2两个亚基,S1亚基内部包含受体结构域RBD（receptor binding domain）,可以与SARS-CoV-2入胞的重要受体血管紧张素转化酶2（ACE2）发生特异性结合,引起病毒感染。由于痘苗病毒基因组大、易于操作等生物学特点常被用作病毒载体。但痘苗病毒也存在一定的缺陷含有的毒副作用成为研究过程的中的阻碍,所以构建基因缺失型的痘苗病毒越来越广泛。本研究以我国自主研制的天坛株痘苗病毒为载体,为达到减弱病毒毒力和缩小病毒宿主范围的目的,实验采用Cre/loxp系统敲除天坛株痘苗病毒上的E3L基因并且与SARS-CoV-2 RBDEPI基因同源重组,构建表达SARS-CoV-2 RBDEPI的重组痘苗病毒rVTTΔE3L-RBDEPI。首先通过CCK-8增殖抑制的检测、结晶紫染色、一步生长曲线检测基因缺失型痘苗病毒的扩散能力和复制能力,经鼻腔接种感染BALB/c小鼠观察缺失型痘苗病毒对小鼠体重的影响,分析其毒力水平。其次经肌肉注射BALB/c小鼠的两后肢股四头肌位置处,同时以相同剂量注射野毒VTT和PBS作为对照,初次免疫后间隔21天进行加强免疫,免疫后的每周对小鼠进行尾静脉采血并分离血清,使用Elisa检测试剂盒检测特异性抗体水平,加强免疫后2周取小鼠脾脏分离脾淋巴细胞,利用ELISPOT检测试剂盒检测IL-4和IFN-γ的表达水平来分析重组痘苗病毒的免疫原性;并于加强免疫后第1天、第7天、第14天取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉等器官进行病毒残留的检测,分析重组痘苗病毒的安全性。经研究发现,成功构建了基因缺失型的SARS-CoV-2重组痘苗病毒载体疫苗,且病毒毒力明显低于野毒VTT,连续传代40代检测没有野毒存在,证明遗传稳定性良好。免疫小鼠后可引起机体发生明显的免疫反应,其免疫原性良好,器官的病毒残留检测发现没有明显的病毒残留,证明构建的SARS-CoV-2重组痘苗病毒载体疫苗的安全性较好。
伍春平[2]（2021）在《A型塞内卡病毒结构蛋白B细胞抗原表位的鉴定》文中研究指明A型塞内卡病毒（Senecavirua A,SVA）属于小RNA病毒科、塞内卡病毒属,能引起各日龄的猪群出现类似口蹄疫等水泡性疾病样临床症状,并造成新生仔猪急性死亡,严重危害我国养猪业的发展。由于塞内卡病毒病是一种新发的传染病,以往的研究主要集中在其生物学特性上,而关于SVA疫苗、侵入机制和免疫机理等方面的研究甚少。VP1、VP2和VP3是SVA表面的结构蛋白,其既包含介导病毒入侵宿主细胞的受体结合域,也包含激发机体免疫应答产生中和抗体的抗原表位。因此,本研究对SVA这3个结构蛋白的B细胞抗原表位进行了筛选与鉴定,为SVA的病原学、诊断方法、抗原结构和新型表位疫苗的研究奠定了基础。本实验室前期利用分离获得的SVA田间流行毒株CH-FJ-2017制备了SVA灭活疫苗,并以此免疫猪群,获得免疫血清SOW6-1、PC6-2和PC4-3。本研究首先对3个免疫血清的生物学特性进行了分析鉴定。间接ELISA试验结果表明这些免疫血清与SVA的结构蛋白均具有良好的亲和性,Western Blotting（WB）和间接免疫荧光试验（Indirect Immunofluorescence Assay,IFA）结果表明这些血清与SVA及其结构蛋白均具有良好的免疫反应性,病毒中和试验（Virus Neutralization Test,VNT）结果表明这些血清对SVA流行毒株的中和效价大于1024。然后结合生物信息学预测法和交叠多肽生物合成法,并利用免疫血清对SVA 3种结构蛋白的B细胞抗原表位进行了筛选与鉴定。通过Protparam和PSIPRED在线软件对这3种结构蛋白的理化特性和二级结构进行分析。利用Bcepred、ABCpred、Bepipred、IEDB、SVMpred、Ellipro和SEPPA2.0等7种生物信息预测软件,对各结构蛋白的B细胞抗原表位进行综合分析。合成预测的抗原表位,并通过ELISA试验进行验证。最终在VP1、VP2和VP3蛋白上分别鉴定出3、6和3个B细胞抗原表位。为进一步提高鉴定的准确性,基于这3种结构蛋白的氨基酸序列,构建96个带GST188标签的交叠16肽,相邻交叠多肽之间重叠8个氨基酸残基,并将这些肽段克隆至pXXGST-1原核表达载体,进行大肠杆菌表达。通过WB试验分析这些交叠多肽与血清的免疫反应性,最终在VP1、VP2和VP3蛋白上分别鉴定出7、13和5个阳性片段。最后对筛选的B细胞抗原表位进行了免疫原性分析。根据以上两种方法的筛选结果,选择并合成两种方法鉴定一致性较好的抗原表位,将这些抗原表位分别与钥孔血蓝蛋白（KLH）偶联,并通过豚鼠免疫试验制备血清。这些免疫血清与SVA结构蛋白具有良好的免疫反应性和较高的亲和力,且能特异性识别IBRS-2细胞中感染的SVA。综上所述,本研究鉴定出SVA VP1蛋白2个线性B细胞抗原表位VP1-1（6-21 aa）和VP1-2（221-233 aa）,VP2蛋白4个线性B细胞表位VP2-1（5-16 aa）、VP2-2（35-57 aa）、VP2-3（175-187aa）和VP2-4（267-282 aa）,VP3蛋白1个线性B细胞抗原表位VP3-1（135-153 aa）,并且这些表位都具有能激发机体免疫应答的能力,为进一步研究VP1、VP2和VP3蛋白的功能、诊断方法和新型SVA表位疫苗的研究奠定了基础。
卢婷[3]（2020）在《基于聚乳酸微球佐剂的乙肝疫苗研究》文中进行了进一步梳理慢性乙肝的治愈之路充满挑战。与传统的抗病毒疗法相比,疫苗疗法是慢性乙肝预防和治疗的重要潜力途径。但是如何使疫苗获得有效的细胞免疫效果满足治疗性需求,具有更好的保护效果,是当前面临的重要挑战。本课题提出生物相容性好的聚乳酸（PLA）微球合理装载抗原和免疫刺激剂,实现按需递送的功能,作为治疗性乙肝疫苗,同时以PLA微球为佐剂探索免疫针次减少的疫苗制剂。课题具体研究内容如下:1)针对免疫刺激剂5,6-二甲基黄酮-4-乙酸（DMXAA）在特定细胞位置发挥作用的需求,成功制备了按需释放抗原的DP微球及抗原/刺激剂的DP-D微球,并验证了其在细胞水平的效果。通过向PLA微球中引入阳离子脂双十八烷基二甲基溴化铵（DDAB）,微球可以温和高效携载乙肝表面抗原（HBsAg,吸附率85%以上）;并且借助质子海绵效应,促进溶酶体逃逸,使DMXAA释放到胞质中,与其受体结合,激活下游通路。在分子水平上,DP-D与抗原组相比,其STING通路的IRF-7和IFN-β表达分别提高了 12和8.2倍。同时微球携载HBsAg后易于被树突状细胞（DCs）摄取及引起溶酶体逃逸,提高DCs表面共刺激分子及MHC分子的表达,促进细胞因子分泌,在高效促进DCs活化的同时诱导后续免疫应答。2)评价了 PLA微球佐剂在健康鼠上的体液和细胞免疫效果,探索了其应用于疫苗时的作用机制。微球疫苗制剂诱导了注射部位IL-1β和CXCL-10等炎症因子和趋化因子的表达,同时招募DCs及巨噬等免疫细胞到注射部位,经APCs转运至淋巴结后,促进了淋巴结内DCs、B及滤泡辅助T细胞（Tfh细胞）的活化。在免疫健康鼠后,诱导产生了高水平的HBsAg特异性抗体IgG,提高IgG2a/IgG1比例、Th1细胞数量及IFN-γ等细胞因子的分泌,实现了体液和细胞免疫的双重提升。3)成功构建了慢性乙肝（CHB）模型鼠,并基于该评价模型开展了微球疫苗制剂的免疫及治疗评价。采用尾静脉注射重组乙肝腺病毒的方式构建CHB模型鼠。结果表明,DP、DP-D组诱导产生高水平的HBsAg特异性抗体IgG,可促进脾细胞增殖活化与Th1型细胞因子的分泌,提升了 HBsAg特异性CTL反应,产生免疫记忆起到保护效果。两组模型鼠血清中HBsAg转阴率均达到50%,显着降低了肝脏中HBcAg的表达,取得了良好的治疗效果。4)验证了以PLA微球为佐剂,用两针代替三针铝佐剂疫苗的长效免疫保护效果。微球疫苗制剂两针免疫后产生与铝佐剂相当的抗体水平,且抗体半年内维持较高水平,在HBsAg再次入侵时可快速产生抗体。优化了该疫苗制剂的冻干保护剂种类及相应浓度,考察了冻干制剂在室温下的稳定性。总体结果明确了微球疫苗佐剂具有减少免疫针次及可冻干的特性,具备临床转化的潜力。综上,本课题设计的PLA微球疫苗制剂应用于乙肝疫苗有较大潜力。
钱雯[4]（2020）在《乙肝表面蛋白偶联的新型肺炎多糖结合疫苗小鼠综合免疫效果研究》文中研究说明肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）引起的细菌性肺炎是一种危害人类健康的全球性传染病。肺炎链球菌以侵入性或非侵入性感染引起全人群,尤其在儿童和老年人中的肺炎、脑膜炎、鼻窦炎、中耳炎和菌血症等多种疾病。肺炎多糖蛋白结合疫苗在对肺炎链球菌引起的感染和疾病的预防和控制中取得了巨大的成功。由于其优于单纯多糖的抗体增强效应,以及可以产生免疫记忆和群体保护的优势,已成为肺炎疫苗的主要开发和应用方向。多糖与有效载体蛋白的结合是研制高效肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的关键。目前已开发上市的肺炎多糖结合疫苗所用的载体局限在破伤风类毒素（TT）、白喉类毒素（PT）、白喉毒素突变体（CRM197）,不可分型流感嗜血杆菌蛋白（PD）少数的几种。这些载体蛋白也被用于其它多种结合疫苗中。重复接种含相同载体蛋白抗原的疫苗会导致免疫抑制效应（CIES）的产生,而使得机体对多糖的免疫反应减弱。另一方面,用作载体的蛋白经过脱毒、结合等化学过程可能改变载体蛋白原有抗原表位从而影响其免疫原性,还没有结合疫苗的产品说明书将其载体部分的免疫效果明确列入说明书中。因此,迫切需要开发安全、有效的新载体蛋白偶联疫苗来控制这种免疫抑制风险,并诱导产生针对多糖和蛋白载体的有效免疫应答,实现一针双效的目标,这对多糖蛋白结合疫苗尤其是肺炎多糖蛋白结合疫苗的开发十分必要和重要。本研究利用一种病原相关蛋白乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）作为新的载体蛋白偶联新型肺炎球菌多糖结合疫苗及其对应的蛋白抗原和多糖抗原分别免疫小鼠后,比较研究免疫后不同时间点诱导产生的荚膜多糖和乙肝表面抗原蛋白的特异性抗体水平、细胞免疫应答和早期基因表达谱的情况。对这种新载体的肺炎结合疫苗的综合免疫效果研究结果表明,这种以乙肝表面蛋白（HBs）为载体偶联33F型肺炎荚膜多糖（PN33Fps）的新型肺炎结合疫苗能刺激免疫小鼠产生分别针对两种抗原的特异性体液免疫反应和细胞免疫反应。与两种单抗原免疫的小鼠相比,这种新的结合疫苗可同时产生更强的针对多糖（PN33Fps）和蛋白（HBs）的体液免疫和细胞免疫,达到一针双效的免疫效果,且随免疫针次的增加而增强。然而,同等剂量的多糖免疫组即使加强免疫也不能产生抗体阳转。此外,采集免疫后小鼠脾脏组织,分析疫苗免疫早期基因表达谱的差异特征发现:这种以乙肝表面蛋白为载体的新型肺炎结合疫苗诱导了更多的免疫相关基因的表达,并呈现出与单抗原不同的变化规律,特别是在免疫细胞的分化和发育中呈现出与单抗原不同的变化规律。这种差异变化规律可能是不同抗原刺激后的先天和适应性免疫细胞中某些免疫信号分子的特征性表达,与多糖和蛋白结合后更强抗体水平的产生以及细胞免疫反应有关。此外,通过细胞融合技术从这种乙肝表面蛋白偶联的新型肺炎多糖结合疫苗免疫的小鼠脾淋巴细胞中,分离到了分别针对肺炎33F型多糖抗原和乙肝表面蛋白抗原的特异性B淋巴细胞的单克隆抗体细胞株。对分离的特异性B淋巴细胞单克隆细胞株进行抗体分泌能力和特性的鉴定显示出所筛选的细胞株具有持续分泌特异性IgG1抗体的能力。进一步验证了这种以乙型肝炎病毒表面蛋白作为载体蛋白的新型肺炎结合疫苗诱导了小鼠脾细胞中特异性B淋巴细胞的分化和发育以及血清中抗体的产生。简而言之,从体液免疫、细胞免疫到分子水平的研究提示了这种新载体结合疫苗在小鼠上良好的免疫效果。在这种以乙肝表面蛋白为载体的新型肺炎结合疫苗免疫效果研究的基础上,我们也对免疫后小鼠的初步安全性进行了评估,通过对免后小鼠不同时间体重观察以及主要器官的组织病理学进行观察和研究。结果表明,该结合物免疫后的小鼠与对照组相比,未出现明显的病理改变,且体重在免疫期内持续增长,显示出了这种结合疫苗的初步安全性是可预期的。总之,本论文研究结果表明出这种以乙肝表面蛋白偶联的新型肺炎球菌多糖结合疫苗在小鼠中具有良好的免疫效果和安全性。提示了以乙肝表面抗原为载体可以促进对多糖免疫效果的提升,同时也能诱导小鼠产生针对乙肝表面蛋白的免疫反应,在小鼠上验证了这种乙肝表面抗原蛋白可以作为肺炎结合疫苗新的载体,并能实现一针双效的免疫效果。对这种结合疫苗免疫小鼠后的早期体液、细胞和分子水平的免疫机理研究为结合疫苗的研究和开发提供了一种新的路径。而用这种结合疫苗免疫小鼠后分离到的肺炎33F型多糖和乙肝表面蛋白的特异性B淋巴细胞单克隆抗体细胞株及其分泌的抗体应用的初步研究为后期该结合疫苗的开发的质量评价奠定了基础。
吴海浪[5]（2019）在《基于病毒样颗粒载体的新型二价高血压疫苗HBcAg-CE12-CQ10的研制》文中指出第一部分新型二价高血压疫苗的构建目的:高血压的临床治疗往往需要针对多靶点联合用药,而现有的高血压疫苗仅针对单一治疗靶点。为了研制更具有应用潜力的高血压疫苗,我们将探索构建针对两种不同靶点的新型二价高血压疫苗。方法:将分别来源于人血管紧张素II受体1型和L型钙通道的短肽抗原表位插入经过修饰的乙型肝炎病毒核心抗原（HBc Ag）的免疫优势区,构建重组蛋白。重组蛋白由大肠杆菌系统表达,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对表达产物进行鉴定。表达产物经过包涵体复性和蛋白质纯化等步骤后可获得重组病毒样颗粒HBc Ag-CE12-CQ10。采用透射电子显微镜观察重组病毒样颗粒HBc Ag-CE12-CQ10的形态结构。另外采用化学偶联技术分别制备针对人血管紧张素II受体1型和L型钙通道的短肽抗原的化学偶联疫苗,分别免疫小鼠,采用杂交瘤技术制备分别针对人血管紧张素II受体1型和L型钙通道的单克隆抗体。将重组病毒样颗粒HBc Ag-CE12-CQ10分别与上述单克隆抗体以及商业化的针对HBc Ag的抗体结合,以检测外源表位在重组病毒样颗粒HBc Ag-CE12-CQ10表面的展示情况。结果:构建的重组蛋白可以在大肠杆菌系统中高效表达,主要以包涵体形式存在于表达产物中。经过包涵体复性和蛋白质纯化后,可以制备得到重组蛋白。并且重组蛋白可自我组装形成直径约30纳米的空心球形病毒样颗粒。分别采用针对人血管紧张素II受体1型和L型钙通道的单克隆抗体以及商业化的针对HBc Ag的抗体与重组病毒样颗粒结合,发现重组病毒样颗粒与针对外源表位的单克隆抗体结合良好,但是与商业化的针对HBc Ag的抗体结合不佳。结论:成功地以HBc Ag病毒样颗粒为基础构建了一种重组病毒样颗粒HBc Ag-CE12-CQ10,这种重组病毒样颗粒能同时良好地展示插入的两种外源表位,有望成为一种新的二价高血压疫苗。第二部分新型二价高血压疫苗的有效性研究目的:我们研制了一种新型二价高血压疫苗,在本研究中,我们将利用这种疫苗免疫高血压动物模型,以探究二价疫苗的免疫原性,并且探究二价疫苗对于高血压动物模型高血压的治疗效果。进一步地,我们对动物模型给予L-NAME诱导肾脏损伤,以研究二价疫苗对于L-NAME诱导的肾脏损伤的保护作用。方法:（1）在第一个高血压动物模型中,将自发性高血压大鼠随机分成空白对照组、L-NAME组、L-NAME+Qβ-CQ10疫苗组、L-NAME+Qβ-CE12疫苗组、L-NAME+氨氯地平+缬沙坦组、L-NAME+二价疫苗组。各疫苗组分别于第0、14、28、56、84、98天给予相应疫苗免疫,L-NAME+氨氯地平+缬沙坦组从第14天开始灌胃给予氨氯地平和缬沙坦,对各L-NAME处理组在第84天至112天在其饮用水中添加L-NAME。定期采用无创鼠尾血压计测定各实验动物血压和心率,并且定期通过ELISA测定各实验动物血清中的抗体滴度。实验结束前,通过代谢笼收集动物尿液,测定24小时尿蛋白含量。实验结束后,取动物肾脏进行Masson染色和透射电子显微镜观察,分析动物肾脏病理改变。同时取动物血清样品,测定动物血清肌酐、尿素氮水平。（2）在另一个高血压动物模型中,将BALB/c小鼠随机分成空白对照组、Ang II组、Ang II+氨氯地平+缬沙坦组、Ang II+二价疫苗组。Ang II+氨氯地平+缬沙坦组从第14天开始灌胃给予氨氯地平和缬沙坦,疫苗组分别于第0、14、28天给予二价疫苗免疫。各Ang II处理组小鼠于第15天在无菌条件下皮下植入充满Ang II的胶囊给药泵,造成高血压模型。定期检测各实验动物的血压、心率、以及血清中抗体滴度。结果:（1）二价疫苗免疫自发性高血压大鼠后,成功诱导产生了分别针对血管紧张素受体和L型钙通道的特异性抗体,同时二价疫苗免疫有效降低了自发性高血压大鼠的收缩压,最大降幅为25mm Hg。并且加强免疫后,二价疫苗引起的降压效应与化学偶联疫苗引起的降压效应相比,血压降幅具有一定优势。（2）在Ang II诱导的高血压小鼠模型,二价疫苗同样诱导产生了分别针对血管紧张素受体和L型钙通道的特异性抗体,同样有效降低了BALB/c小鼠的收缩压,最大降幅为35mm Hg。（3）经过L-NAME处理后,小部分自发性高血压大鼠出现了死亡,二价疫苗组大鼠死亡率略微低于L-NAME组,但差异不具有统计学意义。对各组大鼠肾脏病理变化进行分析发现,二价疫苗能有效减轻L-NAME造成的肾脏纤维化和肾小球基底膜增厚。此外,二价疫苗也有效缓解了L-NAME造成的血清肌酐、尿素氮、以及24小时尿蛋白水平的升高。结论:二价疫苗能诱导产生分别针对血管紧张素受体和L型钙通道的特异性抗体,能有效降低高血压动物模型的血压,相比针对单一靶点的疫苗具有一定的优势;同时二价疫苗能有效减轻L-NAME造成的肾脏损害。第三部分新型二价高血压疫苗的安全性研究目的:我们研制的二价高血压疫苗可诱导产生针对治疗靶点的特异性抗体,并且能有效降低高血压动物模型的血压,我们将从不同角度评估二价疫苗的安全性。方法:（1）在第二部分以自发性高血压大鼠模型为研究对象的实验结束前,用超声仪检查各实验动物心功能;这部分实验结束时,分别收集实验动物的心脏、肾脏、肝脏、肺,进行病理染色,观察各组织器官有无明显炎症细胞浸润。另外将肾脏进行透射电子显微镜观察,注意观察肾小球基底膜和系膜区有无电子致密物沉积。（2）在另一项研究中,将7周龄雄性BALB/c小鼠随机分成三组:即Day 0组、Day 7组、Day 21组。在第0天分别给予各组小鼠200微克二价疫苗皮下免疫,随后于当天处死Day 0组小鼠,第7天处死Day 7组小鼠。第14天给予Day 21组小鼠200微克二价疫苗皮下免疫,于第21天处死Day 21组小鼠。处死小鼠后,分别收集脾脏和血清。采用流式细胞术检测小鼠脾脏中淋巴细胞分化情况,用ELISA试剂盒检测小鼠血清中产生的Ig G抗体亚型。（3）分别制备并培养稳定表达h ERG钾离子通道和NaV1.5钠离子通道的HEK293细胞系,利用针对L型钙通道的单克隆抗体分别与上述细胞共孵育,用膜片钳技术检测该单克隆抗体分别对h ERG钾离子通道电流和NaV1.5钠离子通道电流的影响。结果:心脏超声检测结果显示,二价疫苗不影响动物的心功能。各主要组织器官病理染色没有发现明显的炎症细胞浸润,肾小球基底膜和系膜区也没有发现免疫复合物沉积。二价疫苗免疫后,小鼠脾脏中Th1细胞的分化明显降低,Tfh细胞的分化显着增加,并且小鼠血清中主要产生Ig G1型抗体。膜片钳实验结果表明,针对L型钙通道的单克隆抗体对h ERG钾离子通道电流和NaV1.5钠离子通道电流没有明显影响。结论:二价疫苗免疫后,各主要组织器官没有发生明显炎症反应,主要诱导针对治疗靶点的体液免疫应答,并且发生恶性心律失常的可能性较低,总体安全性良好。
胡瞬[6]（2019）在《菊糖在结核分枝杆菌和寨卡病毒亚单位疫苗中的佐剂作用研究》文中提出佐剂已经成为亚单位疫苗不可或缺的重要组成部分,同时也是制约亚单位疫苗发展的重要因素。目前临床使用的佐剂数量有限,而且还存在不同程度的不良反应,因此,亟待开发更加安全有效的亚单位疫苗佐剂。菊糖（Inulin）是由D-果糖经β-1,2糖苷键连接而成的一种天然果糖聚合物,其来源广泛、价格低廉、安全性高、生物相容性好,而且具有免疫调节功能。因此,菊糖具有作为亚单位蛋白疫苗佐剂的良好潜力。为了研究菊糖对亚单位蛋白疫苗的佐剂效果,制备了基于菊糖化学修饰的结核分枝杆菌疫苗和寨卡病毒疫苗,通过研究两种疫苗的免疫原性,分别评价菊糖在细菌性疫苗和病毒疫苗中的佐剂作用。目前疫苗佐剂的递送主要利用物理混合的方法,根据静电吸附或微球包裹的原理加载抗原。但由于菊糖呈电中性,因此不能直接吸附抗原,而使用额外的添加材料包裹菊糖和抗原,可能会引起机体非特异性免疫应答,并造成一定的安全性问题。为了弥补上述传统方法带来的缺陷,采用化学修饰的方法,将抗原和佐剂共价结合,使得抗原与佐剂同时到达抗原提呈细胞（APCs）,从而增强细胞对抗原的摄取,刺激机体产生更强的免疫应答。菊糖与蛋白抗原共价结合成为一种新型的抗原递送系统,可以形成半衰期较长的亚单位疫苗。通过探讨菊糖与免疫系统的相互作用机制,研究菊糖对疫苗的佐剂作用。全文的主要研究结果如下:（1）菊糖在结核分枝杆菌亚单位蛋白疫苗中具有良好的佐剂效果首先,表达并纯化得到一种结核分枝杆菌抗原融合蛋白,即CFP10-TB10.4融合蛋白（CT）。菊糖与载体蛋白CRM197共价结合成CRM-inu。然后将结合物（CRM-inu）与CT结合形成亚单位疫苗CT-CRM-inu,研究此亚单位疫苗的免疫原性和药代动力学特性。在BALB/c小鼠的体内试验表明,CRM-inu修饰使CT特异性IgG抗体滴度显着升高。与CT组相比,CT-CRM-inu组的CT特异性IgG滴度在第14天、21天、28天分别增加了11.0倍（P<0.05）、8.6倍（P<0.05）、20.6倍（P<0.05）;与此同时,CT-CRM-inu组Th1型细胞因子IFN-γ和TNF-α在脾脏淋巴细胞中的表达分别增强了24.1（P<0.05）和2.4倍（P<0.05）;Th2型细胞因子IL-5和IL-10在脾脏淋巴细胞中的表达分别增强了7.8倍（P<0.05）和3.5倍（P<0.05）,这表明CRM-inu共价修饰能够提高机体CT蛋白特异性的体液免疫和细胞免疫应答。此外,重要的是研究证明小鼠血清样本中未检测出抗菊糖抗体,菊糖佐剂自身免疫原性极低,具有良好佐剂潜力。菊糖修饰的CT蛋白对小鼠心、肝和肾功能没有明显影响,具有良好的安全性。为了进一步研究菊糖的佐剂作用机制,测定了菊糖佐剂修饰的疫苗在SD大鼠体内的药代动力学特征。结果表明,通过CRM-inu修饰,与CT组相比,CT-CRM-inu组的血浆半衰期7.0±0.2 h延长至26.4±0.1 h,药时曲线下面积AUC0-144 h由1228.5±323.5μg mL-1h-1增加至7284.4±535.1μg mL-1h-1,生物利用度的清除率Cl/F由0.32±0.02μg/μg mL-1h-1下降至0.15±0.02μg/μg mL-1h-1。由此可知,CRM-inu修饰可显着延长CT在免疫系统中的暴露时间,提高疫苗的吸收利用程度,降低CT在血清中的清除速率,达到诱导机体产生更强烈的CT特异性免疫应答的目的。（2）菊糖作为寨卡病毒亚单位蛋白疫苗E蛋白佐剂具有良好的效果首先表达并纯化得到作为抗原的寨卡病毒包膜蛋白（E蛋白）。为了提高E蛋白的免疫原性,选用TLR7受体激动剂洛索立宾（Loxoribine,Lox）,与菊糖共同修饰E蛋白,制备了一系列集免疫刺激分子、递送系统以及抗原为一体的新型E蛋白亚单位疫苗Lox-E-inu。疫苗的免疫原性和免疫机理研究结果表明:菊糖协同洛索立宾作为E蛋白的佐剂,可诱导E蛋白的特异性IgG抗体产生以及T细胞反应。与单独的E蛋白组相比,Lox-E-I1组在第7天、第14天和第21天的特异性IgG滴度分别增加了4.0倍（P<0.05）、9.5倍（P<0.05）和25.0倍（P<0.05）。Lox-E-inu组Th1型细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2以及Th2型细胞因子IL-10的脾淋巴细胞数目分别增加了2.8倍（P<0.05）、1.5倍（P<0.05）、1.9倍（P<0.05）和1.8倍（P<0.05）;提高了CD4+T亚群细胞（P<0.05）和CD8+T亚群细胞（P<0.05）的数量,而CD4+T和CD8+T细胞数的比值并没有显着的变化（P>0.05）。此外,血清样本中没有检测出抗菊糖抗体,表明菊糖自身的免疫原性极低,具有良好的佐剂潜力。为进一步探讨菊糖和Lox的佐剂作用机理,采用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪对DC细胞的荧光强度进行分析发现,Lox-E-inu组树突状细胞（imDC细胞）摄取FITC标记疫苗的比率（56.97%）要显着高于单独E蛋白组（11.81%）,平均荧光强度（94.82）高于单独E蛋白组（12.26）,证实菊糖协同Lox佐剂能促进imDC细胞对抗原的高效摄取。此外,疫苗Lox-E-inu接种对小鼠心、肝和肾功能没有明显影响。上述研究结果表明,菊糖和Lox偶联递送E蛋白是增强体液免疫和细胞免疫的有效策略,其主要机制是通过提高imDC细胞对抗原的摄取,促进imDC细胞的分化与成熟,有利于提高DC细胞对抗原的递呈效率。
殷晓辰[7]（2019）在《重组蛋白疫苗抗原分子表征稳定性分析》文中研究表明以类病毒颗粒为基础的重组蛋白疫苗近年来不断发展,目前已有针对HBV、HPV和HEV这三种病毒的重组蛋白疫苗成功上市。类病毒颗粒能够在分子表面充分展示关键表位,刺激抗原提呈及免疫反应的进行,在疫苗的研发中备受青睐。而重组蛋白分子表征的稳定性是保证疫苗发挥免疫原性及抗原性的关键。本文以两种重组蛋白为例对抗原分子表征的稳定性展开研究。一方面,对已上市的戊肝疫苗进行实时稳定性及热稳定性分析。另一方面,对潜力候选疫苗乙肝治疗性抗原的热稳定性展开探索。在戊肝疫苗稳定性研究方面,首先,本研究选取在2-8℃存放36个月的戊肝疫苗样品进行实时稳定性分析。体内效力结果证明戊肝疫苗经长期储存后仍具有良好的免疫原性。体外免疫化学检测中,选择不同特点的8株p239特异性单抗,针对重组蛋白p239的不同表位进行分子表征稳定性分析,不同的体外检测方法得出一致的结论,戊肝疫苗经长期储存后,至少保持50%以上的抗原性。生物物理及生物化学检测方法（LC-MS、MALDI-TOF MS、TEM、CE-SDS、HPSEC）证明,长时间储存后,戊肝疫苗的p239抗原的蛋白完整性及颗粒性基本保持稳定不变。接下来,本研究对热加速后的戊肝疫苗样品进行了体内及体外效力检测。效力试验证明,42℃热加速2周以内,戊肝疫苗的ED50仍小于放行标准（1.0 μg）,且能保持50%及以上的抗原性,这部分数据为戊肝疫苗申请CTC提供可行性数据支持。在乙肝治疗性抗原热稳定性研究方面,首先,针对乙肝治疗性抗原原液的热稳定性进行研究,通过对缓冲液条件的摸索,利用高效液相色谱法（HPSEC）、差式扫描量热法（DSC）以及双抗夹心ELISA法进行检测,最终确定最佳缓冲液配方（5 mMPB 7.0+100 mMNaCl+0.3%Tween 80）。在最佳缓冲条件下,乙肝治疗性抗原原液在50℃热加速7天仍能保持近1 00%的抗原性。随后,对吸附佐剂的乙肝治疗性抗原的热稳定性分析,利用SDS-PAGE、DSC及双抗夹心ELISA法进行检测,发现佐剂的存在不会削弱乙肝治疗性抗原的热稳定性,并且三种新型佐剂FH-003A、5.7xFH-003A和FH-002A对于维持蛋白完整性具有促进作用。综上所述,本研究完成了戊肝疫苗36个月实时稳定性的研究,证明了戊肝疫苗长期储存后仍具有较好的免疫原性、抗原性、颗粒性及蛋白完整性。戊肝疫苗具有较好的热稳定性,为未来戊肝疫苗申报CTC提供数据支持。乙肝治疗性抗原无论在原液状态还是与佐剂吸附后均具有良好的热稳定性,这一结果为乙肝治疗性抗原成为潜力候选治疗性乙肝疫苗提供数据支持。
窦德虎[8]（2018）在《腺病毒注射液TC007安全性评价研究》文中研究指明目的:TC007是以5型腺病毒为载体的重组乙肝治疗性注射液,能在一定程度上模拟病原在体内的复制过程,长时间地反复刺激免疫系统,从而诱导强烈、持久、全面的免疫反应,临床拟用于乙型肝炎的治疗。本研究通过TC007小鼠、食蟹猴一般毒理试验、食蟹猴安全药理试验、小鼠骨髓细胞微核试验、制剂安全性试验,探索TC007临床前安全性,为支持TC007临床试验提供依据。方法:1)C57BL/6小鼠单次给药毒性试验:设置溶媒对照组、1.0×109VP/只、1.0×1011 VP/只和Ad5-null空载体对照组1.0×1011VP/只,共4组,每组6只,雌雄各半。给药容量为0.1 mL/只,单次皮下给药,停药恢复14天。评价指标包括临床观察、体重,IFN-γ ELISPOT检测以及大体解剖肉眼观察。2)食蟹猴单次给药毒性试验:设置溶媒对照组、1.0×109 VP/只低剂量组、1.0×1011 VP/只高剂量组、Ad5-null对照组1.0×1011VP/只,除高剂量每组4只外,其余每组2只,雌雄各半,停药恢复14天。评价指标包括临床观察、体重、心电图、血液常规、血清生化、IFN-γ ELISpot检测（d7）、生物分布（48h、d15）、大体解剖和组织病理学检查。3)食蟹猴重复给药毒性试验:设置溶媒对照组,1.0×109VP/只、1.0×1011VP/只、1.0×1011VP/只低、中、高剂量组及Ad5-null对照组1.0×1011VP/只,每组10只,雌雄各半。每周皮下给药1次,连续7次,停药恢复4周。评价指标包括临床观察、体重、摄食、眼科检查、体温、心电图、血液常规、血清生化、血清电解质、凝血常规、尿液常规,淋巴细胞分群检测（CD3+CD8+T cell、CD4+/CD8+、CD3-CD56+NK cell、CD3+CD56+NKT cell、巨噬细胞 CD45+CD14+）、IFN-γ ELISpot 检测（d7、d35、d45、d68）、肝脏IFN-γ/TNF-α/IL-2免疫组化检测（d46、d71）、免疫原性和免疫毒性检测、生物分布检测（d46、d71）、大体解剖检查、脏器重量、骨髓涂片、组织病理学检查。4)食蟹猴安全药理试验:设置1.0×109VP/只、1.0×1010Vp/只、1.0×1011VP/只TC007低、中、高剂量组,另设Ad5-null对照组（1.0×1011 VP/只）和溶媒对照组,每组6只,雌雄各半,单次皮下给药,于首周期给药前和药后约2 h、4 h、24 h、72 h、120 h、168 h采集至少3 min或3次以上的心血管系统和呼吸系统参数;评价指标包括心血管系统血压（收缩压SP、舒张压DP、平均动脉压mean）、心电图（心率HR、PR间期、QRS间期、QT间期、QTcf）和呼吸系统（呼吸频率Frequ、潮气量TV）。5)C57BL/6小鼠骨髓细胞微核试验,设1×109VP/只、1×1011VP/只TC007低、高剂量组,另设Ad5-null对照组（1×1011VP/只）、溶媒对照组和阳性对照组,每组6只C57BL/6雄性小鼠,皮下注射给药,于给药后24h及48 h各解剖一半小鼠。每只小鼠的骨髓标本在油镜下观察2000个多染红细胞（PCE）,计数其中含有微核的PCE细胞数;计数观察200个PCE同时出现的成熟红细胞（NCE）数,计算PCE的比值。6)制剂安全性试验:被动皮肤过敏试验:设TC007低剂量组（2× 109VP/mL,0.5 mL/只）、高剂量组（2× 1010 VP/mL,0.5 mL/只）、阴性对照组（0.9%氯化钠注射液,0.5 mL/只）及阳性对照组（卵清白蛋白8 mg/mL,0.5 mL/只）4个组。致敏血清制备时,采用16只豚鼠（雌雄各半）,每组4只,皮下注射进行致敏,隔日1次,共3次,末次致敏后第14天制备致敏血清。皮内致敏及激发时,另取24只豚鼠（雌雄各半）,每组6只,皮内致敏时将前期制备的致敏血清用0.9%氯化钠注射液按1:2、1:4、1:8进行倍比稀释,豚鼠背部去毛后选取3点皮内注射相应稀释度的致敏血清0.1 mL,48 h后静脉注射与致敏剂量相同的受试物加等量的0.5%伊文思兰染料共1 mL。激发后约30 min CO2安乐死豚鼠,并取背部皮肤测量内侧斑点的大小。主动全身过敏试验:采用36只豚鼠（雌雄各半）,设供试品低剂量组（2×109 VP/mL,0.5 mL/只）、高剂量组（2× 1010 VP/mL,0.5 mL/只）、阴性对照组（0.9%氯化钠注射液,0.5 mL/只）及阳性对照组（卵清白蛋白4mg/mL,0.5 mL/只）4个组,每组8只。致敏时皮下注射给药,隔日1次,共3次。分别于末次致敏后第14天和第21天,静脉注射2倍致敏剂量的供试品或对照品进行激发,观察豚鼠的主动全身过敏反应。家兔皮下刺激试验:采用新西兰兔6♂8♀,设2个组别,供试品组和Ad5-null对照组,剂量均为1.0 × 1011VP/只,右侧腹部皮下注射给予供试品,给药容积为0.5mL/只,单次给药,仅给药1次,给药后72 h两个组别各取2只家兔进行解剖取材;连续3d给药,每天给药1次,末次给药后72 h两个组别各取3只家兔进行解剖取材;剩余动物继续观察14天作为恢复期,以了解刺激反应的可逆程度,恢复期结束后对左右侧腹部皮下注射局部组织取材并进行组织病理学检查。TC007体外溶血试验:新西兰兔心脏采血并制备成2%红细胞悬液,制备完成后将其与0.9%氯化钠注射液及超纯水按照一定比例加入玻璃试管内,混匀后,于37℃生化培养箱中放置30 min,然后,在对应试管内分别加入5 × 108 VP/mL、5 × 109 VP/mL、5× 1010 VP/mL浓度的供试品,混合均匀,并置于37℃的生化培养箱中,肉眼观察TC007对兔红细胞有无溶血或凝聚作用,可见供试品各试验管均未出现溶血及凝聚现象。结果:1)C57BL/6小鼠皮下注射TC007单次给药毒性试验:溶媒对照组、TC007各剂量组及Ad5-null对照组临床症状观察、体重、大体解剖均未见异常。IFN-γ ELISPOT检测结果显示,1.0× 109VP/只、1.0× 1011 VP/只剂量组均能够检测到针对HBV三种抗原（Core、Env、Pol）分泌IFN-γ的特异性T细胞。2)食蟹猴皮下注射TC007单次给药毒性试验:TC007给药组Ad5主要分布于给药局部,在肠系膜淋巴结有少量分布。在给药后48h,Ad5在高剂量组主要分布于给药局部,Ad5生物分布呈明显消除趋势。IFN-γ ELISpot检测显示1.0× 109VP/只、1.0× 1011 VP/只剂量组,均能够检测到针对HBV三种抗原（Core、Env、Pol）分泌IFN-γ的特异性T细胞。体重、心电图、血常规、血清生化等指标在各剂量组均未见药物相关性异常。临床观察可见皮肤红斑,并可见恢复,组织病理学检查可见给药局部轻微表皮结痂、真皮层、皮下组织炎性细胞浸润。3)食蟹猴皮下注射TC007重复给药毒性试验:食蟹猴重复给予TC007后,生物分布检测结果显示Ad5主要分布于给药局部,在腋下淋巴结有少量分布,心脏、肝脏、脾脏、生殖系统及肾脏等组织未见分布。Ad5生物分布呈明显消除趋势。IFN-γ ELISpot检测结果显示,溶媒对照组及Ad5-null对照组均未检测到针对HBV三种抗原（Core、Env、Pol）分泌IFN-γ的特异性T细胞。d7开始在TC007各剂量组外周血即能够检测到针对HBV三种抗原（Core、Env、Pol）分泌IFN-γ的特异性T细胞。给药结束及停药恢复4周后,TC007各剂量组和Ad5-null对照组食蟹猴肝脏组织中IFN-γ/TNF-α/IL-2阳性程度均不同程度高于溶媒对照组,且阳性程度随着剂量的增加而呈增加趋势;但1.0×1011 VP/只和Ad5-null对照组相比,阳性程度未见明显差异。免疫原性检测TC007各剂量组及Ad5-null对照组所有动物均产生抗体;滴度随剂量增加而有所增加;停药恢复4周,各剂量组动物抗体滴度依然较高。中和抗体活性检测结果显示,上述动物产生的阳性抗体均具有中和活性;相同稀释度的动物血清的中和效应与血清中阳性抗体的滴度吻合,且Ad5-null对照组与高剂量组中和效应无差异。与溶媒对照组以及自身给药前后相比较,体重、摄食量、心电图、眼科检查、血液常规、血清生化、血清电解质、凝血常规、尿常规,骨髓涂片,淋巴细胞分群,补体C3、C4等指标在各剂量组均未见药物相关性异常。TC007各剂量组临床观察均可见药后皮肤红斑,TC007各剂量组及Ad5-null对照组体温在给药期间可见轻微升高。TC007高剂量组循环免疫复合物（CIC）与自身给药前和溶媒对照组相比均可见轻微升高（P≤0.05）。给药末期组织病理学检查各剂量组均可见给药局部皮下组织炎性细胞浸润（浆细胞、淋巴细胞）。恢复期结束计划解剖,组织病理学检查可见给药局部皮下组织炎性细胞浸润（浆细胞、淋巴细胞）,但与给药末期相比,病变可见明显恢复趋势。4)C57BL/6小鼠及食蟹猴皮下注射TC007安全药理试验:小鼠自发活动试验及小鼠转棒试验未见对小鼠神经系统和机体协调平衡能力异常影响。与溶媒对照组和自身给药前相比,1.0×109VP/只、1.0×1010VP/只和1.0×1011 VP/只剂量组和Ad5-null对照组收缩压、舒张压、平均动脉压和呼吸系统指标均未见药物相关性异常;心率HR、PR间期、QRS、QT间期和QTcf心电指标也未见生理学意义改变。5)C57BL/6小鼠皮下注射TC007骨髓微核试验:给药后24 h解剖的小鼠中MNPCE 比率低剂量组、高剂量组及Ad5-null对照组与溶媒对照组比较均未超过其2倍且未见有剂量相关性。给药后48 h解剖的小鼠MNPCE 比率供试品低剂量组、高剂量组及Ad5-null对照组与溶媒对照组比较均超过其2倍且统计后差异具有统计学意义（P<0.05）,且具有一定的剂量相关性,为阳性结果。阳性对照组MNPCE比率明显高于溶媒对照组MNPCE比率,差异具有统计学意义（P<0.05）。6)TC007制剂安全性试验;被动皮肤过敏试验:供试品低剂量组、高剂量组及阴性对照组动物的3个血清注射点均无斑点形成,阳性对照组的动物的3个血清注射点均有斑点形成且斑点直径均>5 mm,在本试验条件下,TC007未见被动皮肤过敏反应。主动全身过敏试验:供试品低剂量组、高剂量组及阴性对照组的动物激发后,均未见过敏反应;阳性对照组动物激发后约17～40s出现过敏症状,约3～6 min死亡。在本试验条件下,TC007对豚鼠未见主动全身过敏反应。家兔皮下刺激试验:结合临床观察及组织病理学检查结果显示,在本试验条件下,供试品及Ad5-null在1.0×1011 VP/只的剂量下,均可对新西兰兔给药部位皮肤产生明显的刺激反应,且该刺激反应经过14天的恢复期后,可见明显恢复趋势。TC007体外溶血试验:结果表明:在3h内,TC007在体外未引起新西兰兔红细胞溶血及凝聚现象。结论:通过科学设计腺病毒注射液TC007的临床前安全性评价方案,在GLP规范条件下进行相关试验研究和评估。结果显示:C57BL/6小鼠单次及食蟹猴单次、重复给药毒性试验,无毒性反应剂量（NOAEL）均为1.0× 1011 VP/只;针对HBV三种抗原（Core、Env、Pol）均可以分泌IFN-γ的特异性T细胞,安全性剂量已经确认,相近评价种属中均未发现明显的靶器官毒性,免疫原性出现亦不影响药理作用,组织分布考察未显.示非预期分布。主、被动过敏反应试验阴性,制剂未引起体外溶血,对神经系统、呼吸及心血管的一般药理研究也未见不良反应。虽微核试验结果显示阳性,但空白载体组也出现类型结果,考虑到临床前外推临床带有一定的局限性,且该类型药物引起染色体损伤的可能性较小。综上所述,其临床前毒理学试验显示具有较好的安全性,参考治疗性生物制品的申报要求,临床前评价内容能够支持该生物药进入临床,进行临床阶段的安全性及有效性研究,同时密切监测可能引起的不良反应。
周兵[9]（2018）在《快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究》文中认为感染性疾病是指由细菌、病毒等致病微生物侵袭人体,进而引起机体所发生的一系列具有感染性临床症状的疾病,严重威胁着人类的生命及健康。近年来,抗感染的抗体药物研究发展十分迅速,目前,已经有25种抗感染的抗体药物正在进行临床研究。HBV感染可以导致慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌等疾病,全世界每年约有88万人死于急性或慢性HBV感染。尽管现有预防性疫苗已显着减少了新发HBV感染,全球仍有3亿的慢性HBV感人者需要得到有效的治疗,以预防该病的并发症。当前FDA批准用于慢乙肝治疗的药物有两大类,干扰素和核苷类似物,分别通过调节宿主免疫和抑制病毒的复制从而起到抗病毒的效果。现有的药物虽有着很强的安全性和抗病毒活性,但治疗效果十分有限。这些药物HBsAg的阴转率都不足5%,无法实现临床治愈。因此,需要开发更有效的新药物,以改善HBV相关疾病的临床管理。尽管全人源抗体技术的发展极大增加了全人源抗体成为临床候选株的数量,但FDA批准的大部分治疗性抗体药物仍然以人源化抗体为主。抗体人源化技术主要包括CDR移植（常用噬菌体展示等抗体库技术）、表面重塑、链替换以及计算机辅助设计等,但是现有技术存在改造后人源化抗体亲和力降低、具有较大的免疫原性、工作量大、筛选不可视以及与转换成完整抗体活性不一致等问题,这些都延长了抗体人源化的时间,因此发展新的快速人源化方法势在必行。本研究旨在建立快速点突变抗体人源化新方法,实现快速获得人源化程度高、保持亲本鼠抗活性的人源化抗体。并利用该方法对HBV鼠抗E6F6进行人源化改造,获得有临床治疗潜力的人源化抗体。本研究分为两部分,第一部分是快速点突变抗体人源化平台的建立。通过对CDR划分方法、人源化模板选择方法的比较和分析,确定结合采用Kabat和Contact定义CDR区域,并选择同源性最高的人胚系基因作为模板。通过对现有大量上市或者临床试验中抗体序列和结构的分析以及一些前期人源化改造工作经验总结,抗体序列中每个氨基酸的位置和功能是有一定的规律可寻的。总结规律包括:（1）FR中有些氨基酸存在于CDR接触面上,直接或间接参与抗体与抗原的结合或者对维持抗体CDR构象具有重要的作用,突变时通常选择保留;（2）有些FR残基存在于VH-VK的交界面上,突变时通常选择保留;（3）还有些FR残基属于抗体序列中内部包埋的氨基酸,突变时选择性保留;（4）最后剩下的FR残基就是对抗体活性影响很小的氨基酸,可以直接突变。不管是属于哪一种功能的FR残基,它的位置是相对固定的。12G6是本实验室筛选获得的一株能高效中和乙型流感病毒（Flu-B）的具有广谱性的鼠源单克隆抗体,我们首先分别对它的轻重链可变区进行Kabat编号,然后按照Kabat和Contact定义的CDR区域划分CDR。再利用IMGT网站搜索比对,找出同源性最高的2-3条人胚系基因,进行序列比对。最后根据上述总结的氨基酸规律,对和胚系基因FR中存在的差异氨基酸进行选择性突变,共设计4条重链和4条轻链,分别将其两两互搭进行真核表达,以亲本鼠抗为对照,检测16株人源化抗体的表达情况、结合活性、中和活性等生物学功能。最终,针对12G6,我们挑选出7株优势的人源化抗体。发现在2个不同亚系的乙型流感病毒HA蛋白的结合实验、中和实验和HI实验中,7株人源化抗体保留了 12G6的生物学活性。5B11和7G5是本实验室筛选获得的两株能同时高效中和A/B型呼吸道合胞病毒（RSV）的鼠源单克隆抗体。根据12G6的实验结果,分别对5B11和7G5各设计一种人源化方案,获得N-5B11和N-7G5两株人源化抗体。两株人源化抗体均显示出良好的反应活性和中和活性,且活性与亲本相当。至此我们针对12G6、5B11和7G5三株鼠抗的人源化改造初步完成,验证了改造方案的可行性,完成快速点突变抗体人源化平台的构建。本研究第二部分是利用第一部分建立的新的人源化平台对乙型肝炎病毒鼠抗E6F6人源化,并对获得的人源化抗体进行性质验证及成药性评估。E6F6是本实验室筛选获得的一株针对HBV外膜蛋白（HBsAg）上一个特定表位的鼠源单克隆抗体;它能够有效并持久地清除转基因小鼠体内的HBV和HBsAg,具有发展成为HBV治疗性抗体的潜力。在前期研究中,我们利用噬菌体展示技术对其进行了人源化及亲和力成熟,成功获得了人源化程度为89%,体内外活性与鼠抗相当的人源化抗体162。本研究利用BIAcoreT200对162进行了亲和力测定,其亲和力为4.18×10-10M。通过对162 Fab的晶体培养及结构解析,获得了 162晶体三维结构。将162与HBsAg表位短肽进行对接,得到抗原-抗体相互作用的重要氨基酸。为了验证第一部分所建立的人源化平台的可行性及提高抗体的人源化程度,本研究第二部分利用第一部分中建立的快速点突变抗体人源化平台,结合162氨基酸序列、162晶体结构、与HBsAg短肽对接数据及Discovery Studio模拟平台,对E6F6进行人源化改造,获得3株人源化抗体,huAb1、huAb2和huAb3。在CHO-S细胞中瞬时表达和纯化,并从抗体的均一性、与抗原反应性、中和活性、体内病毒清除效果、成药性评估等方面进行综合分析。huAb1、huAb2和huAb3的人源化程度高达97%,体外结合及中和活性与162相当,但是在HBV转基因小鼠体内持续清除HBsAg的能力有所下降。C57b1/6小鼠体内发现人源化程度为97%的huAb1清除速率较快。说明人源化程度高的抗体在异源小鼠动物模型中免疫原性增加,被较快的清除,但是人源化程度高的抗体在人体内可能具有更高的优势。同时,huAb1、huAb2和huAb3的反嵌合抗体的体外结合、中和以及体内活性均与鼠抗E6F6相当。162、huAb1、huAb2和huAb3的溶解度高达140mg/mL以上,粘度小于14,等电点在8-9之间,达到了抗体药物的标准,TM值大于80℃,具有较好的热稳定性。在人体内环境和药物储存环境的模拟条件下同样具有较好的稳定性。食蟹猴体内药代动力学实验评估162、huAb1、huAb2和huAb3的半衰期符合标准,均能持续有效的清除食蟹猴体内的HBsAg,其中意外发现huAb3的半衰期较长,分析与其表面电荷分布有关,表面电荷降低可能会延缓抗体的清除。药代动力学参数及食蟹猴血常规和血生化结果提示,162、huAb1、huAb2和huAb3具有良好的药物有效性和安全性。进一步研究发现162、huAb1、huAb2和huAb3与HBsAg形成免疫复合物较小,有利于细胞的高效吞噬。通过对人IgG1Fc区域的突变,获得了体外活性与162相当,吞噬效应显着提高的162-IgG1-KD突变体。发现CH的替换可能导致Fc不依赖与FcγR作用途径,而是通过改变Fab与靶标的结合方式,形成不同大小的免疫复合物,影响吞噬效应。同时首次发现了抗体VH和CH1之间的linker对吞噬的影响,在162重链可变区末端引入柔性linker（Gly4Ser）3可能会增大Fab双臂间的距离,降低抗体的吞噬功能。综上所述,本研究建立了快速点突变抗体人源化方法并利用3株不同靶点的鼠抗完成了全面的验证,大大缩短了改造的时间,为鼠源抗体人源化的改造奠定了坚实的基础,丰富了人源化技术手段,为抗体人源化改造提供了新的选择。获得了具有专利保护的用于HBV感染相关疾病治疗的人源化抗体分子162、huAb1、huAb2和huAb3,并完成了较为全面的体内外活性评估及成药性分析,完善了抗体人源化改造平台,为相应疾病治疗性人源化抗体的研发奠定了坚实的基础,有望成为治疗慢乙肝的新药物。
王国强[10]（2018）在《O型口蹄疫病病毒多表位免疫原和表位嵌合病毒样颗粒研制及其免疫原性评价》文中研究表明口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起的一种感染偶蹄类动物的急性、烈性、传染性病毒疾病,感染包括牛,猪,羊家畜和其它许多野生动物物种。如果一个正常无口蹄疫的国家暴发和流行口蹄疫,感染动物的生产力将严重下降,甚至被扑杀,同时由于疫区封锁和动物产品贸易的限制,将会个该国家带来巨大的经济损失和负面的政治影响。目前防止口蹄疫传播的控制措施主要包括限制动物的活动,屠宰患病动物和与患病动物密切接触病的动物,以及在一些流行地区定期对动物进行大规模疫苗接种。对发达国家来说,上述三个措施基本都可以做到,但对那些经济实力差、技术落后的发展中国家,完全扑杀感染动物和密切接触动物是不现实的,疫苗免疫仍然是这些国家控制和预防口蹄疫发生的主要手段。我国根据实际国情,目前实行积极预防,国家强制免疫为主,一旦发现口蹄疫,立即采取扑杀相结合的综合防控策略。灭活疫苗是当前我国和世界上使用最广泛的疫苗,在控制和净化口蹄疫方面发挥了重大作用。但是,灭活疫苗在实际生产和使用过程中有很多限制性因素。例如,在培养口蹄疫病毒时,病毒逃逸生产现场和灭活不彻底等安全风险;疫苗可能含痕量的口蹄疫病毒非结构蛋白,造成无法区别动物免疫和病毒感染;灭活疫苗热稳定性差,在运输和贮藏整个过程需要低温;灭活疫苗可以预防口蹄疫发生,但是一旦爆发,不能从感染动物中清除体内存在的病毒。为解决灭活疫苗的这些缺点,目前许多努力致力于开发新型疫苗,安全高效的表位疫苗就成了候选疫苗之一。本研究选择O型口蹄疫结构蛋白VP1上两个B细胞表位和一个T细胞表位以及非结构蛋白3A上的一个T细胞表位作为靶序列表位,在其中一个B细胞表位中引入一个氨基酸突变,然后将4个表位进行不同顺序排列组合和表位的串联重复。通过人工合成3条核苷酸序列,构建重组质粒,在大肠杆菌中表达目的蛋白,重组蛋白经过纯化、复性和环化,免疫动物。其中重组多表位蛋白r P2在豚鼠体内刺激产生了略高于商业合成肽疫苗的特异性抗体水平,在体外,并诱导了强的细胞免疫反应。重组多表位蛋白r P2和佐剂ISA 50V2乳化后免疫猪,也刺激猪产生了和商品化疫苗无差异的抗体水平。在宿主动物猪上做攻毒保护试验时,重组蛋白r P2免疫猪中仅有部分猪（2/5）抵抗了FMDV的攻击。同时,以噬菌体MS2作为展示外源多肽的病毒样颗粒平台,构建并表达了嵌合FMDV表位的重组蛋白,该嵌合蛋白可以在体外自组装成病毒样颗粒,纯化后免疫动物,嵌合VLPs诱导动物产生了高于合成肽疫苗的特异性抗体滴度,也刺激产生了高于串联重复蛋白的细胞免疫反应。1、猪O型口蹄疫重组串联多表位抗原制备及免疫原性分析根据国内流行的猪O型口蹄疫SEA拓扑型Mya98谱系O/MYA98/BY/2010毒株序列,选择FMDV VP1上第124-167位（包含G-H环及其两翼序列）,第200-213位作为B细胞表位,VP1上第21-40位和非结构蛋白3A上第21-35位作为T细胞表位,在第124-167位上第158氨基酸引入突变（P158C）。将4个表位序列不同组合和串联重复,密码子优化后,人工合成3条序列。构建重组原核表达载体,转入大肠杆菌中诱导表达,三个蛋白均以包涵体形式表达。三个蛋白经过纯化,复性和环化,Western和间接ELISA检测,得到了有免疫活性的重组蛋白。三个重组蛋白和商业合成肽疫苗免疫豚鼠,经过环化和两个串联重复的多表位蛋白r P2刺激豚鼠产生了和合成肽疫苗无显着性差异的特异性抗体,并诱导产生了高于重组蛋白r P1和r P3的淋巴细胞增殖和细胞因子浓度（IL-2和IFN-γ）。从4种不同种类的佐剂中,选择佐剂ISA 50V2和重组多表位蛋白r P2组合是最优配伍。佐剂ISA 50V2和r P2乳化后免疫猪,刺激产生了和合成肽疫苗相当的特异性抗体水平。在攻毒保护试验中,免疫后第28天1000 ID50/2m L的O/Mya98/BY/2010开始攻毒,观察10天,5头猪中仅有2头猪抵抗了病毒的攻击,3头猪发病,其中2头猪延缓了发病时间,分别在第8天和第10天在一条腿蹄趾处出现水泡。重组多表位蛋白虽产生了部分保护,但还没有达到预期目的,需进一步分析原因,以待解决。2、噬菌体MS2介导的展示猪O型口蹄疫G-H Loop病毒样颗粒构建及免疫原性分析本试验以噬菌体MS2作为展示外源表位的载体平台,通过RT-PCR和SOE-PCR将FMDV VP1上第131-160位氨基酸基因序列插入噬菌体MS2外壳蛋白A-B环第15-16位氨基酸中间。构建重组质粒,在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,嵌合蛋白经过PEG8000的初步纯化和凝胶过滤的进一步纯化,得到纯度达90%的目的蛋白,经过DLS和TEM物理表征,证实30个氨基酸的插入没有影响MS2外壳蛋白的组装,嵌合蛋白在体外自组装形成了嵌合病毒样颗粒。DOT-ELISA进一步表明口蹄疫表位被很好的展示在MS2病毒样颗粒表面。嵌合病毒样颗粒r P-CP-EP131-160和串联多表位蛋白r P–（EP131-160）3免疫小鼠,和串联多表位蛋白相比,嵌合病毒样颗粒诱导产生了更高的特异性抗体水平和更强的T细胞反应。在豚鼠免疫试验中,得到了类似的结果。在宿主猪体内是否也可以产生和合成肽疫苗同样的抗体水平,以及能否在猪免疫攻毒保护试验中提供完全保护,最终保护效果需要进一步动物试验来确认。
二、乙型肝炎病毒新型免疫原性多肽的设计、合成及免疫原性研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、乙型肝炎病毒新型免疫原性多肽的设计、合成及免疫原性研究（论文提纲范文）
（1）SARS-CoV-2重组痘苗病毒载体疫苗的构建、筛选和免疫原性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 新型冠状病毒的分子生物学 |
| 第2章 痘苗病毒的分子生物学 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 E3L基因缺失型痘苗病毒的构建 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 表达SARS-CoV-2RBDEPI重组痘苗病毒穿梭质粒的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 SARS-CoV-2 RBDEPI重组基因缺失型痘苗病毒的免疫原性研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第三篇 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）A型塞内卡病毒结构蛋白B细胞抗原表位的鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 A型塞内卡病毒研究概况 |
| 1.1.1 A型塞内卡病毒的分子特征 |
| 1.1.2 A型塞内卡病毒流行病学 |
| 1.1.3 A型塞内卡病毒病临床症状及病理特征 |
| 1.1.4 A型塞内卡病毒诊断与防控 |
| 1.2 抗原表位研究进展 |
| 1.2.1 抗原表位的概述 |
| 1.2.2 抗原表位的研究方法 |
| 1.2.3 表位的应用 |
| 1.2.4 A型塞内卡病毒抗原表位研究进展 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 表位预测法鉴定A型塞内卡病毒B细胞抗原表位 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 仪器 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 SVA灭活疫苗免疫血清的鉴定 |
| 2.2.2 SVA结构蛋白生物信息学分析 |
| 2.2.3 潜在表位的合成及纯度分析 |
| 2.2.4 潜在表位间接ELISA分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 SVA灭活疫苗免疫血清的鉴定结果 |
| 2.3.2 VP1、VP2和VP3 蛋白生物信息学分析结果 |
| 2.3.3 ELISA分析结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 交叠多肽生物合成法鉴定A型塞内卡病毒B细胞抗原表位 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 仪器 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 主要溶液配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 交叠多肽原核表达质粒构建 |
| 3.2.2 重组质粒的鉴定与交叠多肽的表达 |
| 3.2.3 WB分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 交叠多肽的表达与鉴定 |
| 3.3.2 抗原表位WB鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 A型塞内卡病毒抗原表位免疫原性分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 仪器 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 抗原表位肽的KLH偶联 |
| 4.2.2 KLH偶联表位多肽免疫豚鼠 |
| 4.2.3 免疫血清ELISA分析 |
| 4.2.4 免疫血清的WB分析 |
| 4.2.5 免疫血清的IFA分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 免疫血清的抗体水平检测和抗体亲和力分析 |
| 4.3.2 免疫血清的免疫反应性分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录A GST-188 蛋白的核苷酸序列 |
| 附录B SVACH-FJ-2017(ID: KY747510)核苷酸序列 |
| 附录C SVA结构蛋白的核苷酸序列 |
| 附录D SVA结构蛋白的核苷酸序列 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）基于聚乳酸微球佐剂的乙肝疫苗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 慢性乙肝概述 |
| 1.1.1 乙型肝炎病毒 |
| 1.1.2 慢性乙肝的疾病进程 |
| 1.1.3 慢性乙肝的免疫耐受 |
| 1.1.4 慢性乙肝的药物治疗 |
| 1.2 乙肝疫苗的免疫学基础及当前研究进展 |
| 1.2.1 免疫概述 |
| 1.2.2 预防性乙肝疫苗 |
| 1.2.3 治疗性乙肝疫苗 |
| 1.2.4 慢性乙肝模型鼠 |
| 1.3 疫苗佐剂概述 |
| 1.3.1 免疫刺激剂类佐剂 |
| 1.3.2 递送系统类佐剂 |
| 1.3.3 疫苗及其佐剂研发的挑战 |
| 1.4 立题依据和研究目标 |
| 1.4.1 立题依据 |
| 1.4.2 研究目标 |
| 第2章 DDAB-PLA微球制剂制备及细胞水平评价 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 微球的制备 |
| 2.2.4 微球的表征 |
| 2.2.5 微球的体外释放 |
| 2.2.6 抗原活性与稳定性的检测 |
| 2.2.7 髓源树突状细胞(BMDCs)的提取 |
| 2.2.8 微球细胞毒性检测 |
| 2.2.9 STING信号通路表达水平检测 |
| 2.2.10 微球在BMDCs中的内化及转运 |
| 2.2.11 BMDC的活化水平检测 |
| 2.2.12 BMDCs细胞因子检测 |
| 2.2.13 统计分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 微球的表征 |
| 2.3.2 微球的体外释放 |
| 2.3.3 抗原的稳定性与免疫原性 |
| 2.3.4 微球的细胞毒性检测 |
| 2.3.5 STING信号通路表达水平检测 |
| 2.3.6 微球在BMDCs中的内化及转运 |
| 2.3.7 BMDCs的活化水平 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 DDAB-PLA微球的作用机制探索及体内免疫效果研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 注射部位的炎症反应 |
| 3.2.4 注射部位免疫细胞的招募 |
| 3.2.5 小动物成像检测 |
| 3.2.6 淋巴结中滤泡辅助T细胞检测 |
| 3.2.7 淋巴结中DC、B细胞的激活 |
| 3.2.8 免疫方案 |
| 3.2.9 抗体水平检测 |
| 3.2.10 脾细胞的提取 |
| 3.2.11 脾细胞增殖 |
| 3.2.12 淋巴细胞的激活与杀伤 |
| 3.2.13 脾细胞分泌的细胞因子检测 |
| 3.2.14 Th1型细胞免疫检测 |
| 3.2.15 微球疫苗制剂的安全性评价 |
| 3.2.16 统计分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 微球制剂在注射部位的驻留 |
| 3.3.2 注射部位的炎症反应 |
| 3.3.3 注射部位免疫细胞的招募 |
| 3.3.4 淋巴结中DCs和B细胞的活化 |
| 3.3.5 淋巴结中滤泡辅助T细胞检测 |
| 3.3.6 体液免疫评价 |
| 3.3.7 脾细胞增殖 |
| 3.3.8 脾细胞的激活与杀伤 |
| 3.3.9 脾细胞分泌的细胞因子检测 |
| 3.3.10 Th1细胞免疫水平 |
| 3.3.11 微球疫苗制剂的安全性评价 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 DDAB-PLA微球制剂在慢性乙肝模型鼠中的治疗效果考察 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 慢性乙肝模型鼠的构建 |
| 4.2.4 免疫方案 |
| 4.2.5 血清转阴率检测 |
| 4.2.6 体液免疫水平检测 |
| 4.2.7 脾细胞的提取 |
| 4.2.8 脾细胞增殖 |
| 4.2.9 淋巴细胞活化和杀伤检测 |
| 4.2.10 记忆性淋巴细胞水平检测 |
| 4.2.11 肝脏HBcAg和浸润程度检测 |
| 4.2.12 肝功能检测 |
| 4.2.13 统计分析 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 模型鼠的构建 |
| 4.3.2 脾细胞增殖 |
| 4.3.3 淋巴细胞的活化和杀伤 |
| 4.3.4 细胞因子分泌 |
| 4.3.5 治疗效果评价 |
| 4.3.6 免疫记忆水平 |
| 4.3.7 安全性评价 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 DDAB-PLA微球制剂的长效免疫及冻干研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 免疫方案 |
| 5.2.4 抗体水平检测 |
| 5.2.5 脾细胞的活化和杀伤 |
| 5.2.6 安全性评价 |
| 5.2.7 冻干制剂研究 |
| 5.2.8 统计学分析 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 抗体水平检测 |
| 5.3.2 脾细胞活化杀伤 |
| 5.3.3 安全性评价 |
| 5.3.4 冻干制剂探究 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 创新点总结 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 主要符号表 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（4）乙肝表面蛋白偶联的新型肺炎多糖结合疫苗小鼠综合免疫效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 乙肝表面蛋白偶联的新型肺炎多糖结合疫苗体液与细胞免疫研究 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、小结 |
| 第二章 乙肝表面蛋白偶联的新型肺炎多糖结合疫苗免疫小鼠后早期表达谱的研究 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、小结 |
| 第三章 乙肝表面蛋白偶联的新型肺炎多糖结合疫苗免疫小鼠的特异性B淋巴细胞的分离、鉴定及初步应用研究 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、小结 |
| 第四章 乙肝表面蛋白偶联的新型肺炎多糖结合疫苗免疫小鼠后小鼠体重和主要脏器的病理学观察 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、小结 |
| 结论与创新点 |
| 一、结论 |
| 二、创新点 |
| 参考文献 |
| 文献综述 细菌多糖蛋白结合疫苗研发进展 |
| 参考文献 |
| 附录一 英文缩略语表 |
| 附录二 偶联物免疫组较单独原液组比较不同时间上调（3day)和下调（3day)基因 |
| 致谢 |
| 研究生个人简介 |
（5）基于病毒样颗粒载体的新型二价高血压疫苗HBcAg-CE12-CQ10的研制（论文提纲范文）
| 前言 |
| 参考文献 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 新型二价高血压疫苗的构建 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第二部分 新型二价高血压疫苗的有效性研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 附图(附表) |
| 第三部分 新型二价高血压疫苗的安全性研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 附图(附表) |
| 研究总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表及中文对照 |
| 攻读博士学位期间学术成绩 |
| 致谢 |
（6）菊糖在结核分枝杆菌和寨卡病毒亚单位疫苗中的佐剂作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1 概述 |
| 2 菊糖的研究进展 |
| 2.1 菊糖的结构 |
| 2.2 菊糖的理化性质 |
| 2.3 影响菊糖结构和含量的天然因素 |
| 2.4 菊糖的天然来源及提取 |
| 2.5 菊糖在植物中的功能 |
| 2.6 菊糖在功能食品中的应用 |
| 2.7 菊糖在药物中的应用 |
| 2.8 菊糖的免疫调节功能 |
| 2.9 菊糖的佐剂作用 |
| 3 亚单位疫苗佐剂研究进展 |
| 3.1 亚单位疫苗佐剂的重要性及其作用机制 |
| 3.2 亚单位疫苗佐剂的分类 |
| 3.3 亚单位疫苗递送系统 |
| 3.4 目前被批准使用的佐剂 |
| 3.5 目前佐剂的安全性及局限性 |
| 3.6 高效佐剂的策略 |
| 4 结核病及结核分枝杆菌疫苗 |
| 4.1 结核病流行现状 |
| 4.2 结核分枝杆菌简介 |
| 4.3 结核分枝杆菌疫苗卡介苗 |
| 4.4 新型结核病疫苗研制策略 |
| 5 寨卡病毒流行病学特征及疫苗进展 |
| 5.1 寨卡病毒生物学特征 |
| 5.2 寨卡病毒致病机制 |
| 5.3 寨卡病毒免疫应答特征 |
| 5.4 寨卡疫苗研究进展 |
| 5.5 寨卡疫苗研究挑战 |
| 6 本论文研究的目的意义及主要研究内容 |
| 6.1 本论文研究的目的意义 |
| 6.2 本论文研究的主要内容 |
| 第二章 菊糖修饰的结核分枝杆菌亚单位疫苗的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要材料与试剂 |
| 1.2 主要仪器与设备 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 融合蛋白CFP10-TB10.4的表达、纯化和鉴定 |
| 2.2 分子排阻色谱纯化 CFP10-TB10.4 融合蛋白疫苗 |
| 2.3 CFP10-TB10.4蛋白疫苗的质量控制 |
| 2.4 分子排阻色谱分析纯化后的CFP10-TB10.4融合蛋白疫苗 |
| 2.5 动态光散射分析佐剂修饰后的CFP10-TB10.4融合蛋白水化半径 |
| 2.6 圆二色光谱检测佐剂对CFP10-TB10.4融合蛋白二级结构的影响 |
| 2.7 内源荧光光谱检测佐剂对CFP10-TB10.4融合蛋白三级级结构的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 菊糖修饰的结核分枝杆菌亚单位疫苗免疫原性及药代动力学研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂和仪器 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 佐剂对CFP10-TB10.4 特异性抗体IgG滴度的影响 |
| 2.2 佐剂特异性IgG抗体滴度测定 |
| 2.3 血清中抗体的CFP10-TB10.4融合蛋白特异性检测 |
| 2.4 佐剂对脾淋巴细胞增殖水平的影响 |
| 2.5 佐剂对小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子水平的影响 |
| 2.6 佐剂对抗原在小鼠体内代谢动力学的影响 |
| 2.7 CT 样品药代动力学分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 结核分枝杆菌感染的免疫应答特征 |
| 3.2 菊糖与CRM_(197)协同使用对CFP10-TB10.4 蛋白免疫原性的影响 |
| 3.3 佐剂的免疫原性及安全性 |
| 3.4 菊糖协同CRM197作为佐剂的作用机制 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 菊糖修饰的寨卡病毒E蛋白亚单位疫苗的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂、质粒和仪器 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 E蛋白的表达,纯化和表征 |
| 2.2 寨卡E蛋白亚单位疫苗的纯化 |
| 2.3 圆二色光谱检测佐剂对E蛋白二级结构的影响 |
| 2.4 内源荧光光谱检测佐剂对E蛋白二级结构的影响 |
| 2.5 佐剂修饰后的寨卡E蛋白分子排阻色谱分析 |
| 2.6 动态光散射检测佐剂对的寨卡E蛋白分子半径的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第五章 菊糖修饰的ZIKV亚单位疫苗免疫原性及佐剂作用机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 佐剂对小鼠IgG抗体滴度的影响 |
| 2.2 抗菊糖佐剂特异性抗体的检测 |
| 2.3 佐剂对小鼠脾淋巴细胞的转化率的影响 |
| 2.4 流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞CD4~+T和 CD8~+T亚群分布 |
| 2.5 流式细胞术检测脾淋巴细胞的胞内细胞因子 |
| 2.6 菊糖佐剂修饰对抗原提呈细胞摄取抗原E蛋白的影响 |
| 2.7 菊糖修饰的E亚单位疫苗安全性初步研究 |
| 3 讨论 |
| 3.1 ZIKV引起的免疫应答特征 |
| 3.2 菊糖和洛索立宾对E蛋白免疫原性的影响 |
| 3.3 菊糖和洛索立宾协同作用的机制 |
| 4 本章小结 |
| 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）重组蛋白疫苗抗原分子表征稳定性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1 戊型肝炎研究概况 |
| 1.1 戊肝流行病学特征 |
| 1.2 戊型肝炎病毒分子生物学特征 |
| 1.3 戊型肝炎疫苗研究现状 |
| 2 乙型肝炎研究概况 |
| 2.1 乙型肝炎流行病学特征 |
| 2.2 乙型肝炎病毒分子生物学特征 |
| 2.3 乙型肝炎的预防与治疗 |
| 3 重组蛋白疫苗研究概述 |
| 3.1 疫苗的发展概况 |
| 3.2 疫苗的分类与作用机制 |
| 3.3 类病毒颗粒作为抗原的重组疫苗发展概况 |
| 4 重组疫苗质量分析概述 |
| 4.1 疫苗质量分析方法概述 |
| 4.2 疫苗稳定性研究概述 |
| 4.3 佐剂在疫苗制剂中的作用 |
| 5 本论文的研究目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 实验仪器 |
| 2 实验试剂和材料 |
| 2.1 试剂与耗材 |
| 2.2 细胞株及实验动物 |
| 2.3 常规溶液 |
| 2.4 分析软件 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 单克隆抗体的制备 |
| 3.2 单克隆抗体的HRP标记及荧光标记 |
| 3.3 BCA法测定蛋白浓度 |
| 3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 3.5 pH值测定 |
| 3.6 新型佐剂的制备 |
| 3.7 模拟疫苗制剂与解离 |
| 3.8 重组蛋白免疫原性、抗原性及物理化学性质鉴定 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分 戊肝疫苗终产品稳定性相关研究 |
| 1 戊肝疫苗实时稳定性评价 |
| 1.1 戊肝疫苗物理化学性质评价 |
| 1.2 在动物体内评价戊肝疫苗的免疫原性 |
| 1.3 体外检测评价戊肝疫苗抗原性 |
| 2 戊肝疫苗热稳定性评价 |
| 2.1 在动物体内评估热加速后的戊肝疫苗 |
| 2.2 体外相对效力检测热加速后的戊肝疫苗 |
| 3 第一部分小结 |
| 第二部分 乙肝治疗性抗原热稳定性研究 |
| 1. 乙肝治疗性抗原原液热稳定性评价 |
| 1.1 缓冲液pH对乙肝治疗性抗原热稳定性的影响 |
| 1.2 组氨酸对乙肝治疗性抗原原液热稳定性的初步摸索 |
| 1.3 最佳缓冲条件下乙肝治疗性抗原原液的热稳定性 |
| 2 乙肝治疗性抗原吸附佐剂后的热稳定性评价 |
| 2.1 解离液配方的摸索 |
| 2.2 吸附佐剂后的乙肝治疗性抗原物理化学性质评价 |
| 2.3 吸附佐剂后乙肝治疗性抗原抗原性评价 |
| 3 第二部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 戊肝疫苗实时稳定性评价在疫苗生命周期管理中的意义 |
| 4.2 戊肝疫苗脱冷链运输的可行性 |
| 4.3 乙肝治疗性抗原成为候选疫苗的潜力 |
| 4.4 不同免疫化学方法的优势比较 |
| 小结与展望 |
| 1 小结 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表研究论文 |
| 致谢 |
（8）腺病毒注射液TC007安全性评价研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 TC007一般毒性试验 |
| 1 C57BL/6小鼠单次给药毒性试验 |
| 2 食蟹鲜次给药毒性试验 |
| 3.食蟹织复给药毒性试验 |
| 第二部分 TC007安全药理试验 |
| 4 对CS7BL/6小鼠神经系统和机体协调平衡能力的影响 |
| 5 对食蟹猴心血管系统和呼吸系统的影响 |
| 第三部分 TC007小鼠微核试验 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 第四部分 TC007制剂安全性试验 |
| 7 TC007被动皮纽敏试验 |
| 8 TC007主动全身过敏试验 |
| 9 TC007家兔皮下刺激试验 |
| 10 TC007体外溶血试验 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 中英文对照表 |
| 致谢 |
（9）快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 抗体(Antibody)的概述 |
| 1.1.1 抗体的结构与功能 |
| 1.1.2 抗体的人源化 |
| 1.1.3 抗体药物市场 |
| 1.1.4 抗感染抗体药物的概况及趋势 |
| 1.1.5 Fc改造对效应功能的影响 |
| 1.2 乙型肝炎病毒(HBV)的概述 |
| 1.2.1 HBV基因组 |
| 1.2.2 HBV的病毒结构 |
| 1.2.3 HBV的生命周期 |
| 1.2.4 HBV基因编码的蛋白 |
| 1.2.5 HBV的基因型 |
| 1.2.6 HBV的流行病学 |
| 1.2.7 HBV的预防 |
| 1.2.8 HBV感染的抗病毒治疗 |
| 1.3 本研究的目的、意义和思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要耗材 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 实验常用溶液及试剂配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 常规分子克隆实验方法 |
| 2.2.2 常规细胞生物学方法 |
| 2.2.3 抗体的表达、纯化及鉴定 |
| 2.2.4 免疫学相关实验方法 |
| 2.2.5 体外调理吞噬实验 |
| 2.2.6 抗原-抗体免疫复合物特征分析 |
| 2.2.7 HBV相关抗体的小鼠体内实验方法 |
| 2.2.8 亲和力常数测定 |
| 2.2.9 抗体晶体培养及结构解析 |
| 2.2.10 食蟹猴体内评估抗体的药代动力学 |
| 2.2.11 抗体生物物理特性相关实验方法 |
| 2.2.12 数据处理统计学分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分 快速点突变抗体人源化平台的构建 |
| 3.1 流感病毒鼠源抗体12G6的人源化 |
| 3.1.1 12G6-cAb体外活性的评估 |
| 3.1.2 12G6-cAb的人源化设计 |
| 3.1.3 12G6人源化抗体真核表达载体的构建 |
| 3.1.4 12G6人源化抗体小量转染细胞上清性质鉴定 |
| 3.1.5 12G6人源化抗体大量表达、纯化及性质鉴定 |
| 3.2 呼吸道合胞病毒鼠源抗体5B11和7G5的人源化 |
| 3.2.1 5B11-cAb和7G5-cAb体外活性的评估 |
| 3.2.2 5B11-cAb和7G5-cAb的人源化设计 |
| 3.2.3 5B11和7G5人源化抗体构建、表达、纯化及性质鉴定 |
| 3.3 第一部分小结 |
| 第二部分 乙型肝炎病毒治疗性抗体的改造及成药性评估 |
| 3.4 E6F6人源化抗体162的亲和力测定 |
| 3.4.1 E6F6人源化抗体162的晶体培养及结构解析 |
| 3.4.2 E6F6鼠抗的人源化改造 |
| 3.4.3 E6F6人源化抗体体内外活性的评估 |
| 3.4.4 E6F6人源化抗体的成药性评估 |
| 3.4.5 E6F6人源化抗体与HBsAg免疫复合物的结构特征分析 |
| 3.4.6 E6F6人源化抗体162 Fc改造对吞噬的影响 |
| 3.5 第二部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 鼠源抗体人源化方法 |
| 4.2 抗体CDR的划分和人源化模板的选择 |
| 4.3 FR区人源化点突变规则 |
| 4.4 E6F6人源化抗体在小鼠体内的清除速率 |
| 4.5 E6F6人源化抗体huAb1和huAb3在食蟹猴体内的半衰期 |
| 4.6 抗原-抗体复合物电镜观察与纳米流式检测 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间的科研成果 |
| 致谢 |
（10）O型口蹄疫病病毒多表位免疫原和表位嵌合病毒样颗粒研制及其免疫原性评价（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 文献综述 |
| 1.口蹄疫 |
| 1.1 口蹄疫概况 |
| 1.2 世界范围内口蹄疫流行情况 |
| 1.3 中国口蹄疫流行情况 |
| 1.4 口蹄疫防控 |
| 2.口蹄疫病毒的基本特性 |
| 2.1 生物学特性 |
| 2.2 病毒基因组组成及其功能 |
| 3.口蹄疫疫苗研究进展 |
| 3.1 弱毒疫苗 |
| 3.2 灭活疫苗 |
| 3.3 基因工程亚单位疫苗 |
| 3.4 表位疫苗 |
| 3.4.1 表位疫苗免疫学理论基础 |
| 3.4.2 抗原表位筛选与鉴定 |
| 3.4.3 表位疫苗的设计 |
| 3.4.4 表位之间的连接 |
| 3.4.5 口蹄疫表位疫苗 |
| 3.5 病毒样颗粒疫苗 |
| 3.6 活载体疫苗 |
| 3.7 核酸疫苗 |
| 3.8 总结 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 FMDV串联重组表位抗原的制备和免疫原性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 质粒、动物、灭活病毒、商业疫苗和佐剂 |
| 1.1.2 主要试剂和试剂盒 |
| 1.1.3 仪器设备 |
| 1.1.4 试剂配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 多表位基因的设计及合成 |
| 1.2.2 目的基因片段和粘性末端线性化载体的获得 |
| 1.2.3 重组质粒构建 |
| 1.2.4 重组质粒的筛选与鉴定 |
| 1.2.5 重组串联蛋白表达与纯化 |
| 1.2.6 重组串联重复表位蛋白的纯化和复性 |
| 1.2.7 串联重组多表位蛋白的环化 |
| 1.2.8 复性串联重组多表位蛋白免疫活性测定 |
| 1.2.9 重组串联重复表位蛋白在豚鼠内引起的免疫反应分析 |
| 1.2.10 佐剂的筛选 |
| 1.2.11 候选重组多表位蛋白在猪体内引起的抗体水平 |
| 1.2.12 猪攻毒保护试验 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 多表位串联重组表位蛋白构建策略 |
| 1.3.2 重组质粒构建 |
| 1.3.3 重组载体鉴定 |
| 1.3.4 重组蛋白表达 |
| 1.3.5 重组蛋白纯化和复性 |
| 1.3.6 .复性蛋白免疫活性检测 |
| 1.3.7 重组多表位蛋白引起豚鼠免疫反应分析 |
| 1.3.8 佐剂筛选 |
| 1.3.9 rP2引起猪产生抗FMDV特异性抗体检测 |
| 1.3.10 攻毒试验 |
| 2 讨论 |
| 3 小结 |
| 第二章 噬菌体MS2介导的口蹄疫主要抗原表位G-H环嵌合病毒样颗粒免疫原性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 质粒、灭活病毒、灭活疫苗和佐剂 |
| 1.1.2 主要试剂和试剂盒 |
| 1.1.3 仪器设备 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 重组质粒的构建 |
| 1.2.3 重组蛋白的表达及可溶性分析 |
| 1.2.4 重组蛋白的纯化 |
| 1.2.5 重组蛋白的物理表征 |
| 1.2.6 重组蛋白免疫活性检测 |
| 1.2.7 疫苗制备及小鼠免疫 |
| 1.2.8 嵌合病毒样颗粒和串联重复蛋白豚鼠免疫 |
| 1.3 试验结果 |
| 1.3.1 RT‐PCR和 SOE‐PCR获得目的基因 |
| 1.3.2 重组质粒的鉴定 |
| 1.3.3 重组蛋白可溶性分析 |
| 1.3.4 重组蛋白纯化结果 |
| 1.3.5 重组蛋白免疫活性分析 |
| 1.3.6 病毒样颗粒物理表征 |
| 1.3.7 嵌合病毒样颗粒和串联多表位蛋白在小鼠体内免疫反应评价 |
| 1.3.8 嵌合病毒样颗粒和串联多表位蛋白在豚鼠体内免疫反应检测 |
| 2 讨论 |
| 3 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 附录部分 |
| 附录A 缩略词表 |
| 附录B 攻毒博士期间发表及待发表的学术论文 |
| Abstract |
四、乙型肝炎病毒新型免疫原性多肽的设计、合成及免疫原性研究（论文参考文献）
- [1]SARS-CoV-2重组痘苗病毒载体疫苗的构建、筛选和免疫原性研究[D]. 丛佳南. 吉林大学, 2021(01)
- [2]A型塞内卡病毒结构蛋白B细胞抗原表位的鉴定[D]. 伍春平. 中国农业科学院, 2021(09)
- [3]基于聚乳酸微球佐剂的乙肝疫苗研究[D]. 卢婷. 中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所), 2020(01)
- [4]乙肝表面蛋白偶联的新型肺炎多糖结合疫苗小鼠综合免疫效果研究[D]. 钱雯. 北京协和医学院, 2020(05)
- [5]基于病毒样颗粒载体的新型二价高血压疫苗HBcAg-CE12-CQ10的研制[D]. 吴海浪. 华中科技大学, 2019(01)
- [6]菊糖在结核分枝杆菌和寨卡病毒亚单位疫苗中的佐剂作用研究[D]. 胡瞬. 湖南农业大学, 2019(01)
- [7]重组蛋白疫苗抗原分子表征稳定性分析[D]. 殷晓辰. 厦门大学, 2019(09)
- [8]腺病毒注射液TC007安全性评价研究[D]. 窦德虎. 苏州大学, 2018(04)
- [9]快速抗体人源化平台的建立及乙型肝炎病毒人源化抗体的成药性研究[D]. 周兵. 厦门大学, 2018(06)
- [10]O型口蹄疫病病毒多表位免疫原和表位嵌合病毒样颗粒研制及其免疫原性评价[D]. 王国强. 河南农业大学, 2018