一、人肠生长激素工程菌高效表达培养工艺的研究（论文文献综述）
谢倩[1]（2021）在《基于蛋白质结构预测的IGF-1的制备及活性分析》文中进行了进一步梳理胰岛素样生长因子-1（Insulin like growth factor 1,IGF-1）是人体内一种多功能的稳态调控因子,具有促进机体生长发育、合成代谢等功能,在人体内发挥着重要的作用;IGF-1作为治疗原发性IGF-1缺乏综合征的唯一药物,我国的需求程度极高,在国外已有IGF-1相关的蛋白药物上市,而我国仍依赖于进口,给患者造成了极大的经济负担,从而导致生长发育迟缓的患者无法得到有效的治疗,因此开发进口替代药物具有十分重要的意义。本研究通过计算机模拟技术预测带有不同酶切位点的IGF-1融合蛋白结构来进行其与相应蛋白酶的分子对接,筛选出蛋白酶最适配的IGF-1融合蛋白,利用基因工程技术构建并鉴定了IGF-1融合蛋白原核表达载体,将重组质粒转化大肠杆菌表达菌株Origami B（DE3）,氨苄青霉素抗性筛选重组子,异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导表达,菌体破菌上清经亲和层析、脱盐、凝血酶酶切及酶切产物亲和层析得到目的蛋白,通过3T3细胞增殖法建立活性评价体系并对获得的IGF-1活性进行测定。结果显示在大肠杆菌Origami B（DE3）表达菌株中,0.05 mM IPTG,25℃下诱导16 h,融合蛋白为可溶性表达;在酶切缓冲液为20 mM Tris-HCl+0.15 M NaCl+10 mM CaCl2+1 mM二硫苏糖醇（DL-Dithiothreitol,DTT）,25℃、摇床酶切16 h,可实现1 U凝血酶切割100μg融合蛋白;通过酶切前后两次亲和层析可获得纯度大于90%的目的蛋白;利用3T3细胞增殖法建立了IGF-1体外活性评价体系,该体系检测条件为铺板细胞密度1×104/mL,初始、铺板及维持培养基血清浓度分别为4%、2%与1%,IGF-1样品初始浓度1000 ng/mL,3倍梯度稀释,在该活性评价体系下测得制备的IGF-1比活为2.47×105 U/mg,与市售标准品接近。本课题的研究可为IGF-1药物工业化生产提供实验依据。
郭丹[2]（2020）在《人生长激素在毕赤酵母中的分泌表达》文中进行了进一步梳理重组人生长激素（rhGH）是人类生长发育所必须的,对人体的生长发育非常重要,所以在临床上的需求量很大。因此,有必要开发出一种高效的发酵工艺来生产出高纯度的rhGH。为了能够实现在毕赤酵母中高表达rhGH的要求,本文根据人生长激素的氨基酸序列和酵母菌密码子的偏好性,对人生长激素基因的密码子进行全局优化,屏蔽所有的稀有密码子,在其上游添加了启动子和信号肽序列,拟合成序列全长1040 bp,共设计并利用化学方法合成了30条单链寡核苷酸。通过改进的两步法进行生物拼接成全基因,再克隆到pUC18载体中,经过篮白筛选,挑取阳性克隆测序,得到2个全正确的克隆。通过聚合酶链式反应技术来扩增得到了生长激素基因,然后将扩增得到的生长激素基因插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,该载体拥有AOX1启动子和α分泌信号肽序列,构建出pPIC9K/hGH重组酵母表达载体,然后再利用电击转化毕赤酵母GS115,利用G418筛选菌株,得到整合多拷贝人生长激素基因,该基因株通过进一步的摇瓶培养生长,再通过甲醇的诱导,成功实现了生长激素在毕赤酵母中的分泌表达。然后使用SDS-PAGE技术进行活性分析。经聚合酶链式反应技术扩增酵母基因组DNA的结果显示,目的基因已被成功的整合到了毕赤酵母的染色体当中。筛选出的菌株用甲醇来诱导表达重组目的蛋白,使用SDS-PAGE和Western Blotting技术对表达的产物进行鉴定,在22kD附近存在一条很明显的带,并且颜色随诱导时间的增加而越来越深。而对照组没有出现条带,Western blotting鉴定的结果表明该重组蛋白为重组人生长激素。利用Folin-酚法测定标准浓度的酪蛋白,测得上清中的总蛋白含量是1.21mg/ml。用ELISA法测定样品的hGH的OD490值为0.217,通过标准曲线的公式计算得出,上清中的hGH的含量是330μg/ml。由此计算得出hGH占上清总蛋白的27.2%。将3K超滤后的样品进行第一步层析时,选用Q-sepharose FF为层析介质,10mM PB,pH7.5为上样缓冲液,采用10%Solution B阶段洗脱目的蛋白;在第二步层析时,选用phenyl-sepharose FF为层析介质,10mM PB+1M（NH4）2SO4,pH7.5为上样缓冲液,并用10mM PB,pH7.5作为洗脱缓冲液,经过两步层析后rhGH的纯度达到98%以上。经过基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI TOF MS）测定,重组hGH的相对分子质量为22 113 Da,N-端氨基酸测序显示rhGH的N-端的7个氨基酸为PTIPLSR。重组hGH的生物学活性利用去脑垂体大鼠体重法测定,实验可靠性测验符合标准,同批rhGH样品的PT为4.29 IU/1.33 mg,代表试验误差的可信限率（FL）26.6%,比活为3.2 IU/mg。此外还优化了rhGH的发酵工艺,能够使rhGH蛋白质的表达水平得到很大的提高。总之,本实验为生产高纯度人生长激素rhGH提供了有效的发酵工艺,可以降低大规模生产人生长激素的生产成本,建立了能够高效表达人生长激素的毕赤酵母表达系统,为重组人生长激素的工业化大规模生产打下了坚实的基础。
王旺[3]（2019）在《毕赤酵母工程菌产植酸酶的发酵优化及放大》文中认为植酸酶（E.C.3.1.3.8 phytase）是催化植酸（肌醇六磷酸）及植酸盐水解成肌醇与磷酸（或磷酸盐）的一类酶的总称。大量研究表明,在禽类日粮中添加植酸酶可减少饲料中磷的添加量,这对提高畜牧生产效益及减轻环境污染有重要意义。目前已开发出商品化的植酸酶制剂,植酸酶作为饲料添加剂已应用于实际生产,而植酸酶产量供给有限,限制了植酸酶的应用,因此植酸酶生产相关的研究工作大多围绕提高植酸酶的产量而展开。毕赤酵母表达系统是一种成熟且应用广泛的真核表达系统,以毕赤酵母作为宿主菌高密度发酵表达植酸酶可以显着提升植酸酶的产量。外源蛋白的表达水平与所用菌株的特性、外源基因拷贝数及稳定性等因素相关,同时发酵过程中的优化是下游生产过程中提高产率、降低生产成本的重要途径。本研究的思路是根据Invitrogen公司提供的《毕赤酵母实验操作手册》和《毕赤酵母发酵工艺手册》,在摇瓶水平对培养基主要成分和发酵条件进行单因素多梯度优化,找到最适水平。得到毕赤酵母工程菌产植酸酶在摇瓶水平中的最适条件分别为诱导时间120h、诱导pH为5.5,诱导甲醇添加量1.5%、装液量10%、诱导温度28℃,为高密度发酵罐发酵提供数据参考基础。经过优化后,毕赤酵母工程菌产植酸酶的能力明显优于优化前,产酶能力提升了31.9%。然后以摇瓶发酵得到的优化工艺条件为基础,在3L和15L发酵罐中放大发酵并优化了诱导温度和初始诱导pH两个因素。找出毕赤酵母工程菌产植酸酶高密度发酵适宜条件以提高植酸酶的表达量,优化条件下的毕赤酵母工程菌发酵产植酸酶的酶活力明显高于未优化前,3L罐最高酶活可达到18708 U/mL,比未优化前提高38.3%,而15 L罐植酸酶酶活最高达到23189 U/mL,相较于3L罐水平,菌种生长OD600提高了10.5%,植酸酶酶活提高了24.0%此外,本研究在15L罐发酵水平优化了毕赤酵母工程菌在诱导产酶阶段的甲醇流加速率。为了确定植酸酶发酵过程中最合适的甲醇流加速率,通过控制3.5 g/（L·h）、5.5 g/（L·h）、7.5 g/（L·h）这3种甲醇流加速率,探讨不同甲醇流加速率条件下的毕赤酵母工程菌的植酸酶产量。结果表明,在甲醇流加速率为5.5 g/（L·h）条件下,发酵结束时,植酸酶酶活达到26386 U/mL,是3.5 g/（L·h）甲醇流加速率的106.83%、7.5 g/（L·h）甲醇流加速率的122.17%,该甲醇流加速率对发酵生产植酸酶最有利。本论文对表达植酸酶的重组毕赤酵母发酵条件进行优化,探索出合适的发酵工艺,同时通过对发酵过程中相关参数的测定,缓解了重组毕赤酵母发酵过程中存在的多拷贝重组菌诱导阶段生长缓慢、植酸酶表达活性低等问题,为植酸酶的大规模工业化生产提供技术和理论指导。
任培森[4]（2018）在《大肠杆菌DH5α规模化生产禽流感DNA疫苗的工艺及免疫应用研究》文中研究说明禽流感是由A型流感病毒引起的急性传染病,主要侵害禽类的呼吸和神经系统。在我国主要存在LPAI和HPAI两种类型的禽流感病毒,禽流感病毒毒株的不同亚型同时存在也是普遍现象。HPAI占我国禽流感发生次数的90%以上,在东中西部很多地区均有爆发且发病率、死亡率均比较高,致死率高达70%以上,对我国养殖业造成了非常大的经济损失。目前该病主要靠灭活疫苗接种来预防控制,在我国对HPAI农业部采取强制免疫。由于禽流感病毒基因突变率很高,尤其主要保护性抗原的HA基因突变非常频繁,使得H5亚型高致病性禽流感病毒出现了很多不同的病毒株,但是疫苗毒株相对滞后,同时灭活疫苗存在免疫剂量大、免疫副反应强、干扰流行病学检测等诸多缺点。禽流感DNA疫苗在激活体液免疫的同时也能诱发细胞免疫,而且免疫副反应小,不涉及病毒扩散等优点,其有望成为灭活疫苗的替代产品,国外已经有禽流感的商品化核酸疫苗,禽流感H5亚型DH5α-pCAGGoptiHA5 DNA疫苗新兽药核发已通过。重组菌的小规模培养和质粒小量提取技术,在实验室已经是非常成熟的技术,但是要规模化应用于兽用疫苗生产有较大困难,获得规模化高效表达和高效率提纯是当前主要瓶颈,DNA疫苗生产工艺优化是当前迫切需要。本研究摸索了在100L发酵罐中培养基筛选并建立了种子库,优化了DH5α-pCAGGoptiHA5规模化培养的参数条件,并进一步对放大至1000L发酵罐中禽流感DNA生产工艺进行了更为详细的参数研究。此外,对生产的DNA疫苗进行了免疫研究,探索DNA疫苗联合应用的可能性,为其它产品工艺和产品应用提供有效参考。结合统计学方法、响应面法、最陡爬坡法对DH5α-pCAGGoptiHA5培养工艺的各因素优化研究,筛选出培养基优化配方:胰蛋白胨（10g/L）,蔗糖（17.5g/L）,酵母粉（7.5g/L）,硫酸铵（7.5g/L）,NaCl（10g/L）,利用100L反应器发酵培养,最终质粒浓度为115.25mg/L,产量提高88.52%。菌株经连续传15代后,通过菌培养特性和质粒遗传稳定性筛选,得到适应性良好的菌株15株,成功建立了菌种库,该菌株质粒非常稳定,且纯净性较好。通过规模化生产后,该菌种的质粒稳定性也非常好。通过对生产过程中主要影响因素进行优化实验,利用1000L发酵罐,成功进行了规模化放大生产。结果显示在接种量8%、溶氧30%的补料发酵,37.0℃转42.0℃温度诱导5h,质粒产量高达359.2mg/L,产量提高108.9%,具有可重复性,为规模化生产提供有效数据。利用改进的裂解提取法,采用自主研发的裂解仪、絮状物去除仪、切向流过滤组合工艺,使裂解效率提高15倍,质粒回收效率提高了18.74%,质粒纯度良好。利用质粒制备的禽流感DNA疫苗进行了免疫实验,20μg质粒免后5周抗体即可达到7.3log2;200μg质粒大剂量进行免疫后观察14天,鸡只状态良好,无不良反应;30μg质粒剂量进行免疫两次,连续监测6个月,抗体效价平均为5.4log2。通过禽流感DNA疫苗和转移因子联合免疫研究摸索,结果表明二者联合免疫能提高禽流感抗体水平1.2个滴度,为禽流感DNA疫苗的临床推广应用提供参考。
姚绎[5]（2018）在《RNA复制表达技术的开发及其与宿主间关联的研究》文中研究表明代谢工程领域的主旨即通过人工改造的微生物生产人类所需的产物,而微生物改造技术的发展是其领域进步的基石。对于微生物特定性状的改造十分依赖于对于人工设计的外源基因在目的菌株内进行高效而可控的表达,而本课题即开发出一种全新的对于目的基因表达进行增强的方式。相较于传统菌种表达技术主体针对目的基因的拷贝数、转录、稳定性、翻译等过程进行优化,本课题首次提出可以通过RNA复制的方式针对目的基因的mRNA进行直接扩增,通过mRNA量的直接增加增强目的基因的表达。该方式提升的是目的基因的mRNA含量,与现有对于目的基因的调控方式互不干扰,从而可以实现其与其余调控方式的联合使用。本课题自Qβ噬菌体序列改造得到同样可在大肠杆菌内复制的表达序列,并将其进行通用化改造得到仿造噬菌体的RNA复制系统,以之实现针对人们需求目的基因的表达增强。本课题证明了该系统的有效性、复制性及通用性,可以为后续将之使用于具体工程菌株改造中提供基础。此外,本课题还对RNA复制系统发挥功能时与底盘菌株之间的关联进行了探索,并得出在敲除底盘菌株Rnc基因时,RNA复制系统的效果具有很大改善。同时,本课题也对RNA复制系统在两种目的产物ALA及PHB生产中的效果进行验证,并均使产物产量得到了提升。本课题还验证了RNA复制系统在革兰氏阳性菌乳酸菌（Lb.caseil Zhang）中同样可以发挥功能。这些研究同样预示着本课题所提出的RNA复制系统在代谢工程领域的应用前景。综上所述,本课题构建了促进目的基因表达的一种新方法,即通过RNA复制系统增加mRNA表达量。该方法在报告基因与实际产物中均工作良好,有望成为未来代谢工程菌种改造的又一有力工具。
吕晴霁,潘忠超,石和荣,杨慧荣,王树启,赵会宏[6]（2017）在《斜带石斑鱼生长激素基因重组蛋白的发酵》文中指出将含有石斑鱼生长激素基因的毕赤酵母X33进行震荡培养后,装入≥50L的自控罐中,2830.5℃、pH 5.56.0、溶解氧≥30mg/L条件下发酵84h,生产石斑鱼生长激素基因重组蛋白。发酵期间,通过甲醇诱导毕赤酵母获得目的蛋白的高效表达,最后通过Western Blot和SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶电泳对目的蛋白进行定性定量检测。最终获得目的蛋白表达量约为1.52.0g/L,约占胞外可溶性总蛋白的16.4%。本试验用自控罐发酵生产含有斜带石斑鱼生长激素基因重组蛋白的毕赤酵母生产工艺,为实现工业化生产鱼类生长激素饵料添加剂奠定基础。
白婧[7]（2015）在《利用谷氨酸棒状杆菌高效表达谷氨酰胺合成酶发酵生产L-谷氨酰胺》文中研究指明谷氨酸棒状杆菌（C glutamicum）,革兰氏阳性细菌,是应用于发酵生产中最重要的菌种之一,常被用来生产L-赖氨酸,L-谷氨酸,谷氨酸钠和L-谷氨酰胺（L-Gln）等。谷氨酰胺合成酶（GS）是L-谷氨酰胺（L-Gln）合成过程中的关键酶,然而GS的酶活性会受到多种因素的影响,导致其酶活力不强,产物L-Gln偏低,因此掌握谷氨酰胺合成酶的功能和特性对于L-Gln发酵生产具有特殊意义。本文以GS的基因为研究对象,构建谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）的高效表达系统。利用C.glutamicum中的两种强启动子:tac启动子（Ptac）和麦芽糖启动子（Pmal）,比较不同启动子作用下GS的酶活力;其次,为了避免腺苷酰化对C.glutamicum的GS的抑制作用,将GS的腺苷酰化位点突变成苯丙氨酸（Tyr405Phe）;同时由于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的谷氨酰胺合成酶不受腺苷酰化作用的影响,故将Bacillussubtilis的GS基因导入到C.glutamicum的表达系统中,比较两种基因来源不同GS的酶活力高低,以期达到高产L-Gln的目的。最终结果表明,在谷氨酸棒状杆菌的表达系统中,Ptac比Pmal的效果更好,来自C.glutamicum的GS突变型比来自Bacillus subtilis的GS酶活力更高。重组菌BJ2有最高的酶活力和产量,L-Gln的最终产量达到32.5 g/L。
遇文婧[8]（2014）在《深绿木霉刺激植物响应蛋白TatEpl1诱导杨树系统抗病性机制》文中进行了进一步梳理木霉菌（Trichoderma spp.）是一种应用前景广阔的生防菌,不仅能够抑制多种病原真菌,而且具有诱导植物免疫反应、促进植物生长、降解土壤中的盐类化合物、农药残留物及重金属等功能,生防潜力巨大,被广泛应用于农业和林业。在对其生防机制的深入研究下发现木霉菌能够分泌一些小分子蛋白能够刺激寄主植物对病原真菌产生防御响应,其中包括刺激植物响应蛋白Epl1（Eliciting Plant Response Protein 1）。刺激植物响应蛋白Epl1是一种小分子分泌型半胱氨酸富含蛋白,属于cerato-platanin蛋白家族,无毒,被称为新型植物诱导剂——真菌激活蛋白,具有更高的科研价值和广阔的开发前景。在本研究中,从深绿木霉（T.atroviride）ACCC30153菌株中成功克隆刺激植物响应蛋白基因TatEpl1,经测序得到长度为417 bp的cDNA和487 bp的DNA序列,编码138个氨基酸,预测蛋白分子量为14.37 kDa,等电点5.75,为疏水蛋白。通过BlastP预测其具有cerato-platanin家族的保守区结构域,且与已报道过的绿色木霉（T.virens）Gv29-8分泌刺激植物响应蛋白SM1的氨基酸序列AAZ80388亲缘关系较近,相似性为88%。用荧光定量RT-qPCR方法分析9种不同培养条件下的深绿木霉TatEpl1基因的转录水平。9种培养基分别为MM、C饥饿、N饥饿、1%山新杨（Populus davidiana ×P.alba var.pyramidlis）茎粉或叶粉、1%杨树叶枯病病原菌（Alternariaalternate）或杨树烂皮病病原菌（Cytospora chrysosperma）的细胞壁、5%杨树叶枯病原菌或杨树烂皮病病原菌发酵液。结果显示,9种诱导条件下,TatEpl1基因均呈上调表达;在C饥饿、病原菌细胞壁、病原菌发酵液及山新杨叶粉和茎粉诱导条件下均出现瞬时高表达,其中杨树叶粉和茎粉诱导条件下TatEpl1基因的瞬时表达量最高,分别在16和4 h时达到未诱导时的216和217.8倍。结果说明C饥饿、病原菌及木本植物均能引起深绿木霉ACCC30153的TatEpl1基因转录水平变化,而且在木本植物诱导条件下的表达量最高。为研究深绿木霉的刺激植物响应蛋白TatEpl1的功能,成功构建了TatEpl1基因的原核重组表达载体pGEX-TatEpl1,并转化到大肠杆菌（Escherichia coli）BL21中获得原核重组菌株BL21-TatEpl1,利用IPTG成功诱导表达并纯化出原核重组蛋白E-rTatEpl1,经 SDS-PAGE 电泳检测,在 40.37 kDa（目的蛋白 14.37 kDa+GST标签26 kDa）处可见融合包涵体蛋白,与理论值基本一致,最佳诱导时间为4 h。同时,成功构建了基因TatEpl1的真核重组表达载体pPIC9K-TatEpl1并转化到毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中获得毕赤酵母重组菌株GS115-TatEpl1,并利用甲醇成功诱导表达了分泌型毕赤酵母重组蛋白Y-rTatEpl1,经Tricine-SDS-PAGE电泳检测,在14.37 kDa处可见分泌蛋白,与理论值基本一致,最佳诱导时间为6 h。证明TatEpl1蛋白在大肠杆菌和毕赤酵母中均能大量表达。为研究TatEpl1蛋白对木本植物的刺激响应作用,探讨了用两株工程菌分泌的重组蛋白分别诱导的山新杨的生理变化、激素相关基因转录模式及抗病能力。结果表明,（1）经重组蛋白诱导的山新杨的增长量明显高于未经诱导的山新杨。经原核重组蛋白E-rTatEpl1诱导的山新杨平均增长量为对照的10.3%,经毕赤酵母重组蛋白Y-rTatEpl1诱导的山新杨平均增长量为对照的12.5%,而且根部生长均非常旺盛。（2）经过重组蛋白诱导的山新杨叶片的生理酶活性均发生强烈变化。经原核重组蛋白E-rTatEpl1诱导的山新杨,PPO、PAL、SOD、POD和CAT分别在5 d、5 d、2d、5 d和12 h增长量最大,分别为对照的4.0、6.0、0.9、2.2和5.6倍;经毕赤酵母重组蛋白Y-rTatEpl1诱导的山新杨,PPO、PAL、SOD、POD和CAT分别在3d、3d、3d、12 h和5 d增长量最大,分别为对照的3.3、3.1、3.3、1.6和7.7倍。（3）在原核重组蛋白E-rTatEpl1和毕赤酵母重组蛋白Y-rTatEpl1诱导下的山新杨生长素、水杨酸、茉莉酸途径中的调控基因与未经诱导的山新杨相比均有明显的转录水平变化,并激活生长素和抗病相关基因的表达。（4）分别在原核重组蛋白E-rTatEpl1和毕赤酵母重组蛋白Y-rTatEpl1诱导下的山新杨对杨树叶枯病均产生抗病性。这些结果证明刺激植物响应蛋白TatEpl1不仅能够促进杨树生长,重要的是能够引起杨树防御响应,并使杨树对病原菌产生抗病性。综上所述,TatEpl1基因的克隆、生物信息学分析及转录模式的研究为刺激植物响应蛋白的研究提供基础数据;TatEpl1蛋白的异源表达和特性分析为新型植物诱导剂的开发与利用提供理论依据和技术支持,同时,为新型农药的生产和应用奠定良好的物质基础。
戚楠,张艳红,吴军,马清钧[9]（2012）在《毕赤酵母高效分泌长效人生长激素的研究》文中研究表明目的:为了延长人生长激素（HGH）在血浆中的半衰期,构建了高效分泌表达人血清白蛋白（HSA）与HGH融合蛋白（HSA-HGH）的工程毕赤酵母菌株。方法:从人胎肝cDNA文库中扩增HSA基因,从HGH工程菌载体中扩增HGH基因,将其克隆至真核表达载体pHIL-D2,载体线性化后采用电击法转化毕赤酵母GS115。通过原位双层膜法筛选高效分泌表达菌株。分别采用SDS-PAGE和Western印迹鉴定融合蛋白。对工程酵母培养条件进行研究,发酵液经离子交换层析、亲和层析和分子筛层析纯化。纯化的蛋白经N端序列测定,分子量测定和等电聚焦电泳进行鉴定。冻干的蛋白制剂经食蟹猴试验进行药代动力学和药效动力学测试。结果:确立了工程酵母的最佳培养工艺,融合蛋白表达量达100mg/L。纯化后蛋白纯度达95%以上,得率达42%。融合蛋白与预期结果一致,经食蟹猴试验,显示有良好的生物活性,与等摩尔剂量的重组人生长激素相比,半衰期延长6.8倍,清除率慢44倍。结论:融合蛋白呈现明显的长效动力学特征,为开发重组长效人生长激素HSA-HGH融合蛋白药物（rHSA-HGH）奠定了基础。
谢帝芝[10]（2011）在《重组生长激素酵母饲料的研究》文中认为生长激素（Growth hormone, GH）是脊椎动物脑垂体分泌的促进机体生长发育的单链多肽激素。正常鱼体内生长激素分泌量少,不能满足水产养殖的需要,利用重组DNA技术与大规模培养技术,开展鱼类GH基因工程酵母菌饲料的研究,对鱼类生长激素在养殖中的应用具有重要的科学意义及应用价值。本研究根据GenBank数据库中登记的青鱼（Mylopharyngodon piceus）生长激素基因序列（AF389238）设计特异性引物,采用RT-PCR技术扩增青鱼生长激素（black carp growth hormone, bcGH） cDNA编码区,定向插入含强启动子AOXI的表达载体pPIC3.5k,电击转入毕赤酵母GS115菌株。经甲醇诱导表达,蛋白表达产物的SDS-PAGE和ELISA检测,bcGH在酵母胞内得到正确表达,成功获得重组鱼生长激素酵母（重组bcGH酵母）。250 mL三角瓶中,在pH值6.5、0.5%甲醇、温度30℃和培养时间72 h的诱导条件下,目的蛋白的表达量高达893mg/L。利用正交实验探讨了重组bcGH酵母在豆粕中的发酵条件。结果表明,温度、pH值、培养时间、豆粕浓度、接种量和诱导剂浓度均对生长激素蛋白表达量有影响,在时间96 h, pH6.5,接种量6%,发酵温度30℃,诱导剂浓度1%,豆粕浓度7%等优化条件下,活菌数达到7.96×109cfu/mL, bcGH表达量最高。以重组bcGH酵母发酵豆粕进行鲫鱼生长试验,考察生长性能、血清指标以及IGF基因表达等指标,结果表明,实验组饲料生长性能和血清指标差异明显（p<0.05）,其中相对体重生长率、尿素氮、三碘甲状腺原氨酸T3、甲状腺素、胰岛素水平差异极显着（P<0.01）。肝脏IGF-Ⅰ和IGF-ⅡmRNA相对表达量差异极显着（P<0.01）综上所述,本研究将重组bcGH酵母诱导发酵的豆粕直接添加到鲫鱼基础饲料中,配制成重组bcGH酵母饲料,并将其运用到鱼类养殖上,显着提高了鲫鱼生长性能及其相关基因的表达,为研发绿色、安全、高效的新型微生物渔用配合饲料奠定了基础。
二、人肠生长激素工程菌高效表达培养工艺的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人肠生长激素工程菌高效表达培养工艺的研究（论文提纲范文）
（1）基于蛋白质结构预测的IGF-1的制备及活性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1 章 绪论 |
| 1.1 课题背景 |
| 1.1.1 胰岛素样生长因子-1的研究进展 |
| 1.1.2 胰岛素样生长因子-1国内外生产现状 |
| 1.2 小结 |
| 1.3 本研究的主要内容、目标与方法 |
| 1.3.1 主要研究内容 |
| 1.3.2 研究目标 |
| 1.3.3 技术路线 |
| 第2 章 融合蛋白与相应蛋白酶的虚拟筛选 |
| 2.1 预测服务器 |
| 2.2 预测方法 |
| 2.2.1 融合蛋白氨基酸序列的获取 |
| 2.2.2 融合蛋白二级结构预测 |
| 2.2.3 融合蛋白三级结构预测 |
| 2.2.4 融合蛋白与蛋白酶分子对接 |
| 2.3 预测结果 |
| 2.3.1 融合蛋白结构预测结果 |
| 2.3.2 融合蛋白与蛋白酶分子对接结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3 章 胰岛素样生长因子-1融合蛋白的载体构建 |
| 3.1 实验材料和仪器 |
| 3.1.1 菌株、质粒 |
| 3.1.2 工具酶 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 胰岛素样生长因子-1原核表达载体的构建及重组子的筛选 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 目的片段PCR扩增结果 |
| 3.3.2 抽提质粒结果 |
| 3.3.3 重组质粒PCR鉴定结果 |
| 3.3.4 双酶切鉴定结果 |
| 3.3.5 胰岛素样生长因子-1序列测定及比对结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4 章 胰岛素样生长因子-1融合蛋白的诱导表达及优化 |
| 4.1 实验材料和仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 胰岛素样生长因子-1融合蛋白的诱导表达 |
| 4.2.2 融合蛋白的Western Blot鉴定 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 表达菌株对蛋白表达的影响 |
| 4.3.2 诱导温度对蛋白表达的影响 |
| 4.3.3 诱导时间对蛋白表达的影响 |
| 4.3.4 IPTG浓度对蛋白表达的影响 |
| 4.3.5 融合蛋白的Western Blot鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 第5 章 胰岛素样生长因子-1的分离纯化及酶切优化 |
| 5.1 实验材料与仪器 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 融合蛋白的分离纯化及酶切优化 |
| 5.2.2 反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯度鉴定 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 融合蛋白亲和层析结果 |
| 5.3.2 酶量及酶切方式对酶切结果的影响 |
| 5.3.3 温度及Ca~(2+)浓度对酶切结果的影响 |
| 5.3.4 酶切时间对酶切结果的影响 |
| 5.3.5 DTT对酶切结果的影响 |
| 5.3.6 酶切产物亲和层析结果 |
| 5.3.7 RP-HPLC纯度鉴定 |
| 5.4 讨论 |
| 第6 章 利用3T3细胞检测胰岛素样生长因子-1的活性 |
| 6.1 实验材料与仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 培养液的配制 |
| 6.2.2 3T3细胞的冻存 |
| 6.2.3 3T3细胞的复苏 |
| 6.2.4 胰岛素样生长因子-1活性测定方法的建立 |
| 6.2.5 融合蛋白及胰岛素样生长因子-1样品活性检测 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 铺板细胞密度优化结果 |
| 6.3.2 胰岛素样生长因子-1作用时间优化结果 |
| 6.3.3 铺板及维持培养血清优化结果 |
| 6.3.4 初始培养血清优化结果 |
| 6.3.5 胰岛素样生长因子-1初始浓度及稀释倍数结果 |
| 6.3.6 胰岛素样生长因子-1样品及融合蛋白活性检测结果 |
| 6.4 讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及科研成果 |
（2）人生长激素在毕赤酵母中的分泌表达（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 重组人生长激素的研究进展 |
| 1.1.1 人生长激素的结构与性质 |
| 1.1.2 人生长激素的功能及生理作用 |
| 1.1.3 人生长激素的基因工程表达 |
| 1.1.4 重组人生长激素的分析检测 |
| 1.2 密码子 |
| 1.2.1 密码子种类及特点 |
| 1.2.2 密码子的偏爱性 |
| 1.2.3 密码子的优化 |
| 1.2.4 修饰宿主提高外源蛋白的表达 |
| 1.3 毕赤酵母表达外源基因的研究进展 |
| 1.3.1 宿主 |
| 1.3.2 表达载体 |
| 1.3.3 外源蛋白表达的优化 |
| 1.3.4 发酵条件的优化及分离纯化 |
| 1.3.5 展望 |
| 1.4 本研究的目的意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验中使用的试剂 |
| 2.1.2 实验中用到的仪器 |
| 2.1.3 主要培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 单链寡核苷酸的化学合成 |
| 2.2.2 DA-PCR拼接及反应条件优化 |
| 2.2.3 T7 核酸内切酶Ⅰ处理 |
| 2.2.4 OE-PCR法拼接全基因 |
| 2.2.5 测序载体p UC-h GH的构建 |
| 2.2.6 质粒的抽提及鉴定 |
| 2.2.7 重组质粒的构建 |
| 2.2.8 表达质粒转化酵母宿主菌 |
| 2.2.9 G418 筛选整合有多拷贝子h GH基因的克隆 |
| 2.2.10 阳性菌落的筛选 |
| 2.2.11 酵母染色体中整合h GH基因的PCR鉴定 |
| 2.2.12 表达菌株的诱导表达 |
| 2.2.13 重组人生长素的纯化 |
| 2.2.14 纯化产物鉴定和分析 |
| 2.2.15 小量摇瓶表达条件的优化 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 蛋白质序列的逆翻译与密码子优化 |
| 3.2 序列全长及单链寡核苷酸的拆分 |
| 3.3 DA-PCR结果 |
| 3.4 OE-PCR结果 |
| 3.5 测序载体PUC-HGH的构建 |
| 3.6 基因测序结果 |
| 3.7 酵母表达质粒的重组构建与鉴定 |
| 3.8 转化子的筛选及PCR检测 |
| 3.9 重组目的蛋白的表达与鉴定 |
| 3.9.1 SDS-PAGE电泳检测 |
| 3.9.2 Western Blotting检测 |
| 3.9.3 Folin-酚法测定总蛋白质含量 |
| 3.9.4 hGH的 ELISA检测 |
| 3.9.5 hGH的纯化 |
| 3.9.6 表达产物的相对分子质量测定及N-端序列分析 |
| 3.10 HGH生物学活性初步研究 |
| 3.10.1 去脑垂体幼龄大鼠的制备 |
| 3.10.2 试验分组与给药 |
| 3.10.3 检测指标 |
| 3.10.4 数据处理结果 |
| 3.11 HGH发酵条件的优化 |
| 3.11.1 工程菌株生长周期的观察 |
| 3.11.2 诱导时间对表达的影响 |
| 3.11.3 温度和pH对表达的影响 |
| 3.11.4 保护剂对表达的影响 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）毕赤酵母工程菌产植酸酶的发酵优化及放大（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 植酸酶的研究进展 |
| 1.1.1 植酸的简介 |
| 1.1.2 植酸酶的简介 |
| 1.1.3 植酸酶的分类 |
| 1.1.4 植酸酶的结构 |
| 1.1.5 植酸酶的理化性质 |
| 1.2 微生物植酸酶的研究进展 |
| 1.2.1 微生物植酸酶的来源 |
| 1.2.2 微生物植酸酶的生产 |
| 1.3 植酸酶的应用 |
| 1.3.1 植酸酶在食品工业中的应用 |
| 1.3.2 植酸酶在饲料中的应用 |
| 1.4 毕赤酵母表达系统研究进展 |
| 1.4.1 毕赤酵母表达系统简介 |
| 1.4.2 毕赤酵母的生物学特性 |
| 1.4.3 毕赤酵母的遗传学特性 |
| 1.5 影响毕赤酵母发酵的因素 |
| 1.5.1 培养基 |
| 1.5.2 温度 |
| 1.5.3 pH值 |
| 1.5.4 溶氧量 |
| 1.5.5 甲醇 |
| 1.6 本课题研究的意义与主要内容 |
| 1.6.1 本课题研究的意义 |
| 1.6.2 本课题研究的内容 |
| 第二章 赤酵母工程菌产植酸酶的摇瓶发酵工艺优化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与设备 |
| 2.2.1 实验菌种 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器与设备 |
| 2.2.4 培养基及溶液 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.0 培养方法 |
| 2.3.1 菌体浓度测定方法 |
| 2.3.2 植酸酶酶活测定方法 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 诱导时间对毕赤酵母工程菌生长和产酶的影响 |
| 2.4.2 诱导初始pH对毕赤酵母工程菌生长和产酶的影响 |
| 2.4.3 诱导温度对毕赤酵母工程菌生长和产酶的影响 |
| 2.4.4 装液量对毕赤酵母工程菌生长和产酶的影响 |
| 2.4.5 甲醇添加量对毕赤酵母工程菌生长和产酶的影响 |
| 2.4.6 混合补料对毕赤酵母工程菌GAY生长和产酶的影响 |
| 2.4.7 毕赤酵母工程菌产植酸酶摇瓶水平优化前后的对比 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 毕赤酵母工程菌产植酸酶的高密度发酵工艺优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与设备 |
| 3.2.1 实验菌种 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要仪器与设备 |
| 3.2.4 培养基及溶液 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 培养方法 |
| 3.3.2 菌体浓度测定方法 |
| 3.3.3 植酸酶酶活测定方法 |
| 3.3.4 SDS-PAGE分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 3L罐水平毕赤酵母工程菌产植酸酶发酵放大 |
| 3.4.2 15L罐水平毕赤酵母产植酸酶发酵放大 |
| 3.4.3 15L罐水平毕赤酵母产植酸酶甲醇流加速率的优化 |
| 3.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（4）大肠杆菌DH5α规模化生产禽流感DNA疫苗的工艺及免疫应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 abstract 缩略语中英文对照表 第一篇 文献综述 |
| 第1章 禽流感分子流行病学 |
| 1.1 禽流感分子生物学特征 |
| 1.2 禽流感的宿主及传染源 |
| 1.3 禽流感的传播途径及致病机理 |
| 1.4 禽流感的流行情况 |
| 1.5 禽流感的临床症状及病理变化 |
| 1.6 禽流感的诊断 |
| 1.7 禽流感的防治措施 |
| 第2章 国内外禽流感疫苗的研究进展 |
| 2.1 常规禽流感疫苗的研究进展 |
| 2.2 AIV基因工程疫苗的研究进展 |
| 2.3 禽流感DNA疫苗研究进展 |
| 第3章 大肠杆菌工程菌生产质粒DNA的工艺研究进展 |
| 3.1 影响基因工程菌高密度发酵的因素 |
| 3.2 影响质粒DNA产量的因素 |
| 3.3 E.coli质粒DNA提纯工艺研究 第二篇 研究内容 |
| 第1章 重组大肠杆菌DH5α-pCAGGoptiHA5培养基优化与种子库建立 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 禽流感DNA疫苗规模化培养工艺研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 规模化禽流感DNA疫苗提纯工艺与DNA质粒免疫研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 禽流感DNA疫苗和转移因子联合免疫效果研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 结论 参考文献 导师简介 作者简介 致谢 |
（5）RNA复制表达技术的开发及其与宿主间关联的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要英文缩略词对照表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 问题的提出 |
| 1.2 选题背景及意义 |
| 1.3 文献综述 |
| 1.3.1 代谢工程综述 |
| 1.3.2 细菌中传统提升目的基因表达的方法综述 |
| 1.3.3 病毒及真核生物中的RNA复制行为综述 |
| 1.3.4 Qβ噬菌体及其复制过程综述 |
| 1.3.5 RNA复制过程在方法学中的应用 |
| 1.4 论文研究方法 |
| 1.5 论文结构 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 细菌细胞培养实验试剂 |
| 2.1.4 分子生化实验试剂 |
| 2.1.5 DNA分子量测定 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 培养基的配置 |
| 2.3.2 分子克隆技术 |
| 2.3.3 使用酶标仪测量细菌生长曲线 |
| 2.3.4 使用流式细胞分析仪测定细菌荧光表达量 |
| 2.3.5 使用实时荧光定量核酸扩增检测仪检测RNA含量 |
| 2.3.6 ALA发酵及产量测定 |
| 2.3.7 PHB发酵及产量测定 |
| 2.3.8 HEK293T细胞培养及转染 |
| 2.3.9 转基因鼠的构建 |
| 2.3.10 血清生长激素浓度的测量 |
| 第3章 RNA复制系统的建立 |
| 3.1 在大肠杆菌中使用DNA对Qβ噬菌体序列进行表达 |
| 3.2 仿噬菌体RNA复制系统的建立 |
| 3.2.1 使用报告基因替换噬菌体结构蛋白 |
| 3.2.2 匹配复制系统功能的启动子筛选 |
| 3.2.3 简化仿噬菌体RNA复制系统的建立 |
| 3.3 仿噬菌体RNA复制系统复制功能的验证 |
| 3.3.1 对接头序列的必要性进行验证 |
| 3.3.2 对序列完整的必要性进行验证 |
| 3.3.3 对负链的存在进行验证 |
| 3.3.4 对负链的必要性进行验证 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 对噬菌体生成过程的讨论 |
| 3.4.2 复制系统的构建及其简化 |
| 3.4.3 复制系统的复制功能验证 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 RNA复制相关基因的改造 |
| 4.1 对RNA复制抑制基因的敲除 |
| 4.1.1 对推测RNA复制抑制基因Rnc的敲除 |
| 4.1.2 敲除Rnc基因后复制功能的验证 |
| 4.1.3 敲除Rnc基因后显着改善高浓度模板时的复制效率 |
| 4.2 对RNA复制必须基因的过表达 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 对Rnc基因的敲除 |
| 4.3.2 对EF-Ts和EF-Tu基因的过表达 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 RNA复制系统的优化 |
| 5.1 对于启动子的更换 |
| 5.2 对于复制系统相关元件的更换 |
| 5.2.1 对于复制必须序列的优化 |
| 5.2.2 对于复制酶的优化 |
| 5.3 对于复制系统性能的其余探索 |
| 5.3.1 对于目的基因容量的探索 |
| 5.3.2 对于复制调节序列的添加 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 对于启动子的优化 |
| 5.4.2 对于复制系统本身的优化 |
| 5.4.3 对于复制系统性能的其余探索 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 复制系统在代谢工程方面的应用 |
| 6.1 使用复制系统增强目的产物的产量 |
| 6.1.1 使用复制系统增强ALA的产量 |
| 6.1.2 使用复制系统增强PHB的产量 |
| 6.2 在乳酸菌中测试RNA复制系统 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 使用复制系统增强实际产物的产量 |
| 6.3.2 在乳酸菌中应用RNA复制系统 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 复制系统应用于真核系统尝试 |
| 7.1 RNAe技术的开发 |
| 7.2 RNAe技术的应用前景 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第8章 总结与展望 |
| 8.1 论文总结 |
| 8.2 论文展望 |
| 8.2.1 对底盘菌株与RNA复制系统之间的互作探讨 |
| 8.2.2 对通过优化设计减少复制过程中双链RNA的产生的探讨 |
| 8.2.3 对筛选更优复制系统的探讨 |
| 8.2.4 对将RNA复制系统与其余改造手段相结合的探讨 |
| 8.2.5 对将RNA复制系统应用于代谢工程领域的展望 |
| 8.2.6 对将RNA复制系统应用于真核系统的展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 人工合成DNA序列 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
（6）斜带石斑鱼生长激素基因重组蛋白的发酵（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌种 |
| 1.1.2 试剂及仪器 |
| 1.1.3 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基 |
| 1.1.4 改良基本盐培养基 |
| 1.1.5 营养盐培养基 |
| 1.1.6 PTM1 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 菌种的保存与扩大培养 |
| 1.2.2 摇瓶发酵 |
| 1.2.3 自控罐发酵 |
| 1.2.4 湿质量检测与测定 |
| 1.2.5 SDS-PAGE电泳 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 自控罐发酵 |
| 2.1.1 发酵诱导前后发酵液温度和pH变化 |
| 2.1.2 诱导前后发酵液溶解氧的变化 |
| 2.1.3 诱导前后菌体湿质量的变化 |
| 2.2 重组蛋白的Western Blot鉴定 |
| 2.3 蛋白质量浓度的测定以及目的蛋白表达量的估算 |
| 2.4 发酵上清液目的蛋白表达量随时间的变化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 培养基的选择对发酵的影响 |
| 3.2 pH以及发酵温度对发酵的影响 |
| 3.3 甲醇体积分数对发酵效果的影响 |
| 3.4 最佳发酵时间的确定 |
| 4 结论 |
（7）利用谷氨酸棒状杆菌高效表达谷氨酰胺合成酶发酵生产L-谷氨酰胺（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 L-谷氨酰胺在自然界的存在和理化性质 |
| 1.2 L-谷氨酰胺的生理功能 |
| 1.2.1 抗胃肠道溃疡作用 |
| 1.2.2 L-谷氨酰胺的免疫功能 |
| 1.2.3 L谷氨酰胺的营养保健作用 |
| 1.2.4 L-谷氨酰胺在细胞培养方面的应用 |
| 1.3 谷氨酰胺的市场状况与发展前景 |
| 1.4 生产L-谷氨酰胺的方法 |
| 1.4.1 化学合成法 |
| 1.4.2 酶法 |
| 1.4.3 发酵法 |
| 1.5 基因工程在谷氨酰胺生产中的应用 |
| 1.6 本论文的研究内容 |
| 第二章 谷氨酸棒状杆菌工程菌的构建及GS的酶活力检测 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 菌种与质粒 |
| 1.2 实验主要的试剂和仪器 |
| 1.3 实验的培养基 |
| 1.4 实验的主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 表达载体pEKEX2-Ptac-glnA~m,pEKEX2-Ptac-glnA~(BS)的构建 |
| 2.2 表达载体pEKEX2-Pmal-glnA~m,pEKEX2-Pmal-glnA~(BS)的构建 |
| 2.3 表达载体pEKEX2-Ptac-glnA~m-vgb-F,pEKEX2-Ptac-glnA~(BS)-vgb-F,pEKEX2-Ptac-glnA~m-F-Ptac-vgb-F,pEKEX2-Ptac-glnA~(BS)-F-Ptac-vgb-F的构建 |
| 2.4 Cglutamicum感受态细胞的制备和电击转化 |
| 2.5 Western blot检测重组蛋白的表达 |
| 2.6 谷氨酰胺合成酶的酶活力的检测 |
| 3 实验结果与讨论 |
| 3.1 重组质粒的构建 |
| 3.2 Western blot检测重组蛋白的表达 |
| 3.3 谷氨酰胺合成酶的酶活检测结果 |
| 4 实验讨论 |
| 第三章 谷氨酸棒状杆菌工程菌发酵条件的初步优化 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 菌种 |
| 1.2 实验主要的试剂和仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 培养方法 |
| 2.2 灭菌方法 |
| 2.3 发酵过程中采用的分析方法 |
| 2.4 用HPLC定性地检测L-谷氨酰胺 |
| 2.5 用谷氨酰胺测试盒检测重组菌中L-谷氨酰胺的产量 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 生长曲线的测定结果和葡萄糖的消耗量的检测 |
| 3.2 L-谷氨酰胺发酵培养基的初步优化 |
| 3.3 结合HPLC和谷氨酰胺测试盒检测重组C.glutamicum发酵生产L-Gln的产量 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 |
| 致谢 |
（8）深绿木霉刺激植物响应蛋白TatEpl1诱导杨树系统抗病性机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 课题研究的目的和意义 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 植物诱导剂研究进展 |
| 1.2.2 木霉菌研究进展 |
| 1.2.3 木霉菌刺激植物响应蛋白的研究概况 |
| 1.2.4 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统 |
| 1.3 山新杨概况 |
| 1.4 研究的课题来源、技术路线及主要研究内容 |
| 1.4.1 课题来源 |
| 1.4.2 技术路线 |
| 1.4.3 研究内容 |
| 2 深绿木霉TatEpl1基因的克隆和生物信息学分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 供试试剂 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 供试仪器 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 深绿木霉ACCC30153菌株DNA获取 |
| 2.2.2 深绿木霉ACCC30153菌株cDNA获取 |
| 2.2.3 深绿木霉TatEpl1基因的DNA和cDNA扩增 |
| 2.2.4 核苷酸测序 |
| 2.2.5 TatEpl1基因生物信息学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 深绿木霉ACCC30153基因组DNA |
| 2.3.2 深绿木霉ACCC30153总RNA |
| 2.3.3 深绿木霉刺激植物响应蛋白基因TatEpl1 DNA及cDNA序列的扩增 |
| 2.3.4 TatEpl1基因DNA及cDNA转化大肠杆菌后PCR检测 |
| 2.3.5 深绿木霉刺激植物响应蛋白基因TatEpl1序列分析 |
| 2.3.6 深绿木霉刺激植物响应蛋白TatEpl1特性分析 |
| 2.4 关于TatEpl1基因生物信息学分析的讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 深绿木霉ACCC30153 TatEpl1基因的表达特性分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 供试菌株和树种 |
| 3.1.2 供试试剂 |
| 3.1.3 供试培养基 |
| 3.1.4 供试仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 深绿木霉ACCC30153生防特性研究 |
| 3.2.2 深绿木霉ACCC30153的TatEpl1基因表达特性研究 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 深绿木霉ACCC30153生防特性研究 |
| 3.3.2 深绿木霉ACCC30153的TatEpl1基因表达特性研究 |
| 3.4 关于TatEpl1基因表达特性的讨论 |
| 3.4.1 深绿木霉ACCC30153诱导前培养时间及取样时间的确定 |
| 3.4.2 TatEpl1基因表达特性分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 TatEpl1基因的原核表达及重组蛋白E-rTatEpl1特性分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 供试菌株及载体 |
| 4.1.2 供试试剂 |
| 4.1.3 供试仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 原核表达载体的选择 |
| 4.2.2 pGEX-4T-2质粒的提取 |
| 4.2.3 刺激植物响应蛋白TatEpl1基因的扩增 |
| 4.2.4 重组表达载体pGEX-TatEpl1的构建 |
| 4.2.5 重组表达载体pGEX-TatEpl1的检测及保存 |
| 4.2.6 重组表达载体pGEX-TatEpl1转化大肠杆菌BL21 |
| 4.2.7 原核重组转化子BL21-TatEpl1的诱导表达 |
| 4.2.8 原核重组蛋白E-rTatEpl1的特性分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 原核重组表达载体pGEX-TatEpl1的构建及鉴定 |
| 4.3.2 重组质粒pGEX-TatEpl1转化大肠杆菌BL21及筛选 |
| 4.3.3 原核重组转化菌株BL21-TatEpl1的诱导表达及纯化 |
| 4.3.4 原核重组蛋白E-rTatEpl1的特性分析 |
| 4.4 关于TatEpl1基因的原核表达及重组蛋白E-rTatEpl1特性分析的讨论 |
| 4.4.1 包涵体蛋白的纯化、变性与复性 |
| 4.4.2 原核重组转化菌株BL21-TatEpl1发酵条件的确定 |
| 4.4.3 原核重组蛋白E-rTatEpl1特性分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 TatEpl1基因的毕赤酵母表达及重组蛋白Y-rTatEpl1特性分析 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 供试菌株及载体 |
| 5.1.2 供试试剂 |
| 5.1.3 培养基 |
| 5.1.4 供试仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 真核表达载体的选择 |
| 5.2.2 pPIC9K质粒的提取 |
| 5.2.3 刺激植物响应蛋白TatEpl1基因的扩增 |
| 5.2.4 重组表达载体pPIC9K-TatEpl1的构建 |
| 5.2.5 重组表达载体pPIC9K-TatEpl1的检测及保存 |
| 5.2.6 重组表达载体pPIC9K-TatEpl1转化毕赤酵母GS115 |
| 5.2.7 酵母重组转化子GS115-TatEpl1的诱导表达 |
| 5.2.8 毕赤酵母重组蛋白Y-rTatEpl1的特性分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 真核重组表达载体pPIC9K-TatEpl1的构建及鉴定 |
| 5.3.2 重组表达质粒pPIC9K-TatEpl1转化毕赤酵母GS115及筛选 |
| 5.3.3 酵母重组转化菌株GS115-TatEpl1的诱导表达 |
| 5.3.4 酵母重组蛋白Y-rTatEpl1的特性分析 |
| 5.4 关于TatEpl1基因的真核表达及重组蛋白Y-rTatEpl1特性分析的讨论 |
| 5.4.1 小分子真核表达蛋白Y-rTatEpl1的分离方法 |
| 5.4.2 毕赤酵母重组转化菌株GS115-TatEpl1发酵条件的确定 |
| 5.4.3 山新杨感染杨树叶枯病条件的确定 |
| 5.4.4 毕赤酵母重组蛋白Y-rTatEpl1特性分析 |
| 5.4.5 原核表达系统与真核表达系统分析比较 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）毕赤酵母高效分泌长效人生长激素的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材 料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 HSA与HGH基因的PCR扩增和产物回收 |
| 1.2.2 重组表达载体的构建 |
| 1.2.3 工程酵母的构建、筛选与鉴定 |
| 1.2.4 小量摇瓶表达条件的优化 |
| 1.2.5 工程酵母发酵 |
| 1.2.6 HSA-HGH融合蛋白的纯化 |
| 1.2.7 融合蛋白理化特性测定 |
| 1.2.8 融合蛋白的药代动力学与药效动力学测试 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组表达载体的构建与鉴定 |
| 2.2 工程菌株的构建与筛选 |
| 2.3 工程酵母表达产物的鉴定 |
| 2.3.1 表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳和Western免疫印迹鉴定 |
| 2.3.2 表达的HSA-HGH融合蛋白为单体 |
| 2.4 工程菌株PP-HSAHGH的发酵与表达 |
| 2.4.1 工程菌株生长周期的观察 |
| 2.4.2 诱导起始时间对表达的影响 |
| 2.4.3 诱导时间对表达的影响 |
| 2.4.4 工程菌的发酵罐培养 |
| 2.5 HSA-HGH融合蛋白的纯化 |
| 2.6 融合蛋白的理化特性 |
| 2.7 融合蛋白药代动力学和药效动力学测试 |
| 3 讨 论 |
（10）重组生长激素酵母饲料的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 前言 |
| 2 生长激素研究进展 |
| 2.1 生长激素作用机理 |
| 2.2 生长激素的生理功能研究 |
| 2.2.1 促生长作用 |
| 2.2.2 对物质代谢的影响 |
| 2.2.3 对生殖生理的影响 |
| 2.2.4 对免疫功能的影响 |
| 2.2.5 其它作用 |
| 2.3 影响生长激素分泌的因素 |
| 3 生长激素基因工程菌研究进展 |
| 3.1 生长激素基因工程菌的构建及表达研究 |
| 3.1.1 生长激素基因在大肠杆菌中表达 |
| 3.1.2 生长激素基因在酵母中表达 |
| 3.1.3 生长激素在其它表达系统中的表达 |
| 3.2 外源生长激素的吸收机理 |
| 3.3 生长激素基因工程菌安全性评价 |
| 3.3.1 外源生长激素残留问题 |
| 3.3.2 诱导剂的副作用 |
| 3.4 生长激素基因工程菌的应用 |
| 4 研究目的和意义 |
| 第二章 重组生长激素酵母的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 菌株和质粒 |
| 1.1.3 主要药品和试剂 |
| 1.1.4 培养基 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 青鱼脑垂体总RNA提取 |
| 1.2.3 cDNA第一链的合成 |
| 1.2.4 青鱼GH-cDNA克隆 |
| 1.2.5 pPIC3.5K-bcGH表达载体的构建 |
| 1.2.6 转化酵母细胞 |
| 1.2.7 多拷贝转化子的筛选及鉴定 |
| 1.2.8 重组酵母诱导表达和考染检测 |
| 1.2.9 蛋白纯化及Elisa鉴定 |
| 1.2.10 目的蛋白定量检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 脑垂体总RNA提取结果 |
| 2.2 青鱼生长激素cDNA片段扩增 |
| 2.3 重组表达载体pPIC3.5K-bcGH的构建与鉴定 |
| 2.4 重组酵母的获得与鉴定 |
| 2.5 表达产物的鉴定及其表达条件优化 |
| 2.6 表达产物纯化及ELISA鉴定 |
| 2.7 目的蛋白含量测定 |
| 3 讨论 |
| 第三章 重组生长激素酵母液态发酵条件的研究 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 主要药品与试剂 |
| 1.3 培养基 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 种子培养方法 |
| 2.2 发酵培养方法 |
| 2.3 10L发酵罐发酵 |
| 2.4 活菌数和bcGH表达量的检测 |
| 2.4.1 YPD平板计数法检测 |
| 2.4.2 SDS-PAGE电泳检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 发酵条件单因素试验 |
| 3.1.1 发酵时间对重组bcGH酵母生长及其表达量的影响 |
| 3.1.2 发酵温度对重组bcGH酵母生长及其表达量的影响 |
| 3.1.3 接种量对重组bcGH酵母生长及其表达量的影响 |
| 3.1.4 豆粕浓度对重组bcGH酵母生长及其表达量的影响 |
| 3.1.5 诱导剂浓度对重组bcGH酵母生长及其表达量的影响 |
| 3.1.6 pH值对重组bcGH酵母生长及其表达量的影响 |
| 3.2 发酵条件多因子正交试验 |
| 3.2.1 发酵因素与水平的确定 |
| 3.2.2 正交试验结果及分析 |
| 3.3 正交试验验证试验 |
| 3.4 10L发酵罐发酵试验结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 重组生长激素酵母饲料促生长作用及其机理的研究 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 试验饲料设计 |
| 2.2 饲养试验 |
| 2.3 指标测定及方法 |
| 2.3.1 生长性能指标 |
| 2.3.2 血清指标 |
| 2.4 引物设计 |
| 2.5 湘云鲫肝脏总RNA制备 |
| 2.5.1 总RNA提取及电泳检测 |
| 2.5.2 总RNA Dnase酶处理 |
| 2.6 IGFs-cDNA片段克隆 |
| 2.7 实时荧光定量PCR |
| 2.8 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 对鲫鱼生长性能的影响 |
| 3.2 对鲫鱼血清指标的影响 |
| 3.3 RNA浓度测定及质量鉴定 |
| 3.4 PCR扩增检测 |
| 3.5 对鲫鱼肝脏IGFs mRNA表达影响 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 创新与后续工作 |
| 参考文献 |
| 英文缩写名词索引 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、人肠生长激素工程菌高效表达培养工艺的研究（论文参考文献）
- [1]基于蛋白质结构预测的IGF-1的制备及活性分析[D]. 谢倩. 江汉大学, 2021(01)
- [2]人生长激素在毕赤酵母中的分泌表达[D]. 郭丹. 吉林大学, 2020(08)
- [3]毕赤酵母工程菌产植酸酶的发酵优化及放大[D]. 王旺. 华南理工大学, 2019(06)
- [4]大肠杆菌DH5α规模化生产禽流感DNA疫苗的工艺及免疫应用研究[D]. 任培森. 吉林大学, 2018(12)
- [5]RNA复制表达技术的开发及其与宿主间关联的研究[D]. 姚绎. 清华大学, 2018(04)
- [6]斜带石斑鱼生长激素基因重组蛋白的发酵[J]. 吕晴霁,潘忠超,石和荣,杨慧荣,王树启,赵会宏. 水产科学, 2017(01)
- [7]利用谷氨酸棒状杆菌高效表达谷氨酰胺合成酶发酵生产L-谷氨酰胺[D]. 白婧. 南京师范大学, 2015(02)
- [8]深绿木霉刺激植物响应蛋白TatEpl1诱导杨树系统抗病性机制[D]. 遇文婧. 东北林业大学, 2014(05)
- [9]毕赤酵母高效分泌长效人生长激素的研究[J]. 戚楠,张艳红,吴军,马清钧. 中国生物工程杂志, 2012(12)
- [10]重组生长激素酵母饲料的研究[D]. 谢帝芝. 湖南农业大学, 2011(04)