一、犬腺病毒Ⅱ型弱毒疫苗株的分离、鉴定与筛选（论文文献综述）
巨敏莹[1]（2020）在《犬四种病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立》文中研究表明犬瘟热病毒（CDV）、犬副流感病毒（CPIV）、犬细小病毒（CPV）和犬腺病毒Ⅱ型（CAV-2）是引起犬常见传染病的主要病原体,给养犬业带来了严重经济损失。本研究根据四种病毒在GenBank中登录的序列,设计四条引物和四条TaqMan探针,通过优化反应条件以及敏感性、特异性和重复性试验,建立四种病毒单重TaqMan实时荧光定量PCR方法以及四重TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果表明,四种病毒单重方法对CAV-Ⅱ、CPV、CPIV最小检出量均为101copies/μL,CDV最小检出量为102-101copies/μL,敏感性高;标准曲线线性关系良好,相关系数（R2）均大于0.990;四种病毒只在本病毒阳性模板有扩增信号,特异性强。CPV和CAV-Ⅱ两种病毒组内和组间变异系数均小于2%,CPIV和CDV两种病毒组内和组间变异系数均小于3%,重复性良好。检测了 72份样品结果均能特异性检测出四种病毒。四重方法的敏感性,CAV-Ⅱ和CDV可以达到102copies/μL,CPV和CPIV可以达到103 copies/μL,敏感性较高;标准曲线线性关系良好,相关系数（R2）均大于0.990。不同病毒之间无交叉反应且仅有阳性模板有扩增信号,特异性强。四种病毒组内和组间变异系数均小于5%,重复性良好。检测了 26份样品,同时与普通PCR方法进行复核结果一致。表明所建立的四重TaqMan荧光定量PCR检测方法具有快速、敏感、稳定等优点,可以用于四种病毒的定量检测。
赵炜,孙淼,薛青红,陈延飞,韩爽,印春生[2]（2019）在《犬腺病毒（Ⅱ型）阳性血清的研制及应用》文中进行了进一步梳理为研制犬腺病毒相关制品的检验用阳性血清,以健康易感山羊为免疫靶动物,深入优化免疫原和免疫程序,无菌采血后分离血清,并分装冻干。通过常规检验方法进行纯净性检测、特异性检测、抗体效价测定和中和指数测定,并将其应用于代表性的含犬腺病毒组分的活疫苗制品的外源病毒检验和鉴别检验等。结果显示,该批血清的纯净性检验和特异性满足要求,中和抗体效价为1∶9364,中和指数>106.0。结果表明,该血清对犬腺病毒具有良好的中和作用,能够应用于犬腺病毒相关制品的外源病毒检验和特异性检验等,是兽用生物制品国家标准物质的重要候选标准品。
唐毓[3]（2018）在《犬细小病毒的分离鉴定及其抗体检测间接凝集试验的建立》文中研究指明犬细小病毒病（Canine parvovirus disease）是由犬细小病毒（CPV）引起犬的一种急性传染病,该病在临床上主要表现为发热、呕吐、出血性肠炎、白细胞减少和幼犬心肌炎。目前,免疫接种是防治该病的主要措施。近年来,由于疫苗抗原性差异,幼犬母源抗体干扰,免疫犬抗体水平过低导致免疫失败,引发CPV感染的报道不断出现。因此,定期分离当地的CPV流行毒株,分析其抗原性遗传演变情况,及时了解幼犬CPV母源抗体水平和免疫犬抗体水平,确定最佳的疫苗免疫时机,对于犬细小病毒的防控具有重要意义。本研究将临床疑似感染CPV的病犬排泄物处理后接种F81细胞,传代培养后,经电镜观察、间接免疫荧光技术、PCR、血凝（HA）鉴定确定分离获得1株CPV病毒,命名为CPV-DN17-1。克隆CPV分离株VP2基因,测序结果与GenBank中收录的CPV疫苗株、国内外分离株等24株CPV VP2序列进行比对分析,结果显示,分离株与疫苗株同源性存在差异,核苷酸同源性为95.6%98.8%;与国内外分离株差异不大,核苷酸同源性为98.7%99.8%;与HRB-e2（哈尔滨分离株）氨基酸同源性为100%,其它毒株为97.9%99.4%。系统进化树分析结果显示,病毒分离株与疫苗株、国外分离株、其它种属细小病毒亲缘关系均较远,与国内分离株较近,表明分离株不是来源于疫苗株。与CPV参考株的氨基酸序列比对显示,分离株基因型为new CPV-2a型;分离株与疫苗株相比较,主要抗原表位区氨基酸没有明显的改变。本研究根据DNAStar-Protein软件分析以及参考相关文献,在CPV-DN17-1的VP2基因主要抗原表位编码区设计并合成两对引物sVP2-F1/R1和sVP2-F2/R2,克隆并构建了重组质粒pGEX-VP2-S1和pGEX-VP2-S2。诱导、表达和鉴定后的重组蛋白命名rVP2-S1和rVP2-S2。用重组蛋白制备的多克隆抗体经ELISA、中和试验检测,rVP2-S1的间接ELISA效价为1:12800,中和效价为1:128;rVP2-S2的间接ELISA效价为1:6400,中和效价为1:54。选择免疫原性更好的rVP2-S1致敏红色聚苯乙烯羧基纳米微球,对致敏蛋白浓度、致敏缓冲液、EDC含量等致敏条件的优化结果表明,当纳米微球为25μL（5%w/v）,致敏蛋白量0.3 mg,EDC 0.015 g,醋酸缓冲液500μL时,致敏的彩色微球与兔抗CPV阳性血清凝集效果最佳。凝集结果经试剂盒标定,判定标准为能使致敏微球发生50%（++）以上凝集的血清为阳性血清,该血清抗体对犬有免疫保护作用;低于50%凝集为阴性结果,血清抗体无免疫保护作用。试验证明该方法特异性、敏感性、重复性和稳定性良好。利用建立的检测方法和试剂盒同时对临床采集的40份犬血清进行检测,符合率为97.5%。本研究所建立的CPV抗体检测间接凝集试验具有良好的特异性、敏感性、稳定性,可满足临床对单份血清的检测需求,具有明显的应用价值。
苏瑞红[4]（2018）在《犬瘟热病毒的分离鉴定及其抗体检测间接凝集试验的建立》文中提出犬瘟热病毒（Canine Distemper Virus,CDV）是引起狐、貂、貉等毛皮动物及犬、熊猫、虎等动物犬瘟热的病原。以宠物犬来说,目前,接种疫苗是防治该病的主要措施。由于疫苗抗原性差异、高水平母源抗体或免疫犬血清抗体的干扰,往往造成免疫失败而引起犬瘟热的发生,或因血清抗体水平过低不能提供保护作用而发病。合理的免疫时机应以抗体水平检测结果为基础。临床上应用的抗体检测方法有ELISA、血清中和试验、间接免疫荧光试验等,这些方法快速、准确、便于检测大量样品。但这些检测方法操作较复杂或需要特殊仪器,可能会影响宠物犬母源抗体和免疫抗体检测的普及率。因此,定期分离CDV现地流行毒株,分析其抗原性遗传演变情况,选择抗原性一致的疫苗免疫接种;建立一种简便、经济、能够及时检测单份血清样品的CDV血清抗体检测方法,对有效预防犬瘟热具有重要意义。本研究将临床确诊为CDV病死犬的肠内容物处理液接种MDCK细胞,经传代培养后,通过电镜观察、间接免疫荧光检测、RT-PCR鉴定后确定分离获得了1株CDV,命名为CDVDN17-1。对分离毒株H基因的核苷酸序列分析结果显示,与HeB（09）3毒株H基因核苷酸同源性最高（99.8%）,与临床常用CDV疫苗株Rockborn同源性最高（96.1%）。H基因系统进化树分析结果显示,与HeB（09）3毒株亲缘关系最近,属于Asia-1型。用常规疫苗免疫犬血清与分离病毒进行中和试验,结果显示,当前疫苗毒株的免疫抗体对分离病毒有中和作用。根据对CDV-DN17-1 H基因序列分析,本研究克隆了H基因两段抗原区域片段,原核表达获得了两种重组蛋白rCDV-SDH1和rCDV-SDH2,并分别免疫实验兔制备了抗血清。血清中和试验结果显示,用rCDV-SDH1制备的血清抗体中和效价为1:35,高于rCDV-SDH2制备的血清抗体,因此选择rCDV-SDH1作为凝集试验的检测抗原。经偶联条件优化,将纯化的rCDV-SDH1与红色羧化聚苯乙烯纳米微球偶联,制备了致敏免疫彩色纳米微球。以致敏微球为凝集原,CDV阳性血清为凝集素,经特异性、敏感性和稳定性试验验证,建立了CDV抗体检测间接凝集试验。通过与商品化试剂盒对血清样品的检测结果对比分析,确定了间接凝集试验的阳性判定标准,即能使致敏微球发生凝集度为“++”的血清为阳性血清。该方法具有良好的特异性,只与CDV阳性血清发生凝集反应;试剂盒检测值S≥3的阳性血清,凝集试验结果均为阳性;4℃保存13个月的致敏微球与阴性、阳性血清的凝集结果无变化。初步对40份临床血清样品的检测结果显示,本研究建立的间接凝集试验与试剂盒的检测结果一致。本研究从感染CDV病死犬肠内容物中分离到1株CDV,初步分析了当前流行毒株H基因的变异情况,为疫苗的选择提供了参考;建立的CDV抗体检测间接凝集试验,操作简便,特异性良好,结果易于判定,不仅可以用于大量样品的集中检测,也可以针对宠物门诊单份血清样品随时检测,便于推广应用。
文兆海[5]（2018）在《狂犬病疫苗株与减毒疫苗株的免疫及病理学研究》文中提出狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒感染引起的一种急性致死性人兽共患传染病,一旦发病死亡率几乎为100%。犬瘟热、犬细小亦是造成犬科动物发病死亡的重要传染病。目前,疫苗接种是预防狂犬病、犬瘟热、犬细小最为经济有效的方法。本研究团队利用反方向遗传学技术将狂犬病病毒的G基因提前,敲除其毒力基因,并将犬瘟热病毒和犬细小病毒的主要抗原基因CDV-N、CPV-VP2插入到狂犬病病毒基因组构建重组狂犬病病毒,有望获得基因重排减毒狂犬病疫苗株、犬瘟热病毒N基因重组狂犬病病毒的二联弱毒苗株、犬瘟热病毒N基因-犬细小病毒VP2基因重组狂犬病病毒的三联弱毒苗株。以期为将来制备狂犬病减毒口服活疫苗、犬瘟热-狂犬病二联口服弱毒活疫苗、犬瘟热-犬细小-狂犬病三联弱毒活疫苗奠定基础。首先,为了探究基因重排减毒狂犬病病毒、犬瘟热病毒N基因重组狂犬病病毒（CDV-N重组狂犬病病毒）的拯救及鉴定。利用反向遗传学技术,通过脂质体转染的方法,将纯化后的全长重组质粒与4个辅助性表达质粒共转染BSR细胞;通过RT-PCR技术、间接免疫荧光试验对重组病毒进行鉴定。结果显示,RT-PCR检测出现与预期相符的目的片段;激光共聚焦显微镜观察发现,试验组出现了大量的荧光灶点,空白对照组未见绿色荧光;间接免疫荧光鉴定结果与RT-PCR检测结果相符,表明基因重排减毒狂犬病病毒、CDV-N重组狂犬病病毒拯救成功。其次,探究基因重排减毒狂犬病病毒、CDV-N重组狂犬病病毒、CDV-N-CPV-VP2重组狂犬病病毒对小鼠的免疫效果及安全性评估。利用ELISA试剂盒对狂犬病毒、犬瘟热病毒的特异性抗体进行检测。结果显示:三种重组狂犬病病毒株口服免疫产生的狂犬病毒抗体水平均显着高于亲本毒株Srv9口服免疫组。CDV-N重组狂犬病病毒、CDV-N-CPV-VP2重组狂犬病病毒均可刺激小鼠机体产生狂犬病毒抗体和犬瘟热病毒抗体;病理组织学检查结果表明口服免疫组的安全性优于注射免疫组。最后,探究了基因重排减毒狂犬病病毒、CDV-N重组狂犬病病毒、CDV-N-CPV-VP2重组狂犬病病毒对犬的口服免疫效果。利用ELISA试剂盒对狂犬病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒的特异性抗体进行定量检测。结果显示均能诱发机体产生其特异性抗体,且到第35天时各免疫组血清狂犬病毒抗体水平均高于世界卫生组织推荐的最低保护水平0.5 IU。
刘大飞[6]（2015）在《犬瘟热、细小病毒病、腺病毒病（Ⅰ型）三联活疫苗的研制》文中提出犬瘟热（Canine distemper, CD）、犬细小病毒（Canine parvovirus, CPV）病及犬腺病毒（Canine adenovirus, CAV）病是当前对我国养犬业危害严重的3种病毒性传染病。常引起大批犬、貂和狐等动物发病,经济损失惨重。犬瘟热病毒（Canine distemper virus, CDV）可以感染包括大熊猫、小熊猫以及狮、虎、豹等食肉目所有8个科、灵长目的猕猴属、偶蹄目猪科和鳍足目海豹科等多种动物。CPV可引起犬出血性肠炎与心肌炎,此外,CPV还可引起虎、狮、果子狸和猴等野生动物的感染。CAV不仅流行于我国和世界各地家养的犬、狐中,而且广泛地流行于野生的狐、熊、郊狼和浣熊等动物中。疫苗免疫被认为是犬病防控的最直接有效措施。当前,广泛应用的主要有单价或多价弱毒苗。虽然对于防控犬的重大疫病起到了积极作用,但是还时有疫情发生的报道。同时,目前使用的这些的疫苗大部分为国外疫苗的复制品,其使用的疫苗株与我国优势流行株之间抗原差异显着。因此,研制适合国内流行毒株的疫苗已迫在眉睫。鉴于此,开展以下研究：CDV、CPV及CAV的分离鉴定：将发病犬的病料组织等经过处理后,分别接种鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast, CEF）、 CRFK及MDCK细胞进行传代培养,并进行病毒形态学、PCR及动物回归试验鉴定等一系列鉴定。CDV、CPV及CAV的细胞培养物上清电镜观察分别可见典型的副黏病毒粒子、细小病毒粒子和腺病毒粒子。动物回归试验显示,三种分离株分别可导致犬出现明显的相应的临床症状。PCR和序列分析进一步确定分离株分别为CDV、CPV和CAV的野毒株,并分别命名为CDV-YB、CPV-YN和CAV-H。CDV、CPV及CAV的致弱研究：CDV-YB株分别经CEF、Vero和CEF细胞连续传70、20和15代,CPV-YN和CAV-H分别经CRFK和MDCK细胞连续传至110代,病毒滴度逐渐提高并分别稳定在1065 TCID50/mL、106 TCID50/mL和1075 TCID50/mL左右。并且三种病毒对犬的致病力随着传代次数的增加而逐渐降低。动物回归试验结果进一步表明成功获得致弱毒株,分别命名为CDV-YBR、CPV-YNR和CAV-HR。CDV、CPV及CAV致弱毒株的免疫原效力评价；分别将三种致弱毒株免疫犬,并用亲本强毒株进行攻毒保护试验,结果表明三种致弱毒株均可诱导犬产生理想的中和抗体,并对同源强毒株的攻击提供完全保护。CD、CPV病及CAV病（Ⅰ型）三联活疫苗研制：将致弱毒株CDV-YBR、CPV-YNR和CAV-HR按照比例混匀,加入稳定剂制备三联弱毒疫苗,并对其开展免疫学评价。结果表明：三联活疫苗具有良好的安全性和免疫性原性。与相应单苗相比,二者在免疫效力方面无明显差异。与同类商品化五联活疫苗相比,两者在安全性基本一致；本研究中三联苗在免疫效力方面略胜一筹；在病毒含量和免疫持续期方面均优于商品化疫苗；此外对怀孕母犬进行免疫具有绝对的安全优势。目前,国内应用的弱毒联苗一部分是国外疫苗的复制品,另一部分疫苗种毒直接来自于国外,这与国内目前流行的野毒株在基因水平和抗原性等生物学特性方面存在显着差异,而且,目前商品化疫苗均不适合于怀孕母犬的免疫。而本研究三联弱毒苗的疫苗株均来源于国内优势流行株经致弱而成,有独立知识产权,且制备的疫苗具有良好的安全性和免疫原性,并对怀孕母犬绝对安全。该三联苗已申报新兽药批号,目前处于复核试验阶段。本研究填补了我国犬类国产疫苗的空白,为我国犬的重要病毒病的防控提供了物质基础和技术储备,并将产生良好的经济效益和社会效益。
郭玲[7]（2014）在《大熊猫肠道病毒生态学调查及部分病毒的遗传进化与大熊猫源CPV的分离鉴定》文中研究指明大熊猫病毒性传染病作为大熊猫的重要疾病之一,愈来愈受到人们的重视,在病毒性传染病中肠道疾病对大熊猫种群危害较大。由于物种限制,对大熊猫肠道易感病毒性疾病的系统性研究还是空白。本研究选取对大熊猫威胁较大的5种易感肠道病毒,即犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬冠状病毒、轮状病毒和犬腺病毒作为研究对象,建立其分子生物学检测方法,并用该方法调查不同地区、不同饲养方式以及不同年份的大熊猫携带肠道病毒的情况；对调查为阳性的部分病毒变异基因进行克隆测序,使用生物信息学软件进行分析,研究其遗传变异趋势；采用细胞培养法,对部分阳性样本进行病毒分离,得到大熊猫源病毒株。本研究主要包括以下几个方面：1.大熊猫易感肠道病毒分子检测方法建立根据GenBank中收录的大熊猫易感的4种肠道病毒保守基因序列,设计4对特异性引物,建立了大熊猫易感肠道病毒的分子生物学检测方法。运用所建立的方法对病毒疫苗株进行扩增,成功扩增出目标条带,特异性试验表明其特异性好,敏感性试验表明其敏感性较高,重复性和稳定性试验表明检测结果准确可靠。研究结果表明,所建立的方法可用于大熊猫易感肠道病毒的临床诊断和实验研究。2.大熊猫肠道病毒的生态学调查应用所建立的4种检测方法和实验室原已建立好的大熊猫源轮状病毒检测方法对收集于2011年至2013年期间来自于岷山、邛崃、相岭山系的野生大熊猫及四川地区圈养大熊猫的188份大熊猫材料,进行分子流行病学调查。共检出CDV阳性8份,CPV阳性19份,CCV阳性1份,CAV阳性2份,RV阳性13份。调查结果显示,野生大熊猫的肠道疾病种类数量及感染率低于圈养大熊猫；2011和2012年期间大熊猫感染肠道病原种类数量低于2013年；大熊猫肠道病原种类及感染率在5个不同地区的差异较大,本实验的研究数据丰富了大熊猫肠道病毒生态学的内容。3.大熊猫源部分肠道病毒的遗传变异分析分别扩增大熊猫源犬瘟热病毒H基因和细小病毒VP2基因,并进行克隆测序,同时从GenBank下载标准株序列,进行序列比对并构建遗传进化树进行分析,确定其基因型。对CDV H基因潜在天冬酰胺糖基化位点进行预测,结果表明大熊猫源犬瘟热病毒糖基化位点出现变异,属于Asia-1基因型；对大熊猫源细小病毒进行遗传变异分析,结果表明在其VP2基因的第370位氨基酸位点发生变异,属于New-CPV-2a基因型。4.大熊猫源部分肠道病毒的分离鉴定对大熊猫细小病毒检测为阳性的样品进行病毒的分离培养及鉴定,结果显示,该病毒可在MDCK细胞上生长并出现明显的细胞病变。并用CPV检测引物进行验证,测序并提交NCBI上进行比对,其与犬细小病毒相应序列相似性均大于98%,证明该病毒为大熊猫源犬细小病毒。
林凡娜[8]（2013）在《犬腺病毒的分离鉴定及犬腺病毒基因组文库的构建》文中进行了进一步梳理犬腺病毒病（Canine adeno,CA）是由犬腺病毒（Canine adenovirus,CAV）感染引起的一种传染性疾病,本病广泛流行于家养犬、狐狸、郊狼和浣熊等动物中。犬自然感染CAV的发病率大于50%,死亡率高达25-40%。CAV常与犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）、犬细小病毒（Canine parvo virus,CPV）、犬副流感病毒（Canine parainfluenza virus,CPIV）等混合感染,增加了临床症状的复杂性。本研究通过对武汉部分宠物医院疑似CAV、CDV、CPV、CPIV感染的患病犬进行病毒的分离鉴定,分离获得4株CAV-Ⅱ毒株,1株CPV2b毒株,同时构建了CAV-ⅡWH-27分离株的全基因组文库,为CAV的流行病学调查及预防和控制CAV相关疾病提供参考数据。具体研究内容如下:1、犬源病毒的分离与鉴定从武汉部分宠物医院收集患病犬病料样品410份,选择85份病料样品接种MDCK细胞,有13份接种细胞后发生明显、稳定的细胞病变,表现为细胞肿胀变圆、聚集,呈"葡萄串"状或分散变圆的特征性病变。分别通过CAV、CDV、CPV、CPIV特异性引物对13份细胞病变样品进行PCR/RT-PCR鉴定,结果表明,其中4份样品（编号:27、162、201、208）扩增出1030bp的特异性片段。序列比对和同源性分析表明,27号、162号样品与CAV-Ⅱ标准毒株Toronto A26/61的同源性均为99%;201号、208号样品与CAV-Ⅱ标准毒株Toronto A26/61的同源性均为97%,表明有4株分离病毒为CAV-Ⅱ,分别命名为:WH-27,WH-162,WH-201,WH-208。另外,182号样品扩增出576bp的特异性片段,序列比对和同源性分析表明该毒株与CPV2b毒株BM（11）VP2的同源性为100%,表明182号样品的分离病毒为CPV2b型,命名为:WH-182。通过CDV、CPIV特异性引物的扩增结果均为阴性。电镜结果显示,CAV-Ⅱ WH-27病毒的病毒粒子的直径为60.67nm,形态为六边形,有明显的纤突,呈二十面体立体对称;WH-182病毒粒子直径在20-26nm之间,外观呈圆形,大多为实心,部分为空心。2、CAV-Ⅱ WH-27毒株基因组文库的构建用限制性内切酶Hind Ⅲ分别酶切CAV-ⅡWH-27分离株基因组DNA和载体pBlueScriptⅡSK（+）,回收病毒基因组不同Hind Ⅲ片段和载体片段,进行连接获得不同片段的重组质粒。随机挑取100个单菌落,提取重组质粒并经Hind Ⅲ酶切鉴定、测序。获得了 CAV-ⅡWH-27不同Hind Ⅲ片段的核苷酸序列。通过PCR方法扩增一些没有拼接上的片段,最终获得了 CAV-Ⅱ WH-27分离株全基因组序列。
何丽丽[9]（2012）在《犬瘟热病毒LAMP检测方法建立及其串联表位卵黄抗体中和效力初步研究》文中提出犬瘟热（canine distemper, CD）是由犬瘟热病毒（canine distemper virus, CDV）引起的一种急性高度接触传染性病。近年来其自然感染宿主范围不断扩大,除了犬和毛皮动物外,还可以感染狮、虎、灵长类等多种动物。已建立犬瘟热病毒的检测方法有电子显微镜技术、IFA、 ELISA、RT-PCR等,但因耗时长,操作繁琐,需要特殊仪器等因素没能广泛用于临床诊断。另外,在一些国家和地区出现免疫犬感染犬瘟热的病例报道,可能是流行毒株与疫苗株不匹配,造成疫苗免疫失败。卵黄抗体作为一类高效生物制剂在防治动物疾病中显示了明显的效果,为犬瘟热防治提供了新的思路。本研究首先从感染CDV病犬的内脏器官分离得到了3株病毒,分别命名为J7、A8、S9。对CDV H基因扩增测序,进行了核苷酸、氨基酸同源性和系统进化分析。结果表明：3株分离株核苷酸的同源性为99.1～99.3%,分离株与A75/17毒株同源性最高,与疫苗株Onderstepoor、CDV3同源性最低,与临床常用犬瘟热疫苗同源性差异较大。系统进化树分析表明,分离株与5804P、5804株亲源关系较近,而与疫苗株Onderstepoort、CDV3亲源关系最远。将分离株与CDV7个基因型代表进行核苷酸同源性分析,与国内分离的Asia-1型HLJ3-08同源性最高,为99.2%～99.3%。分离株与Europe型、America-2型、European wildlife型、Asia-2型、Arctic-like型、Vaccine型同源性逐渐降低,分离株属于Asia-1型。分离株H基因编码607个氨基酸,含有9个潜在的N-联糖基化位点,疫苗株Convac、Onderstepoort的糖基化位点有7个和4个,临床常用犬瘟热疫苗糖基化位点为6-7个。本研究建立了CDV环介导等温扩增（LAMP）检测方法。根据CDV N基因保守序列设计合成内引物（FIP,BIP）、外引物（F3,B3）。分别进行了反应条件优化、特异性试验、敏感性试验及临床样品检测。结果显示,该方法63℃水浴1h即可完成反应,可以检测到最低cDNA的浓度大约为9.6×10-5pg/μl,分别比RT-PCR和CDV胶体金试纸条检测方法灵敏10和1000倍。同时对狂犬病毒（RV）、犬细小病毒（CPV）、犬腺病毒Ⅱ型（CAV Ⅱ）、CDV进行LAMP方法扩增,仅CDV为阳性结果。用已建立的LAMP方法检测临床样品,检测结果与RT-PCR方法符合率为100%,说明本方法特异,灵敏,可用于CDV快速检测。本研究利用表位串联技术,采用大肠杆菌原核表达系统,获得CDV F基因B细胞线性表位重组蛋白。将表位串联重组蛋白、CDV-J7株、CDV-11株3种抗原作为免疫原对7月龄海兰蛋鸡进行免疫。共免疫3次,每次间隔2周。串联表位重组蛋白组,一免、二免、三免剂量分别为0.4mg/只、0.6mg/只、0.8mg/只；CDV-J7株组,一免、二免、三免剂量均为3.0ml/只（103.5TCID50/ml）; CDV-11株组,一免、二免、三免剂量均为3.0ml/只（104.5TCID50/ml）。采用氯仿抽提法提取卵黄抗体,间接ELISA法检测抗体效价。3种不同抗原卵黄抗体ELISA效价最高值分别为1:2048、1:512、1:256。体外中和试验结果显示,卵黄抗体原液中和CDV能力较差,随浓缩倍数增加（5和10倍）,卵黄抗体中和CDV能力增强,24h内对细胞有保护作用,48h细胞病变开始明显。未接毒MDCK细胞生长正常,非免疫卵黄抗体产生细胞病变,高免卵黄抗体对细胞几乎无损伤作用。体内中和试验表明,5倍浓缩卵黄抗体对颅内接种CDV的昆明鼠产生保护作用。本研究结果表明,分离的3株病毒属于CDV Asia-1型。所建立的LAMP检测方法具有灵敏、特异、简便的特点,有利于CDV的快速检测。串联表位重组蛋白制备的高免卵黄抗体对CDV有一定中和作用,为CD的特异性防治提供了物质基础,并为下一步的临床应用提供了实验基础。
王凤雪[10]（2012）在《高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp2对病毒致弱及复制影响的研究》文中研究说明猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）,又称“蓝耳病”,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染引起的接触性传染病,PRRSV主要引起怀孕母猪发生流产、早产和死胎等严重的繁殖障碍及仔猪的呼吸道症状和死亡。该病从美国首次发现以来,一直对世界各国养猪行业危害严重。2006年我国暴发的“猪高热综合征”（porcine high fever syndrome, PHFS）病原已被证实为变异的北美洲型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV）,HP-PRRSV的显着特征是基因组非结构蛋白编码区Nsp2不连续缺失30个氨基酸。本研究室分离的HP-PRRSV TJ株经细胞克隆传代获得致弱毒株TJM。为研究PRRSV病毒复制和毒力增强的致病分子机制,我们克隆测序分析TJ株系列代次Nsp2基因的特性,利用真核表达和RNA干扰技术研究TJ株Nsp2蛋白在其复制中的作用效果,建立HP-PRRSV的反向遗传学技术操作平台,分别成功构建了HP-PRRSV TJ株和疫苗株TJM的感染性cDNA克隆。根据GenBank上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）TJ株F3代全基因序列（GenBank号：EU860248）,并结合多个PRRSV亚洲株Nsp2基因比对结果,设计合成引物,扩增HP-PRRSVTJ株噬斑克隆纯化前后的14个不同代次的Nsp2基因高变区片段及TJ株F3代和TJM（F92代）Nsp2全基因,并进行产物克隆测序和氨基酸序列分析及结构预测。测序结果表明PRRSV TJ株在噬斑克隆传代过程中出现序列整段缺失,共120个氨基酸,并且从17代噬斑克隆后到122代一直稳定存在。TJM Nsp2缺失的高变区及Nsp2蛋白二级结构预测表明,缺失的氨基酸使Nsp2蛋白在空间结构上发生较大的变化,推测这可能与PRRSV TJM内毒力和致病力减弱有关系。6对强弱毒Nsp2蛋白序列比对结果表明TJ/TJM对间的序列差异更大,TJM疫苗株的返强几率就更低。为了探讨Nsp2蛋白的表达对PRRSV的增殖的具体影响,构建了表达PRRSV TJ株和其致弱毒TJM株Nsp2蛋白的真核质粒,携带有增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein EGFP）基因表达盒,转染真核质粒,G418筛选,获得稳定表达PRRSVTJ株和TJM株Nsp2蛋白的Marc-145细胞系。接种PRRSV后,病毒在Marc-145-TJ（Nsp2）和Marc-145-TJM细胞系上增殖更快,镜下观察感染细胞早期,PRRSV在表达Nsp2蛋白的细胞系上病变更大更明显,并且最终病毒的滴度高于对照。结果表明Nsp2蛋白对PRRSV复制早期有正向调控作用。PRRSV在Marc-145-TJM（Nsp2）上的增殖系数比Marc-145-TJ（Nsp2）上小,推测120aa的缺失可能影响了Nsp2对病毒的调控作用。为研究Nsp2基因短干扰RNA对PRRSV复制的抑制作用,构建了针对PRRSV Nsp2的3个基因特异性shRNA表达载体,shRNA载体转染Marc-145细胞6h以后,用0.01MOI的PRRSV TJ株接毒,通过CPE、RT-PCR半定量和病毒滴度测定来检测病毒复制,结果表明,3个Nsp2的基因特异性siRNA都能够有效抑制PRRSV在Marc-145细胞内的复制和增殖,特别是在PRRSV复制早期。其中shRNA载体S-1和S-2处理细胞接毒后,病毒滴度TCID50降低明显,最多降低103.38,与空载体比较差异极显着（t检验P<0.001）。本实验根据高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TJ株基因组序列设计并合成PRRSV特异性引物,进而应用RT-PCR技术分7段分别扩增了HP-PRRSV TJ株和其致弱毒TJM全基因组cDNA。将扩增的每个病毒的各个cDNA重叠片段分别克隆到pCR-Blunt穿梭载体上。在基因组5’末端和3’末端Poly（A）尾后通过Overlap PCR技术引入HAM Rz和HDV Rz序列及酶切位点SnaB I及NotI酶切位点。将TJ株基因组第15143位C沉默突变为A和15148位C沉默突变为T,产生一个M1uI酶切位点作为鉴定拯救病毒的遗传标记。酶切、测序鉴定准确的各片段经5步亚克隆连接到pcDNA3.1真核表达载体上。将鉴定准确的含TJ株基因组全长cDNA的质粒和含TJM株基因组全长cDNA的质粒去内毒素纯化,转染Marc-145细胞,冻融物在Marc-145细胞上盲传,拯救出病毒。通过间接免疫荧光和遗传标记检测证明强弱毒重组病毒均拯救成功。比较强弱毒亲本病毒与拯救病毒的病毒滴度、多步生长曲线,发现病毒学及生物学特性没有显着差异。以上结果表明HP-PRRSV TJ株和其致弱毒TJM株感染性克隆构建成功,为探讨PRRSV的分子生物学特性、致病机制和研制有效的标记疫苗奠定了基础。
二、犬腺病毒Ⅱ型弱毒疫苗株的分离、鉴定与筛选（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、犬腺病毒Ⅱ型弱毒疫苗株的分离、鉴定与筛选（论文提纲范文）
（1）犬四种病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立（论文提纲范文）
| 研究项目资助说明 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 犬瘟热概述 |
| 1.1.1 犬瘟热病毒 |
| 1.1.2 犬瘟热的流行病学 |
| 1.2 犬副流感概述 |
| 1.2.1 犬副流感病毒 |
| 1.2.2 犬副流感的流行病学 |
| 1.3 犬传染性肝炎概述 |
| 1.3.1 犬腺病毒 |
| 1.3.2 犬传染性肝炎的流行病学 |
| 1.4 犬细小病毒病概述 |
| 1.4.1 犬细小病毒 |
| 1.4.2 犬细小病毒病的流行病学 |
| 1.5 病毒的检测方法 |
| 1.5.1 病毒分离鉴定 |
| 1.5.2 血清学检测 |
| 1.5.3 分子生物学检测 |
| 1.6 本研究相关病毒PCR方法的研究 |
| 1.7 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒核酸及检测样品 |
| 2.1.2 主要试剂及仪器设备 |
| 2.1.3 溶液配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 CDV、CPV、CAV-Ⅱ、CPIV引物探针设计与合成 |
| 2.2.2 四种病毒单重荧光定量PCR方法的建立 |
| 2.2.3 四重荧光定量PCR方法的建立 |
| 3 结果 |
| 3.1 四种病毒单重荧光定量PCR方法建立 |
| 3.1.1 四种病毒质粒标准品制备结果 |
| 3.1.2 四种病毒单重荧光定量PCR反应体系和条件优化结果 |
| 3.1.3 四种病毒单重荧光定量PCR标准曲线建立结果 |
| 3.1.4 四种病毒单重荧光定量PCR敏感性试验结果 |
| 3.1.5 四种病毒单重荧光定量PCR的重复性试验结果 |
| 3.1.6 四种病毒单重荧光定量PCR的特异性试验结果 |
| 3.1.7 四种病毒单重荧光定量PCR样品检测结果 |
| 3.2 四重荧光定量PCR方法建立结果 |
| 3.2.1 四重荧光定量PCR反应体系优化结果 |
| 3.2.2 四重荧光定量PCR反应标准曲线建立 |
| 3.2.3 四重荧光定量PCR反应敏感性试验结果 |
| 3.2.4 四重荧光定量PCR重复性试验结果 |
| 3.2.5 四重荧光定量PCR特异性试验结果 |
| 3.2.6 四重荧光定量PCR样品检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（2）犬腺病毒（Ⅱ型）阳性血清的研制及应用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 血清 |
| 1.1.4 细胞和培养基 |
| 1.1.5疫苗 |
| 1.1.6 其他 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 试验动物的筛选 |
| 1.2.2 病毒液的制备 |
| 1.2.2. 1 基础病毒液的制备 |
| 1.2.2. 2 基础免疫病毒液的制备 |
| 1.2.2. 3 加强免疫病毒液的制备 |
| 1.2.3 免疫和采血 |
| 1.2.4 血清检定 |
| 1.2.4. 1 无菌检验、支原体检验、外源病毒检验 |
| 1.2.4. 2 特异性检验 |
| 1.2.4. 3 效价测定 |
| 1.2.5 血清在含犬腺病毒组分的生物制品及生产用疫苗株检验中的应用试验 |
| 1.2.6 血清对不同的犬腺病毒毒株的中和指数测定 |
| 1.2.7 血清在间接细胞免疫荧光试验中的应用 |
| 2 结果 |
| 2.1 免疫程序的探索及抗血清的制备 |
| 2.2 血清特异性检定结果 |
| 2.3 血清抗体效价测定结果 |
| 2.4 血清在检验中的应用结果 |
| 2.5 对不同的犬腺病毒毒株的中和指数测定结果 |
| 2.6 血清在间接细胞免疫荧光试验中的应用结果 |
| 3 讨论与小结 |
（3）犬细小病毒的分离鉴定及其抗体检测间接凝集试验的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 犬细小病毒病和犬细小病毒概述 |
| 1.1.1 犬细小病毒病 |
| 1.1.2 犬细小病毒 |
| 1.2 犬细小病毒病的免疫防治 |
| 1.2.1 犬细小病毒病疫苗及免疫程序 |
| 1.2.2 犬细小病毒病疫苗免疫抗体的检测方法 |
| 1.3 凝集试验 |
| 1.3.1 直接凝集试验 |
| 1.3.2 间接凝集试验 |
| 1.3.3 其他凝集试验 |
| 1.4 纳米微球及其在疾病检测领域的应用 |
| 1.4.1 纳米微球的分类 |
| 1.4.2 纳米微球在疾病检测领域的应用 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物、细胞系及质粒 |
| 2.1.2 病毒分离样品、阳性血清、CPV疫苗株 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 引物设计及合成 |
| 2.2.2 CPV分离鉴定 |
| 2.2.3 分离病毒VP2基因分析 |
| 2.2.4 CPVVP2重组基因的克隆与表达 |
| 2.2.5 CPV抗体检测间接凝集试验的建立 |
| 3 结果 |
| 3.1 CPV分离鉴定 |
| 3.1.1 病毒分离 |
| 3.1.2 PCR鉴定 |
| 3.1.3 血凝效价 |
| 3.1.4 电镜观察 |
| 3.1.5 间接免疫荧光鉴定 |
| 3.2 CPVVP2基因的序列分析 |
| 3.2.1 CPVVP2基因克隆鉴定 |
| 3.2.2 CPV分离株VP2基因序列分析 |
| 3.2.3 CPV分离株亚型分析 |
| 3.2.4 抗原表位差异性分析 |
| 3.2.5 TCID50测定 |
| 3.2.6 CPV分离株中和效价检测 |
| 3.3 重组CPVVP2蛋白的原核表达 |
| 3.3.1 重组CPVVP2基因的克隆及鉴定 |
| 3.3.2 重组CPVVP2质粒的构建及鉴定 |
| 3.3.3 重组CPVVP2蛋白的表达 |
| 3.3.4 重组蛋白的纯化及鉴定 |
| 3.4 CPV抗体检测间接凝集试验的建立 |
| 3.4.1 聚苯乙烯微球致敏条件的优化 |
| 3.4.2 间接凝集试验阳性判定标准的确立 |
| 3.4.3 CPV抗体间接凝集试验的特异性 |
| 3.4.5 CPV抗体检测间接凝集试验的重复性和稳定性试验 |
| 3.4.6 CPV疫苗免疫犬血清抗体检测 |
| 3.4.7 间接凝集试验的初步应用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 CPV的分离鉴定 |
| 4.2 CPVVP2重组蛋白的表达及选择 |
| 4.3 纳米微球致敏条件优化 |
| 4.4 间接凝集试验的判定标准的确定 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（4）犬瘟热病毒的分离鉴定及其抗体检测间接凝集试验的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 犬瘟热和犬瘟热病毒概述 |
| 1.1.1 犬瘟热 |
| 1.1.2 犬瘟热病毒形态和理化特性 |
| 1.1.3 犬瘟热病毒分类及其基因组结构 |
| 1.1.4 犬瘟热病毒的分离培养 |
| 1.1.5 犬瘟热病毒的鉴定 |
| 1.2 犬瘟热的防治 |
| 1.2.1 犬瘟热疫苗免疫接种 |
| 1.2.2 犬瘟热临床治疗 |
| 1.3 犬瘟热疫苗免疫抗体的检测方法 |
| 1.3.1 血清中和试验(SN) |
| 1.3.2 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.4 凝集试验 |
| 1.4.1 直接凝集试验 |
| 1.4.2 间接凝集试验 |
| 1.5 纳米微球在疾病检测领域的应用 |
| 1.5.1 纳米微球的种类 |
| 1.5.2 纳米微球在疾病检测领域的应用 |
| 1.5.3 纳米微球致敏技术 |
| 1.6 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌毒株、质粒、实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂、培养基和耗材 |
| 2.1.3 病料和血清 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 犬瘟热病毒的分离鉴定 |
| 2.2.2 犬瘟热病毒H基因克隆及序列分析 |
| 2.2.3 犬瘟热疫苗免疫犬血清抗体检测 |
| 2.2.4 重组CDVH蛋白的表达 |
| 2.2.5 重组蛋白的纯化 |
| 2.2.6 重组蛋白的Western-blot鉴定 |
| 2.2.7 重组蛋白免疫原性比较 |
| 2.2.8 CDV抗体检测间接凝集试验的建立 |
| 2.2.9 CDV抗体检测间接凝集试验的初步应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 CDV分离鉴定 |
| 3.1.1 细胞病变 |
| 3.1.2 电镜观察 |
| 3.1.3 RT-PCR鉴定 |
| 3.1.4 间接免疫荧光鉴定 |
| 3.2 CDVH基因克隆及序列分析 |
| 3.2.1 CDVH基因的扩增 |
| 3.2.2 CDVH基因核苷酸序列分析 |
| 3.2.3 CDVH基因氨基酸的序列分析 |
| 3.2.4 H蛋白的糖基化位点预测 |
| 3.2.5 分离毒株与疫苗毒株H蛋白抗原表位分析 |
| 3.3 CDV疫苗免疫犬血清抗体检测 |
| 3.3.1 CDVTCID_(50)测定 |
| 3.3.2 免疫犬血清中和试验 |
| 3.3.3 商品试剂盒检测犬血清抗体 |
| 3.4 重组CDVH蛋白的表达 |
| 3.4.1 CDVH基因的分段克隆 |
| 3.4.2 重组菌的构建 |
| 3.4.3 重组蛋白的表达 |
| 3.5 重组蛋白的纯化和免疫原性鉴定 |
| 3.5.1 重组蛋白的纯化 |
| 3.5.2 Western-blot免疫原性鉴定 |
| 3.6 重组蛋白免疫原性比较 |
| 3.6.1 免疫抗体检测 |
| 3.6.2 细胞中和试验 |
| 3.7 CDV抗体检测间接凝集试验的建立 |
| 3.7.1 聚苯乙烯微球致敏条件优化 |
| 3.7.2 CDV抗体检测间接凝集试验阳性标准确立 |
| 3.7.3 凝集反应的特异性和敏感性试验 |
| 3.7.4 凝集反应的重复性和稳定性试验 |
| 3.7.5 犬瘟热病毒抗体检测间接凝集试验的初步应用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 犬瘟热病毒分离病料选取 |
| 4.2 犬瘟热病毒的细胞分离培养 |
| 4.3 犬瘟热毒株的遗传变异 |
| 4.4 用于致敏纳米微球的重组蛋白的选择 |
| 4.5 间接凝集试验检测犬血清抗体的应用前景 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（5）狂犬病疫苗株与减毒疫苗株的免疫及病理学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 狂犬病病毒的基因组结构及基本特性 |
| 1.2 狂犬病流行病学 |
| 1.3 狂犬病发病机理 |
| 1.4 狂犬病的临床症状 |
| 1.5 狂犬病疫苗的研究 |
| 1.6 犬瘟热病毒概述 |
| 1.7 犬瘟热流行病学 |
| 1.8 犬瘟热发病机理 |
| 1.9 犬瘟热的临床症状 |
| 1.10 犬瘟热疫苗的研究 |
| 1.11 犬细小病毒概述 |
| 1.12 犬细小流行病学 |
| 1.13 犬细小发病机理 |
| 1.14 犬细小的临床症状 |
| 1.15 犬细小疫苗的研究 |
| 1.16 本论文研究目的及意义 |
| 第2章 基因重排减毒狂犬病病毒的拯救及遗传稳定性的研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 犬瘟热病毒N基因重组狂犬病病毒的拯救及其毒力的研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 狂犬病毒减毒苗、二联苗、三联苗对小鼠的免疫效果及病理学评估 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 狂犬病毒减毒苗、二联苗、三联苗对犬口服免疫效果的初步研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 常用试剂的配制 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）犬瘟热、细小病毒病、腺病毒病（Ⅰ型）三联活疫苗的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 CD概况 |
| 1.2.1 CDV的基本结构和特征 |
| 1.2.2 CD的防控 |
| 1.3 CPV概况 |
| 1.3.1 CPV的基本结构和特征 |
| 1.3.2 CPV病的防控 |
| 1.4 CAV概况 |
| 1.4.1 CAV的基本结构和特征 |
| 1.4.2 CAV病的防控 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 2 CDV、CPV和CAV-I的分离、鉴定、致弱及免疫效力研究 |
| 2.1 实验材料与实验仪器 |
| 2.1.1 实验样品 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 病毒分离 |
| 2.2.2 病毒鉴定 |
| 2.2.3 病毒致弱与免疫效力研究 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 病毒分离结果 |
| 2.3.2 病毒鉴定结果 |
| 2.3.3 病毒致弱及免疫效力研究结果 |
| 2.4 讨论 |
| 3 CD、CPV病和CAV-I病三联弱毒疫苗制备 |
| 3.1 实验材料与实验仪器 |
| 3.1.1 病毒和疫苗 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 CDV、CPV和CAV-I三种病毒与稳定剂配比的研究 |
| 3.2.2 三联活疫苗安全性研究 |
| 3.2.3 三联活疫苗对怀孕母犬的安全性研究 |
| 3.2.4 三联活疫苗最小免疫剂量研究 |
| 3.2.5 三联活疫苗免疫持续期研究 |
| 3.2.6 三联活疫苗与各单苗的免疫效力比较 |
| 3.2.7 三联活疫苗与同类商品苗的比较研究 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 CDV、CPV和CAV-I三种病毒与稳定剂配比的研究结果 |
| 3.3.2 三联活疫苗安全性研究结果 |
| 3.3.3 三联活疫苗怀孕母犬的安全性研究结果 |
| 3.3.4 三联活疫苗最小免疫剂量研究结果 |
| 3.3.5 三联活疫苗免疫持续期研究结果 |
| 3.3.6 三联活疫苗与各单苗的免疫效力比较结果 |
| 3.3.7 三联活疫苗与市场销售的同类商品苗的比较研究结果 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 附件 |
（7）大熊猫肠道病毒生态学调查及部分病毒的遗传进化与大熊猫源CPV的分离鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 大熊猫易感肠道病毒性传染病感染情况 |
| 1.1 大熊猫犬瘟热病毒(CDV)感染情况 |
| 1.2 大熊猫犬细小病毒(CPV)感染情况 |
| 1.3 大熊猫犬冠状病毒(CCV)感染情况 |
| 1.4 大熊猫犬腺病毒(CAV)感染情况 |
| 1.5 大熊猫轮状病毒(RV)感染情况 |
| 2 大熊猫疫苗免疫现状及效果 |
| 2.1 大熊猫疫苗免疫现状 |
| 2.2 大熊猫疫苗免疫效果 |
| 3 小结与展望 |
| 第二章 大熊猫易感肠道病毒分子检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 引物的设计与合成 |
| 1.4 病毒基因组RNA及DNA的提取 |
| 1.5 反转录合成cDNA |
| 1.6 PCR反应及优化反应条件 |
| 1.7 扩增产物的检测及鉴定 |
| 1.8 RT-PCR/PCR特异性试验 |
| 1.9 RT-PCR/PCR敏感性试验 |
| 1.10 RT-PCR/PCR重复性及稳定性试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 CDV检测方法的建立 |
| 2.2 CPV检测方法的建立 |
| 2.3 CCV诊断方法的建立 |
| 2.4 CAV诊断方法的建立 |
| 3 分析与讨论 |
| 3.1 CDV诊断方法的应用前景 |
| 3.2 CPV诊断方法的应用前景 |
| 3.3 CCV诊断方法的应用前景 |
| 3.4 CAV诊断方法的应用前景 |
| 4 小结 |
| 第三章 大熊猫肠道病毒生态学调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 引物 |
| 1.4 基因组RNA及DNA的提取 |
| 1.5 RT-PCR/PCR检测 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 第四章 大熊猫源肠道病毒的遗传变异分析 |
| 一、基于H蛋白基因对大熊猫源犬瘟热病毒遗传变异分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 临床病料处理 |
| 1.2 核酸的提取及扩增 |
| 1.3 扩增产物的检测及鉴定 |
| 1.4 氨基酸分析 |
| 1.5 遗传进化分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 H基因的氨基酸分析 |
| 2.2 H基因的序列和进化分析 |
| 3 分析与讨论 |
| 二、基于VP2蛋白基因对大熊猫源犬细小病毒遗传变异分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 临床病料处理 |
| 1.2 核酸的提取及扩增 |
| 1.3 扩增产物的检测及鉴定 |
| 1.4 序列和进化分析 |
| 2 结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 第五章 大熊猫源细小病毒的分离鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞、菌种及主要试剂 |
| 1.2 样品处理 |
| 1.3 培养细胞 |
| 1.4 增殖病毒 |
| 1.5 病毒毒力测定 |
| 1.6 病毒对理化因子敏感性试验 |
| 1.7 PCR鉴定 |
| 1.8 幼犬回归试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒的分离与培养 |
| 2.2 病毒毒力及理化测定结果 |
| 2.3 PCR鉴定结果 |
| 2.4 动物回归试验结果 |
| 3 分析与讨论 |
| 结论与创新 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介及攻读硕士期间发表论文情况 |
（8）犬腺病毒的分离鉴定及犬腺病毒基因组文库的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略表(ABBREVIATIONS) |
| 1 文献综述 |
| 1.1 犬腺病毒病的流行特点 |
| 1.2 犬腺病毒的危害及致病机理 |
| 1.2.1 犬腺病毒的危害 |
| 1.2.2 病毒感染动物机体的途径 |
| 1.3 犬腺病毒病的预防与临床治疗 |
| 1.3.1 犬腺病毒病的检测方法 |
| 1.3.2 犬腺病毒病的预防 |
| 1.4 犬腺病毒病的治疗 |
| 2 研究目的和意义 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞与菌株 |
| 3.1.2 载体与质粒 |
| 3.1.3 工具酶及主要试剂 |
| 3.1.4 本实验使用的引物 |
| 3.1.5 培养基及其配制 |
| 3.1.6 空斑纯化试剂 |
| 3.1.7 主要缓冲液与相关试剂及其配制 |
| 3.1.8 实验室常用化学物 |
| 3.1.9 其它试剂及其配置 |
| 3.2 实验仪器与实验耗材 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验耗材 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 MDCK细胞的传代 |
| 3.3.2 病料样品的细胞感染 |
| 3.3.3 病毒基因组及RNA的提取 |
| 3.3.4 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) |
| 3.3.5 连接及连接产物的转化 |
| 3.3.6 重组质粒的小量制备(OMEGA小提试剂盒) |
| 3.3.7 限制性内切酶酶切反应 |
| 3.3.8 PCR或酶切产物的回收纯化 |
| 3.3.9 空斑挑取及纯化 |
| 3.3.10 病毒基因组PCR鉴定 |
| 3.3.11 TCID_(50)的测定 |
| 3.4 犬源病毒的分离与鉴定 |
| 3.4.1 病料的采集与处理 |
| 3.4.2 病料的检测 |
| 3.4.3 病毒的分离 |
| 3.4.4 细胞病变样品的检测 |
| 3.4.5 克隆测序及序列比对和同源性分析 |
| 3.4.6 病毒电镜观察 |
| 3.5 犬腺病毒基因组文库的构建 |
| 3.5.1 病毒DNA和pBlueScript Ⅱ SK(+)载体质粒的处理 |
| 3.5.2 犬腺病毒DNA酶切水解片段的克隆及基因文库的构建 |
| 3.5.3 CAV基因组文库序列拼接示意图 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 犬源病毒的分离鉴定 |
| 4.1.1 病料样品的检测 |
| 4.1.2 病料样品的分离 |
| 4.1.3 细胞病变样品核酸水平的检测 |
| 4.1.4 克隆测序及序列比对 |
| 4.1.5 同源性分析 |
| 4.1.5.1 CAV-Ⅱ E3基因的同源性分析 |
| 4.1.5.2 CPV VP2基因的同源性分析 |
| 4.1.6 电子显微镜观察 |
| 4.1.6.1 WH-27电子显微镜观察 |
| 4.1.6.2 WH-182电子显微镜观察 |
| 4.1.6.3 WH-202电子显微镜观察 |
| 4.1.7 CAV- Ⅱ WH-27病毒空斑纯化 |
| 4.1.8 CAV-Ⅱ WH-27分离株毒力的测定 |
| 4.2 CAV-Ⅱ WH-27毒株基因组文库的构建 |
| 4.2.1 CAV-Ⅱ WH-27毒株基因不同Hind Ⅲ酶切片段的克隆 |
| 4.2.2 CAV-Ⅱ WH-27毒株不同基因片段的PCR扩增 |
| 5 讨论与结论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.1.1 犬源病毒的分离鉴定 |
| 5.1.2 CAV-ⅡWH-27毒株基因组文库的构建 |
| 5.2 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 一、病毒的分离鉴定所获得的核苷酸序列 |
| 二、CAV-Ⅱ WH-27毒株基因组文库的构建序列拼接 |
（9）犬瘟热病毒LAMP检测方法建立及其串联表位卵黄抗体中和效力初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 犬瘟热病毒概况 |
| 1.1.1 犬瘟热病原 |
| 1.1.2 犬瘟热病毒的分离培养 |
| 1.2 犬瘟热病毒结构蛋白及其功能 |
| 1.2.1 血凝蛋白(Hemagglutinin Protein,H) |
| 1.2.2 融合蛋白(Fusion Protein,F) |
| 1.2.3 核衣壳蛋白(Nucleocapsid Protein,N) |
| 1.2.4 其它结构蛋白及功能 |
| 1.2.5 抗原表位 |
| 1.3 犬瘟热病毒的检测方法 |
| 1.3.1 形态学观察 |
| 1.3.2 免疫学方法 |
| 1.3.3 核酸检测 |
| 1.4 犬瘟热的防治 |
| 1.4.1 疫苗免疫 |
| 1.4.2 临床治疗 |
| 1.5 环介导等温扩增(LAMP) |
| 1.5.1 LAMP原理 |
| 1.5.2 LAMP方法特点 |
| 1.5.3 LAMP的应用 |
| 1.6 卵黄抗体 |
| 1.6.1 卵黄抗体的形成 |
| 1.6.2 卵黄抗体的结构 |
| 1.6.3 卵黄抗体的特点 |
| 1.6.4 IgY的提取、分离和纯化 |
| 1.6.5 卵黄抗体的应用 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细菌菌株、质粒载体、病毒株 |
| 2.1.2 病料来源 |
| 2.1.3 实验动物及细胞系 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 CDV分离鉴定 |
| 2.2.2 CDV H基因克隆及序列分析 |
| 2.2.3 CDV N基因LAMP检测方法的建立 |
| 2.2.4 串联表位卵黄抗体中和效力评价 |
| 3 结果 |
| 3.1 CDV分离鉴定 |
| 3.1.1 细胞病变 |
| 3.1.2 病毒形态学鉴定 |
| 3.1.3 RT-PCR鉴定 |
| 3.1.4 间接免疫荧光鉴定 |
| 3.1.5 胶体金试纸条检测 |
| 3.2 CDV H基因克隆及序列分析 |
| 3.2.1 CDV H基因扩增 |
| 3.2.2 CDV H重组质粒的PCR及酶切鉴定 |
| 3.2.3 H基因核苷酸序列分析 |
| 3.2.4 H基因氨基酸序列分析 |
| 3.2.5 抗原表位差异性分析 |
| 3.3 CDV N基因LAMP检测方法建立 |
| 3.3.1 LAMP扩增产物的检测 |
| 3.3.2 LAMP反应温度的筛选 |
| 3.3.3 LAMP反应时间的筛选 |
| 3.3.4 LAMP特异性试验 |
| 3.3.5 RT-PCR、犬瘟热病毒抗原快速检测试纸、LAMP灵敏度比较 |
| 3.3.6 临床样本检测 |
| 3.4 串联表位卵黄抗体中和效力评价 |
| 3.4.1 合成质粒及串联表位酶切鉴定 |
| 3.4.2 4F-3L-6His-TAA重组表达质粒酶切鉴定 |
| 3.4.3 表位串联蛋白的诱导表达、纯化及Western blot鉴定 |
| 3.4.4 卵黄抗体效价检测 |
| 3.4.5 卵黄抗体结合试验 |
| 3.4.6 卵黄抗体中和效力评价 |
| 4 讨论 |
| 4.1 犬瘟热病毒分离培养细胞系 |
| 4.2 CDV流行毒株遗传变异 |
| 4.3 LAMP技术 |
| 4.4 表位串联策略 |
| 4.5 串联表位卵黄抗体中和效力评价 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（10）高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp2对病毒致弱及复制影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 第一章 绪论 |
| 1.1 PRRS的病原、分类与流行 |
| 1.2 PRRSV的致病机理 |
| 1.3 PRRSV的基因组结构与复制 |
| 1.4 PRRSV的编码蛋白及其功能 |
| 1.4.1 PRRSV非结构蛋白 |
| 1.4.2 PRRSV结构蛋白 |
| 1.5 PRRSV遗传变异 |
| 1.5.1 非结构蛋白的变异 |
| 1.5.2 结构蛋白的变异 |
| 1.5.3 非编码区序列变异 |
| 1.6 PRRSV毒力因子 |
| 1.6.1 Nsp2基因变异与PRRSV毒力的关系 |
| 1.6.2 其他毒力相关因子 |
| 1.7 PRRSV检测 |
| 1.7.1 病毒分离 |
| 1.7.2 核酸检测 |
| 1.7.3 抗原抗体检测 |
| 1.8 反向遗传系统在研究PRRSV基因功能及发展新型疫苗和病毒载体上的应用 |
| 1.8.1 研究结构蛋白的功能 |
| 1.8.2 研究非编码区和非结构蛋白的功能 |
| 1.8.3 在研究新型疫苗和基因载体的上的应用 |
| 1.9 研究的目的意义 第二章 PRRSV TJ株和TJM株NSP2基因特性的研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 毒株和细胞 |
| 2.1.2 载体、菌株及试剂 |
| 2.1.3 引物的设计与合成 |
| 2.1.4 病毒RNA制备 |
| 2.1.5 RT-PCR反应 |
| 2.1.6 PCR产物的克隆与鉴定 |
| 2.1.7 序列测定及分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 RT-PCR扩增结果 |
| 2.2.2 RT-PCR产物的克隆及鉴定 |
| 2.2.3 重组质粒的测序及比对结果 |
| 2.2.4 缺失的120 aa的蛋白序列结构分析 |
| 2.2.5 PRRSV TJ株F3代和TJM-F92的Nsp2蛋白二级结构预测 |
| 2.2.6 PRRSV TJ株、TJM和VR-2332的Nsp2基因RNA序列结构比较 |
| 2.2.7 鉴别检测TJM与HP-PRRSV |
| 2.2.8 6对PRRSV强弱毒Nsp2基因氨基酸比对及进化树构建 |
| 2.3 结论与讨论 第三章 稳定细胞系的建立及NSP2蛋白对PRRSV复制的影响 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 病毒、细胞、菌种和质粒 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 PRRSV TJ株和TJM株Nsp2全基因表达片段的克隆测序 |
| 3.1.4 重组真核表达载体的构建 |
| 3.1.5 G418最佳工作浓度的确定 |
| 3.1.6 重组真核表达载体的转染与细胞系的筛选 |
| 3.1.7 Nsp2在Marc-145细胞系中的表达检测 |
| 3.1.8 细胞生长曲线的绘制 |
| 3.1.9 PRRSV在细胞系上增殖的测定 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 PRRSV Nsp2全基因表达片段的克隆 |
| 3.2.2 重组真核表达载体的构建与鉴定 |
| 3.2.3 G418最佳工作浓度的确定 |
| 3.2.4 表达Nsp2细胞系的筛选 |
| 3.2.5 PRRSV Nsp2基因在Marc-145细胞中的表达检测 |
| 3.2.6 细胞生长曲线 |
| 3.2.7 PRRSV在细胞系上的增殖 |
| 3.3 讨论 第四章 用NSP2基因小干扰RNA抑制PRRSV复制的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 病毒、细胞和质粒 |
| 4.1.2 引物设计与合成 |
| 4.1.3 siRNA的筛选及PRRSV TJ株Nsp2蛋白基因ShRNA表达载体构建 |
| 4.1.4 shRNA表达载体的转染及病毒的感染 |
| 4.1.5 半定量RT-PCR检测shRNA表达载体抑制效果 |
| 4.1.6 shRNA干扰后病毒滴度测定 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 shRNA的扩增、测序及表达载体的构建 |
| 4.2.2 shRNA表达载体转染效率及对PRRSV的抑制作用 |
| 4.2.3 半定量RT-PCR检测PRRSV Nsp2 mRNA相对表达量 |
| 4.2.4 病毒滴度测定 |
| 4.3 讨论 第五章 高致病性PRRSV强弱毒全长感染性克隆的构建 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 病毒、细胞和质粒 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.1.3 全长构建策略及引物的设计合成 |
| 5.1.4 病毒RNA提取及RT-PCR反应获得cDNA片段 |
| 5.1.5 病毒cDNA的克隆和测序 |
| 5.1.6 全长cDNA克隆的构建及鉴定 |
| 5.1.7 全长cDNA克隆的转染 |
| 5.1.8 重组病毒的检测 |
| 5.1.9 病毒多步生长曲线的绘制 |
| 5.1.10 病毒细胞半数感染量(TCID_(50))测定 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 PRRSV TJ株和TJM株全基因组序列分段扩增及测序结果 |
| 5.2.2 PRRSV TJM株全基因组序列与亲本毒TJ株全序列的比较 |
| 5.2.3 遗传标记的引入 |
| 5.2.4 全长cDNA克隆获得 |
| 5.2.5 PRRSV全长cDNA序列的测序结果 |
| 5.2.6 全基因比对 |
| 5.2.7 重组PRRSV的拯救 |
| 5.2.8 重组PRRSV的鉴定 |
| 5.2.9 重组病毒生长动力学 |
| 5.3 讨论 第六章 全文结论 参考文献 附录 致谢 作者简历 |
四、犬腺病毒Ⅱ型弱毒疫苗株的分离、鉴定与筛选（论文参考文献）
- [1]犬四种病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立[D]. 巨敏莹. 内蒙古农业大学, 2020(02)
- [2]犬腺病毒（Ⅱ型）阳性血清的研制及应用[J]. 赵炜,孙淼,薛青红,陈延飞,韩爽,印春生. 中国兽药杂志, 2019(03)
- [3]犬细小病毒的分离鉴定及其抗体检测间接凝集试验的建立[D]. 唐毓. 东北农业大学, 2018(10)
- [4]犬瘟热病毒的分离鉴定及其抗体检测间接凝集试验的建立[D]. 苏瑞红. 东北农业大学, 2018(11)
- [5]狂犬病疫苗株与减毒疫苗株的免疫及病理学研究[D]. 文兆海. 新疆农业大学, 2018(05)
- [6]犬瘟热、细小病毒病、腺病毒病（Ⅰ型）三联活疫苗的研制[D]. 刘大飞. 东北林业大学, 2015(02)
- [7]大熊猫肠道病毒生态学调查及部分病毒的遗传进化与大熊猫源CPV的分离鉴定[D]. 郭玲. 四川农业大学, 2014(05)
- [8]犬腺病毒的分离鉴定及犬腺病毒基因组文库的构建[D]. 林凡娜. 华中农业大学, 2013(06)
- [9]犬瘟热病毒LAMP检测方法建立及其串联表位卵黄抗体中和效力初步研究[D]. 何丽丽. 东北农业大学, 2012(03)
- [10]高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp2对病毒致弱及复制影响的研究[D]. 王凤雪. 中国农业科学院, 2012(02)