一、THE CONSTRUCTION AND PRELIMINARY APPRAISEMENT OF HSV-2 gD GENE DNA VACCINE（论文文献综述）
马小静[1]（2020）在《牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎二联核酸疫苗的构建及其免疫效应研究》文中指出牛病毒性腹泻（BVD）和牛传染性鼻气管炎（IBR）是危害牛和其他反刍动物的两种重大疾病,病原分别为牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）。BVDV和IBRV常混合感染牛群,引起腹泻、出血综合征、流产、肺炎、脑炎、鼻炎、眼炎等临床症状,给养牛业带来了巨大经济损失。目前,对这两类疫病的防控主要依靠灭活疫苗或弱毒疫苗,但在实际应用中存在免疫持续期短、病毒毒力易返强、保存和运输成本高等诸多缺陷。因此,具有持久免疫应答、制备工艺简单、应用安全等优点的核酸疫苗成为了当下疫苗研制的热点。本研究将BVDV和IBRV的优势抗原基因插入到pVAX1真核表达载体中,获得能同时表达两种抗原基因的重组载体并研究其免疫效果,旨在研制一种能有效预防BVD及IBR的核酸疫苗。主要工作如下:1.BVDV E0与IBRV gD目的基因的克隆及生物信息学分析:根据GenBank收录的BVDV和IBRV参考序列设计引物,PCR扩增BVDV E0基因和IBRV gD基因并测序;利用生物信息学方法对目的蛋白进行分析。结果表明扩增的BVDV E0基因、IBRV gD基因符合预期大小,其蛋白具有较好的免疫原性,可作为核酸疫苗的候选抗原基因。2.pVAX1-E0-IRES-gD真核表达载体的构建:PCR扩增IRES序列;将IRES、BVDVE0、IBRV gD基因片段依次连接至pVAX1载体中,构建pVAX1-E0-IRES-gD重组质粒。重组质粒经双酶切及DNA测序鉴定,结果显示,成功构建本研究所需真核表达载体pVAX1-E0-IRES-gD。3.重组质粒pVAX1-E0-IRES-gD中目的基因体外表达的检测:将质粒pVAX1-E0-IRES-gD用脂质体法转染至293T细胞中,48 h后采用一抗（BVDV、IBRV阳性血清）和二抗（兔抗牛IgG-FITC）进行间接免疫荧光检测。结果显示,荧光显微镜下可观察到绿色荧光,证明目标蛋白E0和gD在293T细胞中成功表达并具有良好反应原性。4.pVAX1-E0-IRES-gD二联核酸疫苗免疫效果研究:将pVAX1-E0-IRES-gD二联核酸疫苗以不同剂量免疫小鼠,首免14d后加强免疫一次。采用ELISA方法检测小鼠血清中抗E0、gD抗体水平以及IFN-γ、IL-4含量,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖能力。结果显示,在抗体和细胞因子水平以及脾淋巴细胞增殖能力这三个指标方面,核酸疫苗组均高于空载体和阴性对照组且差异极显着,200 μg高剂量免疫组优于100μg、50μg中、低剂量组;另外,200μg高剂量核酸疫苗免疫组与BVD-IBR灭活疫苗组相比无显着性差异。本研究成功构建了BVD-IBR二联核酸疫苗,体外表达检测证明目的蛋白具有良好反应原性,动物免疫试验证明其能刺激机体产生良好免疫应答,以上试验结果都为BVD-IBR二联核酸疫苗的研制提供了可靠的数据及理论支持。
姜子义[2]（2018）在《基于伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gD基因mRNA疫苗的初步研究》文中进行了进一步梳理近年来RNA分子领域相关技术突破性进展,mRNA疫苗在流感病毒、埃博拉病毒和寨卡病毒等多种传染病上取得了一定的研究成果,mRNA疫苗将mRNA传递至细胞,表达产生蛋白,从而使机体获得免疫保护。mRNA作为疫苗分子相对于DNA分子具有突出的优点:它不需要任何的核定位信号、体内无需转录使突变风险大大降低且不存在整合到基因组的可能。猪伪狂犬病是当今危害养猪业最重要的传染病之一,疫苗免疫仍是防控伪狂犬病的最主要方式。然而2012年起,伪狂犬病毒变异株在全国多地流行,造成了养猪业的巨大经济损失。本研究以囊膜糖蛋白gD其分子和功能特性为基础,创新地研究PRV囊膜糖蛋白gD基因mRNA疫苗作为候选疫苗对PRV的防治有着重要的潜在价值。猪伪狂犬病毒XJ株为病毒模板,扩增克隆囊膜糖蛋白gD基因,扩增后的囊膜糖蛋白gD基因构建mRNA克隆载体、真核表达载体,实现体外转录mRNA后再与真核表达载体分别进行免疫原性相关研究。主要研究内容为:1.囊膜糖蛋白gD基因的扩增与质粒构建使用生物学软件Premier5.0、Oligo6.0及BLAST对比并参考本实验相关研究,设计了两对特异性引物,第一对引物分别在5’和3’引入BamHI和XhoI酶切位点,第二对引物分别在5’和3’引入Bam HI、T7启动子和XhoI酶切位点。以Vero细胞培养增殖的PRV-XJ病毒抽提的DNA为模板,扩增两段目的片段后分别连接pMD19-T克隆载体和PVAX真核表达载体,构建的克隆重组载体pMD19-gD和真核表达载体PVAX-gD进行双酶切鉴定,送公司测序鉴定,与预期目的基因序列完全一致。2.囊膜糖蛋白gD基因体外转录,mRNA疫苗及PVAX-gD真核表达载体免疫原性相关研究。pMD19-gD酶切后回收获得线性化含有T7启动子的囊膜糖蛋白gD基因片段,加入体外转录体系后获得mRNA,将囊膜糖蛋白gD基因mRNA和真核表达质粒PVAX-gD转染BHK21细胞,40h后富集细胞进行western blot验证,有明确的特异性条带。将囊膜糖蛋白gD基因mRNA脂质体包被制成mRNA疫苗,mRNA疫苗、PVAX-gD真核表达载体进行动物实验,五组BALB/c小鼠大腿肌肉免疫两次,在首免后的第0、2、4、6、8周眼底静脉丛采血分别进行ELISA抗体检测、病毒中和抗体测定;在首免后第4周采血样ELISA检测细胞因子IL-2和IFN-γ的,同时进行流式细胞仪测定T淋巴细胞亚群变化情况。实验数据分析对比可得出,mRNA疫苗和PVAX-gD真核表达载体都可以诱导小鼠产生PRV gD特异性抗体和病毒中和抗体,在二免后,特异性抗体水平和病毒中和抗体效价都有显着提高。实验组CD4+/CD8+细胞占比例提高显着,实验组CD4+比例达到50%,相较于阴性组提高了18%;实验组CD8+比例达到16%,相较于阴性提高了3%以上。在IL-2中,mRNA+保护剂组、PVAX-gD组浓度超过阴性小鼠浓度的1.5倍,mRNA组接近;IFN-γ的浓度mRNA+保护剂组、PVAX-gD组为阴性小鼠的2倍,mRNA组接近阴性小鼠的2倍。攻毒保护试验进一步证明了囊膜糖蛋白gD基因mRNA疫苗能够抵御病毒攻击,与DNA疫苗效果持平可以诱导良好的体液免疫与细胞免疫应答。
汤如[3]（2017）在《靶向DC的DNA疫苗pRSC-NLDC145·gD-IL-21的研制及抗鼠眼角膜HSV-1感染的初步研究》文中研究说明目的:构建靶向树突状细胞（DC）的DNA疫苗pRSC-NLDC145·gD-IL-21,针对抵抗鼠眼角膜单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的感染,探讨其是否能产生更强的免疫应答反应。方法:通过经典基因克隆方法,首先经过限制性内切酶酶切,切除了原先PRSC-gD-IL-21（现存质粒）中gD基因,再通过酶切及连接反应使NLDC145与gD相连克隆至原来gD的克隆位点上,保留原先另一克隆位点IL-21的免疫佐剂的作用,构建靶向DC的重组质粒pRSC-NLDC145·gD-IL-21,对其进行相关鉴定,并和壳聚糖（chitosan）包裹组成纳米HSV DNA疫苗,分别以靶向组pRSC-NLDC145·gD-IL-21 +chitosan、非靶向组 pRSC-gD-IL-21+ chitosan、pRSC+ chitosan 和 chitosan 免疫小鼠 3 次,间隔2周,从而检测各疫苗对小鼠免疫应答的水平及对HSV-1眼部感染的免疫保护反应。结果:靶向DC的重组质粒pRSC-NLDC145·gD-IL-21,经基因测序、酶切鉴定后,序列完全正确;此重组质粒经蛋白印迹方法鉴定,其目的蛋白能在真核细胞内成功表达;且和纳米壳聚糖包裹形成包封率较高的靶向DNA疫苗组,与非靶向组比较,血清中HSV-1病毒中和抗体水平、小鼠泪液中特异性sIgA分泌水平以及CTL、NK细胞杀伤活性程度均明显增高,同时针对HSV-1眼部感染产生了更强的免疫保护反应。结论:成功研制的靶向DC的DNA疫苗pRSC-NLDC145～gD-IL-21,经小鼠眼表粘膜接种后诱导了更强的免疫应答保护反应,同时也间接证明了其目的抗原可最终靶向于DC,为今后该疫苗应用于治疗复发性单纯疱疹病毒性角膜炎（HSK）奠定了坚实的基础。
董莉莉[4]（2017）在《DNA疫苗pRSC-gD.gC-IL-21的构建及其预防HSK的动物实验初步研究》文中认为目的:构建单纯疱疹病毒Ⅰ型（HSV-1）DNA疫苗pRSC-gD.gC-IL-21,探讨其是否能诱导动物免疫应答及抵抗眼角膜HSV-1的感染。方法:提取HSV-1基因组DNA,PCR扩增获得包膜糖蛋白C（gC）基因。以pRSC-gD-IL-21质粒为模板（本实验室2011年构建成功）,将gC与包膜糖蛋白D（gD）进行基因融合,构建重组质粒pRSC-gD.gC-IL-21并进行相关鉴定,用纳米材料壳聚糖（chitosan）包裹,并进行质粒DNA的包封率检测及DpnI保护实验,最后采用粘膜接种的方式分别以pRSC-gD.gC-IL-21+chitosan、pRSC-gD-IL-21+chitosan、pRSC+chitosan 及 chitosan四组免疫小鼠3次,每次间隔2周,末次免疫2周后进行各组小鼠血清中特异性中和抗体、脾淋巴细胞特异性靶细胞杀伤活性、泪液中特异性sIgA分泌水平的检测并进行比较,同时评价各组小鼠对病毒攻击角膜的免疫保护作用。结果:经测序、酶切、PCR、Western Blot鉴定后表明,重组质粒pRSC-gD.gC-IL-21构建成功,目的基因插入正确,在真核细胞内有目的蛋白表达。壳聚糖包裹率高,与对照组相比,该疫苗在小鼠体内产生了更强的特异性中和抗体、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）及自然杀伤细胞（NK）杀伤活性增强、泪液中特异性sIgA水平增高,同时使小鼠产生了更强的针对眼角膜HSV-1感染的免疫保护作用。结论:DNA疫苗pRSC-gD.gC-IL-21构建成功,壳聚糖包裹率高,与疫苗pRSC-gD-IL-21相比,加入免疫原gC后,能诱导小鼠产生更强的免疫应答及针对HSV-1眼部感染的免疫保护作用,能够更好的预防单纯疱疹病毒性角膜炎（HSK）的发生、发展,为下一步最终应用于复发性HSK鼠眼模型打下了基础。
邓明亮[5]（2015）在《牛传染性鼻气管炎基因缺失疫苗的研究与应用》文中研究说明牛传染性鼻气管炎（Infectious bovine rhinotracheitis,IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV）或称牛疱疹病毒Ⅰ型（Bovine herpesvirus-1,BHV-1）感染牛引起的一种以高热、呼吸困难、流鼻汁、上呼吸道及气管、黏膜发炎等为主要特征的传染病。BHV-1感染可引起机体免疫抑制,是牛呼吸道疾病综合征（Bovine respiratory disease complex,BRDC）重要的病原之一,给世界范围内养牛业造成了巨大损失。BHV-1的潜伏感染特性使受感染的牛成为重要的传染源,给疾病的控制和消灭带来了极大困难。目前,采用疫苗免疫已成为IBR防控的主要手段。由于BHV-1基因缺失标记疫苗具有血清学免疫标识,可配套使用鉴别诊断方法区分自然感染与疫苗免疫,在一些欧美国家已得到广泛使用。同时,BHV-1还可作为活病毒载体表达其他重要牛传染病的免疫原性基因制备重组多价疫苗。然而,随着基因缺失标记疫苗的深入研究与广泛使用,该疫苗仍存在免疫抑制、潜伏感染、与野型毒株重组导致毒力返强以及血清学标记灵敏度低与鉴别诊断能力不足等问题,有待进一步完善。目前,我国也缺乏有效的商品化BHV-1标记疫苗用于防控。本实验室前期研制了 BHV-1 gG-/tk-基因缺失疫苗,已证实该疫苗的安全有效性,具有一定的应用前景。本研究旨在对BHV-1 gG-/tk-缺失疫苗进行更深入研究,以期研制更加安全有效的缺失疫苗作为IBR防控手段。牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）主要感染牛引起一种以临床和亚临床感染、繁殖障碍、免疫抑制造成的呼吸系统和肠道系统疾病、血小板减少和出血及致死性粘膜病为主要特征的临床症状复杂多样的疾病,也是BRDC重要的病原之一。BVDV感染可形成持续性感染（Persistently infected,PI）,使受感染的成为是BVDV传播最重要的传染源,因此,对牛群中的PI牛的检测与剔除是BVDV防控重要的措施。此外,采用疫苗免疫降低BVDV流行率是BVDV防控的重要措施。本研究旨在对我国BVDV进行流行病学与基因型研究,并比较不同的BVDV检测方法,为使用BHV-1 gG-/tk-作为病毒活载体研制有效的BHV-1/BVDV重组二价疫苗提供理论依据。本论文主要研究内容和结果如下:1.BHV-1三基因缺失疫苗的构建与免疫原性研究为了进一步缺失BHV-1 gG-/tk-毒株的免疫抑制基因、提高免疫原性,以及进一步降低其毒力与重组而导致毒力返强的可能性,提高血清学标记鉴别诊断能力,本研究利用磷酸钙法转染MDBK进行同源重组构建了 BHV-1 gG-/tk-/gN-与BHV-1 gG-/tk-/gE-三基因缺失病毒。在兔体上进行了安全性及免疫原性研究,结果显示BHV-1 gG-/tk-/gN-接种组未检测到鼻腔排毒,BHV-1 gG-/tk-/gE-接种组只在接种后第三天检测到有一只兔子排毒。攻wt BHV-1后BHV-1 gG-/tk-/gN-与BHV-1 gG-/tk-/gE-接种组排毒时间分别为6、4天,而BHV-1 gG-/tk-接种组排毒时间仅为两天。进一步在牛体上进行BHV-1 gG-/tk-/gE-的安全性及对wt BHV-1与wt BHV-5的保护性研究,结果显示BHV-1 gG-/tk-/gE-与BHV-1 gG-/tk-相比在牛体上的毒力进一步减弱,对wt BHV-1和wt BHV-5的保护率分别为64.2%、68.6%。以上结果表明,BHV-1 gG-/tk-缺失gN基因毒力进一步减弱,免疫原性降低;BHV-1 gG-/tk-/gE较BHV-1 gG-/tk-更安全,但免疫原性有所下降。2.BHV-1 gG-/tk-基因缺失疫苗不同免疫途径的免疫效果比较为了筛选BHV-1 gG-/tk-疫苗有效且切合临床实际应用的免疫途经,采用滴鼻ON)与肌注（IM）途径对牛体进行该疫苗免疫,并在初次免疫21天后进行加强免疫,结果显示IM途径的疫苗毒株排毒量均显着低于IN途径,但首次免疫后IM途径比IN途径能更早的产生中和抗体和gB抗体与产生更高水平的IL-4（p<0.01）。加强免疫后,IN免疫组诱导产生的sIgA水平显着高于IN免疫一次组与IM加强免疫组（p<0.05）,但IM免疫组能诱导更高水平的IFN-γ。攻毒后,IN免疫组的排毒量和排毒时间少于肌注免疫组,且IN加强免疫组的排毒量最少,排毒时间最短,但差异不显着。与未免疫组相比,IM免疫组（包括一次或加强免疫组）的排毒时间与排毒量均显着减少（p<0.001）。以上结果说明,BHV-1 gG-/tk-疫苗采用以上两种途径进行免疫安全性均良好,均能提供有效的保护力,IM可作为该疫苗临床实际应用的有效免疫途径。3.BHV-1 gG-/tk-/gD+与BHV-1 gG-/tk-/gD5+重组病毒的构建与鉴定为了进一步提高BHV-1 gG-/tk-基因缺失疫苗的免疫原性,以及对BHV-5的保护力,本研究基于BHV-1 gG-/tk者因缺失病毒构建了表达双拷贝同源gD（BHV-1 gD）和异源gD（BHV-5 gD,gD5）基因的BHV-1重组病毒,分别为BHV-1 gG-/tk-/gD+与BHV-1 gG-/tk-/gD5+。利用磷酸钙转染法将含有gD胞外区表达盒基因的转移载体与亲本病毒BHV-1 gG-/tk-/EGFP+的基因组DNA共转染MDBK后收获增殖的病毒。通过反向筛选绿色荧光蛋白（GFP）,得到重组病毒。PCR检测表明gD与gD5基因胞外区均已插入到重组病毒的tk基因位置;间接免疫荧光试验和Western blot证实重组病毒中的gD或gD5基因胞外区获得了表达;并进行了重组病毒生物学特性研究,结果表明同源gD的插入对BHV-1病毒的复制无影响,异源gD的插入增强了BHV-1在细胞之间的扩散能力,但生长机制与亲本毒株相似。本研究为研制提高BHV-1 gG-/tk-基因缺失疫苗的免疫原性与对BHV-5的保护力的重组病毒及应用该疫苗毒株作为活病毒载体研制重要牛传染病的BHV-1多价疫苗奠定了基础。4.我国BVDV流行病学调查与基因型研究为了探索以BHV-1 gG-/tk-作为病毒活载体的BHV-1/BVDV重组二价疫苗的应用前景,进行了我国BVDV流行病学及基因型研究。2010-2013年采自我国八个不同省市的肉牛、奶牛、牦牛和水牛血清样品共1379份。采用BVDV抗体检测试剂盒、BVDV抗原检测试纸条与套式RT-PCR分别检测BVDV抗体、抗原与核酸阳性率。结果显示我国的BVDV抗体、抗原和核酸总阳性率分别为58.09%（801/1379）、1.39%（14/1010）和22.64%（146/645）。不同地区、牛种类的阳性率高低不一;奶牛、肉牛、牦牛和水牛的抗体阳性率分别为89.49%（298/333）、63.27%（248/392）、45.38%（236/520）和 14.18%（19/134）,抗原阳性率分别为 0.00%（0/116）、0.77%（3/392）、0.82%（3/368）和 5.97%（8/134）,RT-PCR检测核酸阳性率分别为 32.06%（42/131）、13.00%（26/200）、28.89%（52/180）和 19.40%（26/134）。根据 5’-UTR基因序列进行进化树遗传分析,结果显示存在三种基因亚型:BVDV-lb、BVDV-lm和BVDV-1新亚型（命名为BVDV-lu型）,分别占33.06%、49.19%和17.74%。根据Npro基因序列构建的进化树分析证实以上基因型分型。以上结果表明BVDV感染严重。本研究揭示了近几年我国BVDV的流行情况和存在的主要基因型,为制定BVDV有效防控策略和措施提供了科学依据,为研发我国具有自主知识产权的BHV-1/BVDV二价疫苗提供了流行病学依据。
董罡[6]（2013）在《猕猴B病毒流行病学调查及其囊膜蛋白表达与表位检测》文中研究表明B病毒是动物源性传染性疾病，在自然宿主（猴）中的感染率高（血清学阳性率为10%60%），对人的致死性强（死亡率超过70%）；此外，B病毒属于生物安全4级病原，是潜在的生物战剂。因此，B病毒已成为实验猴质量和相关从业人员安全的严重威胁。当前，受困于B病毒基础研究的不足，准确诊断和有效防治一直裹足不前。有鉴于此，本课题以中国源猕猴的B病毒流行病学调查为基础，以诱导机体免疫应答的主要靶点——B病毒囊膜蛋白gC和gD为重点，以B病毒诊断和防治为目的，研究了B病毒在我国实验猴群中的流行病学特点；克隆表达了囊膜蛋白gC和gD基因，探讨了重组蛋白的诊断价值；制备和纯化了gC和gD的抗体，研究了抗体对病毒感染的影响；鉴定了gC和gD的抗原表位，为B病毒的防治奠定了基础。1．中国源猕猴感染猴B病毒的流行病学调查从四川、北京、海南、和广西收集的953份不同年龄阶段猴血清，检测血清中是否存在B病毒抗体。结果显示：344份血清抗体阳性，阳性率为36.1%；就实验猴群而言，不同猴群的B病毒感染率差异较大（最低为10.4%，最高为48.2%）；就年龄而言，12岁龄猴群的抗体阳性率明显低于成年猴群（阳性率分别为18.4%和53.2%）。对13份B病毒抗体阳性猴的血清和三叉神经组织DNA进行PCR检测，结果显示：仅4份动物的三叉神经组织DNA样品为PCR阳性（30.8%）；扩增产物分析表明，gL基因的GC含量为64.1%，gD为74.2%，且gL的扩增条件和效果明显优于gD。说明B病毒感染猴后将在部分动物神经节中建立潜伏，而gL基因更适合作为分子鉴定的靶标。2．B病毒囊膜蛋白gC和gD的克隆、表达及诊断价值评价利用扩增的gC和gD基因，构建原核表达载体pET-28b（+）-gC和pET-28b（+）-gD，在IPTG诱导下获得大小约为46KDa以包涵体形式表达的gD重组蛋白；pET-28b（+）-gC未见目的蛋白表达。以优化后的gC基因密码子序列，获得约为50KDa的gC重组蛋白。利用重组蛋白gC和gD，通过ELISA反应条件优化，建立了血清抗体的ELISA检测方法。其中，重组蛋白gC和gD的最适包被量分别为150ng/孔和100ng/孔，待测血清稀释度为1:810，兔抗猴IgG-HRP的工作浓度为1：30000。所建立的gC-ELISA敏感性和特异性分别为83.3%和100%，gD-ELISA为100%和90.0%；同比例混合gC和gD，敏感性可提高到100%，特异性为95.0%。3．猴B病毒囊膜蛋白gC和gD抗体制备及表位研究利用重组蛋白gC和gD免疫小鼠制备抗血清，同时采用亲和层析从B病毒阳性猴血清中纯化gC和gD抗体。细胞感染实验显示，只有gD抗体能抑制病毒感染，而gC抗体作用不明显。利用生物信息学软件分别在gC和gD蛋白上发现7、7个可能的抗原表位，合成表位肽段并经B病毒阳性血清证实，gD蛋白上的4个肽段(46LPPLEQKTD54、106RGAPEATRSDA116、291PELAPEERGTSRTPGD306和361AVYLVRRRGR370)和gC蛋白上的3个肽段(32STPAGRPGASRPGGVKRANR51、53AAPARGRGSSNGTGPGSTSAQFRCRRPD81和298RDSVSFSRRNAT309)都能与阳性血清反应，表位肽的敏感性为40.0%80.0%，特异性均为100%。
陈国敏[7]（2013）在《HSV-2抗原表位重组耻垢分枝杆菌的构建和免疫效果观察》文中研究说明目的构建2型单纯疱疹病毒载体疫苗，检测重组载体疫苗的免疫效果，为获得预防和治疗2型单纯疱疹病毒慢性感染的重组载体疫苗奠定理论基础，为2型单纯疱疹病毒疫苗的研制提供一种新的策略。完善耻垢分枝杆菌载体疫苗构建技术，为其作为病毒疫苗制备平台提供技术支持。方法1、pmv261-gBD-570质粒的构建查阅文献，根据GeneBank中登记的HSV-2gD和gB的基因序列构建gBD-570，将含有EcorI和salI酶切位点的gBD-570亚克隆入载体puc57，经鉴定正确后，同时酶切穿梭质粒PMV-261和puc57-gBD-570，并将酶切片段gBD-570回收后亚克隆入酶切后的穿梭质粒PMV-261中，构建重组质粒pmv-gBD-570，经提质粒，酶切和菌落PCR鉴定正确后提取重组质粒，-20℃保存备用。2、目的基因gBD-570的蛋白表达将提取的质粒通过电穿孔亚克隆入耻垢分枝杆菌（MC2155），用SDS-PAGE方法鉴定gBD-570的表达。3.免疫动物6周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为6组（每组10只），于小鼠双侧股四头肌注射免疫，各组依次为：1组，每侧各注射NS（生理盐水）200μl；2组，每侧各注射空载体质粒PMV261200μl（1mg/ml）；3组，每侧各注射1×106cfu/ml的MC2155200μl（1mg/ml）；4组，注射低浓度（1×104cfu/ml）的重组MC2155200μl；5组，注射中浓度（1×106cfu/ml）组的重组MC2155200μl；6组，高浓度（1×108cfu/ml）组的重组MC2155200μl。免疫完成三周后，于小鼠断尾采血，间接ELISA法检测血清IgG、IFN-γ及IL-2表达量，并通过MTT法对小鼠的脾淋巴细胞增值率进行检测结果1、构建重组质粒PMV-gBD-570转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR、双酶切以及测序鉴定正确，质粒构建成功。2、将构建成功的质粒电穿孔转化入耻垢分枝杆菌MS中，经菌落PCR及双酶切鉴定正确，质粒转化成功。3、SDS-PAGE结果显示，重组质粒可以在MS中正确表达4、免疫小鼠后实验结果显示：中浓度组重组MC2155和高浓度组MC2155的免疫效果均优于其他实验组，能够较好的诱导体液免疫及细胞免疫。结论1、成功构建了融合蛋白表达载体PMV261-gBD-5702、重组表达载体在耻垢分枝杆菌中获得了有效表达3、重组耻垢分支杆菌能够较好的诱导小鼠体液免疫和细胞免疫，为下一步的疫苗制备工作奠定了基础。
潘明洁[8]（2012）在《HSV-2 gD蛋白无血清悬浮高表达细胞系的建立及纯化鉴定》文中提出单纯疱疹病毒（herpes simplex virus, HSV）,是一种常见的病原体,是第一个被发现的人类疱疹病毒,它容易建立潜伏感染并且潜伏的病毒可以在以后间歇性地复发引起疾病。HSV分为HSV-1和HSV-2两型。其中HSV-1主要引起口面部感染、眼部感染和疱疹性脑炎等,HSV-2主要引起的疾病是生殖器疱疹,并常伴有尿道炎、膀胱炎或宫颈炎等,所有年龄段都能感染。作为细胞内寄生病毒,HSV可在人体神经节建立终生潜伏期并可消除宿主的免疫应答,这些都是宿主难以有效清除HSV感染的重要因素。尽管现有的抗病毒药物如阿昔洛韦等能够选择性地抑制其复制、缩短其感染过程,但却不能从根本上控制病毒的潜伏、限制疾病的传播以及复发。因此,研制安全有效的HSV疫苗,诱导机体产生较强的体液免疫反应和特异性细胞免疫反应,是预防该病毒的理想方法。HSV-2编码至少有12个糖蛋白,其中gD （glycoprotein, gD）, gB, gC是在感染细胞中表达最丰富的糖蛋白,也是HSV-2病毒包膜上的主要糖蛋白。在这些糖蛋白中,具有重要抗原表位的gD与细胞表面受体相互作用,在病毒吸附和进入细胞中发挥重要作用,也是宿主针对HSV感染产生体液免疫反应和细胞免疫反应的主要靶标。因此,糖蛋白gD是理想的HSV疫苗候选抗原。本研究通过对HSV-2gD抗原表位分析,筛选HSV-2gD胞外区片段抗原表位富集区,选择真核和原核生物均偏爱的密码子,优化设计基因序列,化学合成了全新的HSV-2gD基因序列。将合成的基因片段插入真核表达载体pMD902内,构建重组表达质粒pMD902-gD。将重组表达质粒电转染至中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cell, CHO cell）DG44细胞,Western blot检测培养细胞上清目的蛋白的表达。然后把阳性细胞稀释后放入96孔板,通过培养基去HT（次黄嘌呤,胸腺嘧啶核苷）,逐渐增加培养基MTX（甲氨碟呤）浓度筛选高表达gD糖蛋白的细胞株,Dot blot和SDS-PAGE检测筛选细胞目的蛋白的表达。筛选的稳定高表达细胞株,用1升无血清培养基悬浮培养,培养细胞上清用离子交换层析,凝胶过滤层析方法纯化。高效液相色谱（HPLC）法测定纯化蛋白的纯度,Bradford法测定纯化蛋白浓度。ELISA法检测纯化的重组蛋白抗原性。用重组gD蛋白免疫小鼠,ELISA法测血清特异性抗体效价和免疫小鼠脾细胞细胞因子的表达。实验结果显示,转染重组蛋白的培养细胞上清经Western blot分析,在分子量约为44kDa处可见单一目的蛋白条带,说明重组糖蛋白gD在DG44细胞中以可溶形式表达,糖基化均一。通过将阳性细胞用含有MTX的培养基加压筛选以及细胞株的稳定性检测得到8株稳定高表达gD糖蛋白细胞株。无血清悬浮培养高表达细胞株,纯化获得重组蛋白纯度超过95%, SDS-PAGE及Western blot检测均显示单一蛋白条带,浓度约为1.9mg/mL,1L细胞培养液共获得蛋白总量57mg。ELISA检测显示重组糖蛋白具有较好的抗原性和特异性。间接ELISA检测免疫小鼠抗血清抗体效价均≥1：5000。纯化的重组gD糖蛋白免疫小鼠可以刺激小鼠脾细胞表达细胞因子IL-2和IFN-γ,表明获得的重组糖蛋白gD有良好的免疫原性。实验成功建立了稳定高表达重组gD糖蛋白的无血清悬浮培养细胞系,并证实重组gD蛋白具有良好的免疫活性,为HSV-2基因重组亚单位疫苗研制奠定了基础。
夏利,程培华[9]（2012）在《优化单纯疱疹病毒DNA疫苗的研究进展》文中研究指明单纯疱疹病毒（HSV）是生殖器疱疹（GH）的主要病原体,主要通过性接触传播。HSV感染机体后可长期潜伏在骶神经节中,逃避宿主免疫系统的识别,因而无法彻底清除。在一定条件如应激、疲劳、免疫力低下等情况下,潜伏病毒被激活而发
李君丽[10]（2011）在《携带HSV-2 gB CTL表位的gD抗原制备及其免疫效果评估》文中提出单纯疱疹病毒Ⅱ型（Herpes simplex virus 2, HSV-2）为双链DNA病毒,属疱疹病毒科,感染可引起生殖器疱疹。HSV-2感染在全球普遍存在,发展中国家的形势更为严峻。HSV-2还可增加艾滋病和宫颈癌的感染机率。疫苗在预防和治疗HSV-2感染和复发中具有重要的作用。目前的疫苗研制工作主要集中在HSV-2糖蛋白上。HSV-2表面的11种糖蛋白是其主要免疫原,其中的糖蛋白D（glycoprotein D, gD）和糖蛋白B（glycoprotein B, gB）是亚单位疫苗研究的热点。gD具有高同源性和保守性,是HSV-2最主要的保护性抗原。gB可诱导产生中和抗体并能诱发细胞毒性T细胞反应,CTL表位与MHCⅠ类分子结合,被CD8+ T细胞表面受体识别,激发细胞免疫反应,这种免疫反应是抗HSV-2免疫的重要组成部分。本研究将HSV-2主要免疫原gD与gB上两种CTL表位连接构建重组基因gD-gBCTL,分别在杆状病毒表达系统和原核表达系统中进行表达,并对原核表达的重组蛋白的免疫效果进行初步评价。在杆状病毒表达系统中,以构建的重组基因为模板,分别扩增gD基因和gD-gBCTL基因,连接载体pFastBac1构建重组供体质粒,转化DH10BacTM感受态,通过转座获得重组穿梭质粒,转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒,用获得的两种重组杆状病毒感染Sf9细胞表达重组蛋白。经过筛选重组穿梭质粒、优化表达条件,使gD和gD-gBCTL蛋白都得到了较高量的表达,为下一步纯化这两种蛋白,研究它们的免疫效果奠定了基础。在原核表达系统中,构建重组基因表达质粒pET-22b（+）-gD-gBCTL,转化E.coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达,优化表达条件,His TrapTM HP柱纯化得到可溶性表达的重组蛋白。将该重组蛋白结合不同佐剂,以不同方式免疫Balb/c小鼠,测定抗体效价,初步评价添加CTL表位后重组蛋白的体液免疫效果,并建立动物攻毒模型,评价重组蛋白的免疫保护性,结果表明该重组蛋白具有较强的免疫保护作用。
二、THE CONSTRUCTION AND PRELIMINARY APPRAISEMENT OF HSV-2 gD GENE DNA VACCINE（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、THE CONSTRUCTION AND PRELIMINARY APPRAISEMENT OF HSV-2 gD GENE DNA VACCINE（论文提纲范文）
（1）牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎二联核酸疫苗的构建及其免疫效应研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 牛病毒性腹泻(BVD)研究进展 |
| 1.1.1 BVD的病原学 |
| 1.1.2 BVD的流行病学 |
| 1.1.3 BVD疫苗研究进展 |
| 1.2 牛病毒性腹泻病毒(BVDV)研究进展 |
| 1.2.1 BVDV基因组结构 |
| 1.2.2 BVDV编码的结构蛋白及功能 |
| 1.3 牛传染性鼻气管炎(IBR)研究进展 |
| 1.3.1 IBR的病原学 |
| 1.3.2 IBR的流行病学 |
| 1.3.3 IBR疫苗研究进展 |
| 1.4 牛疱疹病毒1型(BHV-1)研究进展 |
| 1.4.1 BHV-1的基因组结构 |
| 1.4.2 BHV-1编码的结构蛋白及其功能 |
| 1.5 内部核糖体进入位点(IRES)研究进展 |
| 1.5.1 IRES简介 |
| 1.5.2 IRES结构特点及其在载体表达中的应用 |
| 1.6 试验目的及意义 |
| 第二章 BVDV E0和IBRV gD基因的克隆与生物信息学分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 毒株、菌株与细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 BVDV E0与IBRV gD基因的克隆 |
| 2.1.5 BVDV E0与IBRV gD基因生物信息学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 目的片段PCR扩增结果 |
| 2.2.2 目的基因测序结果 |
| 2.2.3 生物信息学分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 BVDV E0基因的选择 |
| 2.3.2 IBRV gD基因的选择与扩增 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 pVAX1-E0-IRES-gD真核表达载体的构建与体外表达检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株、质粒和细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 重组表达载体的设计 |
| 3.1.5 重组载体pVAX1-IRES的构建 |
| 3.1.6 重组载体pVAX1-EO-IRES的构建 |
| 3.1.7 重组载体pVAX1-E0-IRES-gD的构建 |
| 3.1.8 pVAX1-E0-IRES-gD载体中目的基因体外表达的检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 pVAX1-IRES真核表达载体的构建 |
| 3.2.2 pVAX1-E0-IRES真核表达载体的构建 |
| 3.2.3 pVAX1-E0-IRES-gD真核表达载体的构建 |
| 3.2.4 真核表达载体pVAX1-E0-IRES-gD在293T细胞中的表达情况 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 重组质粒的构建 |
| 3.3.2 目的蛋白的表达 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 pVAX1-E0-IRES-gD二联核酸疫苗免疫效果研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 质粒和二联灭活苗 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 大量抽提质粒DNA |
| 4.1.6 小鼠的分组与免疫 |
| 4.1.7 样品采集 |
| 4.1.8 免疫小鼠血清中E0抗体检测 |
| 4.1.9 免疫小鼠血清中gD抗体检测 |
| 4.1.10 细胞因子检测 |
| 4.1.11 脾淋巴细胞增殖实验(MTT法) |
| 4.1.12 数据处理 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 免疫小鼠血清中E0抗体检测结果 |
| 4.2.2 免疫小鼠血清中gD抗体检测结果 |
| 4.2.3 免疫小鼠血清中IFN-γ检测结果 |
| 4.2.4 免疫小鼠血清中IL-4检测结果 |
| 4.2.5 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 小鼠免疫试验后抗E0和gD IgG抗体含量变化 |
| 4.3.2 小鼠免疫试验后细胞因子含量变化 |
| 4.3.3 脾淋巴细胞反应 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）基于伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gD基因mRNA疫苗的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 伪狂犬病研究进展 |
| 1.1 病原及理化特征 |
| 1.2 病毒分子生物学特征 |
| 1.3 病毒复制过程 |
| 1.4 PRV逃逸宿主免疫系统机制 |
| 1.5 囊膜糖蛋白gD的结构与功能 |
| 2 mRNA疫苗 |
| 2.1 mRNA疫苗的分子构成 |
| 2.2 mRNA疫苗的包被 |
| 2.3 mRNA疫苗研究 |
| 2.4 核酸类疫苗免疫应答过程 |
| 3 目的和意义 |
| 第二章 PRV-GD基因mRNA克隆质粒和真核质粒的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 囊膜糖蛋白gD基因扩增 |
| 2.2 mRNA克隆载体的酶切鉴定及测序结果 |
| 2.3 真核表达载体PVAX-gD酶切鉴定及测序结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 pMD19-GD克隆载体酶切线性化体外转录,mRNA疫苗及真核表达载体免疫原性相关研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Western blot结果分析 |
| 2.2 ELISA检测特异性抗体结果 |
| 2.3 病毒中和抗体检测 |
| 2.4 T淋巴细胞亚群数量分析和ELISA测定细胞因子 |
| 2.5 小鼠攻毒保护试验 |
| 3 讨论 |
| 3.1 mRNA疫苗诱导动物的免疫应答反应 |
| 3.2 mRNA疫苗诱导动物的免疫保护 |
| 3.3 核酸类疫苗免疫途径及作用方式 |
| 3.4 mRNA的体外转录及包被 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）靶向DC的DNA疫苗pRSC-NLDC145·gD-IL-21的研制及抗鼠眼角膜HSV-1感染的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号、变量、缩略词等本论文专用术语注释表 |
| 绪论 |
| 综述 单纯疱疹病毒性角膜炎的发病机制及HSV疫苗研究进展 |
| 第一部分 DNA疫苗pRSC-NLDC145·gD-IL-21DNA的设计、构建及鉴定 |
| 前言 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二部分 纳米颗粒壳聚糖为载体的靶向DC的DNA疫苗pRSC-NLDC145·gD-IL-21DNA鼠眼表粘膜接种(局部滴眼)预防HSK的研究 |
| 前言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）DNA疫苗pRSC-gD.gC-IL-21的构建及其预防HSK的动物实验初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号、变量、缩略词等本论文专用术语注释表 |
| 绪论 |
| 文献综述 |
| 第一部分 DNA疫苗pRSC-gD.gC-IL-21的设计、构建与鉴定 |
| 前言 |
| 1.1 实验试剂及材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二部分 DNA疫苗壳聚糖/pRSC-gD.gC-IL-21动物免疫效应及预防HSK的初步研究 |
| 前言 |
| 2.1 实验试剂及材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）牛传染性鼻气管炎基因缺失疫苗的研究与应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 文献综述 |
| 第一章 牛传染性鼻气管炎 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 病毒分类与分型 |
| 1.1.2 病毒形态、理化特性与生物学特性 |
| 1.2 分子生物学研究进展 |
| 1.2.1 基因组结构 |
| 1.2.2 基因组编码的主要蛋白及功能 |
| 1.3 免疫抑制 |
| 1.4 潜伏感染与再激活 |
| 1.5 致病机制 |
| 1.6 流行病学 |
| 1.6.1 流行特点 |
| 1.6.2 国外流行情况 |
| 1.6.3 国内流行情况 |
| 1.7 防控 |
| 1.7.1 国际防控现状 |
| 1.7.2 我国防控现状 |
| 1.7.3 IBR疫苗的研究进展 |
| 第二章 牛病毒性腹泻病毒 |
| 2.1 病原学 |
| 2.1.1 BVDV基因组结构 |
| 2.1.2 BVDV分型 |
| 2.2 BVDV国内外流行病学研究概况 |
| 2.2.1 国外BVDV流行现状 |
| 2.2.2 国内BVDV流行现状 |
| 2.2.3 分子流行病学现况 |
| 2.3 诊断 |
| 2.3.1 病原检测 |
| 2.3.2 血清学检测 |
| 2.4 疫苗研究进展 |
| 2.4.1 疫苗对BVDV防控的重要性 |
| 2.4.2 传统疫苗 |
| 2.4.3 DNA疫苗和亚单位疫苗 |
| 2.4.4 重组活载体疫苗 |
| 2.4.5 多价与交叉保护疫苗 |
| 试验研究 |
| 第一章 BHV-1三基因缺失疫苗的构建与免疫原性研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.2.1 缺失重组质粒pgN~-/e~+的构建与鉴定 |
| 1.2.2 BHV-1 gG~-/tk~-病毒基因组的鉴定 |
| 1.2.3 BHV-1 gG~-/tk~-/gN~-的构建与筛选 |
| 1.2.4 BHV-1 gG~-/tk~-/gN~-的鉴定 |
| 1.2.5 BHV-1 gG~-/tk~-/gE~-的构建与筛选 |
| 1.2.6 BHV-1 gG~-/tk~-/gE~-的鉴定 |
| 1.2.7 BHV-1 gG~-/tk~-/gN~-与BHV-1 gG~-/tk~-/gE~-的生物学特性 |
| 1.2.8 兔体试验 |
| 1.2.9 牛体试验 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 BHV-1 gG~-/tk~-基因缺失疫苗不同免疫途径的免疫效果比较 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 不同免疫途径的安全性 |
| 2.2.2 不同免疫途径的保护力 |
| 2.2.3 不同免疫途径的免疫反应 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 BHV-1gG~-/tk~-/gD~+与BHV-1 gG~-/tk~-/gD5~+重组病毒的构建与鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 gD与gD5基因的扩增 |
| 3.2.2 含不同表达原件的gD基因真核表达质粒的构建与鉴定 |
| 3.2.3 不同表达原件启动下的gD基因在293T细胞表达水平的比较 |
| 3.2.4 gD基因胞外分泌表达检测结果 |
| 3.2.5 gD和gD5表达盒基因的PCR扩增 |
| 3.2.6 重组转移载体pTK-gD与pTK-gD5的构建与鉴定 |
| 3.2.7 BHV-1 gG~-/tk~-/EGFP~+基因组的提取与鉴定 |
| 3.2.8 重组病毒的构建与筛选 |
| 3.2.9 重组病毒的鉴定 |
| 3.2.10 重组病毒的生长特性 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 我国BVDV流行病学调查与基因型研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 BVDV抗体检测 |
| 4.2.2 BVDV抗原检测 |
| 4.2.3 套式RT PCR核酸检测 |
| 4.2.4 不同检测方法的比较分析 |
| 4.2.5 序列与遗传进化树分析 |
| 4.2.6 基因型分析统计结果 |
| 4.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（6）猕猴B病毒流行病学调查及其囊膜蛋白表达与表位检测（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一篇 文献综述 |
| 1.1 猴 B 病毒的基本结构和特性 |
| 1.1.1 猴 B 病毒发现及其分类 |
| 1.1.2 猴 B 病毒的结构特征及其超微结构 |
| 1.1.3 B 病毒的分子生物学特性 |
| 1.1.4 猴 B 病毒的生活周期与潜伏感染 |
| 1.2 猴 B 病毒的发病机理 |
| 1.2.1 猴群中猴B病毒的感染 |
| 1.2.2 B病毒对人的感染 |
| 1.3 猴 B 病毒感染的检测 |
| 1.3.1 病毒学方法 |
| 1.3.2 分子生物学方法 |
| 1.3.3 血清学方法 |
| 1.4 B 病毒的预防与治疗 |
| 参考文献 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 中国源猕猴感染猴 B 病毒的流行病学调查 |
| 第一节 我国不同地区实验猕猴的 B 病毒流行病学调查 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 试验结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二节 B 病毒感染后在机体内的存在形式 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 本章小结 |
| 第二章 B 病毒囊膜蛋白 gC 和 gD 的克隆、表达及诊断价值评价 |
| 第一节 B病毒囊膜蛋白gC和gD基因克隆 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二节 重组 B 病毒囊膜蛋白 gC 和 gD 的制备 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三节 重组蛋白 gC 和 gD 的诊断价值评价 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 本章小结 |
| 第三章 B 病毒囊膜蛋白 gC 和 gD 抗体制备及表位研究 |
| 第一节 B 病毒囊膜蛋白 gC 和 gD 的抗体制备及其对病毒感染的影响 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二节 B 病毒囊膜蛋白 gC 和 gD 的表位分析及鉴定 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 本章小结 |
| 全文总结 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（7）HSV-2抗原表位重组耻垢分枝杆菌的构建和免疫效果观察（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 构建 HSV-2gBD 重组 MC215513 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 重组 MC2155 的初步免疫效果观察 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（8）HSV-2 gD蛋白无血清悬浮高表达细胞系的建立及纯化鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 总体研究方案 |
| 第一部分 HSV-2 gD真核表达载体的构建 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 分析与讨论 |
| 第二部分 稳定高表达HSV-2 gD细胞株的建立 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 分析与讨论 |
| 第三部分 稳定高表达细胞株的无血清悬浮培养及表达蛋白的纯化鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 分析与讨论 |
| 第四部分 重组蛋白HSV-2 gD抗原性分析及抗体制备 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 分析与讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（9）优化单纯疱疹病毒DNA疫苗的研究进展（论文提纲范文）
| 1 HSV-DNA疫苗简介 |
| 2 增强疫苗免疫原性 |
| 2.1 免疫佐剂 |
| 2.2 CTL表位 |
| 2.3 截短糖蛋白 |
| 2.4 模拟抗原表位 |
| 2.5 多表位复合疫苗 |
| 3 增强机体反应性 |
| 3.1 接种方式 |
| 3.2 表达载体 |
| 3.3 联合免疫 |
| 4 展 望 |
（10）携带HSV-2 gB CTL表位的gD抗原制备及其免疫效果评估（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 单纯疱疹病毒Ⅱ型的研究进展 |
| 1.1 单纯疱疹病毒Ⅱ型 |
| 1.2 HSV-2 的感染流行现状 |
| 1.3 HSV-2 感染过程 |
| 1.4 HSV-2 感染与免疫 |
| 1.4.1 HSV-2 感染与天然免疫 |
| 1.4.2 HSV-2 感染与获得性免疫 |
| 1.5 HSV-2 的疫苗研究概况 |
| 1.6 展望 |
| 试验研究 |
| 第二章 HSV-2 在Vero 细胞上的培养、收获和病毒毒力测定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞与病毒株 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 Vero 细胞的复苏、冻存及培养 |
| 2.2.2 HSV-2 333 株在Vero 细胞中的培养与收获 |
| 2.2.3 HSV-2 333 株的纯化 |
| 2.2.4 HSV-2 333 株半数组织感染量（TCID50）的测定 |
| 2.2.5 HSV-2 333 株全病毒灭活与蛋白定量 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 HSV-2 333 株感染Vero 细胞病变观察 |
| 2.3.2 HSV-2 333 株病毒滴度测定结果 |
| 2.3.3 HSV-2 333 株灭活后蛋白含量测定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 HSV-2 gD 融合gB CTL 表位重组蛋白gD-gBCTL 与gD 在杆状病毒表达系统中的表达 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 基因、菌株与载体 |
| 3.1.2 实验用细胞 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 主要试剂的配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物的设计与合成 |
| 3.2.2 目的基因的扩增 |
| 3.2.3 目的基因的鉴定和胶回收 |
| 3.2.4 连接克隆载体pMD18-T |
| 3.2.5 DH5α感受态细胞的制备 |
| 3.2.6 连接产物转化E.coli DH5α |
| 3.2.7 转化后菌落PCR 鉴定 |
| 3.2.8 重组质粒的提取 |
| 3.2.9 目的基因连接供体质粒pFastBac1 |
| 3.2.10 DH10Bac~(TM) 感受态细胞的制备 |
| 3.2.11 转化DH10Bac~(TM) 与鉴定 |
| 3.2.12 重组杆粒Bacmid-gD 与Bacmid-gD-gBCTL 的提取 |
| 3.2.13 PCR 鉴定重组杆粒 |
| 3.2.14 昆虫细胞的复苏、传代培养与冻存 |
| 3.2.15 重组杆粒转染昆虫细胞 |
| 3.2.16 重组杆状病毒的收获 |
| 3.2.17 重组杆状病毒的传代培养 |
| 3.2.18 重组杆状病毒毒种的保存 |
| 3.2.19 病毒毒力的测定 |
| 3.2.20 目的蛋白表达条件的优化 |
| 3.2.21 目的蛋白的Western blot 鉴定 |
| 3.2.22 目的蛋白的大量表达 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 目的基因的扩增 |
| 3.3.2 目的基因连接供体质粒pFastBac1 的酶切鉴定 |
| 3.3.3 重组杆粒的鉴定 |
| 3.3.4 重组杆状病毒感染 sf9 昆虫细胞 |
| 3.3.5 重组杆状病毒毒力测定 |
| 3.3.6 目的蛋白表达条件的优化 |
| 3.3.7 目的蛋白的Western blot 鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 重组蛋白gD-gBCTL 的原核表达与纯化 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 基因、菌株与载体 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 主要试剂的配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 引物的设计与合成 |
| 4.2.2 目的基因的扩增 |
| 4.2.3 目的基因的鉴定和胶回收 |
| 4.2.4 PCR 产物连接克隆载体pMD18-T |
| 4.2.5 连接产物转化E.coli DH5α |
| 4.2.6 转化后菌落PCR 鉴定 |
| 4.2.7 目的基因表达载体的构建 |
| 4.2.8 表达载体的酶切鉴定 |
| 4.2.9 E. coli BL21 感受态细胞的制备 |
| 4.2.10 重组蛋白的诱导表达 |
| 4.2.11 重组蛋白的Western blot 鉴定 |
| 4.2.12 重组蛋白的纯化 |
| 4.2.13 重组蛋白的定量测定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 gD-gBCTL 基因的扩增 |
| 4.3.2 表达载体的酶切鉴定 |
| 4.3.3 gD-gBCTL 蛋白的诱导表达 |
| 4.3.4 gD-gBCTL 蛋白的Western blot 鉴定 |
| 4.3.5 gD-gBCTL 蛋白的纯化结果 |
| 4.3.6 gD-gBCTL 蛋白的定量测定结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 原核表达重组蛋白 gD-gBCTL 免疫效果的初步评价 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 抗原与病毒株 |
| 5.1.2 实验动物 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.1.5 主要试剂的配制 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 实验动物分组及免疫程序 |
| 5.2.2 动物血清与阴道灌洗液的制备 |
| 5.2.3 ELISA 方法检测血清中IgG 抗体 |
| 5.2.4 ELISA 方法检测阴道灌洗液中sIgA 抗体 |
| 5.2.5 ELISA 方法检测血清中IgG 抗体亚型 |
| 5.2.6 ELISA 方法检测血清中IFN-γ的含量 |
| 5.2.7 血清中和实验 |
| 5.2.8 小鼠攻毒模型的建立 |
| 5.2.9 小鼠攻毒方案 |
| 5.2.10 攻毒后病变观察、体重称量与病毒含量测定 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 ELISA 方法检测小鼠血清中IgG 抗体效价 |
| 5.3.2 ELISA 方法检测阴道灌洗液中sIgA 抗体效价 |
| 5.3.3 ELISA 方法检测血清中IgG 抗体亚型 |
| 5.3.4 ELISA 方法检测血清中IFN-γ的含量 |
| 5.3.5 血清中和抗体 |
| 5.3.6 小鼠攻毒模型建立结果 |
| 5.3.7 小鼠攻毒试验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、THE CONSTRUCTION AND PRELIMINARY APPRAISEMENT OF HSV-2 gD GENE DNA VACCINE（论文参考文献）
- [1]牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎二联核酸疫苗的构建及其免疫效应研究[D]. 马小静. 宁夏大学, 2020
- [2]基于伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gD基因mRNA疫苗的初步研究[D]. 姜子义. 四川农业大学, 2018(02)
- [3]靶向DC的DNA疫苗pRSC-NLDC145·gD-IL-21的研制及抗鼠眼角膜HSV-1感染的初步研究[D]. 汤如. 东南大学, 2017(05)
- [4]DNA疫苗pRSC-gD.gC-IL-21的构建及其预防HSK的动物实验初步研究[D]. 董莉莉. 东南大学, 2017(04)
- [5]牛传染性鼻气管炎基因缺失疫苗的研究与应用[D]. 邓明亮. 华中农业大学, 2015(04)
- [6]猕猴B病毒流行病学调查及其囊膜蛋白表达与表位检测[D]. 董罡. 吉林大学, 2013(08)
- [7]HSV-2抗原表位重组耻垢分枝杆菌的构建和免疫效果观察[D]. 陈国敏. 泰山医学院, 2013(01)
- [8]HSV-2 gD蛋白无血清悬浮高表达细胞系的建立及纯化鉴定[D]. 潘明洁. 南京医科大学, 2012(03)
- [9]优化单纯疱疹病毒DNA疫苗的研究进展[J]. 夏利,程培华. 中国老年学杂志, 2012(06)
- [10]携带HSV-2 gB CTL表位的gD抗原制备及其免疫效果评估[D]. 李君丽. 西北农林科技大学, 2011(05)