一、B2同源盒基因反义寡核苷酸对原代脐静脉内皮细胞增殖及细胞周期的影响（论文文献综述）
谌程程[1]（2021）在《c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs用于促进血管生成及糖尿病创面愈合的影响》文中研究说明研究背景和意义:足部溃疡创面经久不愈是糖尿病（diabetes mellitus,DM）患者容易罹患的严重并发症之一,这种以周围神经损害及缺血为特征的足部溃烂,临床上称之为糖尿病足。研究显示糖尿病人群中并发糖尿病足的患者比例从15%到20%不等,这其中大约20%的患者需要接受截肢治疗[1],而截肢对患者来说是心理和生理的双重打击。糖尿病溃疡创面延迟愈合涉及多种复杂机制,目前关于糖尿病足部溃疡的病理研究主要集中在微生物侵袭、再上皮化障碍、持续的炎症反应和免疫功能受损等一些致病因素上[2,3]。而血运障碍是伴随所有糖尿病溃疡形成的另一个潜在致病因素,血运障碍会严重影响创面的正常愈合,多项研究强调了充分的血运和血管生成在组织修复中的重要性,并认为局部血管生成障碍和血供减少是糖尿病慢性创面愈合延迟的重要病理改变之一[4-6]。因此,加强创面血管生成反应的治疗策略可能可以有效地促进糖尿病慢性创面的愈合。血管生成是一个由内皮细胞（endothelial cells,ECs）、与其相关的血管周围支持细胞（血管平滑肌细胞和周细胞）以及免疫细胞协调参与的动态过程。血管生成失调已被认为是多种疾病的共同病理改变,包括癌症、外周动脉疾病、糖尿病性血管病变、类风湿性关节炎和炎症性肠病等[7-10]。血管生成受到生长因子、细胞内信号和细胞外成分的微妙和动态平衡关系的调节。多种类型的细胞（包括内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、血小板、免疫细胞和干/祖细胞）可通过分泌相关生长因子参与这一过程,其中发挥主要作用的是碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,b FGF）[11]、转化生长因子α[12]、转化生长因子β[13]、肿瘤坏死因子α[14]、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）[15-17]和磷脂酶C-γ（phospholipase C gamma,PLCγ1）[18-20]等。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs）具有分化、旁分泌及免疫调控等功能,被认为在血管生成的过程中起到重要作用[21]。此外,Shin等人的研究发现在糖尿病动物模型中内源性间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的功能受损、以及迁移到受损创面的细胞数量明显降低是导致创面难以愈合重要因素之一[22]。目前已发现MSCs通过促进血管生成加速创面愈合的几种机制,包括分泌促血管生成因子、向内皮细胞和（或）周细胞分化促进血管生成、募集内源性干/祖细胞、调控细胞外基质产生和重塑以及免疫抑制作用等[23]。近年来,外源性MSCs在多种疾病动物模型中的治疗效果,特别是在创伤和缺血性疾病的治疗上受到了广泛的关注[24-26]。多项动物实验研究表明,外源性MSCs的注射治疗可以通过促进创面基底血管生成来加速糖尿病等慢性创面的愈合[27,28]。但是,从组织中获取的原代MSCs,其细胞生物学功能在经过体外培养和增殖后大幅降低,导致治疗效果低于预期[29]。因此,亟待寻找一种方法来增强长期扩增培养BM-MSCs的修复功能,并通过动物实验进一步检测其对糖尿病创面的促愈合作用和安全性。c-Cbl（c-Casitas b-lineage lymphoma）是细胞中的一种原癌基因,属于Cbl家族的成员之一,其编码的蛋白被认为是一种E3泛素连接酶且包含特征性的环指（RING Finger,RNF）结构域,能够调控细胞膜表面受体介导的多种信号[30,31]。实验证实在肿瘤及视网膜血管新生的病理过程中,抑制c-Cbl可以增强VEGF诱导的内皮细胞增殖和血管生成,从而促进这一进程[19]。另外,研究还发现在糖尿病小鼠模型中,敲除c-Cbl基因可以改善高脂饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗[32]。这些结果提示,c-Cbl能够通过调控信号分子转导影响细胞的功能改变进而参与血管生成的过程,并且c-Cbl基因在糖尿病动物模型中也起到重要作用。然而,c-Cbl在BM-MSCs及其长期扩增培养后的功能变化中是否起到作用,起到何种作用,目前尚不清楚。因此,在本文中我们通过向SD大鼠腹腔内注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）并以血糖值建模标准筛选Ⅰ型糖尿病大鼠,用于制作创面模型。通过体外实验研究c-Cbl在长期扩增培养的BM-MSCs功能改变中的作用,并在动物模型上观察经过调控的BM-MSCs对促进糖尿病创面愈合的作用。研究结果对MSCs在糖尿病等慢性创面治疗的应用上具有重要意义,并为改善MSCs在体外扩增培养后的功能降低提供理论依据。此外,探索c-Cbl对MSCs促血管生成功能的调控作用,可以更好的阐明MSCs的功能变化与血管生成的关系,具有一定参考价值。实验研究方法:1.体外扩增培养大鼠BM-MSCs,检测c-Cbl与蛋白激酶B（Akt）的活化水平及相互作用关系将购买的Sprague-Dawley（SD）大鼠BM-MSCs在体外进行扩增培养,通过蛋白免疫印迹（western blot,WB）法分别检测传第3代（passage 3,P3）、传第6代（passage6,P6）及传第10代（passage 10,P10）细胞中Y731c-Cbl/c-Cbl和S473-Akt/Akt的蛋白表达水平;并且在P10细胞中使用锁核酸修饰的反义寡核苷酸间隔物（locked nucleic acid modified antisense oligonucleotide gapmers,LNA Gapmers）抑制c-Cbl表达,再次检测S473-Akt/Akt的蛋白表达变化。2.观察c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs旁分泌血管生成因子及迁移能力的影响通过酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）分别定量P3、P10及抑制c-Cbl表达后的P10 BM-MSCs在体外培养过程中分泌血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGFA）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）及b FGF的水平,同时采用小管形成试验分别检测内皮细胞在各组细胞条件培养液中形成血管样结构的程度变化。另外,采用Transwell试验检测各组细胞的迁移功能。3.观察c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs增殖及衰老的影响采用β-半乳糖苷酶染色试剂盒分别对P3、P10及抑制c-Cbl表达后的P10 MSCs进行染色,以检测衰老细胞的比率。采用CCK-8（cell counting kit-8）试验检测各组细胞分别在24、48、72及96小时的细胞增殖速率。4.构建糖尿病大鼠创面模型首先我们以65mg/kg剂量对SD大鼠进行腹腔注射STZ,诱导构建Ⅰ型糖尿病大鼠模型。然后,以1.8cm的直径在大鼠背部制作对称的两处圆形皮肤全层创面。术后1天在创面周围注射BM-MSCs进行治疗干预。5.观察c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs促进糖尿病创面血管生成的影响分别予糖尿病大鼠创面组织周围注射下调c-Cbl表达的P10 BM-MSCs（转染c-Cbl LNA Gapmers）、阴性对照P10 BM-MSCs（转染Scramble LNA Gapmers）及等量磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline,PBS）,采用免疫组化的方法检测术后7天和14天创面组织中血小板-内皮细胞粘附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1/CD31）和VEGFA的表达,以判断创面血管生成情况。6.观察c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs促进糖尿病创面愈合的影响分别予糖尿病大鼠创面组织周围注射PBS、P10及抑制c-Cbl表达后的P10 MSCs,在创面制造后0、3、7、14天拍照并计算创面愈合率。另外,收集术后14天创面组织制作石蜡切片进行苏木精-伊红（hematoxylin and eosin,HE）染色和马松（Masson）染色,并统计病理评分。实验结果:1.体外长期扩增培养的BM-MSCs中,c-Cbl的磷酸化水平明显增加而Akt的磷酸化水平受到抑制,c-Cbl LNA Gapmer转染能够下调c-Cbl的蛋白表达水平,并且c-Cbl下调后,Akt的磷酸化水平得到提高,表明c-Cbl在一定程度上介导了体外长期扩增培养诱导的BM-MSCs的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）/Akt信号抑制。2.体外长期扩增培养的BM-MSCs,其旁分泌血管生成因子和迁移能力受到抑制,而下调c-Cbl的表达可改善其旁分泌和迁移能力。3.体外长期扩增培养的BM-MSCs增殖能力降低并呈现较高的衰老率,而下调c-Cbl的表达可增强其增殖能力并在一定程度上降低衰老率,但并没有过度激活MSCs的增殖活性。4.成功构建了STZ诱导的Ⅰ型糖尿病大鼠,并在此基础上制作了糖尿病大鼠创面模型,模型构建的成功率高、稳定性强。5.下调c-Cbl的表达提高了体外长期扩增培养的BM-MSCs对促进糖尿病创面血管生成的治疗效果,与对照组相比,局部注射c-Cbl下调的BM-MSCs可以显着促进创面组织中VEGFA的早期表达,并最终促进糖尿病创面的血管生成。6.下调c-Cbl的表达提高了体外长期扩增培养的BM-MSCs促进糖尿病创面愈合的速率。另外,通过HE及Masson染色统计分析的组织病理评分显示,经c-Cbl下调的BM-MSCs治疗后,创面评分明显高于对照组。结论:1.下调c-Cbl的表达可以改善BM-MSCs长期扩增培养后的Akt磷酸化抑制及促血管生成相关功能降低,表明c-Cbl的表达水平与BM-MSCs的Akt信号和功能变化具有一定的相关性。2.下调c-Cbl的表达提高了体外长期扩增培养的BM-MSCs对糖尿病大鼠创面的促血管生成及促愈合的治疗效果。
赵梓彤[2]（2020）在《转录下调的miR-4306和基因组扩增的lncRNA-712在三阴性乳腺癌发生发展中的作用机制研究》文中认为三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）是一种特殊类型的乳腺癌亚型,指雌激素受体（estrogen receptor,ER）、孕激素受体（progesterone receptor,PR）,人的表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）均为阴性的乳腺癌,约占所有乳腺癌的15%～20%。三阴性乳腺癌具有发病年龄早、恶性程度高、治疗手段少等特点。因其对内分泌治疗及分子靶向治疗不敏感,化疗是目前主要的治疗方法。但三阴性乳腺癌易发生化疗耐药,导致化疗无效、肿瘤复发,其转移和死亡风险较其他亚型乳腺癌更高。三阴性乳腺癌发生发展及耐药机制尚不明确,这也极大的阻碍了其分子靶向治疗和化疗药物的研究进程。因此,阐明三阴性乳腺癌发生发展及耐药的分子机制,成为乳腺癌研究的热点。非编码RNA（non-coding RNA）是指不编码蛋白质的RNA。在过去,非编码RNA被认为是基因组中的“垃圾RNA”,近年来,随着基因组学和生物学信息学的发展,特别是高通量测序技术的兴起,人们发现非编码RNA在众多生命活动和疾病中发挥重要的作用。非编码RNA参与肿瘤发生发展的各个阶段,研究非编码RNA在肿瘤中作用的分子机制,不仅可从新的角度认识肿瘤的发病机理,也可为肿瘤的诊断与治疗拓展了新方向。本论文的第一部分以miR-4306为研究对象,研究转录下调的miR-4306在三阴性乳腺癌发生发展和治疗中的作用及分子机制。非编码小RNA（microRNA,miRNA）广泛存在于真核生物中,参与生物体各种生理和病理过程。它高度保守,表达具有组织特异性,在组织和血中稳定性高,分子量小,检测手段灵活方便,易制成核酸药物,是极具临床应用潜力的肿瘤诊断标志物和治疗靶点。雌激素受体与孕激素受体都是类固醇激素受体,它们作为转录因子诱导特定基因转录表达,影响靶细胞的生命活动。人的表皮生长因子受体2最为人熟知的功能是具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体,但也有研究表明,它可入核发挥转录因子的作用。目前,已有很多针对microRNA参与三阴性乳腺癌发生发展的研究,但是否存在某个/些microRNA,可同时被上述三个因子转录调控,并且由于这三个因子的缺失,导致其在三阴性乳腺癌中特异性的低表达,从而参与三阴性乳腺癌恶性进展的过程,尚不明确。在本研究中,我们首先利用microRNA芯片结合生物信息学分析,筛选可能同时被ER、PR、HER2调控的非编码小RNA;利用双荧光素酶报告基因实验,DNA免疫共沉淀等实验验证了miR-4306可被ER、PR、HER2转录调控。因此,ER、PR、HER2在三阴性乳腺癌中的缺失是miR-4306特异性低表达的主要原因。我们在325例乳腺癌组织和配对癌旁组织中检测miR-4306的表达,结果显示miR-4306在乳腺癌组织中的表达显着低于癌旁组织,且其在三阴性乳腺癌组织中的表达显着低于luminal型和HER过表达型乳腺癌组织。分析miR-4306的表达与临床资料的相关性,结果显示,miR-4306的表达与三阴性乳腺癌患者的淋巴结转移和不良预后负相关。细胞功能实验表明,miR-4306抑制三阴性乳腺癌恶性表型的形成（特别是与转移密切相关的淋巴管和血管的生成）,同时,miR-4306可促进顺铂诱导的三阴性乳腺癌细胞凋亡。裸鼠相关的动物实验表明,miR-4306抑制三阴性乳腺癌的生长、淋巴结转移和肺转移。鸡胚尿囊膜实验结果显示,miR-4306可明显抑制微血管生成。分子机制研究发现,miR-4306可通过靶向SIX1影响VEGFC的表达,从而抑制淋巴管的生成和淋巴内皮细胞的迁移,最终导致肿瘤的淋巴结转移;可通过靶向SIX1、Cdc42影响它们下游基因CyclinD1、E-caherin等的变化,从而抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移;可通过靶向血管生成因子VEGFA抑制血管生成。综上所述,miR-4306有望成为三阴性乳腺癌的治疗靶点。三阴性乳腺癌患者虽易发生化疗耐药,但对铂类药物较为敏感,可选择有顺铂、卡铂药物的化疗方案。我们构建了三阴性乳腺癌的原位模型,利用经过特殊化学修饰的miR-4306激动剂联合顺铂治疗三阴性乳腺癌,显着地提高了抗肿瘤治疗效率。miR-4306联合顺铂靶向治疗为三阴性乳腺癌的个体化治疗提供了新方案。本论文的第二部分以长链非编码RNA lncRNA-712为研究对象,研究因基因扩增而在三阴性乳腺癌中异常高表达的lncRNA-712诱导三阴性乳腺癌自噬和转移的分子机制。长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）是指长度大于200nt,不具备蛋白编码能力的RNA,可从表观修饰、转录和转录后等水平参与基因的调控与修饰。长链非编码RNA广泛参与多种生理及病理过程,近年来研究表明,IncRNA与肿瘤的发生、发展及化疗敏感性密切相关,可作为肿瘤的诊断标志物和治疗靶点。在本研究中,我们首先通过lncRNA芯片结合TCGA数据库中的拷贝数扩增数据筛选在三阴性乳腺癌中异常高表达的lncRNAs,结果表明,lncRNA-712、lncRNA-836、lncRNA-246基因所在区域在三阴性乳腺癌基因组中明显扩增。我们进一步选择在三阴性乳腺癌基因组扩增最明显的lncRNA-712进行后续研究。在125例乳腺癌组织和配对的癌旁组织中检测lncRNA-712的表达,结果显示,lncRNA-712在三阴性乳腺癌组织中的表达显着高于癌旁组织,且其表达水平与淋巴结转移和不良预后正相关;lncRNA-712在luminal型和HER2过表达型乳腺癌组织中的表达与其在配对癌旁组织中的表达并无明显差别。通过RACE实验鉴定了 lncRNA-712在乳腺癌中的全长为1108nt。核浆分提实验表明LncRNA-712在细胞核和细胞浆均有分布。细胞功能实验显示,LncRNA-712促进三阴性乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移以及自噬。蛋白芯片筛选与lncRNA-712特异性结合的蛋白,并对这些蛋白进行KEGG pathway富集分析,富集到细胞自噬相关的吞噬小体形成的信号通路。在这些蛋白中,吞噬小体形成相关的VPS34和USP14与lncRNA-712结合的评分也很高。RNA免疫共沉淀、RNA pulldown实验验证了 lncRNA-712与自噬相关蛋白VPS34和USP14的结合。进一步机制研究发现,lncRNA-712通过结合USP14增加其蛋白稳定性,导致去泛素化酶USP14的下游分子Beclin1表达上调,引发细胞自噬;lncRNA-712通过结合VPS34抑制其乙酰化,增强其脂激酶活性,引发细胞自噬;lncRNA-712可被外泌体包裹,释放至正常乳腺上皮,诱发正常乳腺上皮细胞发生自噬。以上研究表明,lncRNA-712在三阴性乳腺癌中的表达异常上调,可通过结合并调控自噬相关蛋白USP14和VPS34诱发细胞自噬,进而促进三阴性乳腺癌的恶性进程。我们后续将进一步完善lncRNA-712在三阴性乳腺癌中诱导自噬和转移的具体分子机制,并针对lncRNA-712进行药物筛选,利用类器官模型和PDX模型探讨针对lncRNA-712的药物在三阴性乳腺癌中的作用,期待为三阴性乳腺癌转移的分子机制和治疗方案提供新思路。
赵晓雪[3]（2020）在《长链非编码RNA NORAD通过影响miR590-3p的表达调控缺氧时内皮细胞功能的机制研究》文中提出目的:随着生活水平的不断提高,缺血性心脏病已成为全球死亡的首要原因。近年来的研究发现,心肌缺血后可以触发新生血管形成。而新生血管的形成可以改善缺血区的血液供应。有效的再灌注治疗在早期由于提高了血液供应,从而减少心肌坏死,有助于维持正常的心功能。同时对于预防晚期的左室重塑所致的心衰也至关重要。尽管十几年来,治疗手段发展迅速,但是缺血性心脏病的治疗效果仍不能令人满意。这就促使人们研究新的治疗方案。促血管生成疗法,在促进心肌再灌注治疗效果和提高缺血心肌功能方面的作用,也日益受到重视。关于血管新生的机制目前仍不完全清楚。根据已有的研究结果来看,这是一个涉及到多因素,多阶段的复杂过程。除了低氧诱导因子,生长因子,干细胞/祖细胞外,非编码RNA已经被证实参与了血管新生。在人类基因组中,98%左右的基因都是转录成非编码RNA。其中长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）的功能和作用机制近年来备受关注。目前研究发现lncRNA在基因转录、组蛋白修饰和DNA甲基化等多种生物学过程中都发挥着调控作用。lncRNA与心血管系统的发育,正常生理功能的维持以及病理状态的变化关系密切。在心肌梗死,心衰,肥厚性心肌病等病理情况下,均可以发现lncRNA表达水平的变化。RNAs之间彼此存在相互作用,构成了一个复杂的网络系统,在转录后水平上调控基因的表达。在一系列实验证据的支持下,2011年提出了竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）假说。该假说主要内容是指不同的RNAs转录本含有相同的MREs（miRNA response element）,彼此之间竞争与相应的miRNA结合,互为ceRNA。新近的研究中,发现一种lncRNA,它显示出了进化上的高度保守性,由于是在DNA损伤后诱导产生的,又称为NORAD（noncoding RNA activated by DNA damage）。NORAD在细胞质内含量丰富,且表达于多种组织和细胞系内。NORAD的失活,可以导致细胞的有丝分裂缺陷,且四倍体细胞增多,细胞内的染色体数目多变。即使是二倍体细胞,也显示了不同的染色体数目,提示了一种染色体不稳定的表型。表明lncRNA NORAD可能影响细胞有丝分裂,增殖等相关功能。但是目前为止,对于lncRNA NORAD功能的认识还是比较有限的。综上所述,本论文旨在研究lncRNA NORAD在缺氧情况下对内皮细胞功能的影响及其可能的作用机制。鉴定参与此过程的关键因子,为缺血性心脏病的治疗提供新的靶点和策略。研究方法:原代人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）购自上海中乔新舟生物科技有限公司。经过传代培养后选择第三代到第十代的细胞进行实验。在缺氧实验部分,探讨缺氧的环境对于人脐静脉内皮细胞活力,迁移,小管形成能力以及不同RNAs转录本表达水平的影响。设置常氧和缺氧的培养环境。应用三气培养箱,设置常氧的培养条件5%CO2,21%O2,37°C。设置缺氧的培养条件1%O2,5%CO2,94%N2,37°C。将人脐静脉内皮细胞分别于缺氧和常氧的环境下培养24h后,通过CCK-8实验检测内皮细胞的活力情况,transwell实验检测细胞的迁移能力的变化,Matrigel基质胶成管实验用来检测缺氧对于内皮细胞小管形成能力的影响。qPCR实验检测缺氧对于lncRNA NORAD,miR590-3p以及HIF-1α的表达水平的影响,Western Blot实验检测HIF-1α蛋白水平的变化。在转染实验部分,所有细胞转染后均置于缺氧的环境下培养24h。为了检测在缺氧的环境下lncRNA NORAD对内皮细胞功能的调节,分别转染shNORAD,共转染shNORAD+NORAD1-2000-OE后,qPCR检测lncRNA NORAD,miR590-3p表达水平的回调性变化。同时检测内皮细胞的活力,迁移以及小管形成能力的相应恢复性变化。为了验证lncRNA NORAD通过调控miR590-3p影响内皮细胞的功能,分别转染miR590-3p mimics,共转染shNORAD+miR590-3p inhibitor后qPCR检测lncRNA NORAD和miR590-3p表达水平的回调性变化。同时检测内皮细胞的活力,迁移以及小管形成能力的相应恢复性变化。双荧光素酶报告实验验证lncRNA NORAD与miR590-3p的直接结合。为了检测lncRNA NORAD/miR590-3p轴对下游靶基因的作用,分别转染shNORAD,共转染shNORAD+miR590-3p inhibitor后,分别用qPCR及ELISA检测VEGFA,FGF1,FGF2的表达水平和相应的回调变化。最后双荧光素酶报告实验验证VEGFA,FGF1,FGF2是miR590-3p的直接作用的靶基因。结果:在缺氧实验部分,将内皮细胞分别于常氧和缺氧的环境下培养24小时后,CCK-8实验检测结果显示缺氧可以提高内皮细胞的活力,transwell结果表明,缺氧时内皮细胞的迁移能力增强。Matrigl基质胶成管实验的结果表明缺氧可以促进内皮细胞的小管形成能力。收集细胞分别进行qPCR检测和Western Blot实验,通过分析显示,缺氧时lncRNA NORAD和HIF-1α的表达水平上调,而miR590-3p的表达水平下调。在转染实验部分,我们通过生物信息学预测miR590-3p可能是lncRNA NORAD的作用靶点。转染shNORAD之后,共转染shNORAD+NORAD1-2000-OE,收集细胞进行qPCR检测,结果显示已经上调的miR590-3p表达水平出现向下的回调性变化。同时抵消了对内皮细胞活力,迁移以及小管形成能力的抑制作用。该结果提示在缺氧的情况下,lncRNA NORAD可以调控内皮细胞的部分生物学功能。之后我们转染了miR590-3p mimics,qPCR检测miR590-3p的表达水平,分别用CCK-8实验,transwell实验,Matrigel基质胶成管实验,检测内皮细胞的活力,迁移以及小管形成能力,其结果与敲低lncRNA NORAD的效果一致。共转染shNORAD+miR590-3p inhibitor后,抵消了miR590-3p表达水平的上调性变化。同时减轻了对内皮细胞活力,迁移以及小管形成能力的抑制作用。双荧光素酶报告实验验证miR590-3p mimics可以降低NORAD野生型报告基因的荧光素酶活性,而对于突变型没有明显影响,提示了lncRNA NORAD与miR590-3p的直接结合作用。上述结果证实了在缺氧的情况下,lncRNA NORAD通过调节miR590-3p表达,影响内皮细胞的功能。我们再次通过生物信息学预测VEGFA,FGF1,FGF2可能是miR590-3p的潜在靶基因。分别转染shNORAD,共转染shNORAD+miR590-3p inhibitor后,qPCR及ELISA结果显示,已经下调的VEGFA,FGF1,FGF2表达水平,出现向上的回调性变化。双荧光素酶报告实验表明VEGFA,FGF1,FGF2是miR590-3P的直接作用靶基因。结果表明缺氧的情况下,lncRNA NORAD通过miR590-3p调控VEGFA,FGF1,FGF2的表达,从而影响内皮细胞的血管新生能力。结论:缺氧情况下,由于lncRNAN NORAD的表达水平上调,导致人脐静脉内皮细胞的活力,迁移,小管形成能力增强。lncRNA NORAD可能是通过负性调控miR590-3p的表达水平,从而干扰VEGFA,FGF1,FGF2的表达,影响人脐静脉内皮细胞的功能。表明lncRNA NORAD-mi R590-3p-VEGFA/FGF1/FGF2轴在缺氧时的血管新生过程中发挥关键作用。
牛小伟[4]（2019）在《当归多糖通过Oip5-as1调节SIRT1-AMPK-PGC1α通路改善心肌缺血再灌注损伤的实验研究》文中研究指明背景:急性心肌梗死（AMI）是在世界范围内发病率和死亡率较高的疾病之一。再灌注治疗是改善AMI患者预后的关键。但再灌注本身会增加心肌和冠脉循环的不可逆性损伤,导致梗死面积增加,即心肌缺血再灌注（MI/R）损伤。因此,在恢复心肌有效再灌注的基础上,采取能够改善MI/R损伤的心肌保护措施具有重要临床意义。许多中药在AMI中具有抗心肌缺血损伤、防止心室重构和保护心功能的作用,其中作为甘肃省道地药材的当归是常用药物之一。然而,当归对心肌保护作用的活性成分尚不明确,其发挥疗效的分子机制有待于进一步研究。目的:研究当归活性成分改善MI/R损伤的作用及分子机制。方法:1.运用网络药理学方法筛选当归对心肌保护作用的主要活性成分及可能的信号通路（第一部分）。2.采用体内外实验及分子生物学方法研究由网络药理学筛选出的当归活性成分—当归多糖（ASP）改善MI/R损伤的作用和SIRT1-AMPK-PGC1α信号机制（第二部分）。3.通过实验研究ASP对lncRNA Oip5-as1的影响及Oip5-as1对SIRT1-AMPKPGC1α信号通路的调节作用（第三部分）。结果:1.网络药理学发现ASP可能是当归保护心肌的重要活性成分,SIRT1-AMPK-PGC1α信号通路是潜在作用机理。2.细胞实验发现ASP通过激活SIRT1-AMPK-PGC1α信号通路发挥保护线粒体、抗氧化应激以及减少心肌细胞凋亡的作用。3.细胞实验显示ASP促进Oip5-as1的表达丰度。Oip5-as1作为竞争性内源RNA（ce RNA）调控SIRT1 m RNA的表达,进而激活SIRT1-AMPK-PGC1α信号通路。4.动物实验发现ASP改善MI/R损伤,促进Oip5-as1的表达水平,上调SIRT1-AMPK-PGC1α信号通路。结论:1.利用网络药理学筛选当归活性成分及其在心肌保护中的作用机制是一种可行的方法。2.ASP通过上调Oip5-as1表达,激活SIRT1-AMPK-PGC1α信号通路,从而缓解氧化应激,抑制线粒体凋亡途径,最终减少细胞凋亡,改善MI/R损伤。
王子杰[5]（2018）在《肾微血管内皮细胞转分化在移植肾间质纤维化形成中的作用及肝细胞生长因子的干预研究》文中认为背景:肾移植是治疗终末期肾病的最佳方法。然而,随着外科技术及新型免疫抑制剂的不断发展,肾移植术后远期移植肾的存活率并未得到显着提升。慢性移植肾失功（Chronic allograft dysfunction,CAD）是影响远期移植肾存活率的主要因素,而慢性移植肾间质纤维化是引起CAD的决定性因素,但其机制尚不完全清楚。血管内皮细胞向间充质细胞转分化（Endothelial-to-mesenchymal transition,End MT）近来被证实可引起多种组织纤维化形成。本研究探讨了肾微血管End MT在慢性移植肾间质纤维化形成中的作用及分子机制,以及肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor,HGF）对其的影响和可能机制。方法:首先,从脐带中提取原代人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）,采用倒置显微镜下细胞形态观察和CD31间接免疫荧光染色的方法鉴定该细胞。其次,使用重组人转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）细胞因子体外刺激原代HUVECs,采用蛋白质印迹法（Western Blot assay）法和实时荧光定量聚合酶链反应（Quantitative real-timepolymerase chain reaction,q RT-PCR）法检测与肾微血管End MT过程相关标志物【α-平滑肌肌动蛋白（α-smoothing muscular actin,α-SMA）,血管内皮钙粘蛋白（VE-Cadherin）,CD31和胶原蛋白-Ⅰ（Collagen-Ⅰ）】的表达,并用酶联免疫吸附实验、细胞划痕实验和细胞侵袭实验探究其对内皮细胞功能的影响。接下来,采用各种特异性细胞内信号转导通路抑制剂探索TGF-β1体外诱导肾微血管End MT过程的相关机制,并在诊断为CAD患者的移植肾组织中进一步验证上述实验结果。最后,为探索HGF在移植肾间质纤维化形成过程中的作用及可能机制,我们采用HGF和/或TGF-β1体外刺激原代HUVECs和人肾小球内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HRGECs）株,收集细胞,采用Western Blot法与q RT-PCR法检测肾微血管End MT过程相关标志物的表达;并采用酶联免疫吸附实验、细胞划痕和细胞侵袭实验探究其对内皮细胞功能的影响。并采用各种特异性细胞内信号转导通路抑制剂预处理细胞,探索HGF对TGF-β1诱导肾微血管End MT过程影响的相关机制。此外,本研究还在同种异体肾移植大鼠慢排模型中验证上述实验结果。结果:TGF-β1在原代HUVECs细胞中显着提高α-SMA和Collagen-Ⅰ的表达,显着抑制VE-Cadherin和CD31的表达,且这一现象呈现浓度和时间依赖性;TGF-β1还可显着提升HUVECs细胞分泌细胞外基质的能力以及细胞迁徙和侵袭的能力。进一步体外实验表明,TGF-β1可通过激活TGF-β/Smad和Akt/m TOR/p70S6K信号通路诱导HUVECs发生End MT现象,而这一分子机制在人移植肾间质纤维化的肾组织中也得到了证实。此外,给予HGF处理则可在HUVECs和HRGECs两种血管内皮细胞中显着抑制由TGF-β1介导的End MT过程,且这种作用也呈现出浓度依赖性方式;HGF还可显着减轻由TGF-β1诱导的血管内皮细胞分泌细胞外基质、细胞迁徙和侵袭能力增强的现象;且进一步体外实验表明HGF是通过抑制TGF-β/Smad和Akt/m TOR/p70S6K信号通路活性进而发挥其抑制TGF-β1诱导的肾微血管End MT进程这一作用的。而且,在同种异体大鼠肾移植慢排模型中,我们的研究也证实HGF质粒可通过上述机制显着抑制移植肾间质纤维化的发生,进而延缓CAD的发生与发展。结论:肾微血管End MT过程存在于慢性移植肾间质纤维化发生和CAD发展过程中,并起到重要作用:TGF-β1可通过激活TGF-β/Smad和Akt/m TOR/p70S6K信号通路诱导肾微血管End MT发生,进而参与慢性移植肾间质纤维化的发生和发展;而HGF则可通过抑制TGF-β/Smad和Akt/m TOR/p70S6K信号通路活性阻断由TGF-β1介导的肾微血管End MT过程,从而减缓慢性移植肾间质纤维化及CAD的发生发展。
罗俊一[6]（2017）在《NFKB1基因突变介导血管内皮细胞损伤在冠心病易感性中的分子机制研究》文中认为目的:（1）从人群遗传流行病学角度,探讨NFKB1基因启动子区-94 ATTG插入/缺失突变在新疆汉族人群中的中分布和与冠心病发病和冠状动脉病变狭窄程度的关联性。（2）探讨NFKB1基因突变与冠心病发病相关因子eNOS、IL-6、IL-8、MDA和SOD的水平相关性。（3）从分子遗传学角度明确NFKB1基因突变在冠心病发病中的分子机制。方法:（1）采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法,对1184例冠心病患者和1112例健康对照组NFKB1基因启动子区-94 ATTG插入/缺失突变位点进行基因型鉴定,并采用Logistic回归分析其与冠心病发病的关联性;采用Gensini评分和冠状动脉病变支数评价NFKB1基因突变与冠状动脉病变狭窄程度;（2）应用ELISA检测冠心病患者和健康对照组患者血浆中血管内皮功能因子eNOS、炎性因子IL-6、IL-8以及氧化应激损伤因子MDA和SOD的水平,探索NFKB1基因突变对血管内皮细胞功能、炎性反应和氧化应激损伤的影响。（3）分离培养人原代脐静脉内皮细胞（HUVECs）,采用免疫荧光法检测vWF抗体表达及流式细胞仪检测CD31抗体表达鉴定分离培养细胞纯度;CCK-8法和流式细胞学技术检测氧化应激对NFKB1不同基因型HUVECs造成的损伤;Western blot、real-time PCR和免疫荧光标记法检测NFKB1不同基因型HUVECs中p50蛋白的表达水平及凋亡相关蛋白的表达;EMSA检测核转录因子p50的转录功能。结果:（1）（1）冠心病患者与健康对照组人群中NFKB1基因启动子区-94 ATTG插入/缺失突变三种基因型II、ID、DD的分布频率具有显着差异,冠心病患者DD基因型分布频率在冠心病患者组显着高于健康对照组（18.2%vs.14.1%,P=0.016）。（2）冠心病患者与健康对照组人群中两种等位基因型I、D的分布频率具有显着差异,冠心病患者D等位基因分布频率在冠心病患者组中显着高于健康对照组（41.9%vs.37.9%,P=0.006）。（3）Logistic回归分析表明排除混杂因素影响后NFKB1基因突变与冠心病的发病存在关联性,NFKB1基因-94ATTG插入/缺失突变中DD基因型是冠心病发病的危险因素（OR=1.37,95%CI 1.087-1.726,P=0.008）。（4）冠心病患者中携带NFKB1基因突变DD基因型者冠状动脉狭窄程度较携带II或ID基因型的患者明显严重,并且病变支数也较多（Gensini评分:DD基因型为35.61±8.78分,ID基因型为26.86±7.58分,II基因型为25.95±7.2分,P<0.05;病变支数:DD基因型为2.42±0.32支,ID基因型为2.14±0.35支,II基因型为2.03±0.35支,P<0.05）。（2）（1）冠心病患者中携带NFKB1基因突变DD基因型者血浆eNOS的活性显着低于II或ID基因型携带者（DD基因型为15.85±3.15 ng/ml,ID基因型为20.55±3.74 ng/ml,II基因型为19.57±3.32 ng/ml,P<0.05）;（2）冠心病患者中携带NFKB1基因突变DD基因型者血浆IL-6的水平显着高于II或ID基因型携带者（DD基因型为4.23±1.05 pg/ml,ID基因型为3.62±1.05 pg/ml,II基因型为3.59±1.08 pg/ml,P<0.05）;（3）冠心病患者中携带NFKB1基因突变DD基因型者血浆SOD的水平显着低于II或ID基因型携带者（DD基因型379.56±6.02 pg/ml,ID基因型397.90±4.40 pg/ml,II基因型388.14±5.23 pg/ml,P=0.027）。（3）（1）实验中分离培养的人原代脐静脉内皮细胞比例较高,纯度为93.3%;（2）、NFKB1基因突变型HUVECs中p50蛋白表达水平显着低于野生型细胞;（3）突变型HUVECs中p50转录因子的转录功能显着低于野生型细胞。（4）NFKB1基因缺失突变引起氧化应激条件下NF-κB信号通路被异常激活,导致突变型HUVECs凋亡显着增加。（5）NFKB1基因缺失突变可显着上调炎性因子IL-6基因的mRNA表达,增加突变型脐静脉内皮细胞炎性反应。（6）NFKB1基因缺失突变可显着下调eNOS基因的mRNA表达,降低eNOS的活性,导致突变型HUVECs功能障碍更加显着。结论:（1）NFKB1基因启动子区-94 ATTG插入/缺失突变与冠心病的发病和冠状动脉病变程度存在关联,DD基因型是冠心病发病的危险因素。（2）NFKB1基因突变可引起内皮细胞功能障碍、增加机体炎性反应和氧化应激损伤。（3）NFKB1基因突变可降低HUVECs中NF-κB信号通路中关键亚基p50蛋白的表达,并且降低p50转录因子的转录功能。（4）NFKB1基因缺失突变引起氧化应激条件下NF-κB信号通路被异常激活,导致突变型HUVECs凋亡显着增加。（5）NFKB1基因缺失突变可显着上调炎性因子IL-6基因的mRNA表达,增加突变型脐静脉内皮细胞炎性反应。（6）NFKB1基因缺失突变可显着下调eNOS基因的mRNA表达,降低eNOS的活性,导致突变型HUVECs功能障碍显着明显于野生型细胞。由此可知,NFKB1基因启动子区-94 ATTG缺失突变可能通过降低NF-κB信号通路p50亚基的表达和转录功能,诱导机体炎性反应增加、内皮细胞功能障碍和凋亡从而增加冠心病的易感性。
胡建军[7]（2016）在《血管相关迁移细胞蛋白调控血管新生及血管平滑肌细胞迁移》文中研究指明血管新生是在已有血管的基础上长出新的血管并形成血管网络的生物学过程,涉及到细胞的增殖、迁移、管腔形成、血管成熟和血管重构等一系列过程,这一事件是多种细胞、生长因子、细胞外基质共同参与的一个复杂过程,多种信号分子和信号途径参与其中。VSMCs的表型转化及增殖和迁移是血管损伤后或动脉粥样硬化斑块发生过程中的内膜过度增生的重要原因,导致这一事件的诱导因素有炎症反应、机械损伤、氧化应激等,其中氧化应激因素非常重要。Ox-LDL是促进VSMCs增殖和迁移的主要氧化应激因子之一。过去的研究表明,AAMP是一个与细胞迁移有关的蛋白,这意味着AAMP可能具有促血管新生的特性。但AAMP到底会不会参与血管新生过程,目前还缺乏体内外的实验证据。另外,AAMP和ox-LDL都在内膜增生的过程中有重要作用,但AAMP是否在ox-LDL促进的VSMCs迁移中起作用尚不明确。因此,本研究旨在明确AAMP蛋白在血管新生和VSMCs迁移过程中的作用及其分子机制。通过构建AAMP高表达和干扰表达载体,结合多种细胞分子生物学的实验技术方法研究AAMP调控血管新生和VSMCs迁移及具体的细胞分子生物学机制。本论文的主要研究内容和结论如下:1)首先,通过生物信息学软件分析预测了AAMP的基因和蛋白结构。主要研究结论如下:AAMP是一个在进化上非常保守的蛋白,不同物种的AAMP蛋白一级结构差异较小,有大量保守的结构基序。人AAMP基因位于第2号染色体的长臂上,由10个内含子和11个外显子构成。AAMP蛋白中有8个WD40结构域,三维结构预测显示AAMP蛋白可以形成一个螺旋桨样的三维结构。并且AAMP可能与NOD1、CDC20等蛋白相互作用。2)然后,实验研究了AAMP的表达模式和对血管新生的作用。实验通过蛋白免疫印迹、细胞免疫荧光及反转录RCR技术研究了AAMP在正常细胞、癌细胞、小鼠多种组织中的表达情况。研究结果发现,AAMP在正常的组织细胞中和癌细胞中都有表达,并且大部分的AAMP都定位于细胞的胞浆区域。AAMP在小鼠多种组织器官中都有表达,具有丰富微血管结构并且代谢比较旺盛的组织中AAMP的表达较高。通过构建小鼠后肢缺血的血管新生模型发现,AAMP在缺血诱导的组织中表达量增加,因此AAMP可能参与血管新生过程。构建针对AAMP的干扰RNA表达载体研究AAMP对血管新生的调控作用,发现在HUVECs中干扰AAMP的表达后内皮细胞在三维基质上的管腔形成能力减弱。并且AAMP的特异性抗体抑制AAMP的功能后血管环出芽性血管新生减少。总之,AAMP在血管新生的过程中表达升高,AAMP主要通过调控内皮出芽和管腔形成调控血管新生。3)接下来,对AAMP调控血管新生的细胞分子机制进行了详细研究。通过构建带FLAG标签的AAMP真核表达载体,并用anti-FLAG抗体和anti-AAMP抗体进行细胞免疫荧光染色,发现在HUVECs中外源性和内源性的AAMP都主要定位于胞浆,并且在细胞膜上也有分布;在EA.hy926细胞中,AAMP也主要位于细胞质中。研究发现,VEGF可以促进AAMP的表达,并且VEGF可以促进AAMP向细胞膜上的转移,尤其在细胞边缘的突起部分AAMP蛋白聚集较多。但干扰AAMP的表达不利于细胞膜突起结构的形成,并且会造成细胞边缘膜结构上的AAMP蛋白含量降低。研究还发现AAMP通过调控细胞迁移、细胞粘附和铺展参与血管新生。干扰AAMP的表达后抑制血管内皮细胞的迁移,细胞粘附能力减弱,细胞粘附后的铺展面积减小,细胞内应力纤维束减少,细胞的收缩能力变弱。进一步的研究发现,Rho A/ROCK信号参与AAMP调控的血管新生。干扰AAMP表达或抗体抑制AAMP后抑制了Rho A向细胞膜的转移;Rho A/ROCK抑制剂Y27632抑制血管内皮细胞的血管新生活性。通过构建AAMP的高表达载体在HUVECs中高表达AAMP后发现,高表达外源性AAMP可以促进内皮细胞的迁移、细胞骨架应力纤维的形成及细胞收缩并促进管腔形成,但不能挽救Y27632对血管新生的抑制效应。因此,AAMP可以促进Rho A/ROCK信号的激活,因此Rho A/ROCK信号是AAMP的下游信号分子。4)由于PPARγ信号的激活可以抑制细胞迁移和AAMP的表达。但PPARγ信号活化后对AAMP调控的血管新生的影响还不知道。本实验进一步研究了罗格列酮（RSG）激活的PPARγ信号可以负调控AAMP促进的血管新生。PPARγ激动剂RSG既可以抑制血管内皮细胞管腔形成,也可以抑制主动脉环出芽性血管新生;PPARγ的拮抗剂GW9662预处理后可以显着减弱RSG对血管新生的抑制作用。RSG既可以抑制内皮细胞的迁移,也可以抑制内皮细胞的增殖,但PPARγ拮抗剂GW9662预处理则会解除RSG对细胞迁移和增殖的抑制作用。因此,RSG抑制血管新生是通过抑制内皮细胞的迁移和增殖起作用的,并且这一过程可能依赖于PPARγ。进一步研究发现,RSG可以抑制AAMP的表达,但GW9662可以解除RGS对AAMP表达的抑制作用。RSG还可以促进PPARγ的表达升高并向细胞核内的转移。这进一步证明,RSG抑制AAMP表达通过PPARγ起作用。AAMP高表达可以缓解RSG对血管内皮细胞迁移和管腔形成的抑制,但不能回救对细胞增殖的抑制。因此,RSG抑制细胞迁移和血管新生在一定程度上是通过促进PPARγ的表达和向细胞核内的转移从而抑制AAMP蛋白表达来实现的。进一步的研究发现,p53信号介导RSG对AAMP表达和血管新生的抑制。RSG可以促进p53的表达上调和向细胞核内的转移,抑制p53的活性后AAMP的表达增加。RSG可以抑制VEGF诱导的AAMP向细胞膜上的转移,但GW9662和p53抑制剂Pifithrin-α则会缓解RSG的这种抑制作用。因此,RSG抑制AAMP向细胞膜上的转移与PPARγ信号的激活和p53的表达上调相关。Pifithrin-α可以减弱RSG对内皮细胞迁移、管腔形成和三维基质中培养的主动脉环的出芽性血管新生的抑制。5)此外,由于ox-LDL和VSMCs的迁移在动脉粥样硬化病理过程中的重要作用,实验还研究了不同浓度的ox-LDL对VSMCs的迁移和AAMP表达的影响,并研究了AAMP参与ox-LDL调控的VSMCs迁移的机制。实验研究发现,较低浓度（12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml）的ox-LDL可以促进VSMCs的迁移,而高浓度（100μg/ml）的ox-LDL则诱导VSMCs的凋亡。较低浓度（12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml）的ox-LDL可以促进VSMCs对脂质的吸收和脂质积累,而较高浓度（100μg/ml）的ox-LDL则会抑制VSMCs对脂质的吸收和胞内脂质积累。低浓度（25μg/ml）的ox-LDL可以诱导AAMP的表达和小G蛋白Rac I和Rho A向细胞膜的转移,而较高浓度（100μg/ml）的ox-LDL刺激条件下AAMP的表达无显着变化。干扰AAMP的表达可以抑制25μg/ml的ox-LDL诱导的Rho A向细胞膜的转移和细胞迁移。进一步的研究发现,整合素β3可以通过促进Rho A信号的活化来促进VSMCs的迁移,并且这一过程与AAMP向细胞膜上的转移有关。总之,较低浓度的ox-LDL可以促进AAMP的表达,AAMP通过促进Rho A向细胞膜转移促进细胞迁移,并且整合素β3可以通过促进Rho A信号的活化来促进VSMCs的迁移。综上所述,通过本研究的一系列研究工作我们明确了AAMP在血管新生和ox-LDL促进VSMCs迁移中的作用。首先,AAMP可以促进血管新生。AAMP既可以促进内皮出芽、也可以促进管腔形成,AAMP调控血管新生主要通过调控内皮细胞迁移起作用。AAMP通过PPARγ-p53-AAMP-Rho A/ROCK信号通路调控细胞迁移和血管新生过程。另外,AAMP参与较低浓度的ox-LDL诱导的VSMCs迁移。较低浓度的ox-LDL可以诱导AAMP的表达和Rho A向细胞膜的转移,Rho A的膜转移和活化依赖于AAMP,并且整合素β3也参与这一过程。本研究揭示了AAMP对血管新生和VSMCs迁移的调控作用及分子机制,将为进一步研究AAMP在动脉粥样硬化疾病中的作用及机制提供理论基础。
杜娟[8]（2011）在《Survivin反义寡核苷酸对裸鼠人血管瘤种植瘤血管生成的影响》文中提出血管瘤由大量新生毛细血管和增殖的内皮细胞组成，是“血管形成依赖”性疾病。血管形成的核心是内皮细胞的增殖和凋亡。如何能通过干预血管形成中的关键基因，以控制内皮细胞的增殖和凋亡，是促进或抑制血管形成的关键。survivin是新近发现的，迄今为止最强的凋亡抑制因子，有研究表明及本课题组前期发现survivin、VEGF和caspase-3在血管瘤的增生期和消退期表达有差异，并相关。本研究采用survivin及其基因沉默技术，体外培养血管瘤内皮细胞种植裸鼠皮下建立裸鼠人血管瘤动物模型，并用脂质体包裹Survivin ASODN干预，探讨survivin对血管瘤血管形成的影响，从而阐明survivin及其基因封闭技术对血管瘤血管形成的作用机制，为寻找促进和抑制血管形成的新靶点提供理论和实验依据。第一部分婴幼儿增生期血管瘤内皮细胞的培养和鉴及生状况的观察目的：婴幼儿增生期血管瘤内皮细胞的体外分离培养、纯化及鉴定。方法：采用组织化法对12例新鲜婴幼儿血管瘤行细胞培养，细胞培养成功后，在相差显微镜刮除非内皮细胞。待内皮细胞铺满瓶底，进行传代，同时运用反复贴壁法及酶消化法进行数次纯化，取4代内皮细胞进行免疫组化法对内皮细胞进行鉴定并检测内皮细胞纯度。对所培养的细胞进行计数并绘制细胞生长曲线图。结果：12例标本均成功培养出血管瘤内皮细胞，培养的内皮细胞形态为较规则的圆形、椭圆形或多角形，核居中，部分可见核分裂及双核，细胞境界清楚，细胞融合后内皮细胞特有“铺路石”特征。并通过免疫组化CD31、CD34和Ⅷ因子相关抗原鉴定证实为内皮细胞。检测纯度为CD34（+）数为67.88%±4.25%，所培养的细胞具有“管腔形成”现象。结论：该实验可以满足本研究相关需要。目的：研究Survivin ASODN对人增生期血管瘤裸鼠种植瘤生长的影响。方法：将体外培养的细胞浓度调整为1.0×108个/ml，取0.2mL注入裸鼠皮下，建立人增生期血管瘤裸鼠种植瘤动物模型。瘤体直径大于1㎝时随机分为3组，以脂质体包裹的survivin及其反义核酸survivin局部注射于瘤体，观察干预后的瘤体大小、重量、微血管密度变化；用免疫组织化学法检测干预后瘤体中survivin、VEGF、caspase-3的蛋白表达情况。结果：成功建立人增生期血管瘤裸鼠种植瘤动物模型。ASODN/lip组的肿瘤体积在干预期内下降，而NODN/lip组和空白对照组体积增加；瘤重较其它两组减轻，抑瘤率为56.57%；免疫组化染色后可见ASODN/lip组Suvrivin、VEGF蛋白的表达明显下降，而Caspase-3的表达上调呈强阳性；并导致反义组MVD较其它两组明显减少。结论：Survivin ASODS体内转染可有效抑制体内人血管瘤种植瘤的生长速度，抑制瘤体血管形成，加速瘤体向消退期转变。
沈小燕[9]（2008）在《NF-κB信号通路对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响》文中研究说明目的:构建针对NF-κB p65基因的RNAi腺病毒表达载体,从转录后水平抑制p65基因表达,为研究NF-κB信号通路提供技术工具;研究高糖尤其是波动性高糖对人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell, HUVEC）增殖和凋亡的作用;利用构建的RNAi腺病毒感染HUVEC,抑制p65表达,观察NF-κB信号通路对高糖诱导的血管内皮细胞增殖和凋亡的影响。方法:设计合成针对NF-κBp65 mRNA序列1566位点的shRNA编码序列,克隆到腺病毒穿梭质粒中,然后通过体外同源重组构建重组RNAi腺病毒表达载体;在HEK293A细胞中包装并扩增病毒,空斑实验法测定病毒滴度;腺病毒感染HUVEC,Western Blot法检测构建的RNAi腺病毒对p65表达的抑制效果;并利用RNAi腺病毒抑制p65表达,探讨NF-κB信号通路对高糖诱导的HUVEC增殖和凋亡的影响。结果:1.成功构建了针对NF-κBp65特异的RNAi腺病毒表达载体;2.NF-κBp65特异的RNAi腺病毒感染HUVEC后可使p65表达量明显下降,RNAi腺病毒MOI值25～50即可以实现对HUVEC p65表达的有效抑制; 3.RNAi腺病毒感染HUVEC后48h开始检测到p65表达量下降,且随时间延长p65表达量进一步减少,抑制效应至少持续至感染后第六天;4.高糖（20.5mmol/L或30.5mmol/L）,尤其是波动性高糖可以抑制HUVEC增殖,并且促进HUVEC凋亡;5.NF-κBp65特异腺病毒感染HUVEC,可以明显抑制高糖刺激的NF-κBp65核蛋白转录,使核内p65蛋白表达处于基础水平; 6.BrdU结果分析, NF-κBp65特异腺病毒感染HUVEC可以使高糖诱导的细胞增殖抑制明显下降（P<0.01）,与正常葡萄糖浓度（5.5 mmol/L）下的细胞增殖率相当（P>0.05）;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）及流式细胞检测结果均提示NF-κBp65特异腺病毒可以保护高糖诱导的HUVEC凋亡;流式细胞检测NF-κBp65特异腺病毒可以使高糖下内皮细胞凋亡率降到正常糖浓度水平（P>0.05）,但TUNEL结果显示无法降至正常糖浓度下的细胞凋亡率（P<0.01）。结论:构建NF-κB p65特异的RNAi腺病毒表达载体能有效抑制HUVECp65基因的表达;高糖尤其是波动性高糖可以抑制HUVEC增殖,并且促进HUVEC凋亡;腺病毒感染HUVEC,可以明显抑制高糖刺激的NF-κBp65核转录,从而保护高糖作用的HUVEC增殖抑制与凋亡。
刘亮,刘畅,张晓启,明佳,刘旭盛,徐辉,程天民[10]（2005）在《巨噬细胞对内皮细胞系同源盒B2基因和血管内皮生长因子受体mRNA及整合素ανβ3表达的影响》文中研究指明目的 体外观察巨噬细胞（M）对血管内皮细胞同源盒（HOX）B2基因mRNA和血管内皮生长因子（VEGF）受体KDRmRNA及整合素ανβ3表达的影响。 方法 体外培养人脐静脉血管内皮细胞系ECV304,分为（1）ECV304组; （2）ECV304 +伴刀豆球蛋白A（conA,终浓度25mg/L）组; （3）ECV304+人M系U937组:ECV304细胞中加入1×105 /mlU937细胞; （4）ECV304+U937+conA组:ECV304中加入1×105 /mlU937细胞及终浓度25mg/L的conA.反应48h后,用免疫荧光技术检测各组ECV304细胞整合素ανβ3的表达情况,并用逆转录聚合酶链反应（RT PCR）技术检测细胞KDRmRNA和HOXB2基因mRNA的表达水平。 结果 ECV304组细胞的整合素ανβ3、KDRmRNA及HOXB2基因mRNA的表达水平分别为6. 7±1. 5、0. 633±0. 012、0. 674±0. 004。ECV304+U937+conA组细胞上述指标较ECV304组均明显上调（P<0. 01 ）,分别为10. 2±1. 7、0. 879±0 003、0. 947±0 003。其余两组细胞上述指标与ECV304组比较,差异均无统计学意义（P>0. 05）.结论 被conA活化的M通过影响内皮细胞的KDRmRNA、HOXB2mRNA基因及整合素ανβ3的表达,来促进内皮细胞增殖、迁移及与基质黏附,从而调节血管生成。
二、B2同源盒基因反义寡核苷酸对原代脐静脉内皮细胞增殖及细胞周期的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、B2同源盒基因反义寡核苷酸对原代脐静脉内皮细胞增殖及细胞周期的影响（论文提纲范文）
（1）c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs用于促进血管生成及糖尿病创面愈合的影响（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 长期扩增培养的BM-MSCs中c-Cbl与Akt蛋白的活化水平及相互作用关系 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs促血管生成相关功能的影响 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs促进糖尿病创面血管生成的影响 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs促进糖尿病创面愈合的影响 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 脂筏在血管生成调控中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（2）转录下调的miR-4306和基因组扩增的lncRNA-712在三阴性乳腺癌发生发展中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 菌种 |
| 1.2 质粒 |
| 1.3 细胞株及培养条件 |
| 1.4 实验动物 |
| 1.5 抗体 |
| 1.6 主要试剂盒 |
| 1.7 其他试剂 |
| 1.8 引物的设计及合成 |
| 1.9 RNA的合成 |
| 1.10 主要仪器设备 |
| 1.11 生物学软件和网站 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养及处理 |
| 2.1.1 细胞复苏 |
| 2.1.2 细胞传代 |
| 2.1.3 细胞冻存 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.2.1 短链RNA瞬时转染 |
| 2.2.2 质粒瞬时转染 |
| 2.3 miR-4306慢病毒载体的构建(本部分由海吉凯基因化学技术有限公司) |
| 2.4 构建稳定转染细胞 |
| 2.5 细胞增殖实验 |
| 2.6 细胞周期检测 |
| 2.7 细胞侵袭迁移实验 |
| 2.8 细胞凋亡检测 |
| 2.9 细胞总RNA提取、逆转录及RT-qPCR检测 |
| 2.9.1 组织及细胞总RNA的提取 |
| 2.9.2 RNA逆转录 |
| 2.9.3 实时定量PCR(RT-qPCR) |
| 2.10 细胞总蛋白提取 |
| 2.11 蛋白质免疫印迹(Western blot) |
| 2.11.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.11.2 湿法电转膜 |
| 2.11.3 PVDF膜的封闭及抗原抗体杂交 |
| 2.12 免疫组化(Immunohistochemistry, IHC) |
| 2.13 双荧光素酶报告基因实验(Luciferase assay) |
| 2.14 裸鼠实验 |
| 2.14.1 裸鼠移植瘤实验 |
| 2.14.2 裸鼠肺转移实验 |
| 2.14.3 裸鼠淋巴结转移实验 |
| 2.14.4 三阴性乳腺癌原位模型 |
| 2.15 鸡胚尿囊膜实验(Chick Chorioallantoic Membrane Assay,CAM) |
| 2.16 成管实验(Tube Formation) |
| 2.17 染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation Assay,CMP) |
| 2.18 cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends,RACE) |
| 2.19 蛋白芯片(ProteinChip) |
| 2.20 RNA免疫沉淀(RNA Immunoprecipitation,RIP) |
| 2.21 RNA pulldown |
| 2.22 细胞上清外泌体提取 |
| 2.23 mRFP-GFP-LC3融合蛋白(上海汉恒生物科技有限公司) |
| 2.24 免疫荧光(Immunofluorescence,IF) |
| 2.25 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP) |
| 2.26 统计分析 |
| 实验结果 |
| 第一部分: 转录下调的miR-4306在三阴性乳腺癌发生发展和治疗中的作用及分子机制研究 |
| 1. ER-α/PR/HER2通过调控miR-4306基因的转录,影响miR-4306的表达 |
| 1.1 miR-4306在三阴性乳腺癌细胞系中低表达 |
| 1.2 ER-α/PR/HER2调控miR-4306的基因转录 |
| 1.3 ER-α/HER2/PR激活miR-4306启动子区的转录活性 |
| 1.4 ER-α/HER2/PR调控miR-4306的表达 |
| 1.5 ER-α/HER2/PR共同调控miR-4306 |
| 2. miR-4306在三阴性乳腺癌组织中特异性低表达 |
| 3. miR-4306抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移 |
| 4. miR-4306通过靶向SIX1、Cdc42和VEGFA在三阴性乳腺癌中发挥作用 |
| 4.1 miR-4306在三阴性乳腺癌中影响的信号通路 |
| 4.2 miR-4306的靶基因SIX1、Cdc42和VEGFA |
| 4.3 在乳腺癌组织中,miR-4306与靶基因SIX1/Cdc42/VEGFA表达的相关性 |
| 4.4 miR-4306通过靶基因SIX1/Cdc42/VEGFA在三阴性乳腺癌中发挥作用 |
| 4.5 miR-4306在三阴性乳腺癌中发挥作用的具体分子机制 |
| 5 miR-4306在体内抑制三阴性乳腺癌的生长和转移 |
| 5.1 构建差异表达miR-4306的稳转细胞系 |
| 5.2 差异表达miR-4306稳转细胞系的表型 |
| 5.3 差异表达miR-4306稳转细胞系变化的信号通路 |
| 5.4 差异表达miR-4306对三阴性乳腺癌在裸鼠皮下成瘤、肺转移和淋巴结转移中的影响 |
| 6. miR-4306药物联合顺铂治疗三阴性乳腺癌 |
| 6.1 miR-4306 mimic可联合顺铂促进三阴性乳腺癌的细胞凋亡 |
| 6.2 miR-4306药物联合顺铂治疗三阴性乳腺癌 |
| 第二部分: 长链非编码RNA-LncRNA-712基因扩增诱导三阴性乳腺癌自噬和转移的分子机制研究 |
| 1. LncRNA-712在三阴性乳腺癌中特异性高表达 |
| 1.1 筛选因基因拷贝数扩增在三阴性乳腺癌中特异性高表达的lncRNA |
| 1.2 lncRNA-712在三阴性乳腺癌中特异性高表达 |
| 1.3 lncRNA-712在三阴性乳腺癌组织、血清中异常高表达 |
| 2. LncRNA-712在体外促进三阴性乳腺癌细胞恶性表型的形成 |
| 3. lncRNA-712的结合蛋白VPS34、USP14 |
| 3.1 蛋白芯片筛选与lncRNA-712结合的蛋白 |
| 3.2 lncRNA-712与VPS34和USP14结合 |
| 4. lncRNA-712对VPS34、USP14的调控 |
| 4.1 lncRNA-712对VPS34、USP14的调控 |
| 4.2 lncRNA-712对USP14调控的分子机制 |
| 4.3 lncRNA-712促进VSP34乙酰化 |
| 4.4 lncRNA-712诱导三阴性乳腺癌中自噬流的形成 |
| 5. 在外泌体中可检测到lncNA-712 |
| 6. lncRNA-712诱导正常人乳腺上皮细胞MCF-10A发生自噬 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 细胞自噬的概述及其在肿瘤发生发展中的作用(文献综述) |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 在读期间发表文章、申请及授权专利 |
| 致谢 |
（3）长链非编码RNA NORAD通过影响miR590-3p的表达调控缺氧时内皮细胞功能的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 心肌梗死模型的建立 |
| 2.2.2 人脐静脉内皮细胞准备和实验分组 |
| 2.2.3 人脐静脉内皮细胞复苏,培养 |
| 2.2.4 人脐静脉内皮细胞的传代 |
| 2.2.5 人脐静脉内皮细胞的冻存 |
| 2.2.6 人脐静脉内皮细胞的低氧诱导 |
| 2.2.7 构建质粒 |
| 2.2.8 细胞转染 |
| 2.2.9 CCK-8实验 |
| 2.2.10 Matrige基质胶成管实验 |
| 2.2.11 transwell试验 |
| 2.2.12 实时荧光定量PCR |
| 2.2.13 双荧光素酶报告实验 |
| 2.2.14 ELISA实验 |
| 2.2.15 Western Blot |
| 2.2.16 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 缺氧时HUVECs的功能及相应指标表达水平的变化 |
| 3.1.1 缺氧情况下HIF-1α的表达水平上调 |
| 3.1.2 缺氧情况下HUVECs的活力增强 |
| 3.1.3 缺氧情况下HUVECs的迁移能力增强 |
| 3.1.4 缺氧情况下HUVECs的小管形成能力增强 |
| 3.1.5 在缺氧的情况下,HUVECs内lncRNANORAD的表达水平上调,而miR590-3p的表达水平下调 |
| 3.1.6 心肌梗死模型内,lncRNA NORAD的表达水平上调,而 miR590-3p的表达水平下调 |
| 3.2 缺氧时,lncRNA NORAD可以调控HUVECs的血管新生能力 |
| 3.2.1 缺氧时,敲低lncRNA NORAD可以抑制HUVECs的血管新生能力 |
| 3.2.1.1 验证转染效率 |
| 3.2.1.2 缺氧情况下,转染shNORAD后 miR590-3p的表达水平上调 |
| 3.2.1.3 缺氧情况下,转染shNORAD后 HUVECs的活力受到抑制 |
| 3.2.1.4 缺氧情况下,转染shNORAD后 HUVECs的迁移能力受到抑制 |
| 3.2.1.5 缺氧情况下,转染shNORAD后 HUVECs的小管形成能力受到抑制 |
| 3.2.2 缺氧时,过表达lncRNA NORAD可以促进HUVECs的血管新生能力 |
| 3.2.2.1 验证转染效率 |
| 3.2.2.2 缺氧情况下,转染NORAD1-2000-OE后 miR590-3p的表达水平下降 |
| 3.2.2.3 缺氧情况下,转染NORAD1-2000-OE后 HUVECs的活力增强 |
| 3.2.2.4 缺氧情况下,转染NORAD1-2000-OE后 HUVECs的迁移能力增强 |
| 3.2.2.5 缺氧情况下,转染NORAD1-2000-OE后 HUVECs的小管形成能力增强 |
| 3.3 缺氧时,过表达miR590-3p可以抑制HUVECs的血管新生能力 |
| 3.3.1 验证转染效率 |
| 3.3.2 缺氧情况下,转染miR590-3p mimics后 HUVECs的活力受到抑制 |
| 3.3.3 缺氧情况下,转染miR590-3p mimics后 HUVECs的迁移能力受到抑制 |
| 3.3.4 缺氧情况下,转染miR590-3p mimics后 HUVECs的小管形成能力受到抑制 |
| 3.3.5 双荧光素酶报告实验显示,miR590-3p是 lncRNA NORAD的直接作用靶点 |
| 3.4 缺氧情况下,lncRNANORAD通过miR590-3p调控HUVECs的血管新生能力 |
| 3.4.1 验证转染效率 |
| 3.4.2 缺氧情况下,敲低miR590-3p对 lncRNANORAD和 miR590-3p表达的影响 |
| 3.4.3 缺氧情况下,lncRNANORAD通过miR590-3p对 HUVECs活力的影响 |
| 3.4.4 缺氧情况下,lncRNANORAD通过miR590-3p对 HUVECs迁移能力的影响 |
| 3.4.5 缺氧情况下,lncRNA NORAD通过miR590-3p对 HUVECs小管形成能力的影响 |
| 3.5 缺氧情况下,lncRNA NORAD/miR590-3p轴对下游靶基因的调控作用 |
| 3.5.1 缺氧情况下,lncRNANORAD/miR590-3p轴对VEGFA表达水平的调控 |
| 3.5.2 缺氧情况下,lncRNA NORAD/miR590-3p轴对FGF1 表达水平的调控 |
| 3.5.3 缺氧情况下,lncRNA NORAD/miR590-3p轴对FGF2 表达水平的调控 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）当归多糖通过Oip5-as1调节SIRT1-AMPK-PGC1α通路改善心肌缺血再灌注损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 :基于网络药理学方法探索当归对心肌保护作用的活性成分 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 资料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 第二部分 :SIRT1-AMPK-PGC1α信号通路介导当归多糖抗心肌缺血再灌注损伤的作用 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 第三部分 :当归多糖通过Oip5-as1 调控SIRT1-AMPK-PGC1α信号通路改善心肌缺血再灌注损伤的机制研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（5）肾微血管内皮细胞转分化在移植肾间质纤维化形成中的作用及肝细胞生长因子的干预研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 肾微血管内皮细胞转分化在慢性移植肾间质纤维化形成中的作用及机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 肝细胞生长因子对移植肾间质纤维化形成中肾微血管内皮细胞转分化过程的影响及作用机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 研究生在读期间发表文章（第一作者或共同第一作者） |
| 致谢 |
（6）NFKB1基因突变介导血管内皮细胞损伤在冠心病易感性中的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分:NFKB1 基因启动子区-94ATTG插入/缺失突变与冠心病的关联性研究 |
| 1 研究对象与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分:NFKB1 基因突变对机体血管内皮细胞损伤相关因子水平的影响 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象的选择 |
| 1.2 主要仪器和试剂配制方法 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分:氧化应激状态下NFKB1基因突变介导血管内皮细胞损伤的分子机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验试剂、仪器和耗材 |
| 1.2 主要试剂配制 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（7）血管相关迁移细胞蛋白调控血管新生及血管平滑肌细胞迁移（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 主要缩写词 |
| 1 绪论 |
| 1.1 AAMP的研究进展 |
| 1.1.1 AAMP蛋白的结构和功能 |
| 1.1.2 AAMP与疾病的关系 |
| 1.2 血管新生研究现状 |
| 1.2.1 新血管生成的主要方式 |
| 1.2.2 Angiogenesis的具体过程及其调控机制 |
| 1.2.3 血管新生过程中的内皮细胞迁移 |
| 1.3 核受体PPARγ 与内皮功能和血管新生 |
| 1.3.1 PPARγ 的活化和调控基因表达 |
| 1.3.2 PPARγ 与内皮细胞功能 |
| 1.3.3 PPARγ 调控血管新生 |
| 1.4 问题的提出 |
| 1.5 整体研究思路及创新点 |
| 2 AAMP的生物信息学分析和在血管新生中的作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与实验方法 |
| 2.2.1 主要实验仪器和实验材料 |
| 2.2.2 AAMP生物信息学分析 |
| 2.2.3 细胞培养 |
| 2.2.4 蛋白的免疫印迹Western Blot |
| 2.2.5 细胞免疫荧光染色 |
| 2.2.6 AAMP干扰质粒的构建 |
| 2.2.7 细胞培养和细胞转染 |
| 2.2.8 血管内皮细胞体外管腔形成 |
| 2.2.9 大鼠主动脉环培养 |
| 2.2.10 小鼠后肢缺血模型的建立 |
| 2.2.11 小鼠组织总蛋白的提取 |
| 2.2.12 小鼠组织总RNA的提取 |
| 2.2.13 小鼠多种组织中AAMP的RT-PCR和蛋白免疫印迹 |
| 2.2.14 AAMP表达的荧光定量PCR |
| 2.2.15 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 不同物种AAMP蛋白的比对分析 |
| 2.3.2 人AAMP基因的定位及基因结构分析 |
| 2.3.3 人AAMP蛋白的结构和可能互作用蛋白的预测 |
| 2.3.4 AAMP在多种细胞中的表达 |
| 2.3.5 AAMP在成年小鼠多种组织中的表达 |
| 2.3.6 AAMP与血管新生有关 |
| 2.3.7 AAMP干扰载体的构建和干扰效果验证 |
| 2.3.8 降低AAMP的表达或阻断AAMP的功能抑制体外血管新生 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 AAMP基因和蛋白结构与功能的关系 |
| 2.4.2 AAMP的表达模式与其功能的关系 |
| 2.4.3 AAMP参与血管新生与管腔形成和细胞出芽都有关系 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 AAMP通过调控内皮细胞迁移调控血管新生 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要实验仪器和实验材料 |
| 3.2.2 AAMP高表达质粒的构建 |
| 3.2.3 带FLAG标签的AAMP表达质粒的构建 |
| 3.2.4 细胞培养及细胞转染 |
| 3.2.5 细胞增殖 |
| 3.2.6 细胞迁移，细胞粘附和细胞铺展 |
| 3.2.7 Western Blot和细胞免疫荧光染色 |
| 3.2.8 HUVECs中AAMP蛋白荧光强度分析 |
| 3.2.9 细胞膜Rho A的提取 |
| 3.2.10 细胞骨架应力纤维染色 |
| 3.2.11 凝胶收缩实验 |
| 3.2.12 跨膜区的预测 |
| 3.2.13 统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 C端FLAG标签标记的AAMP真核表达载体的构建及细胞转染 |
| 3.3.2 AAMP蛋白在ECs上的定位 |
| 3.3.3 AAMP的表达受VEGF的诱导 |
| 3.3.4 VEGF调控AAMP蛋白的亚细胞定位 |
| 3.3.5 AAMP通过影响内皮细胞的迁移，粘附，铺展调节血管新生 |
| 3.3.6 AAMP与细胞骨架重构相关 |
| 3.3.7 AAMP影响Rho A在细胞膜上的定位 |
| 3.3.8 AAMP高表达载体的构建及细胞转染 |
| 3.3.9 Y27632抑制AAMP高表达诱导的细胞迁移和血管新生 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 AAMP定位于细胞质与细胞膜上与其功能密切相关 |
| 3.4.2 AAMP调控血管新生主要通过调控细胞迁移起作用 |
| 3.4.3 细胞骨架重构是AAMP调控细胞迁移过程中的重要事件 |
| 3.4.4 RhoA/ROCK信号参与AAMP调控的血管新生 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 罗格列酮激活的PPARΓ 信号参与调控AAMP介导的血管新生 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与实验方法 |
| 4.2.1 主要实验仪器和实验材料 |
| 4.2.2 细胞复苏及细胞培养 |
| 4.2.3 三维胶原基质上的内皮细胞管腔形成和主动脉血管环培养 |
| 4.2.4 细胞增殖和细胞迁移实验 |
| 4.2.5 细胞免疫荧光 |
| 4.2.6 细胞膜蛋白和胞浆蛋白的分离 |
| 4.2.7 蛋白免疫印迹 |
| 4.2.8 统计分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 PPARγ 激动剂Rosiglitazone抑制血管新生 |
| 4.3.2 RSG抑制血管新生通过抑制细胞增殖和细胞迁移实现 |
| 4.3.3 RSG可以抑制AAMP的表达并依赖于PPARγ 的激活 |
| 4.3.4 AAMP高表达可以部分回救RSG抑制的细胞迁移和血管新生 |
| 4.3.5 RSG抑制AAMP的表达与p53的上调相关 |
| 4.3.6 RSG抑制AAMP向细胞膜转移与PPARγ 和p53相关 |
| 4.3.7 抑制p53可以缓解RSG对细胞迁移和血管新生的抑制作用 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 PPARγ 抑制血管新生与内皮细胞增殖和迁移有关 |
| 4.4.2 RSG抑制AAMP的表达依赖于PPAR-γ 表达上调，这一过程可能依赖于正反馈调节机制 |
| 4.4.3 RSG抑制细胞迁移与细胞膜上AAMP蛋白的量有相关性 |
| 4.4.4 RSG对细胞迁移和血管新生的抑制作用依赖于p53的上调 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 AAMP参与OX-LDL诱导的VSMC迁移 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与实验方法 |
| 5.2.1 主要实验仪器和实验材料 |
| 5.2.2 大鼠胸腹主动脉VSMCs的原代培养和鉴定 |
| 5.2.3 细胞转染 |
| 5.2.4 细胞的油红O染色 |
| 5.2.5 细胞迁移和细胞增殖 |
| 5.2.6 细胞凋亡检测 |
| 5.2.7 细胞膜蛋白和胞浆蛋白的分离 |
| 5.2.8 蛋白免疫印迹实验 |
| 5.2.9 统计分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 大鼠VSMCs的原代培养和鉴定 |
| 5.3.2 低浓度的ox-LDL促进VSMCs的迁移和增殖，高浓度的ox-LDL诱导VSMCs凋亡 |
| 5.3.3 VSMCs的胞内脂质含量与细胞生理功能相关 |
| 5.3.4 低浓度的ox-LDL可以诱导AAMP的表达和增加细胞膜上的Rac I及Rho A含量 |
| 5.3.5 干扰AAMP的表达抑制ox-LDL诱导的Rho A向细胞膜的转移和细胞迁移 |
| 5.3.6 整合素 β3 与ox-LDL诱导的VSMCs迁移有关 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 不同浓度的ox-LDL对VSMCs的生理功能影响不一样 |
| 5.4.2 ox-LDL通过促进AAMP的表达和RhoA信号的激活促进VSMCs迁移 |
| 5.4.3 整合素 β3 与ox-LDL诱导的VSMCs迁移有关 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 后续研究工作的建议 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A .作者在攻读博士学位期间的科研论文 |
| B. 作者在攻读博士学位期间参与的科研项目 |
（8）Survivin反义寡核苷酸对裸鼠人血管瘤种植瘤血管生成的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 婴幼儿增生期血管瘤内皮细胞的体外培养和鉴定及生长状况的观察 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 Survivin 反义寡核苷酸对裸鼠人血管瘤种植瘤血管生成的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录 A 缩略词表 |
| 附录 B 综述血管瘤模型的研究现状 |
| 参考文献 |
（9）NF-κB信号通路对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响（论文提纲范文）
| 英文简写字表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 NF-κB/p65 特异的 RNAi 腺病毒载体的构建以及腺病毒包装、扩增和滴度测定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 NF-κB/p65 特异的 RNAi 腺病毒对人脐静脉内皮细胞 p65基因表达的抑制效应 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 NF-κB 信号通路对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 附录1 主要仪器设备 |
（10）巨噬细胞对内皮细胞系同源盒B2基因和血管内皮生长因子受体mRNA及整合素ανβ3表达的影响（论文提纲范文）
| 材 料 与 方 法 |
| 一、细胞来源及培养 |
| 二、整合素ανβ3表达情况的检测 |
| 1.实验分组: |
| 2.整合素ανβ3表达的检测: |
| 三、KDR mRNA和HOXB2 mRNA表达的检测 |
| 1.实验分组: |
| 2.逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) : |
| 四、统计学处理 |
| 结 果 |
| 讨 论 |
四、B2同源盒基因反义寡核苷酸对原代脐静脉内皮细胞增殖及细胞周期的影响（论文参考文献）
- [1]c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs用于促进血管生成及糖尿病创面愈合的影响[D]. 谌程程. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [2]转录下调的miR-4306和基因组扩增的lncRNA-712在三阴性乳腺癌发生发展中的作用机制研究[D]. 赵梓彤. 北京协和医学院, 2020
- [3]长链非编码RNA NORAD通过影响miR590-3p的表达调控缺氧时内皮细胞功能的机制研究[D]. 赵晓雪. 中国医科大学, 2020(01)
- [4]当归多糖通过Oip5-as1调节SIRT1-AMPK-PGC1α通路改善心肌缺血再灌注损伤的实验研究[D]. 牛小伟. 兰州大学, 2019(02)
- [5]肾微血管内皮细胞转分化在移植肾间质纤维化形成中的作用及肝细胞生长因子的干预研究[D]. 王子杰. 南京医科大学, 2018(11)
- [6]NFKB1基因突变介导血管内皮细胞损伤在冠心病易感性中的分子机制研究[D]. 罗俊一. 新疆医科大学, 2017(05)
- [7]血管相关迁移细胞蛋白调控血管新生及血管平滑肌细胞迁移[D]. 胡建军. 重庆大学, 2016(09)
- [8]Survivin反义寡核苷酸对裸鼠人血管瘤种植瘤血管生成的影响[D]. 杜娟. 蚌埠医学院, 2011(01)
- [9]NF-κB信号通路对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响[D]. 沈小燕. 福建医科大学, 2008(01)
- [10]巨噬细胞对内皮细胞系同源盒B2基因和血管内皮生长因子受体mRNA及整合素ανβ3表达的影响[J]. 刘亮,刘畅,张晓启,明佳,刘旭盛,徐辉,程天民. 中华烧伤杂志, 2005(03)