一、猕猴组织工程化骨异体植入修复骨缺损T淋巴细胞亚群的检测（论文文献综述）
艾克拜尔·艾西热甫[1]（2017）在《重组人骨形态发生蛋白-2引起的小鼠炎症反应中单核—巨噬细胞的应答与极化行为以及异位成骨相关研究》文中研究说明目的:验证并明确外源性BMP-2植入后出现的炎症反应与剂量的关系以及对单核-巨噬细胞极化行为的作用。阐明围手术期局部使用地塞米松对高剂量BMP-2引导的炎症反应及成骨作用的影响。为临床上更有效地使用rhBMP-2生长因子提供实验依据。方法:此研究中,不载有和载有不同剂量BMP-2的可吸收明胶海绵生物材料植入于小鼠背部皮下制造出无菌性炎症反应及异位成骨动物模型。88只清洁级8周大小的雄性小鼠随机分配至四个实验组。分别为:空白明胶海绵对照组（0μg BMP-2）,低剂量BMP-2组（20μg BMP-2）,高剂量BMP-2组（50μg BMP-2）以及高剂量BMP-2+40μg地塞米松局部使用组（50μg BMP-2+40μg地塞米松）。每组19只小鼠,分别于植入术后2天,4天,1周,2周及4周将各组小鼠用1%戊巴比妥钠0.15ml/只腹膜内注射麻醉后经快速颈椎脱位法处死,通过流式细胞仪检测,ELISA,RT-PCR,组织学HE染色,免疫荧光染色分析,活体成像,取出样本大体观察,micro-CT扫描,组织学Masson三色染色等表征手段对不同剂量BMP-2负载材料植入后体内局部炎症及成骨反应进行了研究。结果:相对于空白对照组不同剂量BMP-2引起的炎症反应呈剂量依赖性。通过流式细胞仪检测,ELISA,RT-PCR等定量实验获得的炎性反应相关数据在植入术后不同的时间点表现出明显的统计学差异（P<0.05或P<0.01）。低剂量BMP-2引起较温和的炎症反应,而高剂量BMP-2则导致更多炎性细胞的局部迁移聚集,更多单核-巨噬细胞的向M1与M2两种亚型极化,植入区更多促炎性细胞因子（IL-1β,IL-6,TNF-α）及抗炎性细胞因子（IL-10,VEGF-α）的生产分泌并其基因水平的更高表达,引起明显的细胞免疫性炎症反应,于植入术后早期（术后2,4天）最为明显。与此同时,本研究发现术中局部使用地塞米松对高剂量BMP-2诱导的炎性巨噬细胞的趋化聚集几乎无抑制或预防作用。然而,于炎症反应早期（术后2天）地塞米松的局部使用显着降低了高剂量BMP-2诱导的M1型巨噬细胞标志物促炎性细胞因子（IL-1β,IL-6,TNF-α）的表达和分泌。反而,于各个研究时间点（术后2,4及7天）对M2型巨噬细胞标志物抗炎性细胞因子（IL-10,VEGF-a）的表达和分泌则无消极作用。此外,异位成骨研究显示BMP-2的成骨作用也呈剂量依赖性。然而,随着时间的推移高剂量BMP-2诱导形成的新生骨组织中可出现较明显的骨破坏与骨质吸收现象。术中局部使用适当剂量地塞米松则可使高剂量BMP-2于成骨后期引发的骨破坏与骨质吸收现象明显抑制。相对于此,低剂量BMP-2诱导的成骨再生则较稳定。结论:不同剂量BMP-2可引起不同程度的炎症反应,可诱导增加M1型巨噬细胞的同时也可诱导增加M2型巨噬细胞,促炎性与抗炎性作用并存,表现出双刃剑样作用。其作用跟剂量有关,剂量越大此种现象越明显。较低剂量使用BMP-2更有利于减轻材料植入后的无菌性炎症反应,更有利于骨组织再生修复。骨组织工程生物材料植入术中局部使用适当剂量地塞米松不仅有利于减轻高剂量BMP-2导致的强烈的炎症反应,而且还有利于减轻成骨后期骨质吸收破坏现象的程度,可视为一种不错的选择。与此研究结果有关的更为确切的机理有待于今后进一步研究说明。
何锦,王冬,袁媛,蔡辉,李星辉,刘燕,汪宏晶[2]（2015）在《兔组织工程化骨膜冻存前后异体移植早期外周血T淋巴细胞亚群的检测》文中研究指明本实验应用MSCs及成骨诱导培养的MSCs作为种子细胞与SIS复合构建组织工程化骨膜并冻存,与未冻存的组织工程化骨膜同时植入同种异体新西兰兔皮下,通过对外周血T淋巴细胞亚群的检测,初步探讨其免疫原性。本研究结果表明,以同种异体MSCs及经成骨诱导后的MSCs构建组织工程化骨骨膜冻存前后植入异体兔体内其免疫反应水平低。
解芳[3]（2013）在《构建同种异体组织工程骨及修复犬颅骨临界骨缺损的实验研究》文中研究表明目的：组织工程技术为临床骨缺损的治疗带来了新的希望,应用自体骨髓间充质干细胞（autogenic BMSCs, Auto-BMSCs）在体内构建组织工程骨修复骨缺损的方法已基本成熟。然而对于同种异体骨髓间充质干细胞（allogeneic BMSCs, Allo-BMSCs）,是否能成功构建组织工程骨,及移植后的免疫原性如何,仍然有很多争论。本课题拟应用同种异体BMSCs与可降解支架复合构建组织工程骨（Tissue engineered bone, TEB）,并植入犬背部皮下非受力部位,探索同种异体组织工程骨的异位成骨能力,并检测同种异体BMSCs移植的免疫原性。之后进一步构建犬颅骨临界骨缺损模型,评估同种异体BMSCs复合β-磷酸三钙（β-TCP）修复大型哺乳动物颅骨缺损的可行性。方法：1.从犬骨髓血中分离纯化BMSCs,体外向成骨、成软骨、成脂三系诱导分化、鉴定。用CM-DiI对成骨诱导至第2代的BMSCs标记后进行体内示踪研究。MTT比色法测定标记前后BMSCs的增殖状况。RT-PCR检测标记细胞中Ⅰ型胶原、骨粘连蛋白、骨形态发生蛋白-2、骨钙素的表达。将标记CM-DiI后的BMSCs复合β-TCP后植入犬背部皮下,8周后取材,荧光显微镜下观察BMSCs体内转归,组织学观察标记BMSCs-TCP复合物异位成骨情况。2.同种异体BMSCs体内构建异位组织工程骨：成骨诱导至第2代犬BMSCs复合β-TCP分别植入同种异体、自体犬背部皮下,分别作为同种异体组织工程骨组（Allo-TEB组）,自体组织工程骨组（Auto-TEB组）,单纯β-TCP作为材料对照组（Control组）。手术前及术后3、7、14、28、56天通过流式细胞学分别检测三组的外周血T淋巴细胞亚群的变化,评估全身免疫反应情况。术后24周取材并行HE染色,通过组织学计量分析,量化比较三组的成骨情况。3.同种异体BMSCs体内构建原位组织工程骨：构建犬双侧颅骨全层临界骨缺损模型,应用同种异体、自体BMSCs-TCP复合物原位移植修复犬颅骨临界骨缺损,分别作分Allo-TEB组,Auto-TEB组,单纯β-TCP作为材料对照组。术后1、3、6、9月通过影像学量化比较三组的颅骨缺损修复情况。术后9月通过大体观察、micro-CT、生物力学和组织学检查,分别评估三组的颅骨缺损修复质量。结果：1.犬骨髓血中分离得到的BMSCs可以向成骨、成软骨、成脂细胞方向分化,CM-DiI标记BMSCs前后的细胞形态基本一致,两组间细胞的增殖率无显着性差异（P>0.05）；标记后RT-PCR可检测到Col-I、BMP-2、BGLAP、SPARC的表达,显示标记对成骨分化无明显影响。标记细胞构建的组织工程骨植入犬皮下8周后取材,标记细胞仍能激发红色荧光,且HE染色证实标记BMSCs构建的组织工程骨可在体内异位成骨。2.同种异体BMSCs体内构建异位组织工程骨：同种异体、自体BMSCs-TCP复合物均可异位成骨,24周时Allo-TEB组与Auto-TEB组比较,其成骨百分比无显着性差异（P>0.05）,均显着高于单纯β-TCP对照组（P<0.001）。流式细胞学检测显示Allo-TEB组植入第3天、7天时的组内CD4+T淋巴细胞及CD4+/CD8+T高于术前及之后的其他时间点（P<0.05）,随着时间的延长,Allo-TEB组、Auto-TEB组CD4+/CD8+T细胞的百分比呈先升高后降低的曲线。但Allo-TEB组、Auto-TEB组及Control组组间的CD4+T细胞计数、CD8+T细胞计数、CD4+/CD8+T淋巴细胞的百分比无显着性差异（P>0.05）。3.同种异体BMSCs体内构建原位组织工程骨修复犬颅骨临界骨缺损：术后CT三维重建及计量分析显示Allo-TEB组、Auto-TEB组的组织工程骨骨密度在术后1、3月时有所降低,但在术后6、9月时保持稳定,两组间骨密度无显着性差异（P>0.05）,材料对照组骨密度随时间延长逐渐降低,在3、6、9月时明显低于上述组织工程骨组（P<0.001）。9月时标本大体观察及micro-CT显示同种异体、自体组织工程骨仍能保持颅骨的完整性,抗压能力检测显示Allo-TEB组、Auto-TEB组的组织工程骨之间无显着性差异（P>0.05）。组织学检测显示,Allo-TEB组、Auto-TEB组的组织工程骨的类骨质中有大量骨细胞、骨陷窝,在缺损边缘与正常骨之间形成了骨性连接,单纯TCP材料大部分降解,缺损区由纤维组织填充。结论：1.犬骨髓血中分离得到的BMSCs具备向成骨、成软骨、成脂方向分化的潜能。CM-Dil标记对BMSCs的生长增殖、成骨分化无明显影响。体内示踪实验证实,BMSCs可以在体内至少存活8周,且8周时BMSCs在体内异位构建的组织工程骨的成骨过程中发挥了种子细胞作用。2.同种异体BMSCs-TCP在体内构建的组织工程骨有异位成骨的作用。同种异体组及自体组的异位成骨能力在24周时无显着性差异。术后两组间的全身免疫反应无显着性差异。同种异体BMSCs没有引起明显的免疫排斥反应。3.同种异体BMSCs-TCP在体内构建组织工程骨能够原位修复犬颅骨临界骨缺损,成骨速率在早期（3月时）慢于自体组,最终（9月时）两组间无显着性差异。
韩雪松[4]（2013）在《自体种子干细胞体内成骨研究》文中指出目的：为解决组织工程骨血管化缓慢,新骨生长迟缓等问题,在构建组织工程骨时不仅需要植入有成骨潜能的干细胞,而且同时植入加速血管形成的血管内皮祖细胞。本研究在体外情况下,联合培养骨髓间充质干细胞和血管内皮祖细胞复合部分脱蛋白生物骨,构建组织工程骨,植入骨缺损动物模型,分析成骨情况,并探讨移植后免疫排斥反应情况。方法：（1）新西兰大耳兔24只,每组12只,分别建立新西兰大耳兔双侧和单侧胫骨缺损模型,建立模型后1天、3天、1周、2周、4周、12周行CT检查,比较两种骨缺损模型的可靠性和和可行性。（2）新西兰大耳兔48只,分为四组,每组12只,A组：自体BMSCs+自体EPCs+PDPBB组；B组：异体BMSCs+异体EPCs+PDPBB组；C组：单纯PDPBB组；前三组建立骨缺损模型后分别植入组织工程骨,D组为空白对照组。术后3天、7天、2周、4周、8周流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群CD3CD4和CD3CD8,比较各组CD4/CD8值；术后3天、7天、2周、4周、8周酶联免疫法检测各组外周血IL-1、IL-6、GM-CSF、M-CSF、TNF含量；术后4周、8周、12周HE染色组织病理学观察。（3）新西兰大耳兔36只,A组：自体BMSCs+自体EPCs+PDPBB组;B组：异体BMSCs+异体EPCs+PDPBB组；C组：单纯PDPBB组,建立骨缺损模型后分别植入组织工程骨,术后4周、8周、12周进行大体解剖观察、CT检查、HE染色、Masson染色,采用LeicaQwin图像分析系统对各组HE切片进行骨组织计量,得出骨长入率,采用Adobe Photoshop7.0软件的魔棒工具和直方图（histogram）功能,对Masson染色组织切片进行胶原组织形态计量分析,分析各组组织工程骨的成骨性能。结果：（1）单侧骨缺损组11例无骨缺损变形移位,术后12周未出现骨缺损的愈合,双侧骨缺损组建立模型失败11例,原因均为出现单侧或双侧骨缺损变形移位,出现时间多集中于5天之内,以术后2天为最多,4-8周后逐渐出现畸形愈合。（2）异体组1例动物于术后7天出现术区皮肤破溃约0.5cm,红肿,破溃口与骨移植区域相通,可见移植骨片,于移植术后14天死亡,分泌物培养无致病菌,其余各组动物术后情况均好。异体BMSCs+异体EPCs+PDPBB组骨移植术后各个时间点CD4/CD8值均高于对照组（P<0.05）,差异有统计学意义；自体BMSCS+自体EPCs+PDPBB组术后3天、7天CD4/CD8值高于对照组（P<0.05）,差异有统计学意义、其余时间点与对照组比较,差异无统计学意义；单纯PDPBB组各个时间点与对照组比较,差异均无统计学意义。异体BMSCs+异体EPCs+PDPBB组的IL-1、IL-6、GM-CSF、M-CSF、TNF含量在各时间点均高于对照组（P<0.05）,差异有统计学意义；自体组3-7天高于对照组（P<0.05）,差异有统计学意义,其时间点与对照组相似（P>0.05）,差异有统计学意义。单纯PDPBB组各个时间点与对照组比较,差异均无统计学意义。异体BMSCs+异体EPCs+PDPBB组术后4周、8周、12周HE染色组织切片均可见移植骨支架周围大量间质淋巴细胞、单核细胞浸润。其余各组无明显间质淋巴细胞、单核细胞浸润。（3）植入后12周大体解剖观察：自体BMSCs+自体EPCs+PDPBB组：缺损区修复组织色泽、质地同正常骨,移植物与周围宿主骨融为一体,与周围骨难以区分,骨修复外观愈合良好。异体BMSCs+异体EPCs+PDPBB组：组织工程骨与周边骨组织基本融合,部分区域可见孔隙,成骨效果差于自体组。单纯PDPBB组：骨缺损区仍可见较多缺损孔隙。CT检查结果：自体BMSCs+自体EPCs+PDPBB组植入后8周：骨缺损已模糊不清,可见较多骨形成充满骨缺损处；植入后12周：骨缺损边界已无法辨认,可见明显髓腔内骨塑形及皮质骨塑形,胫骨表面平整光滑,修复区新生骨组织塑型好,从各个不同侧面观察与正常胫骨形态接近、并融为一体。异体BMSCs+异体EPCs+PDPBB组植入后12周：可见较多密度不均的骨形成充满骨缺损处,但较周围胫骨增高。单纯PDPBB组植入12周：骨缺损区仍清晰可见,但其中隐约见有少许高密度组织填充。术后12周组织病理结果：自体BMSCs+自体EPCs+PDPBB组周可见大骨支架被大量的骨小梁替代,其内可见血管；异体组支架破坏降解严重其内仍可见间质淋巴细胞、单核细胞浸润,新生血管极少见；单纯PDPBB组未见新生血管及骨小梁。术后4周、8周、12周自体组的骨长入率显着高于异体组和单纯PDPBB组（P<0.01）,异体组高于单纯PDPBB组,差异有统计学意义（P<0.01）。自体组骨胶原量在各个时间点均高于异体组及对照组,术后4-8周骨胶原量上升最明显。结论：（1）兔单侧胫骨缺损动物模型可行性及稳定性均较好,可以做为本实验的动物模型；兔双侧胫骨缺损模型不适用于本实验研究。（2）自体BMSCs和自体EPCs联合培养复合PDPBB移植骨缺损术后未见明显排异反应；异体BMSCs和异体EPCs联合培养复合PDPBB移植骨缺损术后出现排异反应；PDPBB可做为组织工程骨支架,未引起免疫排斥。（3）自体BMSCs和自体EPCs联合培养复合PDPBB构建组织工程骨具有很好的修复骨缺损能力,其成骨效果明显好于异体联合培养细胞构建的组织工程骨。
赵娴[5]（2013）在《自体外周血EPCs与BMSCs联合PDPBB构建微血管化生物骨》文中进行了进一步梳理[研究背景及目的]在整形外科临床工作中,骨缺损严重导致患者外观畸形、功能毁损。中国是拥有世界上最多人口的国家,每年因先天畸形、各类创伤、疾病、交通意外、肿瘤手术等造成的各类骨组织缺损的患者大概在300万例以上。随着人口老龄化范围的扩大,骨缺损患者的数量正在以每年10%的数率增长。随着组织工程的蓬勃发展和研究的不断深入,各种类型的组织工程骨开始逐渐应用于骨缺损修复,但因种子细胞功能单一、多采用异体种子细胞等,导致组织工程骨因血管化不良、排异反应等引发坏死、吸收,不仅使骨缺损修复失败,坏死物更可对机体产生不良损伤,严重阻碍了组织工程骨进入临床研究及运用。因此,构建组织相容性好,无排异反应,血管化良好的组织工程骨,是组织工程骨进行临床修复应用的关键。本课题组拟采用来源于自体的具有优异新生血管及管腔形成能力的自体外周血内皮祖细胞（EPCs）与自体骨髓间充质干细胞（BMSCs）构建联合培养种子细胞,并将该种子细胞复合于课题组制备的脱蛋白生物骨构建自体组织工程生物骨,对BMSCs对EPCs的血管化促进作用、组织工程骨的成骨作用提供体外、体内连续性动态监控。为构建可血管化、无排异组织工程骨的临床应用提供系统化技术支持。[方法]（1）抽取新西兰大耳白兔外周血密度梯度离心法加贴壁法提取纯化自体外周血内皮祖细胞,取第三代细胞进行免疫荧光染色检测贴壁细胞CD34、CD133vWF表面标志；（2）麻醉状态下抽取新西兰大耳白兔骨髓液,密度梯度离心法加贴壁法提取纯化自体骨髓间充质干细胞,取第三代细胞进行免疫荧光染色检测贴壁细胞CD29、CD34、CD90表面标志；（3）取骨髓间充质干细胞与外周血内皮祖细胞按照：外周血内皮祖细胞、2：1、1：2、1：1、骨髓间充质干细胞的浓度共同培养；使用倒置显微镜对各组细胞的形态变化进行观察；各组细胞的生长增殖由Wst-1法检测并描绘出曲线,比较各组细胞增殖率；（4）细胞联合培养体系构建后第3天、7天、14天时将最佳比例自体联合培养细胞（外周血EPCs及BMSCs均来源与同一实验动物）、单纯骨髓间充质干细胞、单纯内皮祖细胞进行碱性磷酸酶染色及和茜素红钙染色；倒置显微镜下观察碱性磷酸酶和骨钙素分泌情况；并采用ALP试剂盒及OC试剂盒定量测定各组细胞碱性磷酸酶和骨钙素含量：（5）于联合培养3、7、14天分别提取最佳比例自体联合培养细胞、单纯骨髓间充质干细胞、单纯内皮祖细胞组总RNA,采用实时荧光定量PCR技术检测成骨和血管化基因的表达,包括VEGF.Osteonectin.Osteopotin和Collagen Type I:（6）采用新鲜猪椎骨脱钙、脱细胞处理后制备成部分脱蛋白骨,纤维粘连蛋白包被制成脱蛋白生物骨,运用扫描电镜、液体置换法检测该生物骨的孔隙率及孔径；骨髓间充质干细胞和外周血内皮祖细胞接种部分脱蛋白生物骨片,Wst-1法检测吸光度,检测最佳比例自体联合培养细胞、单纯骨髓间充质干细胞、单纯内皮祖细胞组细胞在脱蛋白生物骨上的生长情况,确定最佳移植时间,运用扫描电镜对各个细胞组在PDPBB粘附、增殖情况进行观测；（7）抽取外周血及骨髓的健康新西兰大耳白兔12只,于其右上肢、双下肢分别进行自体工程骨回植（PDPBB+外周血内皮祖细胞组；PDPBB+骨髓间充质干细胞；PDPBB+最佳比例自体联合培养细胞组：）,分别将组织工程骨植于新西兰大耳白兔股肌袋内（自体联合培养细胞组植回原取材动物体内）；硬组织切片免疫组化染色检测CD34、CD105、ZO-1分析新骨微血管化情况。[结果]（1）抽取的外周血用密度梯度离心法、贴壁培养法提取纯化并进行扩增,可获得高纯度的EPCs,第三代外周血EPCs抗原CD34、CD133、vWF免疫荧光鉴定均为阳性；（2）骨髓液用密度梯度离心法、贴壁培养法提取纯化并进行细胞扩增,可获得大量高纯度的BMSCs,第三代BMSCs抗原CD29、CD90免疫荧光染色鉴定均为阳性,CD34为阴性；（3）体外联合培养细胞1：2组3天许多细胞间出现突触相互连接,自体联合培养细胞各比例组部分细胞融合成团块状,各组混合细胞Wst-1检测吸光度逐渐升高,骨髓间充质干细胞、2：1、1：2、1：1联合培养细胞体系、外周血内皮祖细胞组均在13天时达到高峰,联合培养细胞组1：2浓度吸光度最高；随后各浓度组细胞吸光度持续平台期,差异有统计学意义；（4）体外培养第3天时ALP染色：外周血内皮祖细胞组及单纯骨髓间充质干细胞组呈阴性反应,自体联合培养细胞组部分细胞阳性：7天时外周血内皮祖细胞组ALP染色仍未见阳性细胞,自体联合培养细胞组可见阳性细胞增多,有小片状细胞阳性,单纯骨髓间充质干细胞组可见散在颜色较淡的阳性细胞；14天时外周血内皮祖细胞组ALP染色仍未见阳性细胞,联合培养细胞组可见阳性细胞增多成大片状,颜色明显加深,单纯骨髓间充质干细胞组可见散在阳性细胞,颜色仍较淡；各组ALP检测量随时间延长逐渐增高,各时间自体联合培养细胞组ALP最高；外周血内皮祖细胞组碱性磷酸酶没有明显变化；ALP含量在其它各组与自体联合培养细胞之间进行两两比较均有统计学意义（P<0.01）。（5）体外培养第3天时茜素红骨钙检测自体联合培养细胞组部分细胞阳性；7天时茜素红染色外周血内皮祖细胞组仍呈阴性反应,自体联合培养细胞组可见阳性细胞增多,有小片状细胞阳性,单纯骨髓间充质干细胞组可见颜色较淡的散在阳性细胞；14天时外周血内皮祖细胞组茜素红染色仍呈阴性,联合培养细胞组可见阳性细胞细胞增多成大片状,颜色明显加深,单纯骨髓间充质干细胞组可见多量散在阳性细胞,；随时间延长,各组OC检测量逐渐增高,14天时检测量最高,OC含量在其它各组与自体联合培养细胞之间进行两两比较均有统计学意义（P<0.01）。（6）实时荧光定量PCR检测显示3天、7天、14天时自体联合培养体系VEGF、 Osteonectin、Osteopotin及Collagen Type I的mRNA表达均逐渐上升,单纯骨髓间充质干细胞组恒定表达少量Osteonectin、Osteopotin及Collagen Type I,VEGF表达量较低,单纯EPCs组VEGF表达升高。其中自体联合培养体系四种因子表达量最高。（7）电镜观察：由猪椎骨制备部分脱蛋白骨由大量的羟基磷灰石纤维编织而成,孔隙分布均匀,纤维蛋白包被的脱蛋白生物骨表面见大量颗粒状、片状纤维蛋白,自体联合培养细胞组的细胞在骨支架上粘附生长较好,并形成团块状分布,产生大量胶原蛋白丝,单纯骨髓间充质干细胞及单纯内皮祖细胞在骨支架上粘附生长较少；（8）通过Wst-1检测显示,各细胞组细胞在脱蛋白生物骨上吸光度逐渐增高,在第12天达到峰值,其中自体联合培养细胞组明显升高,各细胞组之间差异有统计学意义（P<0.01）：（9）植入新西兰大耳白兔股肌袋内的组织工程生物骨血管化情况：采用免疫组化染色检测CD105、CD34、及ZO-1的表达,结果显示第2周肉芽组织已经长入组织工程骨孔隙内,联合培养细胞组于2周、4周、8周可见阳性细胞数逐渐增多,可见薄壁的微血管形成,血管腔内可见红细胞；EPCs组见少量阳性细胞及微血管形成,单纯骨髓干细胞组阳性细胞数少,且未见明显血管管腔样结构；各时间段CD105、CD34、及ZO-1阳性表达于联合细胞组均高于单纯BMSCs组及EPCs组,差异具有统计学意义（P<0.01）；结论：（1）兔外周血经密度梯度离心分离及贴壁法提纯即可获得纯度较高的EPCs,无需特殊诱导；（2）兔骨髓液经密度梯度离心法,并结合贴壁法扩增进行分离纯化获得的BMSCs,经免疫荧光染色鉴定为较高纯度的细胞,可在联合培养实验中应用；（3）外周血内皮祖细胞和骨髓间充质干细胞体外培养下,细胞促进彼此的增殖；在体外,外周血内皮祖细胞能诱导骨髓间充质干细胞成骨分化,而骨髓间充质干细胞可促进外周血内皮祖细胞微血管化,1：2比例自体联合细胞培养可以达到最好效果；（4）体外,骨髓间充质干细胞能促进外周血内皮祖细胞血管化的能力,自体联合细胞培养体系血管化能力最强；（5）外周血EPCs可促进BMSCs在骨支架上的附着和生长,自体联合培养细胞在PDPBB支架材料上的增殖优于单纯骨髓间充质干细胞和单纯外周血内皮祖细胞,12天为最佳移植时机：（6）在动物活体内,自体联合培养细胞组微血管化能力最强,形成微血管管腔,外周血内皮祖细胞能增强组织工程骨血管化能力,形成新生血管,建立微循环,改善组织工程骨的血液供应；（7）外周血内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞联合培养体系复合PDPBB构建的组织工程骨是骨缺损修复的良好微血管化生物活性材料,具有组织相容性好,微血管化好等符合正常骨组织生理特性的优点,适合于临床实验及临床应用。
盘荣贵[6]（2012）在《同种异基因成骨细胞组织工程骨移植修复兔桡骨骨缺损免疫反应的初步研究》文中认为目的：探讨由骨髓间充干细胞诱导而成的成骨细胞,体外对同种异基因T淋巴细胞免疫调节及由该种成骨细胞与羟基磷灰石-磷酸三钙构建的工程化骨,移植修复同种异基因兔桡骨骨缺损免疫反应来探讨同种异基因组织工程骨的免疫性,为同种异基因成骨细胞构建工程骨移植修复骨缺损提供实验依据。方法：1、骨髓间充质干细胞的获取与鉴定取中国家兔骨髓,密度梯度离心法并结合贴壁传代分离、获取、纯化骨髓间充质干细胞,观察细胞形态和检测表面标志物的表达,MTT法测定第3代细胞的增殖情况,并绘制出生长曲线,并进行成脂肪诱导油红O染色鉴定。2、骨髓间充质干细胞成骨诱导的研究取生长良好的传三代细胞,用成骨诱导培养基进行诱导,观察细胞形态,并分别于培养的第2天、第5天、第8天、第11天、第14天收集细胞,进行细胞内碱性磷酸酶含量测定；于诱导7天时行Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色,于诱导14天行骨钙素免疫细胞化学染色,于诱导21天时行钙化结节染色同时用扫描电镜观察细胞形态和基质分泌。3、成骨细胞对混合淋巴细胞培养体系中同种异基因T细胞亚群的免疫调节取新西兰白兔外周静脉血,密度梯度离心法和尼龙毛柱法分离、获取、纯化,培养T淋巴细胞,并检测其浓度。以中国家兔成骨细胞为刺激细胞,新西兰兔T细胞为反应细胞建立混合淋巴细胞培养体系,MTT法测定T细胞增殖、流式细胞仪检测T细胞凋亡。4、同种异基因组织工程骨的构建取中国家兔成骨细胞接种在HA-TCP支架材料上,接种后第4、8、12、24小时取样测定细胞的粘附率；荧光显微镜观察成骨细胞在HA-TCP表面生长情况；复合培养3周后,取材行扫描电镜观察细胞在材料表面的生长增殖和基质分泌情况,RT-PCR检测Ⅰ型胶原表达。5、异基因组织工程骨移植修复骨缺损免疫初步研究（1）分别将组织工程骨（TEB、Ⅰ组）,单纯HA-TCP（Ⅱ组）,自体骨（Ⅲ组）分别随机植入兔桡骨骨缺损处,常规喂养,观察各组动物全身及骨缺损伤口局部情况。（2）术后6周,行X线片检查,观察桡骨骨缺损处骨愈合情况,各组植入物与宿主骨缺损处骨质愈合大体情况以及超微结构变化情况。（3）术后4天,10天,6周分别测定脾重指数,EDU细胞染色观察脾内细胞增殖情况；HE染色观察脾大体病理变化,透射电镜观察淋巴细胞超微结构变化；ELISA检测脾脏内细胞IFN-γ,IL-10表达水平；RT-PCR检测脾内细胞IFN-γmRNA, IL-10mRNA的表达情况。结果：1、经密度梯度离心结合贴壁法分离、纯化所获得到的细胞形态均一,呈长梭形,接近融合状态时可呈现旋涡样生长,细胞增殖检测曲线显示细胞自我增殖、更新能力强；所分离的细胞表达CD44、CD105,仅约2%表达CD34,成脂肪诱导油红染色阳性。2、骨髓间充质干细胞成骨诱导后,细胞形态由长梭形逐渐变为短梭形,多角形,最后成集落层叠生长；在诱导过程中,ALP含量逐渐增高,与对照组比较有显着性差异（p<0.01）；于诱导7天时Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色,诱导14天骨钙素免疫细胞化学染色,诱导21天时钙化结节染色阳性；扫描电镜显示细胞生长旺盛,并分泌基质。3、细胞接种4h,8h,12h,24h,36h细胞粘附率分别为44±1.5%,68±1.3%,78±1.0%,84±2.0%,87±1.8%。36h后,每块HA-TCP材料上细胞粘附率均达85%以上,培养3周后,荧光显微镜和扫描电镜均显示,成骨细胞在HA-TCP材料表面生长旺盛,形态良好,并长入支架材料孔隙中,并有基质分泌。4、各组动物术后伤口愈合良好,局部炎症反应轻,无渗出。6周后,X线显示Ⅰ组中TEB与宿主骨结合处基本愈合,而Ⅱ组中HA-TCP与宿主骨愈合不满意,Ⅲ组中骨缺损处骨质愈合。三组骨缺损骨质愈合情况：Ⅲ组>Ⅰ组>Ⅱ组。透射电镜显示三组骨缺损处成骨细胞突入胶原纤维间,成纤纤维,胶原纤维丰富；三组比较：Ⅰ组成纤纤维,胶原纤维丰富；而Ⅱ组成纤纤维,胶原纤维相对较少；Ⅲ组成纤纤维,胶原纤维最丰富。5、术后4天,10天,6周各时间点各组动物脾指数脾重量指数同组前后比较,前期稍高,后期稍低,但三组间比较,p>0.05；HE染色可见各时间点脾形态结构正常,脾小结大小均匀,红髓、白髓无明显差异；只是早期红髓血管稍扩张、充血,但白髓无明显扩大,脾小结淋巴细胞稍多；形态无明显改变。后期红髓形态恢复正常,脾小结淋巴细胞较早期减少。脾内细胞增殖同组前后比较,前期稍高,后期稍低,但三组间比较,p>0.05；电镜显示,Ⅲ组淋巴细胞结构基本正常,Ⅰ组与Ⅱ组淋巴细胞线粒体均不同程度的出现线粒体空泡化、嵴断裂、紊乱、肿胀、凝集；内质网扩张、间隙增宽脱颗粒；染色质浓缩、边集,染色体疏松等,高尔基复合体和各级溶酶体明显增多,粗面内质网明显脱颗粒,Ⅰ组较Ⅱ组明显。术后4天,10天,6周脾内细胞IFN-γ、IL-10水平及IFN-γmRNA、IL-10mRN表达,同组前后比较,前期稍高,后期稍低,P>0.05；三组相比较P>0.05,无统计学差异,各时间点相比较p>0.05,无统计学差异。结论：1、采用密度梯度离心法结合细胞贴壁法分离BMSCs方法操作简单、易行,分离出的BMSCs纯度高,保持旺盛的增殖能力；在体外可诱导分化成成骨细胞,扩增迅速,性状稳定,符合组织工程种子细胞的基本条件。2、由BMSCs体外诱导成的成骨细胞有一定免疫原性,但极低,可以抑制异基因T细胞增殖,推测其可能促使CD8+细胞凋亡有关。3、由同种异基因BMSCs诱导成的成骨细胞与HA-TCP材料体外构建组织工程骨,简单易行,确切,基本符合组织工程骨的要求。4、同种异基因成骨细胞与HA-TCP构建的组织工程骨,免疫性极低,成骨能力强,可以用于修复骨缺损。
武京国[7]（2012）在《构建同种异体组织工程骨及修复大动物骨缺损的实验研究》文中指出目的：同种异体骨髓间充质干细胞（allogeneic bone mesenchymal stem cells, allo-BMSCs）体内移植后是否完全免疫豁免和发挥生物学作用,目前还存在争议。本实验应用allo-BMSCs复合生物材料构建组织工程骨（tissue-engineered bone,TEB）并植入比格犬皮下,研究同种异体TEB（allo-TEB）异位移植后的成骨能力,并检测受体的免疫反应。同时建立比格犬下颌骨标准骨缺损模型,探索应用allo-TEB修复下颌骨缺损的可行性并检测修复过程中受体的免疫反应。方法：（1）体外分离培养比格犬BMSCs,向成骨、成软骨和成脂方向诱导分化并鉴定。应用电镜扫描观察BMSCs在珊瑚支架材料上的生长。（2）裸鼠体内应用增强型绿色荧光蛋白.（EGFP）和CM-Dil标记比格犬BMSC进行示踪研究。MTT法检测BMSCs标记后的增殖能力。标记BMSC复合珊瑚支架植入裸鼠体内,术后4、8和12周取材,通过免疫组织化学和荧光显微镜观察的方法示踪植入体内的BMSC,并通过组织学观察标记细胞-珊瑚支架复合物的异位成骨能力。（3）实验分组：应用PCR的方法分析比格犬MHC I类基因的不同,并结合混合淋巴细胞培养（MLC）对犬不同个体基因错配进行实验分组。（4）同种异体比格犬BMSCs体内异位构建TEB：比格犬BMSCs分别复合珊瑚和β-TCP支架材料后体外成骨诱导培养1周,植入自体、异体比格犬皮下,空白材料植入作为阴性对照。术后3、7、14、28和56天通过组织学评价allo-TEB的成骨能力,并检测犬外周血白介素的含量。（5）同种异体比格犬BMSCs体内原位构建TEB修复骨缺损：建立比格犬右侧下颌骨标准全层骨缺损模型（长度为3cm）,应用构建的自体、异体BMSC-支架复合物原位移植修复缺损,空白材料植入作为阴性对照,自体骨移植作为阳性对照。术后24周通过影像学、大体观察、生物力学和组织学评价下颌骨缺损的修复质量,并于3、7、14、28和56天检测犬外周血免疫相关细胞因子的含量以及淋巴细胞分型。结果：（1）BMSCs培养和复合支架：比格犬骨髓中分离出的BMSCs能够向骨、软骨和脂肪方向分化,复合珊瑚支架可在三维环境中黏附生长、增殖并分泌细胞外基质。（2）标记BMSCs:EGFP和CM-Dil标记的BMSCs体外增殖能力与未标记BMSCs比较无显着性差异（P>0.05）。植入裸鼠体内12周后,EGFP标记的BMSCs仍表达GFP蛋白,CM-Dil标记的BMSCs在TEB中仍能激发红色荧光,同时上述标记BMSCs构建的TEB均可在裸鼠体内异位成骨。（3）犬不同个体间基因错配：找到MHC Ⅰ类基因片段不同的比格犬,MLC显示不同个体间淋巴细胞刺激后增殖水平显着性高于自体淋巴细胞（P<0.05）。（4）同种异体比格犬BMSCs体内异位构建TEB：自体、异体BMSCs-支架复合物均能异位成骨,8周前自体BMSCs-支架复合物成骨速率快于异体BMSCs-支架复合物（P<0.05）,到12周时两组成骨量比较无显着性差异（P>0.05）,而空白材料不能成骨。异体BMSCs-支架复合物组植入术后7天外周血中IL-2水平较自体BMSCs-支架复合物组短暂性升高（P<0.05）,IL-10水平短暂性降低（P<0.05）,之后两组间IL-2及IL-10水平在各时间点均无显着性差异（P>0.05）。（5）同种异体比格犬BMSCs体内原位构建TEB修复骨缺损：术后X线观察发现自体及异体TEB组骨密度随时间延长逐渐增高,空白支架组骨密度逐渐降低。24周CT三维重建和标本大体观察发现自体、异体TEB修复恢复了下颌骨的连续性,骨密度及生物力学检测显示两组间无显着性差异（P>0.05）。组织学观察,自体、异体TEB组和自体骨移植组示骨基质中骨细胞、骨陷窝及骨断端处骨性连接,空白支架组生物材料降解吸收,缺损区纤维组织连接。术后3天异体TEB组犬外周血TNF-α和INF-γ水平较自体TEB组短暂性升高（P<0.05）,7天IL-2水平短暂性升高（P<0.05）,IL-10水平短暂性降低（P<0.05）,之后两组间TNF-α、INF-γ、IL-2及IL-10水平在各时间点均无显着性差异（P>0.05）。术后全程淋巴细胞分型两组间无显着性差异（P>0.05）。结论：（1）比格犬BMSCs具备向成骨、成软骨和脂肪方向分化的潜能,与珊瑚支架材料相容性良好。（2）体外EGFP和CM-Dil标记不影响比格犬BMSCs的增殖能力,裸鼠体内异位构建TEB具备成骨能力。BMSCs复合珊瑚支架植入体内可存活12周以上（3）同种异体BMSCs体内异位构建TEB成骨速率慢于自体TEB,两组最终（12周后）成骨能力无差异。异体BMSCs-支架复合物植入早期（7天）受体的免疫反应强于自体BMSCs-支架复合物,最终（12周）两组间无明显差异。（4）同种异体BMSCs体内原位构建TEB可修复比格犬下领骨标准缺损。异体TEB修复早期（7天）受体的免疫反应强于自体TEB,最终（12周）两组间无明显差异。
赵凯[8]（2011）在《同种异体BMSCs抗原性对兔桡骨缺损修复的影响》文中提出目的应用原代培养BMSCs和HA复合的人工植骨材料修复兔桡骨缺损,探讨同种异体BMSCs抗原性及其对骨缺损修复的影响。方法从异体兔胫骨分离培养BMSCs,经细胞培养后成骨诱导。将诱导成功的细胞与HA复合培养后,形成BMSCs/HA复合体,并植入骨缺损中。实验分为2组:实验组:为应用异体BMSCs/HA修复兔桡骨缺损,对照组:为应用自体BMSCs/HA修复兔桡骨缺损,每组12只;术后2、4、8周进行大体观察、X线检测、HE染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色、流式细胞术检测淋巴细胞亚群等方法,观察人工植骨材料在植骨区的免疫排斥反应以及对成骨效果的影响。结果原代培养的BMSCs于体外经成骨诱导后,BMSCs/HA复合体植入8周后,24只兔全部存活,伤口均为Ⅰ期愈合。X线结果显示,实验组和对照组于术后2,4周于缺损处有纤维骨痂形成、8周骨密度增高,骨痂形成,两组无显着性差异;光镜形态学观察,实验组和对照组均无明显的淋巴细胞浸润,有明显的新骨形成,两组无显着差异;流式细胞仪结果显示,CD4+,CD8+淋巴细胞分群情况没有明显统计学差异（P>0.05）。结论体外原代培养的BMSCs成骨诱导,自体和同种异体BMSCs移植没有引起明显的免疫排斥反应,自体和异体的BMSCs移植,均没有影响骨缺损的愈合。
马雷[9]（2010）在《bFGF基因修饰的MSCs细胞复合β-磷酸三钙修复骨缺损实验研究》文中研究说明目的：骨缺损畸形是颌面外科、骨科、整形外科临床常见病。颌骨缺损的修复问题一直是口腔颌面外科较难解决的问题,现常规的修复方法很多,但各有其优缺点。组织工程化骨是利用生物组织工程技术将种子细胞与支架材料复合,形成具有与自体骨结构功能相似的骨组织,它弥补了多种单一植骨材料的缺陷,结合了它们各自的优点,具有组织相容性好、骨诱导能力强、取材方便、可快速修复缺损等特性。用组织工程方法构建种子细胞、支架材料和生长因子复合的生物活性人工骨被认为是未来进行骨缺损修复和骨再造最有效的方法之一。通过人碱性成纤维生长因子（basic fibroblant growth factor, bFGF）转染以增加组织细胞bFGF的分泌量,提高bFGF蛋白在生物体骨缺损局部组织中的浓度,达到促进骨愈合的目的。但是,如何提高质粒对于靶组织的转染效率、寻求一种高效、简便的转染手段,如何缩短鉴定转染是否成功的时间,以及在基因转染促进骨愈合的过程中,一直未得到很好的阐明。本研究目的包括以下几个方面：1)建立稳定的、基因序列正确的、检测方便的、和GFP-慢病毒载体,并检测转染293-FT细胞的效率及转染后的生物学活性；2)获得骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells, BMSCs）,bFGF-慢病毒载体转染诱导第3代的犬BMSCs,了解该质粒转染犬骨髓间充质干细胞的效率及转染后的生物学活性；3)体内观察对比bFGF基因修饰rMSCs细胞活性的影响以及诱导异位成骨的情况,为构建更优化的骨组织工程种子细胞和组织工程化骨提供重要的实验基础。方法：1)bFGF基因真核表达载体的构建设计人bFGF基因引物,用Trizol法提取胎盘组织总RNA,用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）的方法扩增bFGF基因,连接至ViraPowerTM慢病毒载体系统,经Xho-Ⅰ, BamH-Ⅰ双酶切和测序并与Genebank中序列进行比较分析。2)bFGF基因遗传修饰的犬骨髓间充质干细胞的建立：①结合Percoll分离液密度梯度离心和差速贴壁传代筛选法相,分离培养犬骨髓间充质干细胞。②在脂质体转染剂Lipofectamine2000的介导下,bFGF-pLenti6/V5-D-TOPO表达质粒同包装质粒pLP1、pLP2、包膜质粒pLP/VSVG共转染293FT细胞株,收集bFGF-慢病毒上清转染诱导后第3代的犬BMSCs, Blasticidin压力筛选稳定表达株。③设计GFP基因引物,以GFP-PMSLV-Plazmid为—1—模板,采用PCR的方法扩增GFP基因,连接至pLenti6/V5-D-TOPO（?）表达质粒,GFP-慢病毒载体的构建及转染BMSCs过程同bFGF-慢病毒。RT-PCR方法检测bFGF mRNA水平的表达。④RT-PCR检测转染组细胞中目的基因mRNA表达情况,Western blot,细胞免疫化学检测各转染组细胞胞浆中目的蛋白表达情况；ELISA检测各各转染组细胞培养上清中目的蛋白的分泌情况。3)bFGF基因转染的rMSCs成骨活性的体内实验研究实验共分为4组进行：A、对照组（空白组）；B、p-磷酸三钙组；C、MSCs细胞复合β-磷酸三钙组；D、bFGF基因修饰rMSCs+β-磷酸三钙组；①在体外分别将rMSCs和bFGF基因修饰rMSCs接种于多孔支架材料磷酸三钙上。②将不同组细胞／材料复合物植入犬牙槽骨内。③每组分别于植入3月后取材,石蜡包埋,组织病理学切片,HE染色分析新骨形成情况；④术后4、8和12周进行X光片、4、8周CT摄片观察骨缺损变化、骨皮质及β-磷酸三钙降解情况。结果：1)RT-PCR自脑组织cDNA库中扩增出bFGF基因；成功将bFGF基因克隆入真核表达载体,构建了bFGF-pLenti6/V5-D-TOPO表达质粒,DNA测序证明,所克隆目的基因序列与Genebank收录一致。2)bFGF真核表达质粒转染了犬骨髓间充质干细胞后,经抗生素Blasticidin压力筛选获得了具有抗性的细胞克隆；GFP真核表达质粒转染了犬骨髓间充质干细胞48小时后,倒置荧光显微镜下显示转染后的犬骨髓间充质干细胞内可见绿色荧光蛋白分布于整个细胞,呈胞浆分布。培养第八代,转染的细胞依然存活,绿色荧光蛋白持续表达；RT-PCR结果显示抗性细胞克隆中均有大量目的基因bFGFmRNA转录,ELISA检测培养上清中目的蛋白表达阳性,Western blot结果显示胞浆中有目的蛋白的表达。3)犬牙槽骨缺损异位诱导成骨实验显示：基因修饰MSCs组与单纯MSCs对照组相比,材料降解和替代的速度明显提高,有较多的新骨形成；实验动物牙槽骨骨缺损愈合过程的X线4周、8周、12周观察显示及4、12周的CT扫描,bFGF基因修饰rMSCs+β-磷酸三钙组骨缺损在骨皮质的连续性、p-磷酸三钙的降解速度及骨缺损愈合的大小优于MSCs细胞复合p-磷酸三钙组,p-磷酸三钙组明显优于对照组,bFGF修饰的MSCs组在各阶段均有比其他组更明显的材料替换速度。结论：1)成功构建了携带人bFGF和GFP基因的真核表达载体。2)含有人bFGF基因序列可以通过脂质体介导有效地导入犬MSCs中并得到表达。3)人bFGF基因对犬骨髓间充质干细胞修饰转染并能在骨髓间充质干细胞中翻译、表达产生bFGF基因。4)bFGF能够启动或诱导MSCs成骨方向分化和能够促进新生血管形成,对rMSCs进行修饰后,能够在犬牙槽骨内有效地促进异位骨的形成。
解芳[10]（2010）在《长期冻存后同种异体骨髓基质干细胞修复颅骨标准骨缺损的实验研究》文中指出目的建立可靠、纯度高的犬骨髓基质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）的分离纯化方法,观察其在体外扩增、成骨分化的能力。并进一步探索和评估：（1）长期冻存后的BMSCs的成骨分化能力；（2）同种异体BMSCs修复颅骨标准骨缺损的能力；（3）同种异体BMSCs移植是否引起明显的免疫排斥反应。旨在建立随用随取的同种异体BMSCs库,解决骨组织工程种子细胞的来源问题,促进骨组织工程早日在临床上广泛应用。方法采用1.077g／mlFicoll分离液,密度梯度离心法分离Beagle犬骨髓得到BMSCs,体外培养、扩增并用成骨条件培养液进行成骨诱导,进行碱性磷酸酶、茜素红染色和OPN、OCN、Ⅰ型胶原免疫细胞化学或免疫荧光染色。将大量扩增且成骨诱导后的BMSCs在液氮中冷冻保存6个月,复苏后接种于β-TCP支架上共培养,构建BMSCs／TCP复合物。在10只平均体重为11.9kg的成年Beagle犬颅骨上分别制造左右两个直径为20mm的标准骨缺损,分别为实验侧和对照侧。实验动物共分为三组,分别为同种异体组、自体组和空白组。同种异体组接种的同种异体BMSCs来自于自体组的2只Beagle犬骨髓。自体组接种的BMSCs来自于自体组的2只Beagle犬各自本身,即为相同来源的BMSCs,其分离、纯化、成骨诱导后冻存、复苏、共培养及移植的方法在各组之间完全一致。其中6只为同种异体组,实验侧（左）应用成骨诱导后的同种异体BMSCs／β-TCP复合物修复,对照侧（右）单独应用β-TCP修复。另外2只犬（提供骨髓犬）为自体组,实验侧（左）应用成骨诱导后的自体BMSCs／β-TCP复合物修复,对照侧（右）单独应用β-TCP修复。其余2只犬为空白组,实验侧（左）单独应用β-TCP修复,对照侧（右）为空白对照,不接种任何材料。应用1-0号丝线封闭切口。采用组织学和影像学方法评估术后16和24周的修复情况。同时监测外周血T淋巴细胞亚群CD4+／CD8+的变化,对术后全身免疫反应进行评估。结果采用1.077g／mlFicoll液可获得纯度较高的BMSCs,细胞生长良好,平均倍增时间为24h,经成骨诱导培养后可定向分化为成骨细胞。应用成骨诱导后的冻存半年的同种异体BMSCs复合β-TCP修复Beagle犬颅骨标准骨缺损,无明显不良反应,所有动物术后均存活,无感染发生。16周后初步的组织学和影像学检查表明,同种异体组（6例）的成骨情况良好。免疫学分析表明CD4+和CD8+T细胞数量以及CD4+／CD8+比值在三组Beagle犬中无显着性差异（p>0.05）。结论采用1.077g／mlFicoll液能有效地分离Beagle犬骨髓中的BMSCs,通过成骨诱导可分化为成骨细胞,从而为骨缺损的修复提供理想的组织工程种子细胞。长期冻存的同种异体BMSCs复苏后与β-TCP支架共培养,植入Beagle犬颅骨标准骨缺损中,在没有使用免疫抑制的情况下可以很好的修复骨缺损,没有明显的免疫排斥反应发生。
二、猕猴组织工程化骨异体植入修复骨缺损T淋巴细胞亚群的检测（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猕猴组织工程化骨异体植入修复骨缺损T淋巴细胞亚群的检测（论文提纲范文）
（1）重组人骨形态发生蛋白-2引起的小鼠炎症反应中单核—巨噬细胞的应答与极化行为以及异位成骨相关研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 |
| 研究内容与方法 |
| 1. 装载rhBMP-2的植入物制备 |
| 2. 动物模型与植入术 |
| 3. 炎性液体回收与植入物取出 |
| 4. 流式分析 |
| 5. 细胞因子产量测定 |
| 6. RT-PCR分析 |
| 7. 组织切片染色评估 |
| 8. 统计学分析 |
| 9. 技术路线图 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 |
| 研究内容与方法 |
| 1. 装载rhBMP-2的植入物制备 |
| 2. 动物模型与植入术 |
| 3. 活体成像 |
| 4. 植入物取出 |
| 5. RT-PCR分析 |
| 6. 样本大体观察评估 |
| 7. micro - CT扫描成像 |
| 8. 组织学染色评估 |
| 9. 技术路线图 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 生物材料的优化与骨缺损的修复 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（2）兔组织工程化骨膜冻存前后异体移植早期外周血T淋巴细胞亚群的检测（论文提纲范文）
| 1 方法 |
| 1.1 SIS的制备 |
| 1.2 骨髓间充质干细胞 (MSCs) 的获取与体外培养及鉴定 |
| 1.3 构建组织工程骨膜 |
| 1.4 实验动物及方法 |
| 1.5 大体观察和组织学观察 |
| 1.6 T淋巴细胞亚群流式细胞仪计数 |
| 1.7 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 MSCs的培养与鉴定 |
| 2.2 扫描电镜观察 |
| 2.3 大体观察和组织学观察 |
| 2.4 T淋巴细胞亚群的表达 |
| 3 结论 |
（3）构建同种异体组织工程骨及修复犬颅骨临界骨缺损的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 CM-DiI示踪犬BMSCs构建组织工程骨的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 同种异体犬BMSCs体内构建异位组织工程骨的研究 |
| 第一节 同种异体犬BMSCs体内构建异位组织工程骨的成骨能力研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二节 同种异体犬组织工程骨异位移植后的免疫学研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 同种异体犬BMSCs构建组织工程骨修复犬颅骨临界骨缺损的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 附录一 略图 |
| 附录二 略表 |
| 致谢 |
| 发表文章和学术交流 |
（4）自体种子干细胞体内成骨研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验一 骨缺损动物模型的建立 |
| 一、方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 五、参考文献 |
| 实验二 BMSCs和EPCs复合脱蛋白生物骨修复骨缺损的免疫排异研究 |
| 一、方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 五、参考文献 |
| 实验三 自体及异体BMSCs和EPCs复合脱蛋白生物骨修复骨缺损成骨研究 |
| 一、方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 五、参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（5）自体外周血EPCs与BMSCs联合PDPBB构建微血管化生物骨（论文提纲范文）
| 英文缩略语 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 实验一 自体外周血来源内皮祖细胞和骨髓间充质干细胞的制备 |
| 1、前言 |
| 2、材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4、讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 外周血内皮祖细胞与骨髓间充质干细胞联合培养体系复合PDPBB建立生物骨 |
| 1、 前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 联合培养体系中外周血EPCs对BMSCs成骨作用的研究 |
| 1、前言 |
| 2、材料与方法 |
| 3、结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验四 外周血EPCs及BMSCs联合培养体系体内、外微血管化能力的研究 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 发表文章及获奖情况 |
| 致谢 |
（6）同种异基因成骨细胞组织工程骨移植修复兔桡骨骨缺损免疫反应的初步研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 同种异基因成骨细胞对混合淋巴细胞培养体系中T细胞亚群的免疫调节 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 结论 |
| 第二部分 构建同种异基因成骨细胞组织工程骨的研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三部分 同种异基因成骨细胞组织工程骨修复兔桡骨干骨缺损早期免疫反应的实验研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 参考文献 |
| 全文小结与展望 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间（待）发表的论文 |
（7）构建同种异体组织工程骨及修复大动物骨缺损的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 BMSCs的分离培养及体外复合珊瑚支架的研究 |
| 第一节 BMSCs的分离培养和诱导分化 |
| 第二节 BMSCs复合珊瑚支架材料的诱导培养及检测 |
| 第二章 EGFP和CM-Dil示踪BMSCs体内构建组织工程骨的研究 |
| 第一节 EGFP和CM-Dil标记对BMSCs增殖能力的影响 |
| 第二节 BMSCs标记后复合珊瑚支架体内成骨能力的研究 |
| 第三章 比格犬白细胞抗原基因配型的检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 同种异体BMSCs比格犬体内异位构建组织工程骨的研究 |
| 第一节 同种异体BMSCs复合支架材料异位成骨能力的研究 |
| 第二节 同种异体BMSCs复合支架材料异位移植后受体免疫反应的检测 |
| 第五章 同种异体BMSCs构建组织工程骨修复犬下颌骨缺损的研究 |
| 第一节 同种异体组织工程骨修复比格犬标准下颌骨缺损的研究 |
| 第二节 同种异体组织工程骨修复缺损移植后受体免疫反应的检测 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 英文缩略词表 |
| 致谢 |
| 发表文章和学术交流 |
（8）同种异体BMSCs抗原性对兔桡骨缺损修复的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 中文论着摘要 |
| 英文论着摘要 |
| 英文缩略语 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）bFGF基因修饰的MSCs细胞复合β-磷酸三钙修复骨缺损实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 慢病毒真核表达载体构建及其转染活性的测定 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料及仪器 |
| 1.2 方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第二部分 bFGF基因修饰的犬骨髓间充质干细胞的建立 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料及仪器 |
| 1.2 实验步骤 |
| 1.3 检测BFGF在骨髓间充质干细胞内的表达情况 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第三部分 bFGF基因修饰的rMSCs细胞生物学特性及MSCs与β-磷酸三钙复合培养的体外实验研究 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第四部分 bFGF基因修饰的rMSCs成骨活性的实验研究 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 细胞-生物材料复合物制备 |
| 1.3 方法 |
| 1.4 观察方法及指标 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 导师评阅表 |
（10）长期冻存后同种异体骨髓基质干细胞修复颅骨标准骨缺损的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 综述一 |
| 综述二 |
| 前言 |
| 第一部分 犬BMSCs的分离纯化和成骨诱导培养 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 长期冻存后同种异体BMSCs修复颅骨标准骨缺损 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
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四、猕猴组织工程化骨异体植入修复骨缺损T淋巴细胞亚群的检测（论文参考文献）
- [1]重组人骨形态发生蛋白-2引起的小鼠炎症反应中单核—巨噬细胞的应答与极化行为以及异位成骨相关研究[D]. 艾克拜尔·艾西热甫. 新疆医科大学, 2017(08)
- [2]兔组织工程化骨膜冻存前后异体移植早期外周血T淋巴细胞亚群的检测[J]. 何锦,王冬,袁媛,蔡辉,李星辉,刘燕,汪宏晶. 甘肃科技, 2015(10)
- [3]构建同种异体组织工程骨及修复犬颅骨临界骨缺损的实验研究[D]. 解芳. 北京协和医学院, 2013(11)
- [4]自体种子干细胞体内成骨研究[D]. 韩雪松. 昆明医科大学, 2013(01)
- [5]自体外周血EPCs与BMSCs联合PDPBB构建微血管化生物骨[D]. 赵娴. 昆明医科大学, 2013(12)
- [6]同种异基因成骨细胞组织工程骨移植修复兔桡骨骨缺损免疫反应的初步研究[D]. 盘荣贵. 广西医科大学, 2012(09)
- [7]构建同种异体组织工程骨及修复大动物骨缺损的实验研究[D]. 武京国. 北京协和医学院, 2012(11)
- [8]同种异体BMSCs抗原性对兔桡骨缺损修复的影响[D]. 赵凯. 辽宁医学院, 2011(01)
- [9]bFGF基因修饰的MSCs细胞复合β-磷酸三钙修复骨缺损实验研究[D]. 马雷. 新疆医科大学, 2010(08)
- [10]长期冻存后同种异体骨髓基质干细胞修复颅骨标准骨缺损的实验研究[D]. 解芳. 中国协和医科大学, 2010(11)