一、胚胎及离体上皮-间质转分化及其在肾脏疾病中的意义（论文文献综述）
王晓玲[1]（2021）在《β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录因子调控肝星状细胞改善肝脏纤维化的机制研究》文中进行了进一步梳理肝纤维化是肝脏组织急性或慢性细胞损伤引起的可逆性伤口愈合反应,反映了肝脏修复和瘢痕形成之间的平衡[1]。目前肝脏慢性纤维化疾病的总负担不断增长,全世界每年约有200万人因此死亡[2,3]。然而,尽管对纤维化病理生理机制取得了实质性进展,但在确定抗纤维化靶点并转化为有效治疗方面仍为空白[3,4],因此,减轻或逆转肝纤维化的研究具有直接的临床意义[5]。肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）作为肝纤维化发病机制的主要调节因子,旁分泌或自分泌转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）,调控肝纤维化过程中胶原纤维等细胞外基质的合成、沉积、降解[4,6,7]。近期研究表明,TGF-β/SMAD信号通路中,SMADs需要与其它DNA结合转录因子相互作用,即β-catenin与T细胞因子（T cell factor,TCF）、叉形头转录因子O1（Forkhead box O1,FOXO1）和乏氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1,HIF-1）相互作用,调控TGF-β/SMAD信号通路,其相对活性取决于结合β-catenin的“转录伴侣”[8]。当β-catenin与TCF结合时,促进细胞增殖和纤维化[9],然而在与FOXO1结合后,发挥抗增殖、促凋亡、促进细胞在氧化应激下的存活[10,11]。在人类结肠癌细胞中发现FOXO1与TCF竞争结合β-catenin[12],在肾脏纤维化的研究中发现[8],β-catenin/FOXO1转录复合物形成可以促进TGF-β诱导的调节性T细胞（regulatory T cells,Tregs）foxp3的表达[8,13],发挥抗炎作用,然而β-catenin不同“转录伴侣”在HSCs及其肝脏纤维化中的作用仍不清楚。因此,本研究从细胞、动物、人体多水平,正向、反向多角度探讨TGF-β信号通路转录因子β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1调控HSCs增殖活化的作用机制,并在体内实验中探讨转录因子复合物β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1对HSCs增殖活化、细胞外基质沉积、肝脏组织免疫调节的作用及其机制,发现转录因子复合物TCF、FOXO1竞争结合β-catenin,可以调节TGF-β促纤维化生物学效应开关,导致不同的生物事件结局,为精准靶向抑制肝脏纤维化的临床研究提供基础及思路。目的:1.结合细胞水平和动物水平实验,阐明肝脏纤维化过程中,TGF-β信号通路中β-catenin与不同“转录伴侣”FOXO1、TCF形成的不同转录因子复合物在肝纤维化病程中的作用机制;研究通过调控HSCsβ-catenin转录因子复合物,启动TGF-β多重生物学效应开关,导向不同生物学事件结局的思路在改善肝脏纤维化中的应用。2.在人体肝纤维化组织中分析β-catenin与不同“转录伴侣”FOXO1、TCF形成的不同转录复合物β-catenin/FOXO1、β-catenin/TCF与纤维化进展之间的关系,丰富肝纤维化疾病进展的病理生理基础,为肝纤维化的治疗提供了新的思路和策略,为进一步探索其在肝脏以及其它器官纤维化治疗中的临床应用提供支撑。方法:1.体外实验:人肝星状细胞LX2体外培养,分对照组、TGF-β诱导分化组、TGF-β诱导分化+ICG-001干预组、TGF-β诱导分化+ICG-001+AS1842856组通过Western Blotting、RT-q PCR检测各组细胞外基质α-SMA和COL-I水平以及HSCs细胞周期、氧化应激功能,应用Western Blotting、Co IP、PLA方法分析HSCs活化后,各组β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录复合物水平变化。2.体内实验:根据肝纤维化的不同病因,构建四氯化碳（CCl4）和胆总管结扎（BDL）两种肝纤维化小鼠模型,观察小鼠肝脏外观,速率法检测丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶,同时对肝纤维化不同时期进行肝脏组织切片、染色,提取RNA及逆转录、RT-q PCR,分析肝纤维化小鼠模型不同时期的纤维化以及炎症因子水平,判断不同模型的干预时间;采用邻位连接技术（PLA）分析肝纤维化不同时期β-catenin转录复合物变化规律。3.在以上实验的基础上,对两种肝纤维化小鼠模型应用β-catenin/TCF抑制剂ICG-001进行干预,分别设立对照组、模型组、ICG-001干预组,观察小鼠肝脏外观,计算肝重、体重比,应用小鼠肝酶血清学水平检测、组织学染色、免疫组化、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和1型胶原蛋白（COL-1）RNA表达水平检测相结合的方法,评价ICG-001干预后是否抑制小鼠肝脏纤维化,并应用ELISA方法检测了BDL各组肝脏组织炎症因子IL-10、IL-17、TNF-α、IL-6水平。4.为正反两个角度进一步探索TGF-β信号通路转录因子复合物在抑制肝脏纤维化中的作用机制,BDL小鼠肝纤维化动物模型中增加TGF-β组、FOXO1抑制剂干预组,采用免疫组化、Western blotting、RT-q PCR、Co IP、PLA实验,分析以β-catenin为核心的转录复合物β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1之间的转换关系;应用组织免疫荧光共定位、组织HSCs特异细胞PLA实验分析体内TGF-β信号通路转录因子复合物对HSCs细胞的作用,并应用RT-q PCR检测了foxp3、TNF-α、P27kip1表达水平。5.最后在胆道闭锁患者不同肝纤维化分期的肝脏组织中开展免疫组化、RTq PCR、PLA实验,分析人体肝脏组织中TGF-β水平、细胞增殖水平、IL-10、β-catenin/FOXO1、β-catenin/TCF与肝纤维化分期是否相关,为重新定向TGF-β信号通路转录因子复合物β-catenin/FOXO1、β-catenin/TCF治疗肝纤维化的临床策略提供依据。结果:1.体外实验:β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1参与肝星状细胞的增殖活化1.1β-catenin/TCF抑制剂ICG-001干预活化的LX2细胞,WB结果显示,ICG-001组LX2细胞α-SMA蛋白表达水平与TGF-β组相比显着下降;ICG-001+AS1842856组与ICG-001组比较,α-SMA蛋白表达水平显着高于ICG-001组;而ICG-001组与对照组相比,α-SMA蛋白表达水平差异不具有统计学意义,ICG-001+AS1842856组与TGF-β组相比,α-SMA表达水平差异不具有统计学意义。说明ICG-001可以抑制活化的HSCs转分化为肌成纤维细胞。1.2 Mn SOD、p27kip1 RT-q PCR结果显示,ICG-001组LX2细胞Mn SOD、p27kip1表达水平的变化趋势与α-SMA、COL-I WB结果相反。说明ICG-001干预活化的HSCs使HSCs细胞周期阻滞,抗氧化应激水平增强。1.3以β-catenin作为Co IP抗体的免疫共沉淀结果显示,ICG-001组与TGF-β组相比,β-catenin结合的TCF水平显着下降,FOXO1水平显着升高。β-catenin、TCF、FOXO1 PLA结果显示,ICG-001组LX2细胞β-catenin/TCF互作与TGF-β组相比显着下降,β-catenin/FOXO1结果与β-catenin/TCF相反。综合与β-catenin结合的TCF、FOXO1水平,应用TF ratio（β-catenin/TCF versusβ-catenin/FOXO1）指标分析各组之间转录因子水平的差异,结果显示TF ratio水平变化趋势与LX2细胞活化的特异性标记物α-SMA表达水平一致,LX2细胞的活化与TF ratio水平升高密切相关。以上结果说明β-catenin/TCF可以促进TGF-β诱导的HSCs增殖、活化。2.体内实验;小鼠肝纤维化动物模型以及β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1与肝纤维化病程关系初探2.1 CCl4肝纤维化小鼠模型在造模4w时,ALT、AST水平达到最高,随着造模时间延长,6w、8w时点ALT、AST水平呈现下降趋势;小鼠肝脏组织HE染色、网状纤维染色结果显示,在造模4w时纤维组织增生逐渐显着,网状纤维增粗、断裂,纤维间隔初步形成,随着造模时间延长,纤维间隔显着;小鼠肝脏α-SMA免疫组织化学结果显示,随着CCl4注射时间延长至4w,α-SMA表达水平与对照组相比显着升高。小鼠肝脏组织IL-6、TNF-αm RNA表达水平在模型4w时达到高峰,foxp3表达水平在模型初期逐步增加,6w时达到高峰,8w时下降。2.2 BDL肝纤维化小鼠模型BDL术后1w,ALT、AST与Sham相比显着升高,术后2w时达到顶峰,术后3w、4w呈现下降趋势;小鼠肝组织HE染色、网状纤维染色、Masson染色、亮绿-天狼星红染色分别从炎症细胞浸润、网状纤维、胶原纤维增生不同维度检测结果显示,BDL术后1周可见毛细胆管增生,汇管区增大,肝细胞轻度水肿变性,少量中性粒细胞及淋巴细胞浸润,随着术后时间延长,可见局灶性坏死,毛细胆管数量增多,肝细胞空泡样变加重;小鼠肝脏α-SMA免疫组织化学结果显示,BDL术后1w汇管区α-SMA表达水平与对照组相比显着增加,随着BDL术后胆总管结扎时间延长,α-SMA表达水平持续升高,。小鼠肝脏组织TNF-αm RNA表达水平在模型1w、2w、3w时逐步上升,foxp3表达水平在模型初期逐步增加,2w、3w时显着升高。以上结果说明CCL4、BDL两种不同机制导致的小鼠肝纤维化模型分别在造模4w、1w时即出现炎症细胞浸润,纤维组织增生。2.3 CCL4、BDL模型不同时期对小鼠肝脏石蜡组织切片进行原位PLA实验,检测β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录复合物在病程不同阶段的变化,结果显示β-catenin/TCF水平在CCl4造模4w时显着增高,β-catenin/FOXO1则在对照组呈现最高水平,在CCl4造模4w时显着下降;β-catenin/TCF水平在BDL手术造模1w时显着增高,β-catenin/FOXO1则在对照组呈现最高水平,术后1w时下降。说明在两种模型中β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录复合物水平与肝纤维化病程相关。3.抑制β-catenin/TCF改善CCL4、BDL小鼠模型肝纤维化3.1 CCl4、BDL肝纤维化小鼠模型分别应用ICG-001干预1w、2w,对肝脏外观、肝重/体重比、肝酶、组织学、α-SMA、COL-I m RNA及蛋白水平进行了比较,结果显示,CCl4、BDL模型中ICG-001干预1w时,肝重体重比较模型组无显着差异,干预2w时,肝重体重比与模型组相比显着下降。两种模型1w、2w干预组小鼠血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）与模型组相比均显着下降。CCl4模型肝脏组织HE染色、网染结果显示,ICG-001组与同期CCL4模型组相比,炎性细胞浸润减少,纤维间隔包绕肝细胞团与同期模型组相比减少。BDL模型肝脏组织HE、Masson、网状纤维、天狼星红染色结果显示,ICG-001组与同期BDL模型组相比,毛细胆管增生及纤维化减少,炎性细胞浸润减轻,I型胶原、III型胶原数量显着降低,网状纤维断裂、肝细胞板增厚程度减轻;BDL模型天狼星红染色半定量结果显示,ICG-001组胶原沉积显着低于同期模型组。RT-q PCR结果显示两种模型ICG-001组2w时COL-I、α-SMA阳性比例与同期模型组相比显着下降。免疫组化结果显示CCl4模型ICG-001组COL-I水平显着低于同期模型组,干预2w COL-I水平与干预1w时相比显着下降;BDL模型ICG-001组α-SMA水平显着低于同期模型组,干预2w时α-SMA水平与干预1w相比显着下降。以上结果说明抑制β-catenin/TCF 1w或2w,均可改善肝纤维化。3.2 CCl4、BDL模型在ICG-001干预后foxp3水平与模型组相比显着升高,p27kip1水平与模型组相比显着升高。3.3 BDL模型,ICG-001干预2w时,IL-6水平与同期模型组相比显着下降;TNF-α、IL-17变化趋势与IL-6一致,IL-10则显着增加。4.BDL模型研究β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1调控肝纤维化的分子机制4.1 BDL模型中,腹腔注射AS1842856抑制FOXO1后,免疫组化、WB检测小鼠肝脏组织α-SMA水平,结果显示,应用AS1842856干预后,α-SMA水平显着增加,肝脏纤维化加重;当在ICG-001基础上应用AS1842856干预时,α-SMA阳性细胞数与ICG-001组相比显着增加。α-SMA和COL-I WB及半定量分析结果显示:术后给予ICG-001,α-SMA和COL-I蛋白表达水平与BDL组相比显着下降,在此基础上应用AS1842856,α-SMA和COL-I蛋白表达水平与ICG-001组相比显着增加。4.2各组小鼠肝脏组织核蛋白IP实验结果显示BDL组与Sham组相比,β-catenin/TCF升高、β-catenin/FOXO1降低,ICG-001干预后,与Sham组趋于一致,在此基础上应用AS1842856,β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1与Sham组相比均显着下降。各组小鼠肝脏组织石蜡切片进行PLA实验,结果显示各组TCF、FOXO1与β-catenin互作的变化趋势与肝脏核蛋白Co IP实验结果基本一致,BDL术后以及TGF-β的作用下,β-catenin、TCF互作呈现增长趋势,而β-catenin、FOXO1互作显示下降,与肝脏纤维化进展相关。ICG-001干预后β-catenin、TCF结合减弱,β-catenin、FOXO1结合增强,而在ICG-001+AS1842856组,β-catenin与TCF、FOXO1的互作关系均减弱,与肝脏核蛋白Co IP实验结果一致。4.3组织免疫荧光结果显示BDL模型组HSCs增殖活化水平显着高于Sham组,ICG-001组显着低于模型组,TGF-β组HSCs数量及活化较BDL模型组增强,ICG-001干预TGF-β组HSCs增殖活化水平显着下降,与ICG-001组相比无显着差异。BDL模型组HSCs细胞β-catenin/TCF ligation与Sham组相比显着增加,ICG-001干预后与BDL组比较显着下降;TGF-β组β-catenin/TCF与BDL组相比显着增加,ICG-001干预TGF-β组,β-catenin/TCF ligation较TGF-β组显着下降。β-catenin/FOXO1ligation BDL组显着低于Sham组,ICG-001干预后与BDL组比较显着升高;TGF-β组β-catenin/FOXO1与BDL组相比显着增加,ICG-001干预TGF-β组,β-catenin/FOXO1 ligation较TGF-β组显着升高。TF ratio作为β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1的比值,可以综合评价与β-catenin竞争结合的TCF、FOXO1之间的动态变化,BDL模型组HSCs细胞中TF Ratio与Sham组相比显着增加,ICG-001干预后与BDL组比较显着下降;TGF-β组与BDL组相比无显着差异,ICG-001干预TGF-β组,TF Ratio较TGF-β组显着下降,与ICG-001组无差异。结合本部分2.1结果显示TF ratio下降,肝纤维化程度减轻,反之则加重。4.4 BDL模型组小鼠肝脏组织RT-q PCR结果显示TNF-α、foxp3表达水平与Sham组比较显着升高,ICG-001干预后TNF-α显着下降,foxp3进一步增加,在ICG-001基础上应用AS1842856抑制FOXO1后,TNF-α水平显着升高,foxp3表达下降。4.5 ICG-001干预后p27kip1水平与BDL模型组相比显着升高,在ICG-001基础上应用AS1842856抑制FOXO1后,p27kip1水平发生显着下降。5.人体肝脏组织β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录复合物与纤维化进展的关系5.1经过彩色多普勒超声初诊,腹腔镜胆囊插管造影确诊的16例胆道闭锁以及其它患者,依据HE、Masson、天狼星红染色结果进行纤维化程度的Ishak评分分期,其中0期3例,1期4例,2期、3期、4期各3例。5.2不同分期患者肝脏组织Masson染色、IL-10、Ki67半定量分析结果显示,肝脏组织纤维化程度逐渐加重,IL-10水平S0-S2期显着升高,细胞增殖S2-S4期显着增强,这些指标均与TGF-β表达水平逐渐升高相关。5.3患者肝脏组织石蜡切片PLA结果显示,S0、S1、S2、S3期β-catenin/TCF ligation S0-S2期逐渐增多;β-catenin/FOXO1 S0期最高,S0-S2期逐渐下降;TF ratio与患者肝脏纤维化程度变化趋势一致。结论:1.体外人肝星状细胞LX2实验中,TCF、FOXO1竞争结合β-catenin,形成不同转录因子复合物,调控TGF-β诱导的LX2转分化及细胞周期、氧化应激水平。2.体内动物实验中,TGF-β通路下游转录因子TCF、FOXO1同样存在竞争结合β-catenin;β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1作为TGF-β通路不同生物学效应的开关导致促纤维化和抗炎、细胞抑制--不同的生物学事件结局。体内通过调控HSCs TF ratio,可以抑制HSCs细胞的增殖活化,减少细胞外基质沉积,同时调节肝脏组织免疫反应,减轻组织慢性损伤,改善肝纤维化。3.β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1相对水平即TF Ratio水平升高与BA患者肝脏纤维化病程早期进展相关。
周莹莹[2]（2021）在《S-烯丙基巯基半胱氨酸包合物的制备及用于治疗糖尿病肾病的初步药学研究》文中研究指明糖尿病发病末期所导致的肾病（DN）是一种急性微血管型末期肾脏慢性疾病临床并发症,主要临床表现是因为由体内发生高血糖新陈代谢功能障碍而改变引起的,它同时也被研究认为可能是目前我国急性糖尿病最常见和高发率的临床治疗并发症之一,从当前临床发病情况分析来看,由于这种发病原因很有可能会直接导致并发终末期急性肾脏病和慢性末期肾脏病。组织间质切片从医学临床上的病理学和生理学上的角度进行分析,一般肾病突出的临床特点之一就是良性肾间质小球基底膜逐渐扩大增厚,肾间质小球逐渐扩张,结节性间质硬化,肾间质小球良性硬化,间质性硬化,炎症反应和肾小管发生萎缩等。据2019年统计结果显示,我国约有1.16亿人口为成人糖尿病病人,最终发展为糖尿病肾病的糖尿病病患比例约为25%至40%。糖尿病肾病不但让病者的正常生产工作和日常生活有较大的发病风险和精神影响,而且还给病者及他们的家人带来了严重的社会和经济负荷。目前,对于直接治疗糖尿病所引发的终末期肾脏疾病的药物在市场上几乎没有,主要采取联合使用降低血糖、降血压和降血脂药物,肾透析肾移植手术等方法。因此,开发出一种药物直接用于医治糖尿病肾脏疾病的需求十分迫切。大蒜作为食药同源的传统中草药,已经被证明具有多种药理活性成分,具有特别的药用价值。从老蒜中分离提取出来的有机硫等一些具有活性的有效成分已经成为目前我国中药和西药研究的热点,其中SAMC（S-烯丙基巯基半胱氨酸）是一种微溶于水的有机硫化物,从蒜头中提取出来。大量文献研究表明,SAMC具有抗氧化应激、抗炎、抗肿瘤、抑制粘液分泌、保肝、治疗顺铂所导致的肾损伤以及治疗急性肺损伤的作用。尽管SAMC具有较为良好的药用价值,但由于SAMC在水相和有机相的溶解度都较低,无法达到体内给药的有效剂量,SAMC的应用并没有得到有效广泛的发展。基于此,本实验课题拟通过制备SAMC的给药剂型从而提高SAMC的溶解度,达到体内外所需的给药水平,进而探究SAMC对于治疗糖尿病肾病所导致的肾纤维化作用的药效与相关分子生物学作用机制。本课题研究的实验内容主要包罗下列三个部分:（1）SAMC环糊精包合物（SAMC-β-CD）的制备与表征;（2）SAMC体外抗肾纤维化作用及其相关分子生物学作用通路的探究;（3）SAMC-β-CD体内对于糖尿病肾病引起的肾纤维化的治疗作用及作用机制的研究。1、SAMC-β-CD的制备与表征:此项研究部分包括建立了 SAMC原料药含量测定方法学的建立、筛选稳定剂、制备SAMC-β-CD的制备工艺、以包合率作为指标筛选最优良的处方、SAMC-β-CD包合物的表征以及溶解度实验验证包合作用对SAMC在水中溶解程度的影响;首先通过HPLC建立了 SAMC的标准曲线并用于含量测定与后期的处方筛选;通过稳定剂筛选,实验结果显示PVP-K30是较为适宜的稳定剂,以β-环糊精作为包合材料和PVP-K30作为稳定剂对SAMC进行包合后,通过单因素筛选,进HPLC测定包合率的方法筛选出最优良的处方,实验结果表明β-环糊精与SAMC的最适宜比例为10:1,SAMC-β-CD与PVP-K30的最佳比例为3:1;SAMC-β-CD包合物形成的验证采取红外光谱分析方法（FT-IR）、差式扫描量热法（DSC）的表征方式;通过溶解度实验证明了 SAMC原料药制备成SAMC-β-CD包合物能增加其溶解度。2、SAMC体外抗肾纤维化作用及其相关分子生物学作用通路的探究:此项研究部分主要由体外肾纤维化模型的建立、测定细胞增殖蛋白的表达、分子信号通路的研究三个模块组成。实验方法主要是将大鼠肾系膜细胞（RMC）培养在高浓度的葡萄糖环境中,从而建立体外肾纤维化模型,观察肾纤维化细胞形态及MTT法对肾纤维化细胞活力进行测定,筛选出了最佳葡萄糖建模浓度为30 mM,最适宜的SAMC给药浓度范围在5-100 μM之间,进而选定10、25、50μM为低中高给药浓度;采用Western blot法测定相关蛋白通路,以及纤连蛋白Fibronectin和增殖细胞核抗原PCNA的表达。实验结果显示出,经过SAMC的治疗,显着降低了纤连蛋白Fibronectin和增殖细胞核抗原PCNA的表达,而机制通路研究证明SAMC可以抑制RMC细胞的增殖,可以通过影响NF-κB p65机制通路来实现,说明SAMC在体外具有抗增殖及治疗肾纤维化作用。3、SAMC-β-CD对于糖尿病肾病引起的肾纤维化的治疗作用及作用机制的研究:此项研究部分主要包括糖尿病肾病小鼠模型的建立、SAMC-β-CD对糖尿病肾病小鼠肾纤维化的治疗作用、肾脏病理组织切片检查、相关分子生物学作用机制的研究。在该临床实验中,将130mg/kg的链脲佐菌素（STZ）一次性大剂量地注射到模型小鼠的腹膜腔中,用于创建患有糖尿病性肾病的模型小鼠,注射建模药物72 h后,对所有小鼠禁食不禁水8 h,剪尾法检测空腹血糖,选择空腹血糖≥11.0 mmol/L的小鼠进行分组;每间隔一周检查一次体重和空腹血糖。同时SAMC-β-CD（50、100mg/kg）灌胃干预8周,依那普利（1.5 mg/kg）作为阳性药。第7周,收集一个24h小鼠尿液被应用于计算和测定一个小鼠尿中微量白蛋白水平;8周后处死小鼠,心脏灌流后收集左肾以左叶片染色时可用于观察小鼠的形态学改变、系膜扩张、细胞外基质沉积以及糖原累计情况;收集一只小鼠的血清,进行体内肾功能参数的测定;通过Western blot方法探索其中有关的分子生物学反应机制。研究结果表明,给予SAMC-β-CD后能明显改善肾系膜纤维化,从Masson染色结果观察到肾系膜扩张现象有所缓解,PAS染色结果显示SAMC-β-CD大大降低了葡萄糖原的累积;同时尿中微量白蛋白程度也有所减少,有效地缓解了白蛋白尿现象;肾功能参数血清肌酐（SCr）、血清尿素氮（BUN）均可有所减少;总甘油三酯（TG）、总胆固醇（T-CHO）的减少说明由于体内高血糖浓度超出了正常体内水平导致脂质代谢紊乱的情况已经有所改善;ELISA试剂盒测定IL-1β、IL-6的表达水平及其RT-PCR法测定炎症因子在基因水平的表达,发现SAMC-β-CD能在体内发挥抗炎症反应的作用;Western blot测定结果表明,SAMC降低了细胞外基质标志蛋白 fibronectin、collagen-Ⅰ、E-cadherin、vimentin 的表达,进而显示 SAMC 抗肾纤维化的疗效与影响上皮-间质转分化（EMT）相关。从上游的信号通路途径来看,SAMC-β-CD一方面可以通过影响LRP5/6的表达从而影响Wnt 3a/β-catenin信号通路,另一方面通过抑制NF-κB p65/HIF-1α上游传输通路,调控下游的转录因子Snail影响EMT的过程主要是通过两条信号通路共同作用。综上所述,本实验课题为了增加SAMC在水中的溶解度达到体内所需的给药剂量,设计制备了 SAMC-β-CD,筛选出最佳工艺处方并对制剂进行了表征。采用葡萄糖刺激,建立了体外肾纤维化模型,考察验证了 SAMC对于抗细胞增殖治疗肾纤维化的作用效果及其作用机制。使用STZ建立体内糖尿病肾病模型,证明SAMC-β-CD可以有效缓解糖尿病肾病所引起的肾纤维化和炎症反应,其作用机制主要是通过降低LRP5/6的表达抑制Wnt3a/β-catenin途径的激活,同时抑制NF-κB p65/HIF-1α信号通路的激活,两条信号途径共同调控EMT进程降低ECM积累,抑制STZ所导致的糖尿病肾病而引起的肾脏纤维化。
张欢[3]（2021）在《SAHA通过调控TGFβ/Smad信号通路在结晶肾损伤模型EMT中的作用及机制研究》文中研究表明慢性肾脏病已经成为一个全球的公共卫生问题,随着终末期肾衰患者的逐年增长,对我国的医疗和经济形成了巨大的负担。梗阻性肾病是引起肾功能衰竭的重要病因,最常见的病因为泌尿系结石,其中主要的成分为草酸钙结石。随着病程迁延反复,结石所导致的梗阻性肾病已成为慢性肾脏病进展的主要病因之一。草酸钙是泌尿系结石的主要组成成分,草酸钙结石占泌尿系结石的80%以上。然而关于肾脏草酸钙结石形成的机制目前仍不十分明确,可能有多种因素参与结石形成,涉及免疫、氧化应激、肾乳头钙斑、多因素等,这些机制研究认为多种因素参与导致的肾小管损伤可能进一步促进结晶的成核、沉积。因此,肾小管损伤可能成为研究肾结石形成一个新的方向。我们结石团队前期的研究结果提示早在草酸钙结晶形成期,既有氧化应激、细胞凋亡、自噬的参与,亦发现有肾小管上皮细胞间质转分化（epithelial mesenchymal transition EMT）的发生,这些因素相互影响可进一步导致肾间质纤维化,加重肾脏病的进展。在此基础上,本课题拟进一步研究在草酸钙结晶形成期,在肾小管上皮细胞损伤发生改变的进程中TGFβ/Smad信号通路的作用,是否可通过乙酰化/去乙酰化的调控通过TGFβ/Smad信号通路抑制结晶肾损伤EMT的发生,延缓肾纤维化的进程,为临床治疗提供新的思路和理论基础。第一部分:基因芯片技术分析TGF-β对于肾小管上皮细胞的作用目的:通过基因芯片技术分析TGF-β刺激HK2细胞,筛选出差异表达基因,然后进一步进行下游的生物信息学分析,筛选和分析TGF-β1对于肾小管上皮细胞的作用和影响。方法:1.运用GEO自带的GEO2R工具对HK-2细胞的48小时对照组和TGF-β1处理组（每组各三个独立重复样本）进行差异基因分析,并且下载R语句在R4.0.3环境中进行进一步整理分析,筛选DEGs。2.使用Benjamini and Hochberg（BH）法将p值调整为错误发现率（false discovery rate,FDR）,并选取FDR<0.05而且log fold change绝对值（|log FC|）>2作为阈值,得到该数据集的DEGs。3.用STRING11.0（https://string-db.org/）进行DEG编码蛋白的相互作用网络分析。结果:1.使用基因芯片技术,从TGFβ刺激的HK2细胞GSE20247数据集中筛选出269个DEGs,其中TGF-β1处理组上调表达基因112个,下调表达基因157个。2.从TGFβ刺激的HK2细胞基因表达谱芯片分析,DEGs分析与GSEA分析发现与TGFβ1/SMAD通路以及EMT相关的24条功能信号通路在TGF-β1处理以后的HK-2细胞中富集。结论:通过对两组基因表达数据的基因芯片分析,与TGFβ1/SMAD通路以及EMT相关的功能信号通路在TGF-β1处理以后的HK-2细胞中富集,所以TGFβ1是肾小管上皮细胞HK2发生EMT现象的重要刺激因素,TGFβ1/Smad通路是其关键通路。第二部分:草酸钙结晶肾损伤模型的构建目的:研究构建合适的草酸结晶肾体外模型,观察TGFβ1/Smad如何参与肾小管上皮细胞损伤的进程,是否可通过调控TGFβ1/SMAD通路从而抑制结晶肾损伤EMT的发生,延缓慢性肾纤维化的进程。方法:1.使用流式细胞技术检测不同浓度草酸钠刺激HK2细胞,HK-2细胞凋亡、线粒体膜电位、胞内ROS的影响;2.不同作用时间条件下,草酸钠对HK2细胞凋亡的影响;3.检测时间梯度、浓度梯度下,HK-2细胞EMT通路相关蛋白表达变化。4.检测草酸钠结晶肾损伤细胞模型中TGFβ/Smad通路蛋白的表达情况。结果:1.流式细胞检测结果显示,随着不同草酸钠浓度（0m M、0.5m M、1m M、2m M、4m M）逐渐增加,细胞凋亡逐渐增加,与空白对照组比较p<0.05。2.当设定草酸钠浓度为1m M时,随着草酸钠作用时间的延长,HK2细胞凋亡明显增加,与对照组相比差异有统计学意义（p<0.05）。3.Smad2、Smad3、Smad7、HDAC1、TGFβ1、TGFBR等基因表达的差异。与空白对照组HK-2细胞相比,Smad2呈现上调,Smad3呈现上调,Smad7自0.5m M浓度草酸钠处理后细胞上升后,后出现浓度梯度依赖的下调。HDAC1、TGFβ、TGFBR均出现草酸钠浓度依赖的上调。4.经过不同时间1m M草酸钠培养液培养后,与空白对照组相比,Smad7呈现下调,作用至12h后,出现上调,但对比空白组仍是下调（p<0.05）。HDAC1呈现上调,TGFβ、TGFBR均出现时间依赖的上调（p<0.05）。上皮细胞标志物E-cadherin呈现时间依赖的下调。间质标志物Vimentin呈现时间依赖的上调。4.1m M草酸作用HK2细胞24小时条件下,Smad2/3、TGFβ的蛋白水平随着草酸刺激时间延长而逐渐上调,上皮细胞标志物ZO-1随着草酸作用时间延长而逐渐下调。结论:中等浓度的草酸（1m M）刺激24小时HK-2细胞可能是比较适宜的结晶肾损伤模型的条件,在这个过程中,出现了TGFβ/Smads信号通路相关蛋白的表达增加,以及EMT的发生。在模型中,随着草酸作用时间的增加,HDAC1表达随之增加。第三部分:SAHA调控TGFβ/Smad信号通路影响草酸钙结晶肾损伤模型中EMT表达目的:探讨通过SAHA对其调控,抑制TGF-β/Smad信号传导,减少EMT,保护肾纤维化。方法:流式细胞学检测去乙酰化酶抑制剂SAHA对结晶肾损伤模型细胞凋亡的影响。westernblot检测SAHA对结晶肾损伤模型TGFβ/Smad通路的影响。Westernblot及免疫荧光检测SAHA对结晶肾损伤模型EMT的影响。结果:1.在草酸刺激HK2细胞结晶肾损伤模型中,相对空白对照组,TGFβ/Smads信号通路蛋白出现了明显的上调,并且导致肾小管细胞失去了上皮细胞形态,出现了上皮标志物下调,间质标志物上调的EMT现象。2.去乙酰化酶抑制剂SAHA通过下调TGFβ/Smads信号通路,改善了模型组出现的EMT现象。结论:SAHA可以通过下调TGFβ/Smads信号通路,改善草酸刺激HK2结晶肾损伤模型的EMT现象,改善肾纤维化。
胡进秀[4]（2021）在《ESRP1和NOX4在人气道上皮间质转分化的机制研究》文中研究指明目的:探索烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（NOX4）、上皮剪切调控蛋白1（ESRP1）的表达与慢性阻塞性肺疾病（COPD）上皮间质转分化（EMT）的机制研究。方法:1、经宁夏医科大学总医院伦理委员会批准,收集2015年1月--2017年12月宁夏医科大学总医院心胸外科因肺部肿瘤需行肺叶切除术的病人,根据术前支气管扩张剂后肺通气功能结果分为对照组（20例）和COPD组（16例）。术中获取病灶远端的正常肺组织标本,通过HE染色观察COPD组及对照组小气道形态学的改变;用免疫组织化学法检测COPD组及对照组肺组织中纤维连接蛋白（fibronectin,FN）)及E钙粘蛋白（E-cadherin,E-ca）的表达情况;经过ELISA检测COPD组及对照组外周血血清8-异前列腺素F2α（8-Isoprostaglandin F2α,8-iso-PGF2α）和总抗氧化能力（Total antioxidant capacity,T-AOC）表达情况;2、体外培养人气道上皮细胞系（16HBE）,用转化生长因子β1（TGFβ1）作用细胞,采用免疫印迹检测上皮剪切调控蛋白1（Epithelial splicing regulatory protein1,ESRP1）、NOX4及细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）标志物（平滑肌肌动蛋白（Alpha-smooth muscle actin,α-SMA）、N钙粘附蛋白（N-cadherin,N-ca）和FN）表达水平;利用si RNA、慢病毒干预16HBE细胞,分别敲低、过表达ESRP1和NOX4,采用免疫印迹检测ESRP1、NOX4的表达以及ECM标志物（α-SMA、N-ca和FN）的表达情况;采用流式细胞术测检测细胞内活性氧簇（Reactive oxygen species,ROS）的表达情况。结果:1、COPD组及对照组小气道形态学的改变;常规病理HE染色观察COPD组小气道病理改变:COPD组气道上皮细胞增生明显,上皮细胞排列紊乱,小气道平滑肌细胞增生。2、COPD组及对照组小气道上皮细胞EMT相关蛋白表达情况:COPD组间质标志物FN较对照组明显升高（（0.072±0.058）和（0.156±0.043）,P=0.035）;上皮标志物E-ca较对照组明显降低（（0.256±0.067）vs（0.142±0.068）,P=0.016）。3、COPD组与对照组外周血血清中8-iso-PGF2α和T-AOC表达情况:COPD组血清中8-iso-PGF2α表达高于对照组（（45.91±21.17pg/ml）vs（29.74±15.88）,P=0.013）;COPD组血清中T-AOC表达低于对照组（（8.49±3.43U/ml）vs（13.35±4.28）,P=0.001）。4、16HBE在TGFβ1作用下ECM标志物及ESRP1、NOX4表达情况:TGFβ1不同浓度和不同时间作用16HBE细胞,免疫印迹检测ECM标志物FN、α-SMA、N-ca的蛋白水平均高于对照组（P<0.05）,且ESRP1、NOX4的蛋白水平亦均高于对照组（P<0.05）。5、采用si RNA敲低ESRP1,观察16HBE在TGFβ1作用后ECM标志物、NOX4及ROS的表达情况:ESRP1-si RNA敲低16HBE细胞ESRP1表达,免疫印迹检测TGFβ1对si ESRP1组FN、N-ca和α-SMA的蛋白表达的影响。结果显示:si ESRP1组FN、N-ca和α-SMA的蛋白表达较Control组降低（P<0.05）,NOX4的蛋白表达水平较Control组亦降低（P<0.05）;si ESRP1+TGFβ1组FN、N-ca的蛋白表达水平较TGFβ1组升高（P<0.05）,NOX4的蛋白表达水平较TGFβ1组降低（P<0.05）;流式细胞术检测si ESRP1组细胞内ROS表达水平较Control组降低（P<0.05）;si ESRP1+TGFβ1组细胞内ROS表达水平较TGFβ1组降低（P<0.05）。6、采用慢病毒过表达ESRP1,观察TGFβ1作用16HBE细胞后ECM标志物、NOX4及ROS的表达情况:建立ESRP1慢病毒过表达体系,TGFβ1作用lv-ESRP1细胞72h,免疫印迹检测lv-ESRP1组FN、N-ca、α-SMA和NOX4的蛋白表达情况,结果显示:lv-ESRP1组FN、N-ca、α-SMA和NOX4的蛋白表达较Control组升高（P<0.05）,;lv-ESRP1+TGFβ1组FN、N-ca、α-SMA和NOX4的蛋白表达情况;结果显示:lv-ESRP1+TGFβ1组FN、N-ca、α-SMA和NOX4的蛋白表达较Control组升高（P<0.05）;流式细胞术检测lv-ESRP1组细胞内ROS表达水平较Control组升高（P<0.05）;lv-ESRP1+TGFβ1组细胞内ROS表达水平较TGFβ1组明显升高（P<0.05）。7、采用腺病毒敲低NOX4,观察TGFβ1作用16HBE后ECM标志物、ESRP1及ROS的表达情况:TGFβ1作用sh NOX4的16HBE细胞72h,免疫印迹检测sh NOX4组及对照组FN、N-ca和α-SMA的蛋白表达情况;结果显示:sh NOX4组FN、N-ca和α-SMA的蛋白表达水平较Control组降低（P<0.05）,ESRP1的蛋白表达水平较Control组亦降低（P<0.05）;sh NOX4+TGFβ1组FN、N-ca和α-SMA的蛋白表达水平较TGFβ1组降低（P<0.05）,ESRP1的蛋白表达水平较TGFβ1组亦降低（P<0.05）;流式细胞术检测sh NOX4组细胞内ROS表达水平较Control组降低（P<0.05）;sh NOX4+TGFβ1组细胞内ROS表达水平较TGFβ1组亦降低（P<0.05）。8、采用腺病毒过表达NOX4,观察TGFβ1作用16HBE后ECM标志物、ESRP1及ROS的表达情况:TGFβ1作用OENOX4细胞72h,免疫印迹检测OENOX4组FN、N-ca和α-SMA的蛋白表达水平较Control组升高（P<0.05）,ESRP1的蛋白表达水平较Control组升高（P<0.05）;OENOX4+TGFβ1组FN、N-ca和α-SMA的蛋白表达水平较TGFβ1组升高（P<0.05）,ESRP1的蛋白表达水平较TGFβ1组亦升高（P<0.05）;流式细胞术检测OENOX4组细胞内ROS表达水平较Control组升高（P<0.05）;OENOX4+TGFβ1组细胞内ROS表达水平较TGFβ1组亦升高（P<0.05）。结论:1、COPD患者小气道存在明显的EMT现象,COPD患者小气道上皮细胞中ESRP1低表达、NOX4高表达,提示NOX4和ESRP1参与COPD上皮间质转化的发生、发展。2、COPD患者外周血氧化物质8-异前列腺素F2α较对照组明显增高;抗氧化物质T-AOC较对照组明显降低;TGFβ1明显诱导16HBE细胞内ROS的产生,伴随ROS的产生增多,16HBE细胞出现明显的EMT.,提示氧化应激参与COPD上皮间质转化过程。3、TGFβ1促进人气道上皮细胞NOX4及ESRP1的表达,增加细胞内源性ROS的产生,并诱发EMT现象,提示TGFβ1-ESRP1/NOX4-ROS信号通路可能参与上皮间质转化的机制研究。4、过表达或干扰ESRP的表达均可引起NOX4表达的相应变化,提示ESRP1可能通过某种途径参与NOX4的信号通路调控,但ESRP1和NOX4的相互关系仍需进一步研究。
完颜萍萍[5]（2020）在《慢性间歇性缺氧对肾脏纤维化的影响及相关机理研究》文中认为目的:阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（Obstructive sleep apnea hypopnea syndrome,OSAHS）可引起呼吸暂停反复出现,且多为动脉氧饱和度降低。研究表明,OSAHS引起的心血管和靶器官损伤来源于间歇性缺氧。缺氧可对众多组织造成损伤。临床研究和动物实验均表明OSAHS可引起机体发生炎症反应,并可通过激活机体肾素-血管紧张素系统,介导慢性肾脏疾病（Chronic kidney diaelace,CKD）的发展,其引起的病理变化为肾脏组织的纤维化。目前为止,OSAHS是如何引起肾脏纤维化的具体作用机制还尚未研究清楚。因此,本研究拟采用慢性间歇性缺氧大鼠模型和细胞模型来初步探讨缺氧在肾脏纤维化进展中的作用及其可能机制。方法:1、模型建立及纤维化相关指标的检测:模拟OSAHS的发病特点,建立慢性间歇性缺氧大鼠模型,实验分组为:正常对照组（NC组）、轻度间歇性缺氧组（CIH 1组）、中度间歇性缺氧组（CIH 2组）和重度间歇性缺氧组（CIH 3组）。各实验组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1水平通过Elisa法进行检测;各实验组大鼠肾脏组织病理学变化和胶原分布分别通过HE染色和MAsson染色方法进行观察;CD3和CD68表达通过免疫组化的方法进行检测;α-SMA、IL-1β、Col I和FN表达通过免疫荧光法进行检测;MCP-1、MIP-1β、Col I、FN、TNF-α和IL-1βm RNA表达通过RT-PCR的方法进行检测;MCP-1、MIP-1、Caspase-1和TNF-α蛋白表达通过Western blot的方法检测;2、采用转录组测序技术对正常大鼠和慢性间歇性缺氧模型大鼠肾脏组织进行测序,根据测序结果,筛选出差异表达基因、并对其进行GO功能和KEGG通路富集分析,进一步获得与纤维化相关的差异表达基因,并且通过RT-PCR方法验证其表达水平;3、通过HK-2细胞构建缺氧损伤模型,通过MTT法对细胞活力进行检测,通过Western blot的方法对各组细胞中Aqp1和HIF-1α蛋白表达变化进行检测;通过免疫组化Aqp1在慢性间歇性缺氧诱导的大鼠肾脏组织中的表达进行检测;4、通过对转录组测序数据分析得到Aqp1在慢性间歇性缺氧诱导的大鼠肾脏组织中显着上调,选择该靶基因进行以下研究:TGF-β诱导HK-2细胞纤维化模型,构建Aqp1干扰载体并转染HK-2细胞,转染后的HK-2细胞活力利用MTT进行检测;HK-2细胞中TNF-α、IL-1β、α-SMA和FN m RNA的表达水平利用RT-PCR法检测进行检测;采用免疫荧光技术检测E-cadherin、Fsp1和Vimentin的表达;同时利用western blot对细胞中E-cadherin、Vimentin、Erk、p-Erk和Aqp1等蛋白的表达变化进行检测。结果:（1）Elisa实验结果表明,与NC组比较,CIH 1组大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6、MCP-1和IFN-γ含量未见明显变化,CIH 2组和CIH 3组IL-1β、TNF-α、IL-6、MCP-1和IFN-γ含量明显增加,并且随着缺氧程度的加深,其含量增加越显着;（2）HE染色结果表明,与NC组比较,CIH 1组大鼠肾脏组织未发生明显病理学损伤,CIH 2组大鼠肾脏组织出现轻微损伤,CIH 3组大鼠肾脏组织损伤加重;Masson染色结果表明,与NC组比较,CIH组肾小管周围出现胶原沉积现象,并且随着缺氧程度的加深,胶原沉积越多;（3）免疫组化染色结果表明,与NC组比较,CIH 1组、CIH 2组和CIH 3组大鼠肾脏组织中CD3、CD68、FN和Col I表达均增加,并且随着缺氧程度的加深,其表达水平升高越显着;（4）免疫荧光结果表明,与NC组比较,CIH 1组、CIH 2组和CIH 3组大鼠肾脏组织中IL-1β和α-SMA表达均增加,并且随着缺氧程度的加深,其表达水平升高越显着;（5）RT-PCR结果表明,与NC组比较,CIH 1组、CIH 2组和CIH 3组大鼠肾脏组织中MCP-1、MIP-1β、Col I、FN、TNF-α和IL-1βm RNA表达均增加,并且随着缺氧程度的加深,其表达水平升高越显着;Western blot结果表明,与NC组比较,CIH 1组、CIH 2组和CIH 3组大鼠肾脏组织中MCP-1、MIP-1β、Caspase-1和TNF-α蛋白表达水平表达均增加,并且随着缺氧程度的加深,其表达水平升高越显着;（6）RNA-seq结果表明,较NC组比较,CIH组大鼠肾脏组织中有20个差异表达基因,其中13个显着上调、7个显着下调;结合现有文献,发现Fos、Erg1和Aqp1与肾脏纤维化相关,RT-PCR验证其m RNA在大鼠肾脏组织中的表达,结果与RNA-seq一致;此外,差异表达基因主要被注释到转录调节、血管发育、细胞增殖和细胞分化等GO功能;主要被注释到凋亡、近端小管重碳酸盐回收、肾素血管紧张素系统、钙吸收、肾素分泌等KEGG信号通路上;（7）成功建立HK-2细胞缺氧模型,与正常对照组比较,缺氧12 h、24 h和48 h后,HK-2细胞中HIF-1α和Aqp1蛋白表达均显着升高。对大鼠肾脏组织Aqp1表达水平进行检测,发现较NC组,CIH 1组、CIH 2组和CIH 3组Aqp1表达水平明显增加,并且随着缺氧程度的加深,其表达水平升高越显着;（8）TGF-β成功诱导HK-2细胞发生纤维化,转染Ad-si Aqp1腺病毒后,结果发现,较Model组比较,Aqp1干扰可抑制HK-2细胞增殖,细胞中E-cadherin表达明显升高,Fsp1和Vimentin表达明显降低;TNF-α、IL-1β、MCP-1、α-SMA和FN m RNA水平均显着降低;（9）Western blot实验结果表明,通过与Blank组进行比较,Model组HK-2细胞中蛋白Erk、p-Erk和Aqp1的表达水平升高;通过与Model组进行比较,Ad-si Aqp1组中蛋白Erk和p-Erk的表达水平不具有统计学差异,Vimentin和Aqp1的蛋白水平降低,E-Caherin蛋白水平升高;Ad-si Aqp1+PD98059组、PD98059组的Vimentin、Erk、p-Erk和Aqp1等蛋白水平均降低,E-Cadherin蛋白水平升高;与Ad-si Aqp1组进行比较,Ad-si Aqp1+PD98059组中蛋E-Caherin蛋白水平升高,Erk、p-Erk、Aqp1和Vimentin等的蛋白水平降低;与Ad-si Aqp1+PD98059组进行比较,PD98059组中蛋白E-Caherin蛋白水平降低,Aqp1和Vimentin蛋白水平升高,Erk和p-Erk蛋白水平没有差异。结论:（1）慢性间歇性缺氧可引起大鼠肾脏组织发生纤维化;（2）慢性间歇性缺氧可引起大鼠肾脏组织中基因表达发生改变,其中Fos、Aqp1和Egr1基因与肾脏纤维化关系密切;（3）Aqp1参与TGF-β诱导的HK-2细胞EMT过程;（4）Erk/Aqp1信号通路参与HK-2细胞纤维化发展。
张振浩[6]（2020）在《吡非尼酮调控GSK3-β对UUO大鼠肾纤维化组织WNT/β-catenin通路、FN表达的影响》文中研究说明目的:研究GSK3-β蛋白、WNT/β-连环蛋白（β-catenin）通路及纤维粘连蛋白（fibronectin,FN）在单侧输尿管梗阻（Unilateral ureteral obstruction,UUO）大鼠肾间质纤维化组织中表达以及吡非尼酮对上述因子及通路的影响,进一步探讨GSK3-β蛋白、WNT/β-catenin信号通路及FN蛋白在肾间质纤维化过程中的作用机制。方法:清洁、健康的周龄为6周的Wistar大鼠72只由佳木斯大学动物实验中心统一采购提供,Wistar大鼠体重大约为130±10g,喂养一周使其适应现有环境,一周后随机平均分配为3组:假手术组（Sham组）、UUO组（单侧输尿管梗阻组）、吡非尼酮组（吡非尼酮250mg/kg/d溶于0.9%Nacl溶液2ml灌胃）。UUO组及吡非尼酮组腹腔内注射麻醉（10%水合氯醛0.3ml-0.4ml/100g）,麻醉成功后按操作步骤进行首先剪除手术部位毛发,用碘伏进行手术部位消毒,铺无菌孔巾,用手术刀逐层切开皮肤、皮下组织,钝性分离肌肉层,剪开腹膜进入腹腔使左侧肾脏充分暴露,钝性分离左侧输尿管结扎并切断,检查无漏尿及渗血后,用头孢甲肟反复冲洗腹腔,逐层缝合。正常给与水及饲料喂养,Sham组大鼠仅钝性分离输尿管不进行剪断,其余操作同前。分别于Wistar大鼠手术后第3天、第7天、第14天随机处死8只。消毒后逐层开腹,分离并完整切下左侧肾脏,剥离肾被膜,用4%甲醛溶液进行固定,常规行脱水、包埋、石蜡固定,制成3μm病理切片,准备行HE染色及Masson染色,HE染色后在400x光学显微镜下,每张HE染色切片随机选取10个视野评估肾小管损伤程度采用TIS评分,Masson染色后在400x光学显微镜下,每张片子随机选取10个视野评估纤维化程度,以RIF指数表示。采用免疫组化染色技术检测UUO大鼠肾组织中GSK3-β蛋白、β-catenin以及FN的表达。每张切片放于400x光学显微镜下随机选择10个不同视野,用徕卡显微镜采集系统采集图像,用Image-Pro Plus6.0分析软件计算各组肾组织棕色颗粒的平均光密度值（AOD）,应用SPSS22.0数据处理软件进行统计学处理及分析。结果:1.造模成功后大鼠症状及体征,UUO组大鼠行左侧输尿管结扎离断术后,大鼠随着梗阻时间延长精神状态变差呈现逐渐加重趋势,喜卧少动,活动量逐渐减少,活力也逐渐降低,饲料剩余量逐步增多,饮水量逐渐减少,大鼠四肢水肿逐渐加重,毛发颜色晦暗无光泽也呈现逐渐加重趋势,并出现体重随梗阻时间逐渐增加;Sham组大鼠精神状态、饮食、活力、体重等各方面未见明显改变,应用吡非尼酮治疗组大鼠精神状态、饮食、活力等临床表现较UUO组有所好转,四肢水肿相对减轻,体重较UUO组各时间点减轻。取出Sham组大鼠左侧肾脏,外观无异常,UUO组大鼠左侧肾脏体积随梗阻时间的延长逐渐增大,被膜紧张呈暗红色,梗阻14天后,个别大鼠肾脏被膜下可见坏死,用23号手术刀片沿肾脏冠状面切开,可见肾盂肾盏明显扩张变形,皮髓质受压明显,呈现不均匀变薄,纤维组织增生,个别肾盂肾盏内可见泥沙样结石,严重者可见纤维瘢痕;吡非尼酮组大鼠较UUO组肾脏体积减小,纤维增生减轻。2.HE染色结果:Sham组大鼠肾组织结构未见异常。UUO组各时间点（3d、7d、14d）,肾组织结构出现不同程度改变,术后3天可见肾小管轻度扩张,扩张数量较少,上皮细胞出现轻度水肿,少量炎性细胞聚集浸润;术后7天肾小管管腔直径明显增大,且肾小管变形数量有所增加,肾间质炎性细胞聚集浸润明显,术后14天可见肾脏皮质及髓质明显受压萎缩,皮髓质厚度明显变薄,皮质及髓质分界不清,肾小管严重变形,上皮细胞出现严重变性、坏死、脱落,肾间质可见大量炎性细胞聚集浸润。吡非尼酮组各时间点与UUO组各时间点相比较,肾小管损伤程度及纤维化程度有所改善,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.Masson染色结果:Sham组大鼠肾间质基本未见绿染,肾组织结构未见异常。UUO组各时间点（3d、7d、14d）肾小管上皮细胞不同程度变形、坏死,胶原纤维不同程度渗出,且与梗阻时间呈正相关,故镜检显示绿染纤维面积逐渐增大;吡非尼酮组大鼠各时间点（3d、7d、14d）肾间质绿染面积较UUO组各时间点减少,肾间质纤维化指数（RIF）减轻,差异具有统计学意义（P<0.05）。4.免疫组化结果:Sham组大鼠肾组织中GSK3-β蛋白、β-catenin、FN蛋白表达呈弱阳性,各时间点蛋白表达量经统计学软件分析不具有统计学意义（P>0.05）。UUO组大鼠随梗阻时间的增加GSK3-β、β-catenin、FN的表达量呈现逐渐升高,与Sham组相比较经统计学软件分析具有统计学意义（P<0.05）。吡非尼酮组各时间点与UUO组相比较,GSK3-β、β-catenin、FN表达量均有下降,肾间质纤维化程度得到一定改善,差异存在统计学意义（P<0.05）。结论:1.随着UUO组大鼠梗阻时间的延长,GSK3-β、β-catenin、FN表达量逐渐增加,肾间质纤维化逐渐加重,表明GSK3-β、β-catenin、FN是导致肾间质纤维化的重要因子,WNT/β-catenin通路作为较经典的信号通路,可能参加了肾间质纤维化的信号传递,FN作为其下游因子影响了肾脏纤维化的进程。2.吡非尼酮可能通过负向调控GSK3-β蛋白的表达,抑制WNT/β-catenin通路及下游FN的表达,从而改善肾间质纤维化程度。
秦田雨[7]（2020）在《肾康注射液对慢性肾脏病和肾纤维化的作用及机制研究》文中指出[目的]从整体动物、细胞和分子水平,结合系统药理学靶点预测,研究中药复方肾康注射液（Shenkang,SK）对慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）和肾纤维化的保护作用和机制,为SK对CKD及肾纤维化的临床治疗提供更多的数据支持及科学依据。[方法]1.系统药理学:首先通过数据挖掘和文献查阅构建SK分子数据库,并通过药物相似性和药物半衰期评估来筛选活性分子;使用WES药物靶向模型来预测生物活性成分的直接药物靶向;使用Cytoscape 3.2软件构建复合物-靶标,靶标-通路和靶标-疾病网络,并根据BioGPS数据库确定靶标在组织和器官中的分布。2.整体动物:C57BL/6小鼠36只,采用随机对照设计法将小鼠按体重随机分为:假手术组,模型组,阳性药（ARB）组,SK高剂量组,SK中剂量组,SK低剂量组（n=6）。对模型组、ARB组、SK各剂量组小鼠实施UUO手术,制备肾纤维化模型,假手术组分离左输尿管但不结扎输尿管。术后第一天开始给药,共计14天。假手术组和模型组:尾静脉注射生理盐水0.13 mL/10 g,灌胃生理盐水0.15 mL/10 g,ARB组:尾静脉注射生理盐水0.13 mL/10g,灌胃氯沙坦钾溶液0.15 mL（生药0.13 g）/10 g,SK高剂量组:尾静脉注射SK 0.13 mL（生药0.08 g）/10 g,灌胃生理盐水0.15 mL/10 g,SK中剂量组:尾静脉注射SK 0.13 mL（生药0.04 g）/10 g,灌胃生理盐水0.15 mL/10 g,SK低剂量组:尾静脉注射SK 0.13 mL（生药0.02 g）/10 g,灌胃生理盐水0.15 mL/10 g,实验过程中观察记录小鼠体重等一般情况,给药第13天行MRI扫描测定FA值明确活体肾纤维化程度,给药14天后摘眼球取血,称量肾脏重量,分别冻存固定肾脏。比色法测定血肌酐、血尿素氮、血CysC水平,行HE和天狼星红染色观察患侧肾脏病理形态学和纤维化程度,透射电镜观察超微结构情况,Western Blot检测各组小鼠肾脏肌成纤维细胞标志物α-SMA,ECM成分Col Ⅰ,JAK2/STAT3通路分子蛋白磷酸化水平,Real-time PCR检测假手术组、UUO组和SK中剂量组肾脏肌成纤维细胞标志物α-SMA,FSP-1、ECM成分(Col Ⅲ,JAK2、STAT3、TGF-β1和负调节分子SOCS1,SOCS3 mRNA水平。3.细胞:NRK-49F细胞进行复苏传代培养,以10 ng/mL 的TGF-β1刺激48 h诱导NRK-49F细胞增殖活化,不同浓度SK（0,1,2,4mg/mL）干预后,观察细胞形态、Western Blot检测NRK-49F细胞成纤维细胞标志物α-SMA,ECM成分Col Ⅲ,JAK2/STAT3通路分子蛋白磷酸化水平和负调节分子Prdx5的表达,Real-time PCR检测NRK-49F细胞肌成纤维细胞标志物α-SMA,JAK2、STAT3 mRNA 水平。[结果]1.系统药理学部分:以DL≥0.6为筛选标准,“HL=long”用于定义适当的HL范围。最终选出88种化合物作为活性分子。利用WES算法和CTD、TTD筛选结果,确定了 85个与治疗CKD相关的潜在化合物作用靶点,包括STAT3。通过KEGG数据库映射获得关键通路,包括NF-κB、MAPK、TRP离子通道和VEGF通路,结合CKD病理机制的相关进展,构建了 CKD治疗模块的通路,包括炎症、增殖、分化、迁移、通透性、降解等模块。对靶标-疾病相互作用网络的深入分析表明,SK治疗CKD主要通过影响6种疾病发挥作用:泌尿生殖系统疾病、代谢性疾病、内分泌疾病、心血管疾病,病理过程和免疫疾病。组织定位结果显示SK通过包括肾脏、肝脏、肺和心脏在内的组织模块发挥作用。2.整体动物部分:（1）肾功能检测:与假手术组比较,UUO组小鼠肾脏血CREA、BUN、Cys-C水平显着性升高（p<0.01）;与UUO组相比,ARB和高剂量SK组小鼠血CREA水平显着降低（p<0.01）;与UUO组相比,ARB和SK各剂量组小鼠血BUN水平显着降低（p<0.05或p<0.01）;与UUO组相比,SK高剂量组小鼠血Cys-C水平显着降低（p<0.05）。（2）肾脏重量和病理检测:与假手术组相比,UUO模型组的患侧肾质量/体重、患侧肾/对侧肾质量、对侧肾质量/体重均显着增加（p<0.05或p<0.01）。但各药物治疗后对UUO小鼠肾脏重量各指标没有产生影响。与假手术组比较,UUO组小鼠肾脏FA值显着性升高（p<0.01）;与UUO组相比,ARB阳性药组、SK高中低剂量组FA值显着降低（p<0.01或p<0.001）,其中以SK中剂量组最为显着（p<0.001）。与假手术组比较,UUO组小鼠肾脏病理损伤明显;与UUO组比较,各治疗组肾脏损伤情况均有不同程度缓解,细胞外基质积聚、炎性细胞浸润、肾小管扩张和/或萎缩减轻,以SK中剂量组和高剂量组较好。与假手术组比较,UUO组小鼠天狼星红面积极显着增加（p<0.001）;与UUO组比较,ARB组、SK高、中、低剂量组小鼠患侧肾脏天狼星红染色红色面积显着减少（p<0.05或p<0.01）。电镜下观察各浓度SK对UUO所致的细胞器丰富的成纤维细胞增多,间质局灶胶原纤维增生和肾小管凋亡均有一定的改善作用。（3）Western blot检测:与假手术组相比,UUO组α-SMA蛋白水平显着增加（p<0.01）,与UUO比较,SK中剂量组和低剂量组显着下调了 UUO状态下的α-SMA蛋白水平升高（p<0.05）;与假手术组相比,UUO组Col Ⅰ蛋白水平显着增加（p<0.01）,与UUO 比较,SK中剂量组显着下调了 Col Ⅰ蛋白水平升高（p<0.05）;与假手术组相比,UUO组p-STAT3（Try705位点）/STAT3比例显着增加（p<0.01）,与UUO比较,SK中（p<0.01）、低剂量（p<0.001）组显着下调了 Try705位点的STAT3磷酸化程度;与假手术组相比,UUO组p-JAK2（Try1007位点）/JAK2比例有上升趋势,但无统计学差异,与UUO 比较,SK高剂量组显着下调了 Try1007位点的JAK2磷酸化程度（p<0.05）,（4）PCR检测:与假手术组相比,UUO组小鼠患侧ECM成分Col Ⅰ、Col Ⅲ、FN,成纤维细胞活化标志物α-SMA、FSP-1,以及 JAK2、STAT3、TGF-β、JAK2/STAT3 通路负调节因子SOCS1、SOCS3 mRNA水平显着上升（p<0.05或p<0.01或p<0.001）;与UUO组相比,SK中剂量组显着降低了 Col Ⅰ、ColⅢ、FN,α-SMA、FSP-1,JAK2、TGF-β、SOCS1、SOCS3 mRNA 水平（p<0.05 或p<0.01）。3.细胞实验:TGF-β1诱导后,NRK-49F细胞的细胞骨架显示出内部微丝束,并逐渐增厚和伸长,丧失纺锤形或星形成纤维细胞外观。不同浓度的SK一定程度上逆转了TGF-β1诱导的形态变化和增殖。与空白对照组比较,模型对照组成纤维细胞p-STAT3（Try705位点）/STAT3、Prdx5蛋白水平显着性升高（p<0.05）,p-JAK2（Try1007位点）/JAK2有一定程度升高但未达统计学意义（p>0.05）;与模型对照组相比,4 mg/mL SK组和2 mg/mL SK组细胞的STAT3蛋白Try705位点的磷酸化水平显着降低（p<0.05）,1 mg/mL SK组和2 mg/mL SK组细胞的JAK2蛋白Try1007位点的磷酸化水平显着降低（p<0.05）,4 mg/mL SK组细胞的Prdx5蛋白表达水平显着降低（p<0.05）。与空白对照组比较,模型对照组成纤维细胞α-SMA、JAK2、STAT3 mRNA水平显着升高（p<0.05或p<0.001）;与模型对照组相比,ARB及不同浓度SK均极显着地降低了α-SMA mRNA 水平（p<0.001）,与模型对照组相比,ARB、1mg/mL、2 mg/mL SK（p<0.05）及 4 mg/mL SK（p<0.01）显着降低了 STAT3 mRNA 水平,与模型对照组相比,ARB及4 mg/mL SK显着降低了 JAK2 mRNA水平（p<0.05）。[结论]（1）系统药理学预测显示SK中多种化合物可能通过作用于与炎症、凋亡、增殖等相关的NF-κB、MAPK、TRP离子通道和VEGF等多通路的靶点分子治疗CKD。（2）SK有效改善UUO小鼠肾功能指标和肾间质纤维化,其机制可能是通过调节JAK2/STAT3信号通路抑制成纤维细胞活化实现的,验证了系统药理学结果。（3）SK还能够抑制TGF-β1诱导NRK-49F增殖活化以及ECM产生,其作用机制可能是通过抑制JAK2/STAT3通路的激活介导的。
陆玲玲[8]（2020）在《生长抑制因子4对低氧诱导的人肾小管上皮间质转分化的作用及机制研究》文中指出目的:慢性肾脏病（Chroinc kidney disease,CKD）已经成为了危害人类健康的全世界公共卫生和健康问题。近年来,我国慢性肾脏病发病率呈现出上升的趋势。反复的检查和治疗不仅给患者增加了身体上的痛苦,更是带来了巨大的经济和心理上的压力,降低了生活质量。肾间质纤维化是公认的慢性肾脏病发展至终末期肾脏病的标志。以往研究已证实,肾小管上皮细胞-间质转分化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）,是促成肾间质纤维化（Renal interstitial fibrosis,RIF）进程的重要原因之一。EMT即参与机体正常的生长,也与很多疾病过程相关,在其中发挥了重要作用。如胚胎发育,慢性炎症疾病,组织重塑,癌细胞转移以及多种纤维化疾病。生长抑制因子家族（Inhibitor Of Growth Family Members,INGs）是一组抑癌基因,包括ING1ING5这5个家族成员,其中生长抑制因子4（Inhibitor Of Growth Family Members,ING4）作为INGs的重要一员,对肿瘤细胞的生长、转移、浸润的抑制及对细胞凋亡的促进等发挥着重要作用。近年来有研究发现,ING4涉及多种疾病,不仅能抑制肿瘤细胞的EMT过程,且与肺纤维化参数呈负相关。然而,ING4在肾脏纤维化疾病及肾小管EMT中的作用仍然是未知的。本课题首先进行大鼠肾脏单侧输尿管结扎,建立UUO模型,研究ING4与肾小管间质纤维化的关系。然后采取低氧条件诱导人肾小管上皮细胞（HK2细胞）发生EMT,探讨ING4与低氧诱导的肾小管EMT的关系。最后探讨ING4影响低氧诱导肾小管发生EMT可能的机制。研究方法:首先,将SD雄性大鼠随机分成肾间质纤维化组（UUO-L组）及对照组（Control-NL组）,每组各6只。UUO-L组大鼠行左侧输尿管结扎手术,之后缝合腹膜及皮肤,Control-NL组大鼠仅进行左侧输尿管游离、不结扎,之后直接缝合腹膜及皮肤。手术14天以后将大鼠处死,留取大鼠左侧肾组织,用PBS冲洗,再用4%多聚甲醛固定,之后制作切片。HE染色法检测肾组织病理学变化。Masson三染检测肾组织胶原蛋白表达情况。免疫组织化学染色（Immunohistochemical staining,IHC）检测肾组织中ING4、低氧/缺氧诱导因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）表达部位。Western blot法测定大鼠肾组织中N-钙黏蛋白（N-cadherin,N-cad）,波形蛋白（vimentin）以及E-钙黏蛋白（E-cadherin,E-cad）的表达程度。Quantitative Real-time PCR（q RT-RCR）和Western blot分别检测肾组织中ING4和HIF-1α的m RNA及蛋白表达水平。明确当肾脏发生间质纤维化时,ING4及HIF-1α水平是否发生变化,以及UUO模型内是否存在低氧环境。其次,将HK2细胞分为两组（即:（1）normoxia:常氧组;（2）hypoxia:低氧组）,分别在常氧、5%O2低氧条件下培养24小时。之后拍摄细胞形态,MTT法检测细胞活力的变化,Western blot检测两组细胞中E-cad、vimentin及N-cad的蛋白水平,免疫荧光检测细胞中N-cad表达情况,q RT-RCR检测细胞中胶原蛋白I（Collagen I）、胶原蛋白IV（Collagen IV）、ING4的m RNA水平,Western blot检测细胞中ING4的蛋白表达程度。根据以上结果判断低氧条件下HK2细胞是否发生EMT,以及在常氧、低氧两种条件下HK2细胞ING4表达水平是否发生变化。根据基因序列,构建ING4过表达质粒,转染至HK2细胞,q RT-RCR检测ING4 m RNA转录水平,Western blot方法检测ING4蛋白表达程度,验证过表达效果。证明ING4过表达质粒转染细胞成功后,将HK2细胞分为四组（即:（1）normoxia:常氧组,（2）hypoxia:低氧组,（3）vector+hypoxia:空载+低氧组,（4）ING4+hypoxia:ING4过表达+低氧组）,于常氧或5%O2低氧条件下接着培养24小时,然后用q RT-RCR检测细胞中Collagen I、Collagen IV m RNA转录水平,Western blot检测HK2细胞中N-cad,vimentin及E-cad三者的蛋白表达水平,免疫荧光法检测HK2细胞N-cad表达情况。通过以上结果观察过表达ING4对低氧诱导的HK2细胞EMT过程的影响。最后,HK2细胞中加或不加二甲基乙二酰基甘氨酸（Dimethyloxallyl Glycine,DMOG）（该试剂是一种HIF羟化酶抑制剂,可以使HIF-1α稳定表达,起到HIF-1α激活剂的作用）,将细胞分为四组（即:（1）vector+hypoxia:空载+低氧组,（2）ING4+hypoxia:ING4过表达+低氧组,（3）vector+DMOG+hypoxia:空载+激活剂+低氧组,（4）ING4+DMOG+hypoxia:ING4过表达+激活剂+低氧组）,于5%O2低氧环境下继续培养24小时,然后q RT-RCR检测四组细胞中collagen I和collagen IV m RNA的水平,Western blot检测E-cad、N-cad和Snail的蛋白水平。目的在于观察在低氧条件下,过表达ING4影响HK2细胞EMT过程的机制。结果:1、HE染色结果显示:UUO-L组表现为肾小管扩张,肾小管上皮细胞肿胀,呈空泡样变,重者萎缩;肾间质水肿,可见炎性细胞浸润。Masson染色结果显示:UUO-L组肾脏组织中蓝染的胶原纤维明显多于control-NL组。UUO-L组E-cad表达低于control-NL组（p<0.0001）,而N-cad、vimentin表达高于control-NL组（p<0.0001）。免疫组化结果显示:在control-NL组肾组织中,ING4在肾小管上皮细胞核中表达较为显着,UUO-L组中表达较对照组有明显降低。HIF-1α表达相反,在UUO-L组的肾小管上皮细胞中表达显着升高,主要在细胞核中表达,胞浆中少量表达,而control-NL组核表达不明显,在胞浆中少量表达。UUO-L组ING4的m RNA水平及蛋白表达量低于control-NL组（p<0.0001）,而HIF-1α的m RNA水平及蛋白表达量高于control-NL组（p<0.0001）。2、低氧培养HK2细胞,细胞的形态由单层鹅卵石样变成梭形的成纤维细胞样,细胞之间间距增加。低氧条件下细胞的活力较常氧条件下细胞活力降低。与常氧组相比,低氧组vimentin和N-cad的蛋白表达量增加（p<0.01）,E-cad的蛋白表达量下降（p<0.0001）,纤维化标志物Collagen I、Collagen IV显着增多（p<0.01）。与常氧组相比,低氧组HK2细胞中ING4的m RNA水平及蛋白水平下降（p<0.0001）。构建ING4过表达质粒p EGFP-N1-ING4,转染HK2细胞,与vector组比较,ING4过表达组m RNA水平和蛋白表达显着升高（**p<0.01,***p<0.001）,证实ING4过表达质粒构建成功。与转染空质粒的对照组相比,过表达ING4组HK2细胞中的Collagen I、Collagen IV的m RNA水平下降（*p<0.05,**p<0.01）,E-cad的蛋白水平升高（**p<0.01）,而vimentin和N-cad的表达量下降（**p<0.01,***p<0.001）。3、低氧培养HK2细胞,与常氧组相比,低氧组HIF-1α的m RNA和蛋白水平升高（**p<0.01）,且snail的m RNA和蛋白水平亦升高（*p<0.05,**p<0.01）。低氧条件下,与转染空质粒组相比,过表达ING4组中HIF-1α和snail的m RNA水平下降（*p<0.05,**p<0.01）,HIF-1α和snail的蛋白水平亦下降（**p<0.01）。转染ING4过表达质粒的HK2细胞在低氧条件下培养,与未经DMOG处理组相比,经DMOG处理组的Collagen I、Collagen IV的m RNA水平显着升高（***p<0.001）,E-cad的蛋白表达量减少（*p<0.05）,N-cad和snail的蛋白表达量明显升高（****p<0.0001）。结论:1、体内实验和体外实验证明,ING4参与肾间质纤维化过程,且与HIF-1α共同参与调节EMT。2、低氧诱导HK2细胞发生EMT后,ING4表达下降,HIF-1α和snail表达升高。3、过表达ING4可以抑制低氧诱导HK2细胞发生EMT,并抑制HIF-1α和Snail的表达。4、低氧条件下,加入HIF-1α激活剂DMOG使HIF-1α稳定表达后,ING4对EMT和Snail的抑制作用减弱。5、低氧条件下,ING4可能通过下调HIF-1α进而抑制Snail的表达来逆转HK2细胞发生EMT。
金福泉[9]（2020）在《双脱氧基姜黄素对肾脏纤维化和顺铂肾脏毒性的保护作用》文中研究指明目的:肾脏纤维化是各种进展性慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）的标志和共同途径,它的特征是肾脏间质成纤维细胞大量增殖激活和细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）过度累积。研究统计显示,CKD的全球发病率约为11.7-15.1%,而且随着药物治疗引起的急性肾损伤（Acute kidney injury,AKI）、糖尿病、肥胖人群的增多以及人口老龄化的加剧,CKD的发病率呈现不断上升的趋势。肾脏纤维化不仅给患者带来巨大的生理痛苦,还造成沉重的经济负担。但迄今为止,对肾脏纤维化的治疗仍然存在严重的不足,在临床实践中表现为无药可医。因此,对于肾脏纤维化的发生发展机制的研究和寻找有效的干预策略越来越受到了人们的重视,也是现阶段攻克该疾病的重点和难点。双脱氧基姜黄素（Bisdemethoxycurcumin,BDMC）是姜科和天南星科植物根茎中常见的一种天然化学成分,我们在前期的筛选实验中发现其在20μM左右的浓度条件下能有效诱导成纤维细胞凋亡,而不对肾小管上皮细胞产生影响。同时,我们也发现在顺铂（Cisplatin）诱导的肾小管上皮细胞损伤模型中,BDMC能产生有效的缓解作用。在此基础上,本文深入研究BDMC对肾脏纤维化和顺铂肾脏毒性的保护作用,并探讨其具体机制。方法:（1）采用细胞模型筛选能特异性损伤成纤维细胞而不会影响正常肾小管上皮细胞的天然化合物。使用相同浓度梯度的一系列天然化合物分别作用于肾小管上皮细胞（HK-2细胞）和成纤维细胞（3T6细胞）,并通过SRB法检测细胞的增殖情况。（2）采用单侧输尿管结扎（Unilateral ureteral obstruction,UUO）的方法构建小鼠肾脏纤维化模型,灌胃给予高低不同剂量的BDMC,通过血液生化指标的检测、苏木素-伊红（Hematoxylin-Eosin,H&E）染色、天狼星红染色实验方法评价BDMC对肾脏纤维化的治疗情况。（3）通过一次性腹腔注射20 mg/kg顺铂构建小鼠急性肾损伤的模型,在注射顺铂前两天开始每天灌胃给予高中低不同剂量的BDMC,持续到注射顺铂后的第二天。通过血液生化指标的检测、H&E染色、免疫组化实验方法评价BDMC对顺铂肾脏毒性的治疗情况。（4）采用PI/Annexin V双染结合流式细胞术实验方法检测BDMC对HK-2和3T6细胞诱导凋亡能力的不同和BDMC对顺铂诱导HK-2细胞凋亡的保护情况（5）通过蛋白免疫印迹法（Western blot）检测体内外相关蛋白的变化。结果:（1）通过使用成纤维细胞（3T6细胞）和肾小管上皮细胞（HK-2细胞）对植物提取的天然化合物筛选发现BDMC在一定浓度范围内能特异性诱导成纤维细胞损伤;（2）在单侧输尿管梗阻的小鼠实验中,血液生化指标、脏器病变程度、组织切片H&E染色、天狼星红染色实验结果显示BDMC缓解UUO诱导的肾脏损伤和肾纤维化;（3）PI/Annexin V双染结合流式细胞术和western blot检测结果显示BDMC在20μM浓度条件下通过特异性诱导成纤维细胞凋亡来阻止肾脏纤维化的进展;（4）通过对天然化合物的筛选实验发现BDMC能抑制顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡;（5）在顺铂诱导的小鼠急性肾损伤实验中,血液生化指标、脏器病变程度、组织切片H&E染色结果显示BDMC缓解顺铂诱导的肾脏损伤;（6）PI/Annexin V双染结合流式细胞术和western blot检测结果显示BDMC通过抑制顺铂诱导上调的p53蛋白水平,进而抑制顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡;（7）细胞活性氧（ROS）检测、western blot和组织切片免疫组化实验结果显示,BDMC通过上调Nrf2（NF-E2-related factor 2）的表达水平进而缓解顺铂诱导的肾脏氧化应激反应;（8）Western blot和组织切片免疫组化实验结果显示BDMC通过抑制NF-κB蛋白和细胞间黏附分子1（Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1）及单核细胞趋化蛋白1（Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）表达来缓解顺铂引起的肾脏炎症反应。结论:本研究通过体内外的实验研究发现BDMC具有治疗肾脏纤维化和缓解顺铂诱导的肾脏损伤的作用。BDMC治疗肾脏纤维化的机制在于其能特异性诱导成纤维细胞发生凋亡。BDMC能有效缓解顺铂肾脏毒性的机制在于其能通过多个方面阻断顺铂对肾脏的损伤:1)BDMC通过抑制顺铂诱导上调的p53蛋白水平,进而抑制顺铂引起的肾小管上皮细胞凋亡;2)BDMC通过抑制顺铂诱导下调的Nrf2蛋白表达水平进而缓解顺铂诱导的肾脏氧化应激反应;3)BDMC通过抑制NF-κB蛋白的表达激活和下调ICAM-1及MCP-1的表达来缓解顺铂诱导的肾脏炎症反应。我们的研究为肾脏纤维化的治疗提供了一种新的策略和理论依据;也为顺铂的肾脏毒性提供一种新的干预手段。
姚芳[10]（2019）在《ETS2对肾小管上皮细胞EMT和肾纤维化的作用及其机制研究》文中研究表明背景和目的目前全球范围内有超过13%的人群患有不同程度的慢性肾脏病,慢性肾脏疾病己严重威胁着人类健康。肾小管间质纤维化在肾脏疾病转归中起主导作用,其严重程度是评价肾功能损害程度和疾病预后判断的重要指标。多项研究表明上皮-间充质转分化（endothelial-mesenchymal transition,EMT）在肾脏损伤修复和器官纤维化过程中发挥重要作用,但肾小管上皮细胞发生EMT的分子机制尚未完全阐明,探索肾小管上皮细胞发生EMT的分子调控机制对防治肾脏纤维化具有重要的意义。我们用基因表达谱芯片筛选TGFβ1诱导HK2细胞发生EMT时表达差异的基因,并通过生物信息学分析芯片数据挑选出可能调控HK2细胞EMT的候选基因ETS2和JUNB。目前关于ETS2与JUNB在慢性肾脏纤维化疾病中是否有作用及作用机制的研究未见报道,本研究旨在探讨ETS2和JUNB在肾小管上皮细胞转分化中发挥的作用,以及ETS2是否通过JUNB调控肾小管上皮细胞转分化及肾纤维化进程,为寻找肾纤维化新的治疗靶点提供理论基础。方法和结果1.采用基因表达谱芯片筛查出TGFβ1刺激HK2细胞后共有587个基因表达发生了差异性改变,其中上调基因248个,下调基因339个。用生物信息学对这些表达差异的基因进行分析,初步筛查出12个基因可能与TGFβ1诱导HK2细胞EMT有密切关系。2.用实时荧光定量PCR方法验证发现:在细胞水平,这12个基因的表达趋势与基因表达谱芯片结果一致;而在小鼠肾纤维化模型,只有6个基因的表达趋势与基因表达谱芯片结果一致。通过生物信息学分析和文献检索方法挑选出ETS2基因进行深入研究。3.ETS2主要分布在肾小管上皮细胞核中表达,ETS2在UUO组的表达明显高于sham组。在TGFβ1刺激HK2细胞中,ETS2的表达呈浓度和时间依赖性增高。4.siRNA敲低ETS2在HK2细胞中的表达,明显抑制TGFβ1诱导HK2细胞 EMT,并下调 TGFβ1 诱导 HK2 细胞的 a-SMA、Vimentin、N-cadherin、Collagen I和FN蛋白表达升高。再者,敲低ETS2能明显抑制HK2细胞CCL2、IL18、TNFα 和 IL6mRNA 的表达。5.生物信息学分析预测ETS2与JUNB存在相互作用,我们采用荧光素酶实验,通过分段截短和位点突变的方式,证实ETS2直接调控JUNB的转录及明确了具体的作用位点。敲减或过表达ETS2明显抑制或促进TGFβ1诱导HK2细胞JUNB表达升高。6.JUNB主要分布在肾小管上皮细胞核中表达,在UUO组的肾小管上皮细胞中表达明显高于sham组。在TGFβ1刺激HK2细胞中,JUNB的表达呈浓度和时间依赖性增高。7.在HK2细胞中敲低JUNB的表达明显抑制TGFβ1诱导HK2细胞EMT,并下调TGFβ1诱导HK2细胞的Vimentin、N-cadherin、Collagen I和FN蛋白表达升高。然而,过表达JUNB能明显促进TGFβ1诱导HK2细胞Vimentin、N-cadherin和FN蛋白表达升高。8.敲减JUNB表达明显抑制ETS2对TGFβ1诱导纤维化相关基因表达的促进作用。结论1.在小鼠肾纤维化模型中,ETS2和JUNB表达明显升高;而在HK2细胞中,TGFβ1以浓度和时间依赖性的方式诱导ETS2和JUNB表达增加。2.ETS2和JUNB均能促进TGFβ1诱导HK2细胞EMT形态学改变和纤维化相关蛋白表达。3.ETS2直接调控JUNB的转录和表达,并可能通过调控JUNB表达促进TGFβ1诱导HK2细胞EMT。4.本研究探讨ETS2和JUNB在肾小管上皮细胞转分化中发挥的作用及机制,为寻找肾纤维化新的治疗靶点提供了理论基础。
二、胚胎及离体上皮-间质转分化及其在肾脏疾病中的意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、胚胎及离体上皮-间质转分化及其在肾脏疾病中的意义（论文提纲范文）
（1）β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录因子调控肝星状细胞改善肝脏纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 参与肝星状细胞的增殖活化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器及试剂盒 |
| 1.2 实验试剂配制 |
| 1.3 LX2 细胞培养及细胞传代 |
| 1.4 rhTGF-β诱导LX2 细胞活化增殖 |
| 1.5 ICG-001、AS1842856 干预活化的LX2 细胞 |
| 1.6 实验方法 |
| 1.7 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 调控LX2 增殖活化表型 |
| 2.2 β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 调控LX2 细胞增殖活化的作用机制 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 小鼠肝纤维化动物模型构建以及β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 与肝纤维化病程关系初探 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器及试剂盒 |
| 1.2 实验试剂配制 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 动物模型建立及实验分组 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 CCl_4、BDL模型不同时点的小鼠一般状况 |
| 2.2 CCl_4、BDL模型不同时点的肝脏外观改变 |
| 2.3 CCl_4、BDL模型不同时点的肝功能变化 |
| 2.4 CCl_4、BDL模型不同时点的组织学改变 |
| 2.5 CCl_4、BDL模型不同时点α-SMA免疫组织化学结果 |
| 2.6 CCl_4、BDL模型不同时点炎症因子表达水平 |
| 2.7 CCl_4、BDL模型不同时点β-catenin/FOXO1、β-catenin/TCF转录复合物变化. |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 抑制β-catenin/TCF改善CCL4、BDL小鼠模型肝纤维化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器及试剂盒 |
| 1.2 实验试剂配制 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 动物模型建立及实验分组 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 抑制CCl_4、BDL模型β-catenin/TCF1 w、2 w时小鼠一般状况 |
| 2.2 抑制CCl_4、BDL模型β-catenin/TCF1 w、2 w时肝脏外观及肝重体重比 |
| 2.3 抑制CCl_4、BDL模型β-catenin/TCF1 w、2 w时血清肝功能水平 |
| 2.4 抑制CCl_4、BDL模型β-catenin/TCF1 w、2 wS时肝脏组织学变化 |
| 2.5 抑制CCl_4、BDL模型β-catenin/TCF1 w、2 w时 COL-I、α-SMA水平 |
| 2.6 抑制CCl_4、BDL模型β-catenin/TCF2 w促进FOXO1 靶基因foxp3、p27~(kip1)表达 |
| 2.7 抑制BDL模型β-catenin/TCF时肝脏组织炎症因子水平 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四部分 BDL模型研究β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 调控肝纤维化的分子机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器及试剂盒 |
| 1.2 实验试剂配制 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 动物模型建立及实验分组 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 β-catenin/TCF、FOXO1 共同调控肝纤维化进展 |
| 2.2 肝脏核蛋白中TCF、FOXO1与β-catenin竞争结合形成不同转录复合物 |
| 2.3 体内HSCs中 TCF、FOXO1与β-catenin形成不同转录复合物调控肝纤维化进展 |
| 2.4 β-catenin/TCF、FOXO1 调节肝脏组织炎症因子水平 |
| 2.5 β-catenin/TCF、FOXO1 调节肝脏组织细胞周期抑制蛋白p27~(kip1) |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第五部分 探讨人体肝脏组织β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 转录复合物与纤维化进展的关系 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器及试剂盒 |
| 1.2 临床组织标本收集 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 胆道闭锁导致胆汁淤积性肝纤维化患者基本信息统计 |
| 2.2 患者肝脏组织石蜡切片HE、Masson、天狼星红染色结果及纤维化分期 |
| 2.3 不同分期患者肝脏组织TGF-β、IL-10、Ki67 水平 |
| 2.4 不同分期患者肝脏组织β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1 水平 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文总结 |
| 创新点与不足之处 |
| 1.本研究的特色与创新点 |
| 2.本研究不足之处及进一步的研究设想 |
| 参考文献 |
| 综述 转化生长因子-β信号通路与纤维化 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）S-烯丙基巯基半胱氨酸包合物的制备及用于治疗糖尿病肾病的初步药学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 前言 |
| 1 糖尿病肾病研究概况 |
| 1.1 糖尿病肾病的治疗概况 |
| 1.2 糖尿病肾病的病理分期 |
| 1.3 糖尿病肾病的分子机制 |
| 1.4 糖尿病肾病小鼠体内模型的建立方法 |
| 2 S-烯丙基半胱氨酸研究现状 |
| 2.1 S-烯丙基巯基半胱氨酸概述 |
| 2.2 S-烯丙基巯基半胱氨酸用于治疗糖尿病肾病的理论基础 |
| 2.3 S-烯丙基巯基半胱氨酸的基础理化性质 |
| 3 β-环糊精的概述 |
| 4 PVP-K30的概述 |
| 5 本课题的研究意义和研究内容 |
| 5.1 本课题研究意义 |
| 5.2 本课题的主要研究内容 |
| 第二章 S-烯丙基巯基半胱氨酸的β-环糊精包合物制备与质量评价 |
| 1 引言 |
| 2 实验仪器与材料 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 SAMC含量方法的建立 |
| 3.2 稳定剂的筛选 |
| 3.3 SAMC-β-CD的基本处方和制备工艺 |
| 3.4 测定包合率 |
| 3.5 SAMC-β-CD的单因素筛选 |
| 3.6 最佳工艺三次验证实验 |
| 3.7 SAMC-β-CD包合物的表征 |
| 3.8 SAMC-β-CD溶解度实验 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 SAMC含量测定的考察结果 |
| 4.2 稳定剂筛选结果 |
| 4.3 SAMC-β-CD的单因素筛选结果 |
| 4.4 最佳工艺三次考察结果 |
| 4.5 SAMC-β-CD的表征 |
| 4.6 SAMC-β-CD溶解度考察结果 |
| 5 讨论 |
| 6 本章小结 |
| 第三章 S-烯丙基巯基半胱氨酸的体外抗纤维化作用研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验仪器与材料 |
| 2.1 实验仪器与设备 |
| 2.2 药品与实验试剂 |
| 2.3 实验细胞株 |
| 2.4 实验试剂的配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 RMC细胞复苏 |
| 3.2 RMC细胞培养 |
| 3.3 RMC细胞传代 |
| 3.4 RMC细胞冻存 |
| 3.5 细胞计数 |
| 3.6 MTT法测定细胞毒性 |
| 3.7 高糖刺激RMC细胞建立体外肾纤维化模型 |
| 3.8 BCA测定蛋白浓度 |
| 3.9 Western blot法检测SAMC对肾纤维化的作用 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 MTT法测定细胞毒性 |
| 4.2 MTT法筛选葡萄糖建模浓度 |
| 4.3 MTT法筛选建模的细胞数量 |
| 4.4 SAMC抑制高糖诱导的NF-κB β65信号通路 |
| 4.5 SAMC抑制高糖诱导肾纤维化Fibronectin、PCNA蛋白 |
| 5 讨论 |
| 6 本章小结 |
| 第四章 S-烯丙基巯基半胱氨酸的β-环糊精包合物对STZ所导致的糖尿病肾病小鼠肾纤维化的保护作用及机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 实验仪器与材料 |
| 2.1 实验仪器与设备 |
| 2.2 药品与试剂 |
| 2.3 实验动物 |
| 2.4 实验试剂配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 糖尿病肾病小鼠体内模型的筛选 |
| 3.2 糖尿病肾病体内模型的建立及分组 |
| 3.3 糖尿病肾病小鼠体重及血糖记录 |
| 3.4 糖尿病肾病小鼠的肾重及肾指数 |
| 3.5 C5 7BL/6小鼠尿液中尿微量白蛋白测定 |
| 3.6 C57BL/6小鼠的TG、T-CHO、BUN、SCr水平的测定 |
| 3.7 炎症因子IL-1β、IL-6的测定 |
| 3.8 肾组织的Masson和PAS染色 |
| 3.9 Westen blot检测肾组织中相关通路蛋白的变化 |
| 3.10 RT-PCR测定mRNA的表达 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 体内糖尿病肾病小鼠模型筛选结果 |
| 4.2 C57BL/6糖尿病肾病小鼠的体重及血糖变化曲线 |
| 4.3 C57BL/6糖尿病肾病小鼠的肾重及肾指数 |
| 4.4 ELISA试剂盒测定糖尿病肾病小鼠的尿微量白蛋白 |
| 4.5 糖尿病肾病小鼠的TG、T-CHO、BUN、SCr测定结果 |
| 4.6 糖尿病肾病小鼠炎症因子IL-1β、IL-6的变化 |
| 4.7 肾的组织病理学分析 |
| 4.8 体内RT-PCR考察结果 |
| 4.9 SAMC-β-CD通过抑制EMT和ECM积累减轻体内STZ诱导的肾纤维化 |
| 4.10 SAMC-β-CD通过抑制Wnt/β-catenin信号通路减轻体内STZ诱导的肾纤维化 |
| 4.11 SAMC-β-CD通过抑制NF-κB/HIF-1α信号通路减轻体内STZ诱导的肾纤维化 |
| 5 讨论 |
| 6 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情祝表 |
（3）SAHA通过调控TGFβ/Smad信号通路在结晶肾损伤模型EMT中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分:基因芯片技术分析TGF-β对于肾小管上皮细胞的作用 |
| 引言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果与讨论 |
| 三、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分:草酸钙结晶肾损伤模型的构建 |
| 引言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果与讨论 |
| 三、结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分:SAHA调控TGFβ/Smad信号通路影响草酸钙结晶肾损伤模型中EMT表达 |
| 引言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果与讨论 |
| 三、结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 EMT与肾纤维化 |
| 参考文献 |
| 发表论文及科研成果 |
| 致谢 |
（4）ESRP1和NOX4在人气道上皮间质转分化的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 慢性阻塞性肺疾病小气道上皮间质转化的表达情况 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 第二部分 ESRP1和NOX4 在人气道上皮细胞间质转分化的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| ESRPs与肺部疾病的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 个人简介 |
| 开题、中期及学位论文答辩委员组成 |
（5）慢性间歇性缺氧对肾脏纤维化的影响及相关机理研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征 |
| 1.1.1 OSAHS定义和主要临床表现 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 高危因素 |
| 1.1.4 并发症 |
| 1.2 肾脏纤维化 |
| 1.2.1 肾脏纤维化的病因学和病理生理学 |
| 1.2.2 肾脏纤维化和炎症反应 |
| 1.2.3 肾脏纤维化和TGF-β信号 |
| 1.2.4 肾脏纤维化对人类健康的影响 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 第二章 慢性间歇性缺氧对大鼠肾脏纤维化的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 OSAHS大鼠模型建立 |
| 2.2.2 Elisa实验 |
| 2.2.3 HE染色 |
| 2.2.4 Masson染色 |
| 2.2.5 免疫组织化学 |
| 2.2.6 免疫荧光 |
| 2.2.7 RT-PCR |
| 2.2.8 Western blot |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 慢性间歇性缺氧对大鼠体重的影响 |
| 2.3.2 慢性间歇性缺氧对大鼠血清IFN-γ、TNF-α、MCP-1、IL-1β和IL-6水平的影响 |
| 2.3.3 慢性间歇性缺氧对大鼠肾组织病理学变化的影响 |
| 2.3.4 慢性间歇性缺氧对大鼠肾脏组织胶原沉积的影响 |
| 2.3.5 慢性间歇性缺氧对大鼠肾脏组织中Col I、FN、CD3和CD68 蛋白表达的影响 |
| 2.3.6 慢性间歇性缺氧对IL-1β和α-SMA蛋白表达的影响 |
| 2.3.7 慢性间歇性缺氧对MCP-1、MIP-1β、Col I、FN、TNF-α和IL-1βmRNA表达的影响 |
| 2.3.8 慢性间歇性缺氧对MCP-1、MIP-1β、Caspase-1和TNF-α蛋白表达的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 慢性间歇性缺氧大鼠肾脏组织转录组表达谱分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 组织准备 |
| 3.2.2 总RNA提取及检测 |
| 3.2.3 RNA的处理与测序 |
| 3.2.4 差异基因分析 |
| 3.2.5 差异基因GO功能和KEGG Pathway分析 |
| 3.2.6 RT-PCR |
| 3.2.7 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 测序数据整理及质量评估 |
| 3.3.2 转录组测序与参比基因序列比对 |
| 3.3.3 测序数据饱和度检验 |
| 3.3.4 差异表达基因筛选 |
| 3.3.5 差异表达基因GO分析 |
| 3.3.6 差异表达基因KEGG Pathway分析 |
| 3.3.7 差异表达基因的RT-PCR验证 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 Aqp1与肾脏缺氧的关系 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞株 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 细胞复苏 |
| 4.2.2 细胞传代 |
| 4.2.3 细胞缺氧处理 |
| 4.2.4 Western blot |
| 4.2.5 MTT |
| 4.2.6 免疫组化 |
| 4.2.7 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 缺氧对HK-2细胞形态的影响 |
| 4.3.2 缺氧对HK-2 细胞HIF-1α和 Aqp1 蛋白表达的影响 |
| 4.3.3 缺氧对HK-2细胞活性的影响 |
| 4.3.4 缺氧对大鼠肾脏组织中Aqp蛋白表达的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 Aqp1在肾小管上皮间质转化中的潜在作用及机制研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 细胞株 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 Aqp1腺病毒病毒载体构建 |
| 5.2.2 细胞纤维化模型建立 |
| 5.2.3 细胞转染 |
| 5.2.4 MTT |
| 5.2.5 RT-PCR |
| 5.2.6 免疫荧光 |
| 5.2.7 Western blot |
| 5.2.8 统计学分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 细胞感染效率 |
| 5.3.2 Aqp1干扰对HK-2细胞增殖的影响 |
| 5.3.3 Aqp1 干扰对HK-2 细胞TNF-α、IL-1β、α-SMA和 FN m RNA表达的影响 |
| 5.3.4 Aqp1 干扰对HK-2 细胞E-Cadherin、Fsp1和Vimentin表达的影响 |
| 5.3.5 ERK/Aqp1 信号抑制对HK-2 细胞Aqp1 表达和EMT的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）吡非尼酮调控GSK3-β对UUO大鼠肾纤维化组织WNT/β-catenin通路、FN表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 英文缩写 |
| 攻读学位期间发表的学术成果 |
| 附图 |
（7）肾康注射液对慢性肾脏病和肾纤维化的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 慢性肾脏病肾纤维化的现代研究进展 |
| 1 病因研究 |
| 2 发病机制研究 |
| 3 治疗与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医药防治慢性肾脏病研究进展 |
| 1 病名研究 |
| 2 病因病机研究 |
| 3 防治研究 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验一 肾康注射液治疗慢性肾脏病的系统药理学分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果和讨论 |
| 3 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 肾康注射液对UUO小鼠肾间质纤维化的保护作用及机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 肾康注射液对NRK-49F人鼠肾间质成纤维细胞活化的作用及机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 主要研究成果 |
| 个人简历 |
（8）生长抑制因子4对低氧诱导的人肾小管上皮间质转分化的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :ING4与肾小管间质纤维化的关系研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器及设备 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.1.5 引物的设计和合成 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 建立动物模型 |
| 2.2.2 HE染色 |
| 2.2.3 Masson染色 |
| 2.2.4 免疫组化染色 |
| 2.2.5 q RT-PCR |
| 2.2.6 Western blot |
| 2.2.7 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 构建大鼠UUO模型 |
| 3.1.1 HE染色检测大鼠肾组织病理学变化 |
| 3.1.2 Masson染色检测大鼠肾组织纤维化情况 |
| 3.2 大鼠UUO模型中EMT参与肾间质纤维化 |
| 3.3 肾间质纤维化组织中HIF-1α表达升高,ING4 表达下降 |
| 3.3.1 免疫组化法检测大鼠肾组织中的ING4和HIF-1α |
| 3.3.2 大鼠肾组织中ING4、HIF-1αm RNA转录水平 |
| 3.3.3 大鼠肾组织中ING4、HIF-1α蛋白表达水平 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :ING4与低氧诱导的人肾小管上皮间质转分化的关系研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器及设备 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.1.5 引物名称及序列 |
| 2.1.6 ING4过表达质粒载体及序列 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞复苏 |
| 2.2.2 细胞传代 |
| 2.2.3 细胞计数 |
| 2.2.4 细胞冻存 |
| 2.2.5 MTT实验 |
| 2.2.6 免疫荧光染色 |
| 2.2.7 细胞转染 |
| 2.2.8 q RT-PCR |
| 2.2.9 Western blot |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 低氧促进肾小管上皮细胞间质转分化 |
| 3.1.1 低氧条件下HK2细胞形态变化 |
| 3.1.2 MTT检测细胞活力的变化 |
| 3.1.3 HK2 细胞E-cad,N-cad和 vimentin蛋白表达水平 |
| 3.1.4 免疫荧光检测HK2 细胞中N-cad表达 |
| 3.1.5 HK2 细胞中collagen I和 collagen IV的 m RNA转录水平 |
| 3.2 ING4参与低氧诱导的肾小管上皮细胞间质转分化 |
| 3.3 过表达ING4 抑制EMT及肾间质纤维化 |
| 3.3.1 ING4过表达质粒效果的验证 |
| 3.3.2 过表达 ING4 对 HK2 细胞中 collagen I 和 collagen IV m RNA 水平的影响 |
| 3.3.3 过表达 ING4 对 HK2 细胞中 E-cad、N-cad 和 vimentin 蛋白表达的影响 |
| 3.3.4 过表达ING4对HK2 细胞中N-cad表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 :ING4抑制低氧诱导的肾小管上皮间质转分化的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器及设备 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.1.5 引物名称及序列 |
| 2.1.6 ING4过表达质粒载体及序列 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞转染 |
| 2.2.2 细胞加药 |
| 2.2.3 免疫荧光染色 |
| 2.2.4 q RT-PCR |
| 2.2.5 Western blot |
| 2.2.6 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 过表达ING4对HK2中HIF-1α、Snail表达的影响 |
| 3.1.1 HK2 细胞中HIF-1α、Snail的 m RNA转录水平 |
| 3.1.2 HK2 细胞中HIF-1α、Snail的蛋白表达水平 |
| 3.1.3 免疫荧光检测HK2 细胞中HIF-1α表达情况 |
| 3.2 有或无HIF-1α激活剂时,过表达ING4对HK2 细胞collagen I和 collagenIV转录水平的影响 |
| 3.3 有或无HIF-1α激活剂时,过表达ING4 对肾小管EMT的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究自我创新性评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）双脱氧基姜黄素对肾脏纤维化和顺铂肾脏毒性的保护作用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与仪器 |
| 2.1 细胞株 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 药物与主要试剂 |
| 2.3.1 药物 |
| 2.3.2 试剂 |
| 2.3.3 相关试剂的配制 |
| 2.4 仪器设备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 动物分组及实验 |
| 3.2.1 肾脏纤维化模型的构建及后续实验 |
| 3.2.2 顺铂诱导肾损伤模型的构建及后续实验 |
| 3.3 Western Blot检测相关蛋白表达水平 |
| 3.3.1 细胞总蛋白的提取 |
| 3.3.2 动物组织蛋白的提取 |
| 3.3.3 Lowry法测定样本总蛋白含量 |
| 3.3.4 蛋白质免疫印迹 |
| 3.4 磺酰罗丹明B(SRB)法检测细胞增殖 |
| 3.5 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 3.6 苏木素-伊红(H&E)染色 |
| 3.7 天狼星红染色 |
| 3.8 免疫组化 |
| 3.9 数据分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 BDMC能特异性损伤成纤维细胞 |
| 4.2 BDMC缓解UUO诱导的肾脏损伤 |
| 4.3 BDMC缓解UUO诱导的肾脏纤维化 |
| 4.4 BDMC通过特异性诱导成纤维细胞凋亡来阻止肾脏纤维化的进展 |
| 4.5 BDMC抑制顺铂诱导的肾小管上皮凋亡 |
| 4.6 BDMC缓解顺铂诱导的肾脏损伤 |
| 4.7 BDMC通过降低顺铂诱导上调的p53 蛋白水平来抑制顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡 |
| 4.8 BDMC通过上调Nrf2 的表达水平进而缓解顺铂诱导的肾脏氧化应激反应 |
| 4.9 BDMC通过抑制NF-κB激活和下调ICAM-1及MCP-1 的表达来缓解顺铂诱导的肾脏炎症反应 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在读期间取得的科研成果 |
（10）ETS2对肾小管上皮细胞EMT和肾纤维化的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 基因表达谱芯片筛选TGFβ1诱导HK2细胞表达差异的基因 |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 ETS2对TGFβ1诱导HK2细胞EMT及肾脏纤维化的影响 |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 ETS2调控JUNB表达影响HK2细胞的EMT过程 |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词汇表 |
| 攻读学位期间的成果 |
| 致谢 |
四、胚胎及离体上皮-间质转分化及其在肾脏疾病中的意义（论文参考文献）
- [1]β-catenin/TCF、β-catenin/FOXO1转录因子调控肝星状细胞改善肝脏纤维化的机制研究[D]. 王晓玲. 山西医科大学, 2021(01)
- [2]S-烯丙基巯基半胱氨酸包合物的制备及用于治疗糖尿病肾病的初步药学研究[D]. 周莹莹. 山东大学, 2021(12)
- [3]SAHA通过调控TGFβ/Smad信号通路在结晶肾损伤模型EMT中的作用及机制研究[D]. 张欢. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [4]ESRP1和NOX4在人气道上皮间质转分化的机制研究[D]. 胡进秀. 宁夏医科大学, 2021(02)
- [5]慢性间歇性缺氧对肾脏纤维化的影响及相关机理研究[D]. 完颜萍萍. 兰州大学, 2020(04)
- [6]吡非尼酮调控GSK3-β对UUO大鼠肾纤维化组织WNT/β-catenin通路、FN表达的影响[D]. 张振浩. 佳木斯大学, 2020(09)
- [7]肾康注射液对慢性肾脏病和肾纤维化的作用及机制研究[D]. 秦田雨. 北京中医药大学, 2020(04)
- [8]生长抑制因子4对低氧诱导的人肾小管上皮间质转分化的作用及机制研究[D]. 陆玲玲. 中国医科大学, 2020(01)
- [9]双脱氧基姜黄素对肾脏纤维化和顺铂肾脏毒性的保护作用[D]. 金福泉. 浙江大学, 2020(07)
- [10]ETS2对肾小管上皮细胞EMT和肾纤维化的作用及其机制研究[D]. 姚芳. 南方医科大学, 2019(02)
标签：β-catenin论文; 肾小管论文; 健康论文; 药品论文; 养生论文;