一、腺病毒介导的cox-2反义RNA对食管癌细胞株生长的影响（论文文献综述）
马晓丽[1]（2021）在《ILK对食管鳞癌恶性表型的影响及其功能研究》文中研究指明目的:本研究目的是探讨整合素连接激酶（ILK）基因对食管癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响,研究其在食管癌中功能,为食管癌的精准诊疗奠定理论基础和临床参考。方法:1)采用meta分析评价ILK在消化系统肿瘤组织中的表达,及与消化系统肿瘤临床表型及预后间的相关性;2)筛选ILK高表达的人食管鳞癌细胞系,建立ILK慢病毒干扰序列。将ILK慢病毒干扰序列转染食管鳞癌细胞系TE-1和KYSE-150,用q RT-PCR检测干扰载体转染后ILK的表达。在细胞水平上,利用MTT增殖、克隆检测、流式细胞仪凋亡检测、Transwell小室侵袭及划痕愈合等技术,研究ILK基因消减对食管鳞癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响;3)建立ILK慢病毒干扰载体,转染KYSE-150细胞。在裸鼠皮下分别接种sh ILK及对照细胞株,建立KYSE-150细胞裸鼠皮下移植瘤模型,通过观察肿瘤生长,测量肿瘤大小和体积。在动物水平上,研究ILK基因消减对食管鳞癌细胞生长的影响。基于RNA-seq技术筛选食管癌的差异表达基因,通过GO功能富集和KEGG通路分析预测其可能的发病机制,筛选可能参与食管癌发生发展的关键调控基因及相关信号通路。结果:第一部分:meta分析结果显示ILK在消化系统肿瘤组中高表达,ILK表达与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移、肿瘤浸润程度及生存预后呈相关性,与年龄及性别无明显相关性。第二部分:在体外ESCC细胞水平,沉默ILK基因后,可显着抑制TE-1、KYSE-150细胞增殖和集落形成,促进TE-1、KYSE-150细胞凋亡。ILK基因消减后,TE-1、KYSE-150细胞侵袭及迁移能力明显减弱。第三部分:裸鼠移植瘤动物模型结果发现,ILK干扰组裸鼠肿瘤生长缓慢,相比较于对照组,肿瘤的重量及体积均偏小,ILK基因消减后影响了裸鼠成瘤的能力。基于RNA-seq技术,ILK基因干扰后挖掘到5540个食管癌差异表达基因,其中上调基因为2839个,下调基因为2601个。上调的基因有SOD2、IRF6、PER1、PHLDB2、TNFAIP3等,下调的基因有RPL21、HYOU1、WARS、SUPT16H、DHCR24等。可能参与TNF信号通路、AMPK信号通路、Fox O信号通路、P53信号通路、NF-k B信号通路等。结论:ILK在消化系统肿瘤中高表达,与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移、肿瘤浸润程度及生存预后呈相关性,与年龄及性别无明显相关性。ILK基因消减抑制ESCC细胞增殖、克隆形成、侵袭及转移,促进细胞凋亡。体内致瘤研究证实,ILK基因消减会阻碍KYSE-150移植瘤的生长。基于RNA-seq技术筛选出食管癌的差异表达基因,通过GO功能富集和KEGG通路分析预测差异表达基因,可能相关的信号传导通路。
陶华[2]（2019）在《沉默HDAC6基因通过HSP90抑制食管癌增殖和转移的作机制研究》文中研究指明背景:在中国十大最常见的恶性肿瘤中,食管癌排名第六,仅次于胃肠道肿瘤的胃癌,呈现双高特征,即高发病率和高死亡率,而且往往呈区域聚集性。中两部卫生资源匮乏的农村尤其高发,食管癌高额的医疗费用仍是当地居民的上要疾病负担,严重的威胁个人的生命健康及生活质量,给家庭、社会带来巨大的影响。随着现代医疗水平突飞猛进的提高,临床上,食管癌的预防、诊治工作也取得了显着的进展,治疗方案的制定需要综合患者的临床分期、全身情况、当地吹院的条件设备及医疗水平等因素。外科手术仍是目前食管癌最重要的治疗手段,然而,局部晚期食管癌患者的预后并不理想。针对有手术机会的ⅡA-Ⅲ期食管鳞癌,单纯手术切除5年生存率低,有待进一步提高。由于食管癌对化疗和放疗敏感性较差,术后化疗或术后放疗均未能有效提高食管癌患者的预后。早期诊治成为改善食管癌患者预后的关键。然而食管癌的病因和发病机制尚不完全明了,基因突变、染色体重排、转录调控及修饰等基因遗传学的改变在食管癌中无疑发挥着极其重要的作用。因此,寻找食管癌特异性相关基因将可能为食管癌的诊断和治疗提供新的理论依据、成为针对该肿瘤的防治关键。表观遗传调控并不涉及DNA序列改变,是一个动态可逆、可遗传的过程,与诸多疾病的关系密切,组蛋白去乙酸化酶（Histone deacetylase,HDACs）、组蛋白乙酰化转移酶（histone acetylase,HATs）,不仅是维持核心组蛋白去乙酰化和乙酰化两者之间稳态的基础,而且有利于染色质状态的调节。进而影响基因的表达,因此,乙酰化调控是表观遗传学调控最重要的方式之一。蛋白家族HDACs有众多的成员。组蛋白脱乙酰化酶6（HDAC6）因其结构中含有两个且功能上独立的HDAC催化结构域,归属于一种比较特殊的HDACs成员。HDAC6的主要作用是催化乙酰化αα-微管蛋白、热休克蛋白90（Heat shock protein 90,HSP90）等非组蛋白的脱酰化效应。而组蛋白酰基化作用并不受控于 HDAC6活性的特异性抑制。通过去除组蛋白的乙酰基和其他转录调控,HDAC6在肿瘤的形成中起着重要作用。分裂周期中,发生在细胞中的不适当脱乙酰化、从细胞质到细胞核的再分配,都可能导致转录抑制,并且异常基因表达从而诱导肿瘤的发生、发展。当下研究的焦点、热点问题之一就是HDACs及其抑制剂。已有大量的研究表明,抑制HDACs的表达或活性成为治疗恶性肿瘤行之有效的分子靶点。越来越多的研究表明,许多恶性肿瘤包括乳腺癌、口腔鳞癌、白血病、肺癌等组织中HDAC6表达异常,表明其在参与肿瘤的形成中起着不愈言说的作用。HSP90是对许多蛋白质的稳定性和功能起至关重要的分子伴侣蛋白,以维持细胞蛋白质稳态和细胞存活。同样,在肿瘤发生过程中,HSP90对肿瘤发展中不可缺少的多种致癌蛋白的稳定性和功能至关重要。HSP90在食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）细胞系中的表达量较正常的食管上皮细胞的表达量明显增加。HSP90抑制剂能阻断食管癌细胞的增殖效应,该抑制剂如17-烯丙胺-17-脱甲氧格尔德霉素（17-allyamino-17-demethoxygeldanamycin,17-AAG）。当 HDAC6沉默、失活或敲除时,作为HDAC6的底物HSP90,将发生高乙酰化作用,从而造成HSP90活性的丧失。联合抑制HDAC6和HSP90显示很好的协同作用,在人白血病细胞中,HDAC6和HSP90的联合抑制在抗癌活性中具有协同作用。HSP90-HDAC6的药物治疗可能是食管癌的一种有前景的策略。然而,迄今为止,国内外尚罕见有关HDAC6基因通过HSP90抑制食管癌增殖及转移的作用机制的研究报道。目的:1、探讨HDAC6基因在食管癌中的表达及临床意义;2、构建慢病毒载体并制备,该载体携带HDAC6基因并将其靶向沉默,奠定了后续体内、外实验工具的基石,该表达系统的应用,以期验证其进行食管癌基因治疗的有效性;3、探讨慢病毒介导靶向HDAC6基因沉默联合HSP90抑制的功能学（食管癌细胞生物学特性）影响,为食管癌临床治疗的新靶向系统最终应用提供实验依据和科学理论。方法:1、HDAC6在食管癌的表达及临床意义分别采集10例食管癌及癌旁组织,qRT-PCR和Western blot方法检测组织中HDAC6 mRNA及HDAC6蛋白的表达情况。另外选取90例食管癌标本,IHC检测食管癌中组织中HDAC6的表达情况,分析HDAC6的表达与食管癌患者临床病理的关系。2、靶向沉默HDAC6基因慢病毒载体的构建和制备2.1根据HDAC6基因（NM0001130416.1）序列为标靶,通过BLAST 同源性分析,设计、选择两段寡核甘酸序列,长度为21 nt,作为以HDAC6基因为靶点的shRNA片段序列,以该序列为模板,即能合成两对DNA单链片段,并以次为引物,经退火、双酶切后,也同样的把pLKO.1-增强型绿荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein,EGFP）质粒进行双酶切,连接、转化两种双酶切后的产物,获得2个质粒:以HDAC6基因为模板,合成了 2对长引物单链DNA片段,退火后双消化,同一双消化质粒pLKO。1-增强型绿色荧光蛋白（增强型绿色荧光蛋白,EGFP）2.2 qRT-PCR和Western blot方法检测食管正常上皮细胞系（HEEC-1）及KYSE140、KYSE170和KYSE180三株ESCC细胞系中HDAC6基因的表达情况,将转染稳定的细胞筛出。获得的质粒分别转染ESCC细胞系（KYSE140、KYSE180）,分别用qRT-PCR和Western blot方法检测HDAC6mRNA和HDAC6蛋白的表达水平,以HDAC6基因为靶点,筛选出沉默表达效应最显着的质粒;基于该质粒,通过基因克隆技术,可将携带有 HDAC6 基因靶向沉默的 shRNA 片段-pLKO.1-shRNA（HDAC6）-EGFP慢病毒包装质粒构建。2.3采用 Invitrogen公司的共转染系统,进行制备慢病毒表达载体系统（Lenti-shRNA（HDAC6）-EGFP）及其相关的质量检测,qRT-PCR 和 Western blot分别检测转染后KYSE140、KYSE180细胞株中HDAC6mRNA和HDAC6蛋白的表达。3、慢病毒介导靶向HDAC6基因沉默联合HSP90抑制表达对食管癌细胞生物学特性的影响3.1靶向HSP90-HDAC6抑制对食管癌细胞生物学特性体外实验采用构建的Lenti-shRNA（HDAC6）-EGFP慢病毒表达载体系统感染食管癌细胞株 KYSE140和 KYSE180。3.1.1 CCK-8法检测沉默HDAC6的表达对食管癌细胞增殖的影响;3.1.2 Transwell法检测沉默HDAC6的表达对食管癌细胞迁移运动的影响;3.1.3 CCK-8法检测不同浓度的HDAC6抑制剂 Tuabasin A对食管癌细胞增殖的影响;3.1.4 Transwell法检测不同浓度的Tuabasin A对食管癌细胞迁移运动的影响;3.1.5 Western blot及免疫荧光法检测HDAC6 siRNA、不同浓度的Tubastatin A对α微管蛋白乙酰化的影响;3.1.6 免疫共沉淀法（co-immunoprecipitation,CO-IP）检测 HDAC6 siRNA、不同浓度Tubastatin A对HSP90蛋白乙酰化的影响;3.1.7 Western blot检测不同浓度的HSP90特异性抑制剂 PU-H71、Tubastatin A对下游蛋白质表达的影响;3.1.8 CCK-8法检测HSP90-HDAC6抑制剂对食管鳞癌细胞增殖的影响;3.1.9 Transwell法检测 HSP90-HDAC6抑制剂对食管癌细胞迁移运动的影响;3.1.10 Western blot检测HSP90-HDAC6抑制剂对下游蛋白质表达的影响。3.2 HSP90-HDAC6抑制剂对裸鼠皮下食管癌细胞移植瘤生长抑制作用的实验研究建立食管癌细胞KYSE140移植瘤模型,接种2周成瘤后,根据治疗方式的不同,按照随机数字法,将裸鼠分为PU-H71组、TubastatinA组、PU-H71+TubastatinA组,并设赋形剂为对照组,进行腹腔注射,观察其对荷瘤裸鼠移植瘤生长、瘤体大体标本、存活情况及下游蛋白表达的影响。结果:1、HDAC6在食管癌的表达及临床意义1.1 qRT-PCR法检测HDAC6mRNA在ESCC组织及癌旁组织中的相对表达量分别为（5.13±3.78）VS（2.12±2.04）。较之于癌旁组织,在ESCC组织中HDAC6 mRNA的相对表达量显着增加,差异明显,组间差异比较具有统计学意义（P<0.05）。1.2 Western Blot法检测HDAC6蛋白在ESCC组织及癌旁组织中的相对表达量分别为（2.35±1.64）VS（1.21±0.57）。HDAC6蛋白在ESCC组织中的相对表达量较癌旁组织的相对表达量明显增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。1.3免疫组织化学检测结果显示HDAC6阳性表达位于癌细胞核。90份食管鳞状细胞癌组织标本中,62份HDAC6阳性表达,表达率为68.9%。1.4在ESCC患者中,食管癌患者的临床病理分期及淋巴结转移与HDAC6的表达有关（P<0.05）;而性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤直径、肿瘤分化、肿瘤浸润深度与HDAC6的表达无关（P<0.05）。2、靶向沉默HDAC6基因慢病毒载体的构建和制备2.1干扰靶点的设计结果人HDAC6特异性shRNA-1序列（正向序列:CCGGGCAGUUAAAUGAAUUCCAUTTCTCGAGAAATGGAATTCACCCAAC TGCTTTTTC、反向序列:AATTGAAAAAGCAGUUAAAUGAAUUCCAUTTCTCGAGAAATGGAATTCA CCCAACTGC）;人HDAC6特异性shRNA-2序列（正向序列:CCGGGGAGUUAACUGGCAGGCAUTTCTCGAGAAATGCCTGCCAGTTAACT CCTTTTTC、反向序列:AATTGAAAAAGGAGUUAACUGGCAGGCAUTTCTCGAGAAATGCCTGCCAG TTAACTCC）。2.2 测序鉴定重组质粒 pLKO.1-shRNA（HDAC6）-EGFP经BLAST软件分析,重组质粒pLKO.1-HDAC6-shRNA测序结果与原始序列比对,设计序列正确插入载体,并无碱基的缺大、突变、移位,证实合成的实验组与对照组干扰靶点均已成功构建成重组质粒,符合预期设计,载体构建成功。2.3采用共转染策略制备经PCR鉴定的Lenti-shRNA（HDAC6）-EGFP慢病毒表达载体系统,确认构建成功,该慢病毒体系具有可重复性好、高滴度、强感染活性的特点。3、HDAC6 siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞生物学特性的影响3.1 HDAC6 siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞生物学特性体外实验3.1.1 CCK-8检测了阴性对照组、干扰靶点1和十扰靶点2 组 ESCC细胞系KYSE140和KYSE180细胞的增殖能力。在两株细胞中,较之于阴性对照组,干扰靶点1和干扰靶点2组的细胞增殖率均明显降低,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）。3.1.2 Transwell检测了阴性对照组、干扰靶点1和干扰靶点2组ESCC细胞系KYSE140和KYSE180细胞的迁移运动能力。在两株细胞中,较之于阴性对照组,干扰靶点1和干扰靶点2组的细胞穿膜数均显着减少,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）。3.1.3一致地,HDAC6抑制剂Tuabasin A,也能抑制食管癌KYSE140细胞和KYSE180细胞的增殖,并呈剂量依赖性。当Tuabasin A的浓度达到500 nM时,较之于阴性对照组,抑制剂组细胞增殖率明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.1.4一致地,Tuabasin A也能抑制食管癌KYSE140细胞和KYSE180细胞的迁移运动,并呈剂量依赖性。当浓度达到500 nM时,与阴性对照组比较,抑制组细胞穿膜数均显着减少,差异具有统计学意义（P<0.05）,且在食管癌KYSE140细胞中更为明显（P<0.05）。3.1.5 α-微管蛋白是HDAC6的一个靶点,与细胞运动有关。Western blot法检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞中,干扰靶点1和干扰靶点2组均较阴性对照组表达量增加,差异显着,有统计学意义（P<0.05）。在KYSE140和KYSE180细胞中,阴性对照组、TuabasinA（100 nM）组、TuabasinA（500 nM）组、Tuabasin A（1μM）乙酰化α微管蛋白的相对表达量逐渐增加,差异比较具有统计学意义（P<0.05）。免疫荧光检测中发现,冷诱导微管破坏后,微管被分解,KYSE140和KYSE180细胞中几乎不能观察到微管。与阴性对照组相比,Tuabasin A处理的细胞中检测到更多微管（P<0.05）。3.1.6免疫共沉淀法检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞中,乙酰化HSP90蛋白在干扰靶点1和干扰靶点2组均较阴性对照组表达增加,差异显着,有统计学意义（P<0.05）。在HDAC6抑制剂的研究中,呈现一致地结果。在KYSE140和 KYSE180 细胞中,阴性对照组、Tuabasin A（100 nM）组、Tuabasin A（500 nM）组、TuabasinA（1 μM）中HSP90蛋白乙酰化量呈现递增的趋势,组间比较差异明显,具有统计学意义（P<0.05）。3.1.7 HSP90抑制剂PU-H71、Tubastatin A调节蛋白质的表达。在KYSE140和KYSE180细胞中,与对照组相比,PU-H71处理的细胞中EGFR、Akt、磷酸激酶和磷酸化ERK水平降低。在KESE140和KYSE180细胞系中,Tubastatin A治疗还可降低蛋白EGFR、AKT、磷酸化AKT（p-AKT）和磷酸化ERK（p-ERK）的表达水平,但抑制的程度较HSP90抑制剂低（P<0.05）。3.1.8 CCK-8检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞系中,阴性对照组、单独 Tubastatin A（100 nM）、单独 PU-H71（100 nM）、联合 Tubastatin A（100 nM）+PU-H71（100 nM）组的平均细胞增殖率分别为 100.00%、91.45%、78.26%、62.03%,联合Tubastatin A+PU-H71与单独任一种抑制剂治疗相比显着降低了细胞活力（P<0.05）。3.1.9 Transwell检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞系中,阴性对照组、单独 Tubastatin A（100 nM）、单独 PU-H71（100 nM）、联合 Tubastatin A（100 nM）+PU-H71（100 nM）组细胞穿膜转移数呈逐渐递减的趋势。较之于阴性对照组,抑制剂组细胞穿膜转移数明显减少,差异有统计学意义（P<0.05）。联合Tubastatin A+PU-H71 治疗与单独任一种抑制剂治疗相比显着降低了细胞迁移运动能力（P<0.05）。3.1.10 Western blot检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞系中,阴性对照组、单独 Tubastatin A（100 nM）、单独 PU-H71（100 nM）、联合 Tubastatin A（100 nM）+PU-H71（100 nM）组EGFR蛋白、p-AKT蛋白、p-ERK蛋白的表达呈逐渐递减的趋势。较之于阴性对照组,抑制剂组EGFR蛋白、p-AKT蛋白、p-ERK蛋白的表达水平降低,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）。两种细胞系的实验结果均致的表明,Tuabasin A和PU-H71联合治疗与单独的Tuabasin A或PU-H71治疗相比,EGFR、p-AKT和p-ERK的蛋白表达水平最低。3.2 HDAC6-HSP90 i对食管癌KYSE140细胞荷瘤裸鼠移植瘤的影响3.2.1裸鼠皮下移植瘤的造模选用人食管鳞状细胞癌KYSE140细胞株裸鼠皮下移植,观测移植瘤不同时间段成瘤的大小。裸鼠腹股沟接种区平均2周左右出现移植瘤,3 周后直径约0.2-0.6 cm,接种的所有动物均存活下来,并在体形成了肿瘤,接种点无发热、红肿、破溃等炎症反应。第3周开始,PU-H71+Tubastatin A注射组裸鼠移植瘤直径均明显低于上述其他三对照组移植瘤的直径,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）;第6周开始,PU-H71注射组裸鼠移植瘤直径均低于赋形剂注射组、Tubastatin A注射组移植瘤的直径,差异有统计学意义（P<0.05）。仅在 Tuabasin A（10 mg/kg）和 PU-H71（50 mg/kg）联合注射的裸鼠中观察到显着的肿瘤抑制作用。3.2.2观察裸鼠存活情况及皮下移植瘤大体标本对照组、Tuabasin A组、PU-H71组裸鼠活动少,精神状态、食欲差,嗜睡等,而PU-H71组+Tuabasin A组裸鼠活动多,精神状态好,食欲佳。联合PU-H71+Tuabasin A注射显着抑制肿瘤生长,有利于改善裸鼠的生存质量。Tuabasin A和PU-H71联合注射组移植瘤体积较小,瘤体周围能看到较明显完整的包膜形成,形状较规整,有清楚的界限,无明显浸润、粘连的现象,能较完整的剥离肿瘤组织。而瘤体内注射赋形剂、TuabasinA组的裸鼠中,移植瘤的体积则较大,瘤体组织与周围无明显的界限,边缘毛糙,瘤体周围无完整的包膜形成,更有甚至,表面皮肤将受累。3.2.3 HSP90-HDAC6抑制剂对荷瘤裸鼠移植瘤下游蛋白表达的影响荷瘤裸鼠移植瘤中,赋形剂注射对照组、单独Tubastatin A（100 nM）注射组、单独 PU-H71（100 nM）注射组、联合 Tubastatin A（100 nM）+PU-H71（100 nM）注射组瘤体中EGFR蛋白、p-AKT蛋白、p-ERK蛋白的表达呈逐渐递减的趋势。较之于阴性对照组,抑制剂组EGFR蛋白、p-AKT蛋白、p-ERK蛋白的表达水平降低,差异显着,比较具有统计学意义（P<0.05）。与其他三组相比,TuabasinA（10mg/kg）和PU-H71（50 mg/kg）联合注射组裸鼠移植瘤中EGFR、p-AKT和p-ERK蛋白表达水平最低。此外,IHC 分析也显示,Tuabasin A（10 mg/kg）+PU-H71（50 mg/kg）联合注射组可显着抑制荷瘤裸鼠移植瘤中EGFR蛋白的表达。结论:1、HDAC6高表达于食管癌组织中,促进食管癌的发生、发展,有望作为食管癌治疗的重要靶点。2、采用共转染策略制备,成功的将慢病毒穿梭质粒载体构建后,制备了 HDAC6基因靶向沉默表达的Lenti-shRNA（HDAC6）-EGFP重组慢病毒载体,经PCR鉴定和Western blot检测方法,确认构建成功,该慢病毒体系具有可重复性好、高滴度、强感染活性的特点,为进一步开展HDAC6基因的食管癌治疗临床前研究提供了必须的实验工具。3、HSP90作为HDAC6的底物,其配体的活性部分能够被HDAC6介导的脱乙酰化效应激活。构建的HDAC6基因靶向沉默慢病毒载体通过RNAi在体外可有效抑制食管癌细胞系KYSE140和KYSE180的增殖和细胞迁移运动能力,沉默HDAC6之后,HSP90的脱乙酰化效应随着沉默,表现出HSP90的乙酰化过度,从而导致HSP90配体活性散失,两者联合抑制具有协同作用。联合HDAC6抑制剂（TubastatinA）和HSP90抑制剂（PU-H71）与单独任一种抑制剂治疗相比显着降低了食管癌细胞系KYSE140和KYSE180的增殖、细胞迁移运动能力及EGFR、p-AKT和p-ERK的蛋白水平。4、食管癌KYSE140细胞荷瘤裸鼠移植瘤造模成功,HSP90-HDAC6抑制剂显着的抑制肿瘤的生长,有利于改善裸鼠的生存质量,HSP90-HDAC6抑制剂显着降低裸鼠移植瘤中EGFR、p-AKT和p-ERK蛋白表达水平。5、靶向沉默HDAC6基因可能通过HSP90的过度乙酰化有效阻断食管癌中细胞信号传导通路EGFR、p-AKT及p-ERK表达谱的变化,开辟了阐述食管癌发病机制的全新分子生物学学说,临床应用前景呈现出一片大好的趋势。
吴训[3]（2016）在《COX-2和SPARC在口腔鳞癌中表达的研究》文中认为口腔颌面-头颈鳞状细胞癌（Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC/Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck,HNSCC）占成人恶性肿瘤的8%[1],口腔颌面-头颈部肿瘤占全身恶性肿瘤的6.6%,而这其中鳞状细胞癌又占到55.8%,口腔和下咽部为高发部位（20.9%）,并呈逐年递增的趋势[2]。2015年中国约有新发浸润性癌病例数429.2万,有281.4万癌症死亡病例,其中,唇、口腔、咽癌年新发病例4.81万,年死亡病例2.21万[3]。几乎22%的全球新发癌症病例出现在中国,27%的癌症死亡病例在中国[3]。OSCC大多临近重要的组织器官,使手术的范围受到严重的制约,而且由于头颈颌面组织血管、淋巴管丰富以及舌的频繁机械运动,常发生早期颈淋巴结转移,预后较差,死亡率高达50%[1],严重威胁着人们的生命健康。尽管肿瘤综合治疗的不断发展,口腔鳞癌的治疗取得了一定的进步,但是近20年,五年生存率没有明显改善。由于口腔颌面-头颈鳞状细胞癌患者总体生存率很低,其发病相关的分子机制尚未明确,关于它的诊断与治疗始终是恶性肿瘤治疗领域的研究热点。尽管众多与肿瘤发生发展相关的生物标志在多项前瞻性研究和Meta分析中得到反复确证,但仍缺乏足够的证据支持临床应用,因此,与OSCC/HNSCC发生发展相关的分子标志的研究仍需不断的探索。初步研究显示,环氧化酶-2（Cyclooxygenases,COX-2）与富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine,SPARC）在OSCC/HNSCC组织中上调明显,提示其与OSCC/HNSCC发生和发展可能有相关性,可能是OSCC/HNSCC复发、转移和治疗指导方面有价值的关键节点基因[4-6]。目的:检测SPARC和COX-2基因在口腔鳞状细胞癌、癌旁、淋巴结以及正常组织中的表达,研究它们在肿瘤发生发展过程中的可能作用机制以及相互关系;对SPARC和COX-2的甲基化情况进行初步的探讨,验证甲基化修饰水平是否能够调控SPARC和COX-2在口腔鳞癌中的表达。方法:应用免疫组织化学、蛋白质免疫印迹、实时定量聚合酶链反应技术检测SPARC和COX-2基因在口腔鳞状细胞癌、癌旁、淋巴结以及正常组织中的表达。甲基化特异性PCR（MSP）检测上述样本中这两个基因的甲基化状态。统计学方法分析上述实验结果。结果:1.免疫组化显示COX-2在癌组织高表达,在正常组织中几乎无表达;其表达含量随肿瘤分化程度降低而逐渐增高,与肿瘤的临床分期、病理分级、淋巴结转移存在明显正相关性。COX-2m RNA的表达量在癌、癌旁、转移淋巴结组织标本中均高于正常粘膜组织,其中在癌组织的表达量最高（P<0.01）;除Ⅳ区与Ⅴ区淋巴结组织中COX-2m RNA的表达量相比不具有统计学意义以外,其余各组间COX-2m RNA的表达均具有明显统计学意义（P<0.01）。2.免疫组化显示SPARC在正常粘膜和癌旁组织呈现高表达,在癌组织中呈低表达或不表达。其表达与肿瘤分化程度和淋巴结转移呈负相关。与正常粘膜组的SPARC m RNA表达量相比,除癌旁组织和Ⅴ区淋巴结不具有统计学意义以外,其余各组表达均低于正常粘膜组织（P<0.05）。3.Western blot发现COX-2和SPARC在正常组织、癌旁组织、口腔鳞癌和淋巴结组织中有不同程度的表达,且蛋白表达水平与二者m RNA表达趋势一致。4.COX-2m RNA和SPARCm RNA的相对表达量在口腔癌组织、癌旁组织、颈部Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ区淋巴结中表现为显着的负相关性P=0.000。5.在头颈鳞癌多个细胞系中COX-2的表达强烈,SPARC表达沉默或低下,二者表达趋势与所测癌组织中表达结果一致。6.在OSCC组织样本中,在癌组织,淋巴结组织中SPARC基因启动子均出现了高甲基化,而COX-2基因启动子则出现非甲基化状态。在正常组织中,COX-2基因启动子则出现高甲基化,SPARC基因启动子则表现出了非甲基化状态。在癌旁组织中,COX-2和SPARC均表现为非甲基化。7.在头颈肿瘤Scc-9、Scc-25、Tca8113、HN13多个细胞系均发现SPARC基因启动子区出现甲基化修饰,而COX-2基因启动子区无甲基化条带。在正常上皮细胞系h OMK则发现COX-2甲基化和SPARC非甲基化。8.在舌癌细胞株中COX-2基因启动子23个Cp G岛仅有36个位点出现甲基化,甲基化率不足10%;SPARC的17个Cp G岛全部出现甲基化修饰。去甲基化处理后,SPARCm RNA的表达出现明显上调（P=0.000）;COX-2m RNA的表达无明显变化,组间比较无统计学差异（P=0.064）。9.COX-2和SPARC蛋白表达状态与启动子区甲基化均存在着负相关关系,P=0.000。结论:1、COX-2在口腔鳞状细胞癌中高表达,与临床TNM分期的密切相关,可能是口腔鳞状细胞癌的促进因子。2、SPARC在口腔鳞状细胞癌中低表达,其表达缺失与临床TNM分期关系密切,可能是口腔鳞状细胞癌的抑制因子,可以作为口腔鳞状细胞癌诊断的分子生物学标志物。3、癌组织中SPARC启动子区甲基化和COX-2启动子区去甲基化是引起二者蛋白表达及m RNA表达异常的重要原因。4、COX-2和SPARC的表达沿纵形淋巴链呈梯度变化,且它们的表达存在着负相关关系,二者在OSCC的发生发展过程中可能存在着某种拮抗作用。
吴慧[4]（2012）在《cox-2表达与食管鳞状细胞癌放射敏感性的基础与临床研究》文中进行了进一步梳理前言食管癌是十大恶性肿瘤之一,我国发病率据世界首位,发病人数占全世界的50%以上。约60%以上的患者就诊时为中晚期,这些患者的治疗主要是以放射治疗为主的综合治疗,放射治疗已成为中晚期食管癌的主要治疗手段之一。中国食管癌的主要病理类型是鳞癌,属中度放射敏感性肿瘤,单纯放疗5年生存率仅10～20%,多数患者死于肿瘤局部未控和复发。寻找放疗敏感性的分子标志物,预测食管癌放射敏感性,探讨食管癌放疗抗拒性的机制,提高肿瘤局部控制率是本研究的主要目的。研究表明Cox-2可作为评估肿瘤对放射治疗是否抵抗的一个指标,在肿瘤组织中Cox-2蛋白的表达水平越高,其放射敏感性越差。Cox-2基因表达水平的高低与放射治疗疗效之间的关系在头颈部肿瘤的治疗方面有不少报道,但在食管癌方面研究甚少。本研究通过分析76例食管癌患者近期放疗疗效与肿瘤组织中Cox-2表达水平,探讨Cox-2表达与食管鳞状细胞癌放射抗拒性的关系；通过构建Cox-2特异性siRNA重组质粒和Cox-2表达载体,转染人食管癌EC9706细胞,分别下调和上调Cox-2基因表达,再联合不同剂量的X射线照射,观察放射结合Cox-2基因调控对细胞增殖、细胞周期、凋亡、细胞侵袭能力和放射敏感性的影响,并初步探讨沉默Cox-2基因表达的放射增敏机制；通过观测荷瘤裸鼠经放射线照射后瘤体体积的变化,从活体水平来评价双向调控Cox-2基因表达对放射线的增敏作用,为基因治疗联合放射治疗的临床应用提供理论基础和实验依据。材料与方法1.单纯采用放射治疗的76例食管鳞癌患者。2.采用免疫组织化学SP法分别检测76例食管鳞癌组织中Cox-2的表达水平。并检测其中20例患者正常食管黏膜组织中Cox-2蛋白的表达。用统计学软件SPSS13.0对实验数据进行统计学处理,观察食管鳞癌组织中Cox-2蛋白表达水平与放疗抗拒性的关系。3.针对人Cox-2基因mRNA序列,构建2个siRNA重组质粒：pRNA-U6.1-sicox214和pRNA-U6.1-sicox799,同时构建Cox-2表达载体和1个无关序列siRNA,利用脂质体转染技术转入人食管癌EC9706细胞,G418筛选得到稳定转染细胞株。同时设立转染无关序列siRNA组、空载体对照组和未转染组。4.0Gy、2Gy、4Gy射线照射,应用荧光定量RT-PCR检测细胞中Cox-2、MMP2、Bax、Bcl-2的表达水平；Western blot检测Cox-2蛋白及AKT蛋白和磷酸化AKT蛋白（pAKT）的表达。5.流式细胞术检测EC9706细胞周期和细胞凋亡率,比较各实验组经0、2、4Gy射线照射后细胞周期以及凋亡率的变化；6.通过Transwell侵袭小室实验检测双向调控Cox-2表达联合射线照射对食管鳞癌细胞侵袭活性的影响。7.CCK8实验和克隆形成实验检测不同剂量射线照射对细胞增殖能力和存活分数的影响。8.建立稳定转染的EC9706细胞株裸鼠移植瘤模型,观测荷瘤裸鼠经20Gy射线照射后瘤体体积的变化,从体内实验进一步探讨双向调控Cox-2表达对食管鳞癌组织放射敏感性的影响。统计学分析采用SPSS13.0统计学软件对所有数据均进行统计学处理,两变量之间的关系分析用spearman等级相关分析表示,阳性率之间的比较用χ2检验,检验标准以α=0.05为显着性检验水准。结果：1.76例食管癌患者放射治疗结束后1个月做胸部增强CT扫描和食管钡餐造影检查进行疗效评价,其中放射敏感（CR+PR）55例（CR：13例；PR：42例）；NR（21例）放射抗拒。2.免疫组织化学SP法检测证实,正常食管黏膜组织中Cox-2蛋白的表达明显低于食管鳞癌组织,放射抗拒组Cox-2蛋白的表达明显增高,且明显高于放射敏感组（p<0.05）。3.成功构建了2个Cox-2基因siRNA重组质粒和1个Cox-2表达载体,经测序鉴定正确。利用脂质体转染技术成功导入人食管癌EC9706细胞,经G418筛选得到稳定转染的人食管癌EC9706细胞。4.0、2、4Gy的X射线照射后,荧光定量RT-PCR和Western blot检测结果显示沉默Cox-2基因表达的EC9706细胞中MMP2mRNA、Bcl-2mRNA、AKT蛋白和磷酸化AKT的表达水平均显着降低,且与照射剂量呈反比。BaxmRNA表达水平显着升高,与照射剂量呈正比。而上调Cox-2表达的EC9706细胞中MMP2mRNA、Bcl-2mRNA、AKT蛋白和磷酸化AKT的表达水平均显着升高,BaxmRNA表达水平显着降低,与照射剂量均无明显相关性。5.流式细胞仪检测证实Cox-2沉默组G0／G1期细胞所占比例及细胞凋亡率较Cox-2上调组及对照组均明显增高,差异有统计学意义（p<0.05）；且均有随照射剂量增加而上升的趋势。6. Transwell侵袭小室实验结果显示,沉默Cox-2表达可以显着降低食管癌细胞EC9706的侵袭活性。7.CCK8实验证实0、2、4Gy的射线照射,沉默Cox-2表达对细胞生长均有抑制作用,而上调Cox-2表达组细胞增殖抑制率均为负值。克隆形成实验结果显示与对照组相比沉默Cox-2表达可降低食管癌EC9706细胞集落形成能力,使细胞存活率明显下降（p<0.05）。而上调Cox-2表达相对存活率较对照组升高（p<0.05）。8.裸鼠移植瘤实验证实接种3周后沉默Cox-2表达组的平均瘤体体积较对照组明显减低（p<0.05）,上调Cox-2表达组的平均瘤体体积较对照组明显增高（p<0.05）。放射治疗20Gy后,沉默Cox-2表达组平均肿瘤体积明显减小（p<0.01）,而上调组裸鼠皮下种植瘤平均体积较放疗前无明显变化（p>0.05）。结论1.食管鳞癌组织中Cox-2蛋白呈阳性表达,且放射抗拒组Cox-2蛋白表达率明显高于放射敏感组。2.沉默Cox-2基因表达,EC9706细胞中MMP2mRNA、Bcl-2mRNA、AKT蛋白和磷酸化AKT的表达水平下降,且与照射剂量呈反比,但BaxmRNA表达水平上调,与照射剂量呈正比；而上调Cox-2表达则结果相反。3.RNA干扰Cox-2基因表达对EC9706细胞有放射增敏作用,其增敏机制与MMP2、Bax、Bcl-2、AKT蛋白和磷酸化AKT蛋白有关。4.裸鼠移植瘤实验显示,沉默Cox-2表达能够显着抑制瘤体生长,增加肿瘤对放射治疗的敏感性。
龙思泽,张初民[5]（2011）在《环氧合酶-2与Barrett’s食管和食管腺癌的关系》文中进行了进一步梳理Barrett’s食管（BE）被认为是食管腺癌（EAC）的癌前病变,环氧合酶-2（COX-2）在BE和EAC中表达增加,可能是BE向EAC转化的早期分子事件。COX-2基因多态性研究显示COX-2-1195G→A基因型人群患EAC等消化系统肿瘤的风险增加。COX-2可能通过抑制细胞凋亡和刺激细胞增殖、促进肿瘤血管、淋巴管生成、影响细胞周期进程等多种机制促进EAC的发生、发展。而COX-2抑制剂对BE和EAC的防治作用尚无一致结论,COX-2相关的基因治疗可能有较好的前景。
陈占峰,陈滋华,万春辉,谢艳敏,袁占鹏[6]（2009）在《硒蛋氨酸对食管癌细胞株环氧合酶-2表达影响》文中研究表明目的:探讨硒蛋氨酸对食管癌细胞系EC9706环氧合酶-2（COX-2）表达的影响。方法:采用MTT比色法、细胞生长曲线描绘观察硒蛋氨酸对食管癌细胞系EC9706增殖的影响,琼脂糖凝胶电泳法检测DNA ladder,细胞免疫化学方法检测EC9706COX-2的表达。结果:硒蛋氨酸呈时间、剂量依赖性方式抑制EC9706细胞增殖,抑制食管癌细胞系EC9706COX-2的表达,诱导细胞凋亡。结论:硒蛋氨酸可能通过抑制食管癌细胞系EC9706COX-2的表达从而抑制EC9706细胞增殖,诱导细胞凋亡。
陈玉龙[7]（2009）在《Survivin反义寡核苷酸联合TCS诱导食管癌细胞Eca-109凋亡的作用与机制》文中认为目的:研究天花粉蛋白（Trichosanthin,TCS）对食管癌细胞Eca-109增殖的影响及与survivin的关系,在此基础上,进一步探讨Survivin反义寡核苷酸联合TCS诱导细胞凋亡的作用及其分子机制。方法: TCS处理食管癌细胞Eca-109后,应用MTT法检测TCS对Eca-109细胞增殖的抑制作用;透射电子显微镜观察亚细胞结构变化;AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞早期凋亡率;流式细胞仪分析细胞周期;RT-PCR检测Eca-109细胞survivin mRNA表达变化;Western blot检测Survivin、Caspase-3与C-myc蛋白表达变化;TRAP-PCR银染法测定细胞的端粒酶活性。进而,将实验分6组:未处理组、脂质体组、survivin正义寡核苷酸组（SODN）、survivin反义寡核苷酸组（ASODN）、天花粉蛋白组（TCS）、survivin反义寡核苷酸联合天花粉蛋白组。各处理因素作用食管癌细胞Eca-109后, RT-PCR检测Eca-109细胞survivin mRNA表达变化;Western blot检测Survivin、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达变化;AnnexinV-FITC/PI双染法检测Eca-109细胞早期凋亡率。结果:TCS对食管癌细胞Eca-109增殖有抑制作用且具有剂量-时间依赖性;33μg/ml TCS作用细胞48h后,与未处理组相比,TCS组早期凋亡率增高（P<0.05）,G2期阻滞、S期细胞明显增多（P<0.05）,survivin mRNA及Survivin、C-myc蛋白表达量下降,Caspase-3蛋白表达量则增高,端粒酶活性降低,差别均具有统计学意义（P<0.05）。各处理因素作用食管癌细胞Eca-109 48h后, ASODN组、TCS组和联合组的survivin mRNA和Survivin蛋白表达水平明显低于脂质体组、SODN组和未处理组,差别具有显着性（P<0.05）;脂质体组、SODN组和未处理组两两比较,差别均无显着性（p>0.05）;联合组survivin mRNA和Survivin蛋白表达水平明显低于ASODN组和TCS组,差别有显着性（P<0.05）;ASODN组和TCS组差别无显着性（P>0.05）。ASODN组、TCS组和联合组的早期凋亡率和Caspase-3蛋白表达水平明显高于脂质体组、SODN组和未处理组,差别具有显着性（P<0.05）;脂质体组、SODN组和未处理组两两比较,差别均无显着性（P>0.05）;联合组的早期凋亡率和Caspase-3蛋白表达水平高于ASODN组和TCS组,差别有显着性（P<0.05）;ASODN组和TCS组差别无显着性（P>0.05）。TCS组和联合组细胞的Bcl-2蛋白的表达,与其他四组相比,明显降低,差别有显着性（P<0.05）, Bax蛋白的表达则增加,差别也具有显着性（P<0.05）。关于Bcl-2、Bax蛋白的表达,TCS组和联合组差别无显着性（P>0.05）,脂质体组、SODN组、ASODN组与未处理组两两比较,差别均无显着性（P>0.05）。结论:TCS具有抑制食管癌细胞Eca-109增殖、诱导凋亡作用, survivin抑制可能是其作用机制的关键环节。TCS联合survivin的ASODN在诱导Eca-109细胞的凋亡方面,能够发挥协同作用;TCS和survivin的ASODN共同抑制survivin基因表达;TCS下调Bcl-2蛋白表达和上调Bax蛋白表达,激活caspase级联反应途径,此为两药发挥协同作用的分子基础。
冯艳铭[8]（2008）在《慢病毒介导的亲环素A（CyPA）siRNA对非小细胞肺癌抑制作用的实验研究》文中提出肺癌是常见的恶性肿瘤,被认为是对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。全球每年新增120万病例,中国每年有60万人死于肺癌,在中国肺癌5年生存率仅8.9%,非小细胞肺癌占肺癌的85%以上,而非小细胞肺癌中85%以上又都属中晚期肺癌而失去根治性手术治疗的机会。肺癌的发生是环境因素和遗传因素共同作用的结果,多种基因在肺癌的发生和发展中均起到了非常重要的作用,蛋白组学的发展使得在非小细胞肺癌（Non-small celllung cancer,NSCLC）发现了许多高表达和低表达蛋白,亲环素A（Cyclophilin A,CyPA）就是众多相关蛋白之一。CyPA是本课题组应用双向电泳技术（2-DE）在肺腺鳞癌组织中发现的特异性高表达的差异蛋白,CyPA是功能相关的蛋白家族成员之一,具有肽基脯氨基顺反异构酶活性,能催化细胞内蛋白质的折迭、装配和运输,起分子伴侣的作用。新近研究表明,CyPA参与了许多癌的发生和发展过程,其促进癌细胞生长的作用在胰腺癌研究中,取得了很有说服力的结果。RNA干扰（RNAi）技术具有快速、高效、易行的特点,在基因功能研究、基因治疗方面显示了巨大的前景。慢病毒载体介导的短发夹RNA（shRNA）表达载体能感染非分裂细胞和终末分化细胞,并且在感染后整合到宿主细胞的基因组,进行长时间的稳定表达,适合体内实验研究。研究目的1.假设特异性地沉默CyPA基因可能是抑制非小细胞肺癌生长的有效方法,为此,本课题首先构建慢病毒介导的CyPA siRNA系统。2.本课题旨在研究CyPA在NSCLC发生中的作用,以寻求其作为基因治疗新靶点的依据。因此,采用慢病毒介导的CyPA siRNA,分别在体内体外水平研究CyPA基因沉默对非小细胞肺癌细胞生长的抑制作用,对已筛选的肺癌相关蛋白CyPA的基因进行生物学功能研究。材料与方法1.CyPA mRNA和蛋白在NSCLC细胞和组织的表达水平1.1采用双链嵌合荧光染料SYBR GreenⅠ荧光定量PCR技术,设计特异性引物,提取NSCLC A549、H1299及人正常支气管上皮细胞BEAS-2B细胞的总RNA,反转录获得cDNA进行PCR,低熔点琼脂糖凝胶回收纯化PCR扩增产物,取1μl的纯化产物,作10倍系列稀释共9个梯度,取后6个稀释梯度的模板做标准曲线,分别建立内对照β-actin和目的基因CyPA定量标准曲线。检测A549、H1299及BEAS-2B细胞CyPAmRNA的表达水平,以BEAS-2B细胞作为对照,用2-ΔΔCt计算CyPAmRNA相对表达量,通过PCR产物的熔解曲线评价其特异性。1.2收集45例NSCLC手术病人切除的肺癌组织,22例对应的癌旁组织,33例对应的正常肺组织制成组织芯片,其中鳞癌25例,腺癌20例;按TNM分期标准Ⅰ+Ⅱ期27例,Ⅲ期18例,用SP免疫组化方法和组织芯片技术,观察CyPA在NSCLC癌组织、癌旁组织及正常组织中的表达和分布情况以及与临床病理指标的关系。2.构建并筛选慢病毒介导的CyPA siRNA有效靶点和制备病毒颗粒2.1首先设计并合成4对CyPA基因siRNA靶序列寡核苷酸,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的pGCL-GFP载体连接产生Lv-shCyPA慢病毒质粒载体,PCR及测序筛选鉴定阳性克隆。2.2将阳性克隆Lv-shCyPA慢病毒质粒载体与pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染293T细胞,包装制备5个假包装病毒颗粒（Lv-shCyPA）并感染NSCLC A549、H1299细胞,Western Blot分析CyPA蛋白表达水平,筛选CyPA siRNA有效靶点并进行该靶点高滴度病毒包装,命名为Lv-shCyPA。2.3待A549、H1299细胞生长至50%～70%融合度时,将Lv-shCyPA分别按照MOI值为2、5、10、20、40感染A549细胞、H1299,根据表达荧光的细胞百分数优化MOI值。3.慢病毒介导的CyPA siRNA对A549、H1299细胞生长的体外研究3.1待A549、H1299细胞生长至50%～70%融合度时,按照优化的MOI值,加入适量的病毒,每孔细胞加Polyberne（5μg/ml）,正常培养传代4～5次,以GFP为报告基因镜下筛选GFP强表达的克隆,分离培养,建立了CyPA稳定沉默的细胞系A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA。3.2将Lv-shCyPA分别按照A549细胞（MOI=20）、H1299（MOI=5）感染NSCLC A549、H1299细胞,感染第5天提取细胞总RNA,采用荧光定量RT-PCR检测CyPA mRNA表达水平。3.3取对数生长期的CyPA稳定沉默的细胞系A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA,胰酶消化后重悬成2×104/ml的细胞悬液,每孔接种100μl于96孔板,分别在培养1d、2d、3d、4d、5d、6d时终止培养,MTT法检测细胞增殖情况。3.4将Lv-shCyPA按照A549细胞（MOI=20）、H1299（MOI=5）感染A549、H1299细胞,用不含EDTA的0.25%胰酶消化感染第5天的细胞培养物,4℃70%乙醇固定细胞,加1mlPI（50μg/ml）染色,4℃避光30min,进行细胞周期及凋亡检测。3.5阴性对照病毒颗粒按上述步骤进行平行实验,未感染病毒的A549、H1299分别作为实验对照组。4.慢病毒介导的CyPA siRNA对A549、H1299细胞裸鼠移植瘤生长的作用4.1 A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA细胞悬液（5×107/ml）,注射于裸鼠协腹皮下,每组5～6只裸鼠,注射体积为100μl/只。4.2裸鼠成瘤后每四天测量1次移植瘤体积,从注射起测量到第38d,肿瘤体积=（长×宽2）×0.5,根据移植瘤体积绘制移植瘤生长曲线。4.3阴性对照病毒颗粒感染的A549、H1299按上述步骤进行致瘤,未感染病毒的A549、H1299分别作为实验对照组。5.统计学处理利用SPSS12.0软件对数据进行统计分析,采用t检验对不同感染条件下细胞CyPA蛋白、mRNA、细胞增殖率、细胞周期分布、凋亡率以及裸鼠移植瘤瘤体、重量与对照组比较;秩和检验比较不同组织CyPA蛋白表达水平的差异,以α=0.05为检验水准。结果1.CyPA mRNA和蛋白在NSCLC细胞和组织的表达水平1.1荧光定量RT-PCR检测A549、H1299、BEAS-2B细胞中CyPA mRNA的表达水平,结果显示:肺腺癌细胞A549、H1299中CyPA mRNA呈高表达,其表达水平与BEAS-2B细胞相比差异均有统计学意义（P＜0.05）。1.2组织芯片免疫组织化学技术检测,结果显示:CyPA蛋白的阳性信号见于肺癌细胞浆、肺泡上皮细胞浆,呈棕色颗粒状,其分布以广泛性表达为主,偶见局灶性或散在性分布;正常肺组织未见或少见棕色颗粒沉着。NSCLC癌组织及癌旁组织中CyPA的表达水平明显高于正常肺组织中CyPA蛋白的表达水平,其差异有统计学意义（P＜0.05）,CyPA蛋白在正常组织、癌旁组织及肺癌组织中的阳性表达率分别为9.09%（3/33）、53.62%（12/22）、82.22%（37/45）,CyPA在正常组织、癌旁组织及肺癌组织中的表达水平依次呈递增趋势;肺腺癌与肺鳞癌组织中CyPA蛋白的表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）;不同TNM分期的的癌组织CyPA蛋白的表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。2.慢病毒介导的CyPA siRNA的有效靶点有效的CyPA siRNA靶序列是5’-GTGAAAGAAGGCATGAATA-3’,根据该序列制备的CyPA siRNA假包装病毒颗粒滴度为2×109TU/ml。3.慢病毒介导的CyPA siRNA对A549、H1299中CyPA基因的沉默作用Lv-shCyPA感染A549、H1299细胞,CyPA mRNA和蛋白表达水平均下降,与对照组相比,CyPA mRNA相对表达量分别为0.048和0.1452,CyPA mRNA的沉默效率分别为95.2%和85.48%,CyPA蛋白水平相对表达量分别为13.48%和14.7%,其表达抑制效率分别为86.52%和85.3%,CyPA mRNA与蛋白的表达水平具有一致性,其表达水平与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05）。阴性对照A549/NC、H1299/NC组CyPA mRNA和蛋白的表达水平与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。4.慢病毒介导的CyPA siRNA对A549、H1299细胞生长的抑制作用MTT法分析不同条件下A549、H1299细胞的生长状态,结果显示:A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA细胞生长明显平缓,感染第5d细胞增殖率下降,与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。流式细胞术分析不同条件下细胞各周期分布,结果显示:不同条件下细胞G0-G1期、S期细胞比例与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）;A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA细胞G2-M期细胞相对减少,细胞凋亡率增加,与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05）;而A549/NC、H1299/NC组G2-M期比例、细胞凋亡率与对照组相比差异均无统计学意义（P＞0.05）。5.慢病毒介导的CyPA siRNA对A549、H1299细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用未感染病毒组及阴性对照病毒颗粒感染组的细胞接种裸鼠后,移植瘤在第4d出现可见肿瘤,然后生长迅速,而A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA感染组可见肿瘤在接种后6d出现,移植瘤生长明显迟缓。接种后第38d,A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA组移植瘤体积小、重量轻,与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05）,CyPA基因沉默组移植瘤瘤体重量平均降低了77.76%和78.85%。而A549/NC、H1299/NC组细胞接种后形成的移植瘤体积、重量与对照组相比差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论1.CyPA蛋白在正常肺组织、NSCLC癌旁组织及癌组织中的表达水平依次呈递增趋势,尤其是在癌组织中呈高表达水平;同时在NSCLC A549、H1299细胞中CyPA mRNA亦呈高表达水平,CyPA mRNA的表达水平与BEAS-2B细胞相比差异有统计学意义,提示CyPA可能参与了非小细胞肺癌的发生发展。2.筛选出有效的CyPA siRNA靶序列为5’-GTGAAAGAAGGCATGAATA-3’,制备的Lv-shCyPA经体外观察对NSCLC A549、H1299中CyPA基因的表达有沉默作用,对NSCLC A549、H1299生长有抑制作用。3.慢病毒介导的CyPA siRNA在裸鼠移植瘤实验中也显示出一定的抑瘤作用,为肺癌的基因治疗和药物治疗提供新的治疗策略。
李胜保,费沛,童强,王强,荣珍,王小虎,吴清明[9]（2007）在《选择性环氧合酶-2抑制剂NS-398对食管癌细胞株EC9706的生长抑制作用》文中研究指明目的:探讨NS-398对人食管癌细胞株EC9706的生长抑制作用。方法:采用3H-TdR掺入法检测不同浓度（0、10、20、50、100μmol/L）和作用24、48、72、96h的NS-398对细胞的增殖抑制效应;采用流式细胞术（FCM）及DNA片段分析法检测NS-398诱导的细胞凋亡情况。结果:EC9706经不同浓度的NS-398处理后,实验组3H-TdR掺入量明显减少,具有时间和剂量依赖关系,与对照组比较差异显着（P<0.05或P<0.001）。FCM检测发现实验组在G1期前出现亚倍体凋亡峰,细胞凋亡率达（45.23±1.08）%,并出现典型的细胞凋亡梯带;而对照组无凋亡峰出现,细胞凋亡率为（2.14±0.28）%,两组比较有显着性差异（P<0.001）。结论:NS398对食管癌细胞株EC9706细胞具有增殖抑制作用和诱导细胞凋亡作用。
王小虎,李胜保,谢国建,易建华,吴清明[10]（2005）在《腺病毒介导的环氧合酶-2反义RNA对肝癌细胞株生长的影响》文中研究表明目的探讨环氧合酶-2（COX-2）的表达与肝癌的关系,并构建表达人COX-2反义RNA的腺病毒载体,研究其对人肝癌细胞生长的抑制作用。方法采用免疫组织化学法探讨34例肝癌组织COX-2 的表达与肝癌病理特征的关系。采用基因重组法把人COX-2的cDNA片段反向克隆于穿梭质粒pHCMVSP1A,获得pAd-AShcox-2,通过脂质体与pJM17共转染293细胞,经同源重组产生编码COX-2反义RNA的重组腺病毒--Ad-AShcox-2。经聚合酶链反应法鉴定为阳性克隆者大量扩增、纯化,转染人肝癌细胞株SMMC-7402和SMMC-7721,采用免疫细胞化学、细胞集落形成率及流式细胞术检测其对肝癌细胞生长、凋亡及细胞周期分布的影响。结果34例肝癌组织中有28例COX-2高度表达,阳性率达82.4%; COX-2的表达水平与肝癌的病理分级有关,与甲胎蛋白、细胞类型、有无肝内转移无关。成功构建、扩增、纯化得到编码COX-2反义RNA的重组腺病毒Ad-AShcox-2,滴度达1.06×1012PFU/ml;Ad-AShcox- 2转染两种肝癌细胞株后,发现高度表达COX-2的SMMC-7402 COX-2表达水平明显降低,细胞凋亡率明显增加,出现G1期阻滞,与Ad-LacZ组及空白对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）;而不表达COX- 2的SMMC-7721变化不明显。细胞集落形成实验显示SMMC-7402细胞集落形成率较低（2.7%±0.94%）; 而SMMC-7721
二、腺病毒介导的cox-2反义RNA对食管癌细胞株生长的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、腺病毒介导的cox-2反义RNA对食管癌细胞株生长的影响（论文提纲范文）
（1）ILK对食管鳞癌恶性表型的影响及其功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 ILK表达与消化系统恶性肿瘤临床表型及预后相关性的Meta分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 检索数据库 |
| 1.2 文献纳入和排除标准 |
| 1.3 文献筛选和资料提取 |
| 1.4 研究方法学质量评价 |
| 1.5 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 ILK对食管鳞癌细胞恶性表型的功能影响 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 细胞系及来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 ILK对食管鳞癌体内成瘤性的影响及生物信息学分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验动物来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 整合素连接激酶在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文 导师评阅表 |
（2）沉默HDAC6基因通过HSP90抑制食管癌增殖和转移的作机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 HDAC6基因在食管癌中的表达及临床意义 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 组织来源及患者资料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 主要方法 |
| 1.5 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 HDAC6 mRNA在食管癌组织及癌旁组织中的表达水平 |
| 2.2 食管癌组织及癌旁组织中的HDAC6蛋白的表达水平 |
| 2.3 免疫组织化学检测结果 |
| 2.4 食管癌组织中HDAC6的表达水平与食管癌临床病理特征关系 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 靶向沉默HDAC6基因shRNA慢病毒载体的构建和制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 载体及细胞 |
| 1.4 主要仪器及耗材 |
| 1.5 主要溶液配制 |
| 1.6 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 干扰靶点设计结果 |
| 2.2 重组质粒pLKO.1-HDAC6-shRNA测序鉴定 |
| 2.3 HDAC6 mRNA在食管鳞状细胞癌系中的表达 |
| 2.4 HDAC6蛋白在食管鳞状细胞癌系中的表达 |
| 2.5 慢病毒干扰后KYSE140和KYSE180细胞中HDAC6 mRNA和蛋白的表达 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 HDAC6 siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞生物学特性的影响 |
| 第一节 HDAC6 siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞的体外实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 主要方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 沉默HDAC6的表达抑制食管癌细胞增殖 |
| 2.2 沉默HDAC6的表达抑制食管癌细胞的迁移运动 |
| 2.3 HDAC6抑制剂Tuabasin A抑制食管癌细胞增殖 |
| 2.4 HDAC6抑制剂Tuabasin A抑制食管癌细胞迁移运动 |
| 2.5 HDAC6siRNA及Tubastatin A增加α微管蛋白的乙酰化作用 |
| 2.6 HDAC6siRNA及Tubastatin A增加HSP90的乙酰化作用 |
| 2.7 HSP90抑制剂和TubastatinA调节下游蛋白质的表达 |
| 2.8 HSP90-HDAC6抑制剂对食管鳞癌细胞增殖的影响 |
| 2.9 HSP90-HDAC6抑制剂对食管鳞癌细胞迁移的影响 |
| 2.10 HSP90-HDAC6抑制剂对下游蛋白表达的影响 |
| 第二节 HDAC6siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞的体内实验研究 |
| 1 材料及方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 裸鼠皮下移植瘤模型建立 |
| 2.2 HSP90-HDAC6抑制剂对荷瘤裸鼠移植瘤下游蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 HSP90相关性抑制剂的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 攻读博士学位期间参编的书籍 |
| 攻读博士学位期间获得奖项 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（3）COX-2和SPARC在口腔鳞癌中表达的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 标本收集与标本库的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 COX-2 与SPARC在口腔鳞状细胞癌中的表达与临床病理特征的相关性研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 1.4 实验耗材 |
| 1.5 实验用主要试剂的配置 |
| 1.6 实验用器械的处理 |
| 1.7 实验方法 |
| 1.8 统计学分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 免疫组化检测结果 |
| 2.2 实时荧光定量 PCR 检测结果 |
| 2.3 Western Blot 检测结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三部分 口腔鳞状细胞癌中COX-2、SPARC的DNA甲基化修饰研究 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文 |
（4）cox-2表达与食管鳞状细胞癌放射敏感性的基础与临床研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一部分 COX-2表达与食管鳞状细胞癌放射敏感性关系的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 调控COX-2表达与食管癌EC9706细胞放射敏感性关系的研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 调控COX-2对人食管癌细胞EC9706裸鼠移植瘤放射敏感性的影响 |
| 前言 |
| 实验材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 食管癌放化疗敏感性的研究与进展 |
| 一、食管癌放射敏感性的基础研究 |
| 二、食管癌放射敏感性的临床研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
（5）环氧合酶-2与Barrett’s食管和食管腺癌的关系（论文提纲范文）
| 1 COX |
| 2 COX-2在BE和EAC中的表达 |
| 3 COX-2基因多态性与EAC易感性 |
| 4 COX-2在EAC发生发展中的作用机制 |
| 4.1 抑制细胞凋亡和刺激细胞增殖 |
| 4.2 促进肿瘤血管、淋巴管生成 |
| 4.3 影响细胞周期进程 |
| 4.4 增强肿瘤细胞的浸润和转移 |
| 4.5 抑制免疫反应 |
| 4.6 加强前致癌物的转变 |
| 5 COX-2与Barrett's食管和EAC的防治 |
| 5.1 COX-2抑制剂 |
| 5.2 以COX-2为靶向的基因治疗 |
| 6 结语 |
（6）硒蛋氨酸对食管癌细胞株环氧合酶-2表达影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要试剂 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.1.3 细胞系 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 硒蛋氨酸对食管癌细胞EC9706生长的影响 |
| 1.2.3 细胞生长曲线 |
| 1.2.4 DNA琼脂糖凝胶电泳法 |
| 1.2.5 硒蛋氨酸对食管癌细胞系EC9706COX-2表达的影响 |
| 1.2.6 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 MTT测定结果 |
| 2.2 细胞生长曲线 |
| 2.3 琼脂糖凝胶电泳检测DNA ladder结果 |
| 2.4 硒蛋氨酸对食管癌细胞系EC9706 COX-2表达的影响 |
| 3 讨论 |
（7）Survivin反义寡核苷酸联合TCS诱导食管癌细胞Eca-109凋亡的作用与机制（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文正文：Survivin 反义寡核苷酸联合 TCS 诱导食管癌细胞Eca-109 凋亡的作用与机制 |
| 前言 |
| 第一部分 TCS 对食管癌细胞 Eca-109 的增殖抑制作用 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Survivin 反义寡核苷酸联合 TCS 诱导食管癌细胞 Eca-109 凋亡的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附图 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间所完成的论文 |
（8）慢病毒介导的亲环素A（CyPA）siRNA对非小细胞肺癌抑制作用的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 慢病毒介导的亲环素A(CyPA)siRNA对非小细胞肺癌抑制作用的实验研究 |
| 引言 |
| 1.研究背景及目的、意义 |
| 2.研究技术路线 |
| 第一部分 人CyPA在非小细胞肺癌中的表达水平研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 慢病毒介导的CyPA siRNA的构建及假包装病毒颗粒的制备 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 慢病毒介导的CyPA siRNA对非小细胞肺癌抑制作用的体外研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四部分 慢病毒介导的CyPA siRNA对非小细胞肺癌抑制作用的体内研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| RNA干扰技术在肿瘤基因治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 后记 |
| 本课题创新点 |
| 本课题的启示与下一步工作 |
| 英文缩写词索引 |
| 图表索引 |
| 博士研究生期间主要成绩 |
| 致谢 |
（9）选择性环氧合酶-2抑制剂NS-398对食管癌细胞株EC9706的生长抑制作用（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 细胞系 |
| 1.4 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 NS-398对食管癌细胞EC9706 3H-TdR掺入的影响 |
| 2.2 NS-398诱导食管癌细胞凋亡的定量检测 |
| 2.3 DNA片段分析 |
| 3 讨论 |
（10）腺病毒介导的环氧合酶-2反义RNA对肝癌细胞株生长的影响（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 1. 试剂: |
| 2. 质粒、菌株、腺病毒与细胞系: |
| 3. 肝癌组织COX-2的表达: |
| 4. COX-2反义RNA重组腺病毒载体的构建、鉴定、扩增、纯化、滴度测定: |
| 5. 病毒转染效率测定: |
| 6. 肝癌细胞株重组腺病毒的转染及COX-2表达变化的检测: |
| 7. 流式细胞仪检测: |
| 8. 集落形成实验: |
| 9. 统计学处理: |
| 结果 |
| 1.COX-2在肝癌组织中的表达及其与病理特征关系: |
| 2.PCR法鉴定重组腺病毒: |
| 3.Ad-AShcox-2的滴度及转染效率: |
| 4.肝癌细胞株COX-2表达的变化: |
| 5.对肝癌细胞凋亡的检测: |
| 6.Ad-AShcox-2对细胞周期的影响: |
| 7.Ad-AShcox-2对肝癌细胞集落形成能力的影响: |
| 讨论 |
四、腺病毒介导的cox-2反义RNA对食管癌细胞株生长的影响（论文参考文献）
- [1]ILK对食管鳞癌恶性表型的影响及其功能研究[D]. 马晓丽. 新疆医科大学, 2021
- [2]沉默HDAC6基因通过HSP90抑制食管癌增殖和转移的作机制研究[D]. 陶华. 苏州大学, 2019(08)
- [3]COX-2和SPARC在口腔鳞癌中表达的研究[D]. 吴训. 广西医科大学, 2016(11)
- [4]cox-2表达与食管鳞状细胞癌放射敏感性的基础与临床研究[D]. 吴慧. 郑州大学, 2012(08)
- [5]环氧合酶-2与Barrett’s食管和食管腺癌的关系[J]. 龙思泽,张初民. 实用医院临床杂志, 2011(01)
- [6]硒蛋氨酸对食管癌细胞株环氧合酶-2表达影响[J]. 陈占峰,陈滋华,万春辉,谢艳敏,袁占鹏. 武汉大学学报(医学版), 2009(06)
- [7]Survivin反义寡核苷酸联合TCS诱导食管癌细胞Eca-109凋亡的作用与机制[D]. 陈玉龙. 重庆医科大学, 2009(06)
- [8]慢病毒介导的亲环素A（CyPA）siRNA对非小细胞肺癌抑制作用的实验研究[D]. 冯艳铭. 郑州大学, 2008(10)
- [9]选择性环氧合酶-2抑制剂NS-398对食管癌细胞株EC9706的生长抑制作用[J]. 李胜保,费沛,童强,王强,荣珍,王小虎,吴清明. 郧阳医学院学报, 2007(02)
- [10]腺病毒介导的环氧合酶-2反义RNA对肝癌细胞株生长的影响[J]. 王小虎,李胜保,谢国建,易建华,吴清明. 中华肝脏病杂志, 2005(05)