一、肿瘤特异性凋亡基因对荷瘤小鼠基因治疗的实验研究（论文文献综述）
钟鹏程[1]（2021）在《艾可清颗粒减轻环磷酰胺心脏毒性的作用及机制研究》文中提出目的:作为一线肿瘤化疗药物及强力免疫抑制剂,环磷酰胺（Cyclophosphamide,CTX）广泛应用于多种恶性肿瘤及自身免疫性疾病的治疗。然而,CTX在发挥治疗作用的同时也可引起多种严重不良反应,如骨髓抑制、心脏毒性、肝功能损害、出血性膀胱炎等。此外,在中医药基础科研领域,CTX常被用作复制中医阳虚、血虚证候动物模型的药物。目前针对CTX毒副反应尚无特效药物,预防或缓解CTX化疗导致的毒副反应对于提高肿瘤治疗效果具有重要的临床意义。艾可清颗粒（AKQ）作为广州中医药大学热带医学研究所创制的专利复方,在艾滋病治疗方面已运用多年,具有增强艾滋病患者免疫力、提高生活质量的作用。本课题组认为AKQ扶阳益气、补肾健脾的功效用于CTX引起的气阳两虚、脾肾双亏副作用的“纠偏”,在理论上具有针对性。基于此,本研究以AKQ为研究对象,通过体内、体外实验结合网络药理学分析、代谢组学以及肠道菌群分析,期望达到以下研究目的:1.明确AKQ对CTX引起的正常与荷瘤小鼠的毒性反应是否具有减毒作用及减毒效应的主要靶器官。2.评估AKQ对CTX毒性代谢产物丙烯醛（ACR）诱导的H9c2心肌细胞损伤是否具有保护作用。3.探索AKQ在上述动物和细胞水平减轻CTX毒性的机制,为中医异病同治理论提供实验依据。方法:1.体内（动物）实验1:观察AKQ对CTX所致昆明小鼠毒性反应的影响。（1）昆明小鼠CTX中毒模型的建立:8周龄,体重25±3g的健康昆明小鼠CTX连续4天腹腔注射给药:第1、2天100 mg/kg/d,第3、4天50 mg/kg/d。（2）分组处理及一般状况观察:健康昆明小鼠24只,随机分为3组,每组8只:正常对照组（第1-4天生理盐水0.3 mL/次/d腹腔注射+第1-7天纯水0.3 mL/次/d灌胃）,模型组（第1-4天CTX注射造模+第1-7天纯水灌胃0.3 mL/次/d）,艾可清组（第1-4天CTX注射造模+第1-7天AKQ灌胃1.3 g/kg/d）,实验周期8天,每日观察并记录各组小鼠一般状况及死亡数。艾可清给予小鼠1.3 g/kg/d相当于人临床剂量的9倍。（3）血液及生化指标的测定:实验结束后处死各组小鼠,取全血及血清,血细胞分析仪及生化分析仪检测WBC、RBC、PLT、HGB、LYM、MON、AST、ALT、CRE、CK。（4）主要脏器组织病理学观察:实验结束后处死各组小鼠,取各组小鼠心、肝、脾、肺、肾组织进行HE染色并观察。2.体内（动物）实验2:观察AKQ对CTX中毒小鼠心脏毒性的影响（1）CTX中毒小鼠心脏毒性模型的建立及分组:8周龄,体重25±3 g的健康昆明小鼠50只,随机分为5组,每组10只,CTX连续4天（第8-11天）腹腔注射造模（方案同体内实验1）。动物分组为正常组（第8-11天N.S 0.3 mL/次/d腹腔注射+第1-13天纯水0.3 mL/次/d灌胃）,模型组（第8-11天CTX注射造模+第1-13天纯水灌胃0.3 mL/次/d）,艾可清低剂量组（第8-11天CTX腹腔注射+第1-13天AKQ灌胃0.65 g/kg/d）,艾可清中剂量组（第8-11天CTX腹腔注射+第1-13天AKQ灌胃1.3g/kg/d）,艾可清高剂量组（第8-11天CTX腹腔注射+第1-13天AKQ灌胃2.6 g/kg/d）,实验周期14天,14天后取血清及心脏,进行相关检测。艾可清给予小鼠低、中、高剂量相当于人临床剂量的4.5、9、18倍。（2）心脏指数的测定:各组小鼠取心脏称重,计算心脏指数。（3）心肌酶及氧化指标的测定:各组小鼠取血清检测CK、CK-MB、GSH、SOD、MDA。（4）心脏的组织病理学观察:取各组小鼠心脏组织进行HE染色并观察。（5）心脏组织凋亡检测:Western blot检测各组小鼠心脏组织中Bax及Bcl-2的表达。3.体外（细胞）实验:观察AKQ对ACR诱导的H9c2毒性损伤的影响及机制探索（1）AKQ对H9c2活力影响的观察:AKQ颗粒甲醇提取物,加DMSO溶解,加细胞培养基稀释,配成不同浓度梯度,加入H9c2培养液,共孵育24、48及72小时,CCK8法测定细胞活力。（2）ACR对H9c2 IC50测定:将不同浓度梯度ACR溶液加入H9c2培养液培养,24小时后CCK8法测定细胞活力。（3）AKQ对ACR诱导的H9c2毒性损伤影响的观察:H9c2细胞分5组:对照组（正常培养）,ACR组（ACR 20μmol/L干预培养）,ACR+AKQ低剂量组（ACR+AKQ 20μg/mL）,ACR+AKQ 中剂量组（ACR+AKQ 40 μg/mL）,ACR+AKQ 高剂量组（ACR+AKQ 80 μg/mL）。培养24小时后观察细胞形态,进行CCK8检测、Hochest染色、流式Annexin V-FITC/PI双染及WB检测bax、Caspase3、Caspase9及bcl-2表达。（4）AKQ缓解CTX心脏毒性的网络药理学分析:进行CTX心脏毒性相关疾病靶点及AKQ药物成分治病靶点筛选并映射,构建药物-成分-靶点网络及PPI网络,对靶点进行GO分析和KEGG通路富集分析。（5）网络药理学分析的实验验证:用RT-qPCR及WB技术验证网络药理学分析富集的通路靶点表达水平。（6）AKQ对ACR诱导的H9c2毒性损伤机制的探索:H9c2细胞分4组:对照组（正常培养）,ACR组（ACR20 μmol/L干预培养）,ACR+AKQ组（ACR+AKQ 80μg/mL）,AKQ+LY294002 组（ACR+AKQ 80 μg/mL+LY294002 10 μmol/L）。培养 24小时后RT-qPCR及WB检测相关通路蛋白及凋亡蛋白的表达。4.体内（动物）实验3:AKQ对CTX化疗的荷瘤小鼠心脏毒性的影响及机制研究（1）荷瘤小鼠模型的建立:将密度为1× 107个/mL的S180肉瘤细胞悬液以0.2 mL/只的体积皮下接种于昆明小鼠后颈部。（2）动物分组及处理:将肿瘤体积范围为40-100 mm3的S180荷瘤小鼠24只随机分为3组,每组8只:肿瘤模型对照组（第1-13天纯水0.3 mL/次/d灌胃+第8-11天连续N.S 0.3 mL/次/d腹腔注射）,CTX单独化疗组（第8-11天连续CTX腹腔注射,CTX注射方案同前+第1-13天纯水灌胃0.3mL/次/d）,CTX化疗联合AKQ治疗组（第8-11天CTX连续腹腔注射+第1-13天艾可清2.6g/kg/d灌胃）。实验周期14天,第12天收集新鲜粪便,第14天取血清及心脏,进行后续检测。（3）心肌酶及氧化指标的测定:各组小鼠取血清检测CK、CK-MB、SOD、MDA。（4）心脏组织病理学观察:取各组小鼠心脏组织进行HE染色并观察。（5）心脏凋亡相关蛋白检测:WB检测各组小鼠心脏组织bax及bcl-2。（6）心脏通路蛋白检测:WB及免疫组化检测各组小鼠心脏组织相关通路靶点蛋白表达。（7）荷瘤小鼠瘤体重量测定:实验结束后取各组小鼠瘤体称重。（8）荷瘤小鼠血清代谢组学研究:各组小鼠取血清做GC/MS非靶向代谢组学分析。（9）荷瘤小鼠肠道菌群分析:接取小鼠新鲜未污染粪便做肠道菌群16SrRNA测序分析。结果:1.昆明小鼠腹腔注射环磷酰胺（100 mg/kg/d×2d,50 mg/kg/d×2d）后可见活动减少,畏寒蜷缩,毛发蓬松、竖立,进食减少,体重减轻等明显的中毒症状,加服AKQ后,上述中毒症状减轻,且死亡率较模型组明显下降（P=0.0028）。昆明小鼠予环磷酰胺注射后白细胞、血小板及淋巴细胞可出现显着减少（P<0.001,P<0.001,P<0.01）,而红细胞、血红蛋白及单核细胞无明显变化;AST、ALT及CRE无明显改变,CK出现显着上升（P<0.05）,加服AKQ 口服后,CK上升情况较模型组明显缓解（P<0.05）,其他血液生化指标比较无显着性差异。HE染色显示各组小鼠肝、脾、肺、肾组织病理改变无明显差异;模型组可见明显心肌损伤改变,加服AKQ后心肌病变程度减轻。2.昆明小鼠腹腔注射环磷酰胺（100 mg/kg/d ×2d,50 mg/kg/d×2d）后心脏指数较正常组明显增大（P<0.05）,AKQ低、中、高剂量组心脏指数较模型组均有显着性减小（P<0.05,P<0.01,P<0.01）。模型组CK-MB、MDA较正常组显着升高（P<0.001,P<0.001）,GSH 及 SOD 明显降低（P<0.05,P<0.001）,加服 AKQ 后,AKQ 各剂量组上述指标得到不同程度改善,其中以高剂量组改善最明显,高剂量组CK、CK-MB、MDA较模型组均显着下降（P<0.05,P<0.001,P<0.001）,而GSH及SOD明显上升（P<0.05,P<0.001）。模型组心脏HE染色可见明显心肌损伤改变,艾可清低、中、高剂量组心肌病变程度较模型组依次减轻。与正常组比较,模型组小鼠心脏组织中Bax表达增强,Bcl-2的表达减弱,AKQ各剂量组Bax表达与模型组相比呈剂量依赖性减弱,Bcl-2的表达呈剂量依赖性增强。3.AKQ醇提物在0-80 μg/mL浓度范围呈浓度依赖性促进H9c2细胞的增殖,ACR对H9c2细胞24小时IC50为20.37 μM。ACR作用于H9c2细胞24小时,引起的细胞损伤涉及:形态改变、细胞活力下降、Hochest染色阳性数目增多、流式Annexin V-FITC/PI双阳性细胞比例增加,凋亡蛋白Bax、Caspase3、Caspase9表达增强及抗凋亡蛋白Bcl-2表达减弱。H9c2细胞予AKQ处理后,与模型组相比,可剂量依赖性地改善H9c2细胞损伤形态、增强细胞活力、减少Hochest染色阳性及Annexin V-FITC/PI双阳性细胞比例,抑制Bax、Caspase3、Caspase9表达而增强Bcl-2表达。网络药理学分析结果显示:通过靶点筛选及映射得到192个靶点为AKQ主要成分治疗CTX心脏毒性损伤的作用靶点;通过构建AKQ药物-活性化合物-治病靶点网络图,得到15个关键化合物（包括等槲皮素、木犀草素、山奈酚、丹参酮Ⅱa、柚皮素等）;通过构建PPI网络得到30个核心靶点;GO分析显示靶点涉及的生物学功能主要包括调控细胞增殖/凋亡过程及氧化/炎症反应等。KEGG通路富集分析显示排名前10的信号通路涉及PI3K-AKT、TNF及MAPK通路。RT-qPCR显示上述3条通路关键靶点中的PI3K及AKT在AKQ组中表达较ACR组显着上调（P<0.001）,WB实验也观察到PI3K及AKT总蛋白及磷酸化蛋白水平均显着高于ACR组。AKQ+ACR组加入抑制剂LY294002后,上调的PI3K及AKT mRNA及蛋白水平被逆转;AKQ+ACR组较ACR组中上调的bax、Caspase3、Caspase9及下调的bcl-2同样被逆转。4.以密度为1×107个/mL的S180肉瘤细胞悬液,按0.2mL/只皮下接种于昆明小鼠后颈部,约6天后可成模。CTX单独化疗组CK-MB、MDA较肿瘤模型对照组显着升高（P<0.001,P<0.001）,SOD明显降低（P<0.001）,CTX化疗联合AKQ治疗组CK、CK-MB、MDA较CTX单独化疗组显着下降（P<0.01,P<0.001,P<0.001）,而SOD明显上升（P<0.001）。CTX单独化疗组心脏HE染色可见显着的心肌损伤,CTX化疗联合AKQ治疗组心肌病变程度较CTX单独化疗组明显减轻。与肿瘤模型对照组相比,CTX单独化疗组小鼠心脏组织Bax表达上调,Bcl-2、PI3K及AKT表达下调,加服AKQ后,Bax表达减弱,Bcl-2、PI3K及AKT表达增强。实验结束后,CTX化疗联合AKQ治疗组瘤体重量较单独化疗组显着减轻（P<0.05）。血清代谢组学分析在三组间共鉴定出44个差异代谢产物,AKQ干预能使CTX化疗改变的L-谷氨酸、L-天冬氨酸、柠檬酸、甘氨酸、鸟氨酸等代谢物轮廓向肿瘤模型对照组靠近;CTX联合AKQ治疗后显着增强的代谢通路包括:柠檬酸循环、精氨酸生物合成、丙氨酸天冬氨酸和谷氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、氨酰tRNA生物合成、谷胱甘肽代谢、组氨酸代谢、D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢。肠道菌群分析显示CTX单独化疗组鞘氨醇单胞菌（Sphingomonadales）、溶杆菌（Lysobacter）相对丰度下调,普雷沃菌9（Prevotella9）上调,CTX 化疗联合 AKQ 治疗后,Sphingomonadales及Lysobacter 丰度上调,Prevotella9丰度下调。CTX单独化疗组中显着下调的p53信号通路、倍半萜生物合成、胆汁分泌及咖啡因代谢等通路,在AKQ干预后重新被显着上调。结论:1.AKQ能改善CTX引起的昆明小鼠中毒症状,显着降低死亡率;AKQ能降低CTX引起的心肌酶异常升高,减轻氧化应激失衡、减少心肌细胞凋亡,改善CTX诱导的心脏病理形态改变。2.AKQ能促进H9c2心肌细胞增殖,激活PI3K/AKT通路而减少ACR诱导的H9c2凋亡。3.荷瘤小鼠CTX化疗可引起心肌酶异常升高、氧化应激失衡、心肌细胞凋亡增加及PI3K/AKT表达下调,联用AKQ能改善上述病变,且能增强CTX抑瘤效果。4.AKQ可调节CTX化疗的荷瘤小鼠L-谷氨酸、L-天冬氨酸、柠檬酸、甘氨酸、鸟氨酸等44种差异代谢物表达,增强TCA循环,精氨酸生物合成,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等16条代谢通路功能;上调有益菌（目水平Sphingomonadales、属水平Lysobacter）,下调有害菌（属水平Prevotella 9）丰度,增强肠道菌p53信号通路、胆汁分泌等功能从而发挥减轻CTX心脏毒性的作用。
王博[2]（2021）在《疏肝化症方治疗三阴性乳腺癌临床疗效及其作用机制研究》文中认为目的:通过临床回顾性队列研究、荷瘤小鼠体内实验和乳腺癌细胞体外实验,初步探究疏肝化症方治疗TNBC临床疗效及其作用机制,为疏肝化症方的进一步研究提供循证医学和基础研究证据,拓宽其临床应用空间。方法:1.应用回顾性队列研究方法,设立对照组和观察组,比较两组患者近期疗效、肿瘤标志物变化、功能状态改善、远期存活和毒副反应发生情况。2.应用乳腺癌4T1细胞构建小鼠乳腺癌模型,设立对照组及疏肝化症方各剂量组,对比各组小鼠的瘤体体积、食量、体质量变化,观察小鼠肿物的病理形态。3.培养乳腺癌4T1细胞,设立正常对照组和疏肝化症方各剂量组:观察疏肝化症方对4T1细胞形态的影响;细胞计数法检测疏肝化症方对4T1细胞生长数量的影响;MTT比色法检测疏肝化症方对4T1细胞增殖抑制率的影响;划痕实验检测疏肝化症方对4T1细胞侵袭能力的影响;PI染色流式细胞术检测疏肝化症方对4T1细胞周期的影响;Annexin V-PI染色流式细胞术检测疏肝化症方对4T1细胞凋亡的影响;RT-PCR检测疏肝化症方对4T1细胞PI3K/AKT/Bax通路相关基因m RNA表达的影响;Western Blot检测疏肝化症方对4T1细胞PI3K/AKT/Bax通路相关基因蛋白表达的影响。结果:1.与对照组比较,观察组患者近期疗效稳定率、肿瘤标志物（CEA、CA125及CA153）总改善率、功能状态总改善率均显着升高（P<0.05）,而远期存活及毒副反应发生情况未见显着差异（P>0.05）。2.疏肝化症方各剂量组作用荷瘤小鼠一定时间,结果发现:第21d时,0.10、1.00和10.00g/kg剂量组小鼠抑瘤率显着增加（P<0.05或P<0.01）;各剂量组小鼠每日进食量未见显着差异（P>0.05）;第14d和21d时,10.00g/kg剂量组小鼠体质量显着增加（P<0.01）;各剂量组小鼠瘤体较小,其血管逐渐减少、出血及坏死面积逐渐增大,差异显着（P<0.01）;肿瘤细胞的形态逐渐消失,核分裂相逐渐减少,且可观察到显着细胞碎裂。3.疏肝化症方各剂量组作用4T1细胞后一定时间,结果发现:各剂量组细胞体积缩小、凝集和碎裂,且与药物浓度存在依赖关系;各剂量组细胞生长数量:正常对照组>低剂量组>中剂量组>高剂量组,差异显着（P<0.01）;各剂量组细胞增殖抑制率显着增加（P<0.05）,且与药物浓度和时间存在依赖关系;各剂量组细胞划痕修复率显着减少（P<0.05）,且与药物浓度和时间存在依赖关系;中、高剂量组G0/G1期、G2/M期细胞DNA含量显着升高,S期细胞DNA含量均显着降低（P<0.05或P<0.01）,且与药物浓度存在依赖关系;各剂量组早期及晚期凋亡率显着升高（P<0.05或P<0.01）,且与药物浓度存在依赖关系;各剂量组PI3K、Akt、caspase-3和Bax的m RNA表达显着上升,而Bc1-2的m RNA表达显着下降（P<0.05或P<0.01）,且与药物浓度存在依赖关系;各剂量组PI3K和Akt的蛋白表达无显着变化,p-PI3K、p-Akt和Bcl-2的蛋白的表达显着下降,而Bax和caspase-3的蛋白的表达显着上升（P<0.05或P<0.01）,且与药物浓度存在依赖关系。结论:1.疏肝化症方对晚期TNBC患者具有治疗作用,可提高肿瘤近期治疗稳定率,降低肿瘤标志物水平,提升功能状态,且无毒副反应。2.疏肝化症方对乳腺癌荷瘤小鼠具有抑瘤作用,可减缓瘤体生长,破坏瘤体组织结构,提高小鼠体质量,且不影响小鼠进食量。3.疏肝化症方对乳腺癌4T1细胞具有抑制作用,可诱导细胞周期阻滞,抑制细胞增殖,抑制细胞侵袭能力,其机制可能通过调节PI3K/AKT/Bax信号通路上相关基因来实现。
吴喆[3]（2021）在《扶正解毒方调控肿瘤相关成纤维细胞cGAS/Wnt16b/β-catenin轴介导癌细胞干性化逆转耐药的研究》文中提出研究背景:胃癌（gastric cancer,GC）是我国最常见的恶性肿瘤之一,大部分患者在就诊时已处于进展期,因此化疗是基础的治疗手段。肿瘤复发转移是胃癌患者的主要死因之一,而耐药是关键原因。研究表明化疗药物在杀伤癌细胞的同时不可能避免的影响了肿瘤微环境（TME）中的其他细胞,如肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblast,CAFs）,加速了耐药的形成。当化疗药物损伤DNA后会造成CAFs衰老,产生的衰老相关分泌表型（SASP）是CAFs引起耐药的重要机制。环磷酸鸟苷-腺苷合成酶（cGAS）是细胞质中重要的DNA感受器,在识别胞质中内源性DNA后通过下游信号转到激活核转录因子κB（NF-κB）促进多种因子表达,其中包括Wnt16b。Wnt16b是Wnt/β-catenin通路的配体之一,在化疗后的CAFs中高表达,通过激活癌细胞内β-catenin促进癌细胞干性化,而肿瘤干细胞（CSCs）是引起耐药的关键。因此调控cGAS/Wnt16b//β-catenin轴对于提高化疗效果具有积极的意义。扶正解毒方是中国中医科学院广安门医院肿瘤科治疗肿瘤复发转移的有效方。前期研究表明该方能够提高化疗对荷瘤小鼠模的治疗效果,机制与调节TME中另一主要细胞群体肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）亚群比例,抑制血管生成,改善肿瘤免疫抑制有关。本实验将进一步研究该方提高化疗效果的机制是否与调控CAFs功能有关。研究目的:通过构建化疗诱导后DNA损伤的CAFs模型,及CAFs/癌细胞荷瘤小鼠模型,从体内、外观察CAFs的促耐药作用及探索扶正解毒方的能够通过调控cGAS/Wnt16b//β-catenin 轴改善耐药。研究方法:基础实验研究分为三个部分:一、建立并评价DNA损伤的CAFs模型;二、观察扶正解毒方对cGAS/Wnt16b//β-catenin轴介导胃癌耐药的影响;三、构建5-FU耐药的荷瘤小鼠模型,观察扶正解毒方的干预作用,探索相关机制。1.建立并评价DNA损伤的CAFs模型①以MRC-5为CAFs,以5-FU为诱导药物,通过CCK8法筛选合适的干预条件。②通过免疫荧光法检测DNA损伤MRC-5（dMRC-5）中DNA损伤标志物γH2AX的表达情况。③通过Annexin V/PI双染法检测dMRC-5细胞凋亡情况。④通过qRT-PCR法检测dMRC5中cGAS基因表达情况。2.观察扶正解毒方对cGAS/Wnt16b//β-catenin轴介导胃癌耐药的影响①制备扶正解毒方含药血清,20只SD大鼠分为对照组和扶正解毒组,分别与纯水及扶正解毒方溶液（0.33g/ml）灌胃,连续5次后取腹主动脉血。②Western-blot法检测MRC-5及不同干预后dMRC-5中cGAS表达。③免疫荧光法检测MRC-5及不同干预后dMRC-5中Wnt16b表达。④收集MRC-5及不同干预后dMRC-5的条件培养基（CM）,培养胃癌细胞系MKN45细胞,CCK8检测IC50。⑤Western-blot检测各组别CM培养后MKN45中β-catenin表达。3.构建5-FU耐药的荷瘤小鼠模型及扶正解毒方抗肿瘤作用研究。①以非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷（NOD-SCID）小鼠为载体,分别接种MKN45及MKN45/dMRC-5,其中单独荷瘤小鼠设立对照组及5-FU组,混合荷瘤小鼠设立对照组、5-FU组、扶正解毒组及扶正解毒+5-FU组。②比较单独荷瘤小鼠和混合荷瘤小鼠对照组瘤重,单独荷瘤小鼠和混合荷瘤小鼠5-FU治疗效果及抑瘤率评价模型构建情况。③比较混合荷瘤小鼠各组平均瘤重及抑瘤率,评估扶正解毒方的抗肿瘤作用。④免疫组化法检测各组小鼠肿瘤组织中CD44表达。⑤Western-blot法检测各组小鼠肿瘤组织中β-catenin表达。研究结果:1.5-FU 0.8mM诱导72h后MRC-5中γH2AX阳性细胞比率大于90%,活细胞比率大于65%,cGAS表达显着高于对照组,完成了 dMRC-5的构建。2.与MRC-5相比,dMRC-5中cGAS表达明显增加（P<0.0001）,干预后dMRC-5中cGAS含量依次为对照组>BS组>FS组>G150组>空白组。3.与MRC-5相比,dMRC-5中Wnt16b表达明显增加（P<0.001）。干预后各组dMRC-5中Wnt16b含量依次为对照组>BS组>G150组>FS组>空白组。4.MKN45经MRC-5 CM及各组dMRC-5 CM培养后IC50呈不同程度的上升,依次为:对照组>BS组>正常组>G150组>FS组>空白组。5.与空白组相比,MRC-5 CM各组及dMRC-5 CM培养后MKN45细胞中β-catenin表达显着增加（P<0.0001）,依次为对照组>BS组>G150组>FS组>正常组>空白组。6.混合荷瘤小鼠对照组平均瘤重大于单独荷瘤小鼠,混合荷瘤小鼠5-FU组抑瘤率低于单独荷瘤小鼠5-FU,完成5-FU耐药荷瘤小鼠模型构建。7.混合荷瘤小鼠各组平均瘤重依次为:对照组>5-FU组>扶正解毒组>扶正解毒+5-FU组。扶正解毒+5-FU组平均瘤重低于对照组（P<0.01）。8.混合荷瘤小鼠各组抑瘤率依次为:扶正解毒+5-FU组>扶正解毒组>5-FU组>对照组。9.混合荷瘤小鼠及单独荷瘤小鼠5-FU组肿瘤组织CD44表达均高于各自的对照组（P<0.01）。混合荷瘤小鼠组内CD44表达依次为:5-FU组>扶正解毒组>扶正解毒+5-FU组>对照组。10.单独荷瘤小鼠5-FU组β-catenin含量高于对照组（P<0.01）。混合荷瘤小鼠组内β-catenin含量依次为:5-FU组>对照组>扶正解毒+5-FU组>扶正解毒组。研究结论:1.5-FU处理后MRC-5中cGAS及Wnt16b过表达,抑制cGAS后Wnt16b表达减少。2.扶正解毒方能够抑制dMRC-5介导的癌细胞干性化从而改善耐药,机制与调控 cGAS/Wnt16b//β-catenin 轴有关。3.dMRC-5在体内可促进肿瘤生长及耐药,扶正解毒方提高化疗效果的机制可能与抑制β-catenin表达,减少癌细胞干性化有关。
张颖慧[4]（2021）在《粘蛋白MUC1在结肠癌中诱导免疫抑制的作用机制研究》文中研究说明[目的]粘蛋白Mucin1（MUC1）在结肠癌中表达高低与肿瘤的进展阶段和患者预后相关,表达上调表明疾病处于晚期阶段且提示预后较差。MUC1的过表达和异常糖基化可促进肿瘤细胞的增殖,同时MUC1相关的唾液酸（Mucin-associated sialyl-Tn）抗原与树突状细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞上存在的多种受体结合,通过抑制免疫细胞的抗肿瘤效应有助于肿瘤细胞逃避免疫监视。我们通过比较MUC1阳性和阴性的结肠癌细胞在野生型和免疫缺陷型小鼠上的生长情况,发现只有在野生型小鼠中生长速度存在明显差异,数据表明MUC1可能通过影响肿瘤微环境中的免疫应答状态,促进肿瘤生长。本论文的研究目的是通过构建MUC1过表达荷瘤模型和收集MUC1高表达的结肠癌组织,分析肿瘤微环境中免疫细胞的功能,阐明MUC1在抗结肠癌免疫应答中的功能。[方法]（1）构建稳定表达人MUC1的人和小鼠肿瘤细胞系SW480/MUC1和CT26/MUC1,将其注射至BALB/c鼠和免疫系统缺陷鼠腹部皮下。每3天测量一次肿瘤的直径。荷瘤小鼠肿瘤最长径大于12mm时,被认为死亡,获得荷瘤小鼠的生存曲线。（2）收集CT26/MUC1荷瘤小鼠的肿瘤组织,通过酶联免疫吸附法测定肿瘤组织匀浆液中细胞因子的分泌;流式细胞仪检测浸润至肿瘤组织中的CD4+T细胞,调节性T细胞（Regulatory T cells）,CD8+T细胞,骨髓来源的抑制性细胞（Myeloid-derived suppressor cells）,肿瘤相关巨噬细胞（Tumor associated macrophage）的比例。通过细胞胞内细胞因子检测测定T细胞的杀伤功能。（3）PDL1抗体治疗CT26/MUC1荷瘤小鼠,分析荷瘤小鼠的生存曲线,评价PDL1抗体治疗效果,同时收集抗体治疗小鼠的肿瘤组织,检测组织中T细胞,MDSC,TAM的浸润情况。测定T细胞的活性改变,分析肿瘤组织中程序性死亡分子PD1及其配体PDL1的表达情况。（4）利用CD8抗体,封闭荷瘤小鼠体内CD8+T细胞功能,通过动物体内T细胞耗竭实验,研究抗体发挥作用的细胞依赖机制。（5）收集结直肠癌患者术后的肿瘤组织样本,同过分析MUC1表达情况,分为MUC1高表达组和MUJC1低表达组。通过酶联免疫吸附法检测肿瘤组织中细胞因子的分泌,通过流式细胞仪分析肿瘤组织免疫细胞的比例,T细胞的活化状态,程序性死亡分子PD1及其配体PDL1的表达情况。（6）利用TCGA结肠癌数据库,分析粘蛋白MUC1在结肠癌患者肿瘤组织中的转录水平与肿瘤患者生存时间的关系。[结果]（1）在免疫系统完整的野生型小鼠中,MUC1阳性的肿瘤细胞生长速度快于MUC1阴性的肿瘤细胞生长（p<0.05）,但是在免疫系统缺陷的裸鼠中,MUC1阳性和阴性的肿瘤细胞的生长速度没有显着差异。（2）MUC1阳性肿瘤组织中炎性细胞因子增加。与MUC1阴性或低表达的肿瘤组织相比,MUC1阳性或者高表达的肿瘤组织中炎性细胞因子IL-17A和IFN-γ水平明显升高,而抑炎性因子如IL-10,TGF-β和TNF-α水平没有显着变化（p<0.05）。流式细胞仪分析荷瘤小鼠和患者的肿瘤组织中CD45+CD3+CD4+T细胞、CD45+CD3+CD8+T细胞胞内细胞因子分泌情况,发现MUC1阳性和MUC1高表达的肿瘤组织内,CD4+、CD8+T细胞诱导产生的IL-17A和IFN-γ的水平明显升高,但与MUC1阴性或者低表达的肿瘤组织相比,CD8+T细胞分泌granzyme B的水平并没有显着增加。（3）MUC1阳性肿瘤组织中免疫抑制性细胞增加。流式细胞仪分析发现MUC1 阳性和MUC1 高表达的肿瘤组织中 Tregs（CD4+Foxp3+）,MDSC（CD11b+Gr1+）,TAM（CD11b+F4/80+）的浸润明显增加（p<0.05）。MUC1 高表达的人结肠癌组织或MUC1阳性的小鼠肿瘤组织中MDSC、TAM和肿瘤细胞表面PDL1表达升高（p<0.05）。然而,在转染了表达MUC1质粒的CT26和SW480细胞中,MUC1并没有促进肿瘤细胞表面PDL1的表达。而IL-17A和IFN-γ刺激可促进CT26细胞和CT26/MUC1细胞上PDL1的表达。结果还显示,在MUC1阳性的小鼠肿瘤组织中以及高表达MUC1的人结肠癌组织中的CD8+T细胞上PD1的表达均显着增加（p<0.05）。（4）MUC1阳性的荷瘤小鼠模型中靶向PDL1治疗可诱导抗肿瘤免疫反应。与同型抗体治疗的荷瘤小鼠相比,PDL1抗体治疗的小鼠,肿瘤组织中浸润的CD8+T细胞比例显着升高,CD4+/CD8+T细胞比例明显下降,MDSC和TAM的比例也显着降低。CD8+T细胞分泌IFN-γ和granzyme B的能力,CD4+T细胞产生IFN-γ的能力增强（p<0.05）。表达PD1的CD8+T细胞的百分比也明显更高（p<0.05）。（5）靶向PDL1可抑制肿瘤生长。与对照组相比,PDL1抗体治疗组的肿瘤体积明显缩小,生存期显着延长。而CD8+T细胞缺失的小鼠则失去了 PDL1抗体诱导的抗肿瘤保护作用。注射PDL1抗体治疗后,MUC1阳性的荷瘤小鼠则显示出更强的抗肿瘤免疫应答效应。（6）在TCGA结肠癌数据库中,通过MUC1的拷贝数来确定其在肿瘤组织中表达。分析MUC1的表达与患者的生存之间的关系。数据显示,MUC1低表达患者组较MUC1高表达患者组生存时间显着延长（p<0.05）。[结论]在MUC1阳性或MUC1高表达的肿瘤组织中发现了更多的炎性细胞因子和抑制抗肿瘤免疫应答的免疫细胞。在炎性细胞因子作用下,抑制性免疫细胞MDSC,Treg,TAM和肿瘤细胞上调免疫检查点分子PDL1的表达,抑制了肿瘤微环境中T细胞的抗肿瘤免疫应答。在MUC1阳性肿瘤细胞荷瘤小鼠模型中,利用PDL1抗体,阻断PDL1-PD1抑制性信号通路,减少了肿瘤微环境中Treg细胞,MDSC和TAM的细胞百分比,增强了 T细胞的细胞毒性并抑制了肿瘤的生长,最终使MUC1阳性荷瘤小鼠的生存时间得以延长。因此,本研究阐明了 MUC1在肿瘤免疫逃逸中的作用,并为PDL1抗体在MUC1阳性结直肠癌患者的治疗中的应用提供了理论基础。
石秦林[5]（2021）在《TGF-β/Smad信号通路在肾母细胞瘤转移侵袭过程的作用机制研究》文中进行了进一步梳理目的:肾母细胞瘤（Wilms Tumor,WT）为儿童常见的恶性胚胎性肿瘤,其发病机制尚不清楚,目前研究认为可能涉及基因改变,染色体异常,以及遗传因素等。近年来,研究表明TGF-β1在WT中异常表达与肿瘤的转移,复发及细胞的侵袭能力相关。但是,其具体机制仍不明确。本研究拟探讨TGF-β1在WT中表达的意义,通过TCGA和GEO数据库对WT差异性基因进行分析,寻找TGF-β1介导的下游基因表达,利用WT细胞及动物模型,对TGF-β1受体及下游基因进行干预,阐明TGF-β信号通路在WT发生和发展的意义,为临床综合治疗WT提供新的思路。方法:第一部分:检测WT中TGFβ/Smad蛋白表达情况并探讨与临床资料相关性,通过抑制TGFβ/Smad信号检测其对WT肿瘤细胞和动物模型的影响:（1）通过免疫组织化学染色检测60例肾母细胞瘤及癌旁对照组织样本TGFβ1和P-smad2/3表达水平;（2）采用CCK-8,划痕实验,侵袭实验和流式凋亡实验分别检测TβRI抑制剂,TGFβ激动剂对G401细胞增殖,迁移,侵袭和凋亡的影响;（3）构建WT动物模型,检测TβRI抑制剂对肿瘤细胞增殖的影响,并检测抑制剂对肝肾功代谢影响。第二部分:利用GEO及TCGA数据库筛选肾母细胞瘤核心基因:（1）采用R studio软件分别对GEO肾母细胞瘤数据集（GSE66405,G SE73209）和TCGA-Target-WT转录组测序结果进行差异性表达基因筛选,寻找三个数据集共同上下调基因;（2）采用David分析上调基因和下调基因富集的肿瘤信号通路;（3）利用Cytoscape软件和String进行蛋白交互网络分析,寻找到核心基因,GSEA分析核心基因受调控的上游基因;（4）免疫组织化学染色验证肾母细胞瘤核心基因的表达情况;（5）体外构建si-RNA模型,CCCK8,划痕实验和周期实验检测其对WT细胞的增殖,迁移,细胞周期调控的影响。第三部分:检测TGFβ1,c-MYC及CDC20在WT中表达相关性,抑制WT中TGFβ信号通路,检测其对下游MYC/CDC20介导细胞周期和EMT的影响:（1）WB检测肾母细胞瘤肿瘤组织中TGFβ1和cMYC和CDC20表达情况,Spearman分析其蛋白表达相关性;（2）采用TβRI抑制剂干预WT细胞系及荷瘤小鼠模型,WB检测及IP检测下游EMT相关蛋白（E-cad,N-cad,β-cat,CK）表达情况;（3）采用R as蛋白抑制剂干预WT细胞系,检测细胞周期相关蛋白表达情况;（4）沉默G401和SK-NEP-1中CDC20基因后,检测其细胞周期相关蛋白表达情况。结果:第一部分:（1）TGF-β1,P-Smad2/3蛋白在WT中表达明显增高,且与患儿临床分期与肿瘤侵袭转移明显相关;（2）抑制TGF-β1受体I能够明显减少WT细胞增殖,迁移和侵袭能力,且增加肿瘤的凋亡能力;（3）通过荷瘤小鼠实验,采用TβRI抑制剂能够明显减少肿瘤组织的增殖,且抑制剂不具有肝肾功损害。第二部分:（1）本部分研究发现GSE66405,GSE73029,TCGA-T arget-WT共同上下调基因为44个和272个,上调基因主要富集于Ce ll cycle,Cell division cycle。（2）蛋白交互网络分析Top链接基因发现CDC20核心,且有更多关联性,其主要受上游MYC等基因调控。（3）si-CDC20转染WT细胞系G401及SK-NEP-1能够显下抑制肿瘤细胞的增殖,迁移,同时,细胞在G2/M期停滞。第三部分:（1）TGFβ1和c-MYC和CDC20在WT中均表达增高,且三者具有正相关性;（2）抑制Ras蛋白后能够明显减少c-MYC,C DC20蛋白表达,并增加G2/M期蛋白（Securin and Cyclin B1 and C yclin A）表达水平;（3）抑制TβRI能减少N-cad,SMA,MMP7,β-cat蛋白表达水平,同时增加E-cad,CK表达表达;（4）si-CDC20能够明显增加WT细胞G2/M期蛋白（Securin and Cyclin B1 and Cyclin A）)表达水平。结论:WT中TGF-β/Smad信号通路的激活可能是其增殖,转移和侵袭的原因,抑制TGF-β/Smad信号通路通路后能够明显减少肿瘤的增殖,侵袭和迁移能力,其机制可能涉及TGFβ/Smad信号通路调控Myc/CDC20造成细胞紊乱及TGFβ介导的肿瘤EMT。
田叶红[6]（2021）在《基于肿瘤神经新生学说探讨p75NTR介导的电针围刺的抑瘤机制》文中研究说明神经新生已成为肿瘤的重要获得性特征之一,研究表明通过基因技术特异性操控乳腺癌神经,激活交感神经促进乳腺癌进展,激活副交感神经抑制乳腺癌生长。神经调控肿瘤的分子机制成为肿瘤研究的热点,阻断神经为抗肿瘤治疗提供重要靶标。然而,目前针对神经生长的相关因子及受体的抑制剂研究正处于初始阶段。围刺为传统中医刺法,可沟通局部经脉、络脉、浮络和皮部之间的联系,以理气活血、化瘀通络。针对肿瘤的围刺,即以肿瘤局部为中心,沿肿瘤边缘进行多针包围性针刺。前期研究显示电针围刺后肿瘤组织内p75神经营养因子受体（p75 neurotrophin receptor,p75NTR）表达明显增多,与抑瘤率变化趋势一致,且参与调控了肿瘤内的轴突导向因子Sema3a表达,提示围刺可能影响肿瘤神经。但围刺是否能够调控肿瘤神经及相关机制,仍有待进一步的研究阐明。本研究第一部分为文献综述,包括两方面:一是从临床应用角度,对围刺疗法及瘤周注射在肿瘤的运用和疗效进行整理、总结;二是从现代医学角度,梳理和总结了肿瘤神经新生及p75NTR在乳腺癌中的研究进展。第二部分为实验研究:目的:1比较不同围刺法对乳腺癌移植瘤肿瘤生长及癌细胞凋亡的影响;2观察电针围刺对肿瘤神经、神经递质、神经营养因子（NTs）及相应受体的影响;3通过有参转录组测序获取电针围刺相关的差异基因表达,并通过生物信息学分析探索电针围刺调控肿瘤神经的候选靶基因和相关分子机制;4以p75NTR为突破口,通过电针围刺后抑制p75NTR信号转导,观察p75NTR对电针围刺调控神经、细胞凋亡及肿瘤生长的影响。方法:构建4T1乳腺癌小鼠移植瘤模型,实验一分为TG组（模型组）、ETG组（电针围刺组）、ATG组（毫针围刺组）,TG组小鼠每天抓握3min,ETG组予电针围刺3min/天,ATG组予毫针围刺3min/天,于干预后1周、2周、3周取材,绘制生长曲线、计算抑瘤率,TUNEL检测肿瘤细胞凋亡,比较电针与毫针围刺对肿瘤生长、癌细胞凋亡的影响。实验二分为TG组、ETG组、NG组（空白组）、ENG组（空白电针组）,TG组、ETG组干预同实验一,NG组、ENG组均为正常小鼠,其中NG组每天抓握3分钟,ENG组电针围刺,其针刺部位、方法与ETG组一致,通过HE、IHC、ELISA检测,以明确电针围刺对肿瘤神经、神经递质、NTs及受体的影响。实验三样本来自实验二,取TG组与ETG组干预1周的肿瘤组织冰冻样本,每组各3个,共6个样本用于有参转录测序,并通过生物信息分析,以探索电针围刺对肿瘤神经的调控作用及潜在机制。基于前期研究电针围刺对p75NTR的上调作用,实验四分为TG组、ETG组、ETTG组（TP组,即p75NTR抑制剂组）,TG组、ETG组干预同前,ETTG组电针干预同ETG组,并在电针后15分钟腹腔注射p75NTR受体抑制剂TAT-Pep5（75μg/kg·d）,以明确抑制p75NTR信号传导对肿瘤神经、肿瘤细胞凋亡及肿瘤生长的影响。结果:1电针与毫针围刺抑制4T1小鼠乳腺癌肿瘤生长的比较（1）肿瘤生长曲线显示,ETG组肿瘤生长最慢,TG组最快,ATG介于ETG组与TG组之间;在实验干预第15天,三组肿瘤生长曲线开始趋于一致。肿瘤体积的组间比较显示,ETG组肿瘤体积于实验干预第5-18天较TG组显着缩小（p<0.05）,ATG组肿瘤体积于实验干预第6-14天较TG组显着缩小（p<0.05）。（2）三个取材时点的瘤重比较,ETG组瘤重最小,TG组瘤重最大,ATG组瘤重介于ETG组与TG组之间。（3）在三个取材时点,ETG组抑瘤率分别为36.93%、46.49%、27.89%,ATG组抑瘤率分别30.79%、26.61%、21.67%。（4）TUNEL染色结果显示,ETG组在三个取材时点的癌细胞凋亡指数均显着高于ATG组与TG组（p<0.05）,且在实验干预2周的凋亡指数最高,ATG组的凋亡指数与TG组相当。2电针围刺对4T1小鼠乳腺癌神经的影响（1）HE染色、IHC标记PGP 9.5均提示4T1小鼠乳腺癌肿瘤组织和癌旁组织有神经支配。（2）β3-tubulin+神经:ETG组β3-tubulin+神经束在实验干预1周、2周均少于TG组,至实验干预3周两组无差别;ETG组神经纤维在三个取材时点均多于TG组;IPP半定量分析β3-tubulin+表达面积显示,ETG组在三个取材时点β3-tubulin+表达面积均显着少于TG组（p<0.05）。（3）TH+交感神经:TH+神经纤维呈细丝状,分布于肿瘤间质,且多围绕在血管周围,ETG组在三个取材时点的TH+神经纤维均显着少于TG组。（4）血清神经递质:ENG组NE、ACH、AD较NG组均有一过性升高趋势,其中仅干预3周的AD差异有显着统计学意义;ETG组NE、ACH、SP含量较TG组有一过性升高趋势,其中仅第3周NE差异有显着统计学意义。（5）肿瘤组织神经递质:ETG组在三个取材时点的NE含量均低于TG组,其中干预2周、3周差异有统计学意义;ETG组 ACH水平均低于TG组,其中干预2周差异有统计学意义。（6）血清NTs:NGF、BDNF、NT-3、NT-4含量在三个取材时点组间比较均无差异。（7）肿瘤组织NTs:ETG组在干预1周、2周的NGF含量均明显高于TG组（p<0.05）,ETG组在干预3周的NT-3水平显着高于TG组（p<0.05）,BDNF、NT-4水平在ETG与TG组均无差异,ETG组proNGF相对表达量在三个取材时点均显着高于TG组（p<0.05）。（8）NTs相关受体:ETG组在三个取材时点的p75NTR相对表达量均显着高于TG组（p<0.05）,TrkA、TrkB相对表达量在ETG与TG组均无差异。3有参转录组测序探索电针围刺对肿瘤神经的作用相较于TG组,ETG组共获得116个差异基因,其中66个上调基因,50个下调基因,GO功能注释分析显示电针围刺相关的差异基因主要与免疫反应、细胞死亡与稳态、氧化应激、物质与能量代谢等生物学过程相关,KEGG通路富集分析显示电针围刺相关的差异表达基因主要与神经、免疫反应、物质与能量代谢相关,其中在神经的生物学过程中,包含四个神经递质兴奋性突触通路和一个神经轴突导向通路,涉及1 1个差异基因,5-HT2、VGCC、COX、TRPC1、Ablim 下调,Gi/o、PLA2、GLS、CREB、Boc、Netin-G2上调,涵盖胞吐、钙离子内流、神经兴奋性、神经保护、轴突导向、神经递质释放的反馈抑制调节、突触可塑性等生物学功能。4 p75NTR介导电针围刺调控肿瘤神经及癌细胞凋亡的机制腹腔注射TAT-Pep5以抑制p75NTR信号传导,观察电针围刺对肿瘤神经、癌细胞凋亡的影响。（1）β3-tubulin+神经:ETTG组β3-tubulin+神经总数和神经纤维较ETG组和TG组均有减少趋势（p>0.05）,而β3-tubulin+神经束比ETG组和TG组有增多趋势（p>0.05）,此外,ETTG组在实验干预1周、2周β3-tubulin+表达面积显着高于ETG组（p<0.05）。（2）TH+神经:ETTG组TH+神经纤维在三个取材时点均显着多于ETG组（p<0.05）;ETTG组在干预1周、2周的TH+神经纤维与TG组相当,至干预3周明显少于TG组（p<0.05）。（3）肿瘤组织神经递质（NE、ACH）:ETTG组肿瘤组织NE含量介于TG组与ETG组之间;ETTG组肿瘤组织ACH含量在三个取材时点均高于ETG组,其中实验干预2周的差异有统计学意义,但与TG组无差异。（4）肿瘤组织NGF、proNGF:ETTG组在三个取材时点的NGF含量均显着高于TG组（p<0.05）,在实验干预1周与ETG组相当,2周显着低于ETG组,3周高于ETG组;对于proNGF,在三个取材时点ETTG组proNGF表达均与ETG组相当,而显着高于TG组（p<0.05）。（5）肿瘤生长:ETTG组瘤体、瘤重均介于ETG组与TG组之间,三个取材时点ETTG组的抑瘤率显着低于ETG组（p<0.05）。（6）癌细胞凋亡:ETTG组在三个取材时点的凋亡指数均显着低于ETG组（p<0.05）,而与TG组相当。结论:1单纯电针与毫针围刺均可抑制肿瘤生长,电针围刺较毫针围刺抑瘤作用更强、更持久,其中电针围刺的抑瘤机制之一为癌细胞凋亡增加。2电针围刺调控肿瘤神经,具体表现为促进神经新生、抑制神经浸润（PNI）和交感神经形成,调节肿瘤组织神经递质（ACH、AD、NE）、NTs（NGF、proNGF、NT-3）水平,上调 p75NTR 表达,可能为电针围刺抑瘤潜在分子机制。3电针围刺可能通削弱胞吐、抑制钙离子内流、调节神经兴奋性等作用抑制神经递质释放,及通过促进神经保护和轴突导向而诱导神经轴突生成,以调控肿瘤微环境。4电针围刺上调p75NTR/proNGF信号转导诱导癌细胞凋亡而直接抑制肿瘤生长,同时经由p75NTR介导以抑制PNI和交感神经支配,下调肿瘤组织NE、ACH水平,以调控肿瘤微环境而发挥间接抑瘤作用。
徐磊[7]（2021）在《糖皮质激素非受体依赖性抑制肿瘤效应的研究》文中研究说明临床上,糖皮质激素（Glucocorticoids,GCs）广泛用于缓解化疗药物的副作用如恶心、呕吐等,也用于调节免疫疗法所造成的免疫相关不良反应（ir AEs）。以往认为GCs对免疫系统具有强大的抑制作用,而GCs对免疫反应的抑制作用似乎与临床上肿瘤治疗中的联合使用是相悖的。以往认为GCs的作用途径主要通过其受体（GR）依赖途径发挥基因组调控模式,而GCs非受体依赖途径在肿瘤进展中的作用机制尚不明确。因此,在免疫系统正常或者免疫系统激活的机体中阐明GCs在肿瘤进展的作用及机制是必要的。通过采用动物模型实验,免疫印迹实验、荧光定量PCR实验方法,围绕着糖皮质激素干预的肿瘤微环境中肿瘤细胞和免疫细胞（Th1和CD8+T细胞）,探究在免疫系统正常或者免疫系统激活的机体中GCs在肿瘤进展的作用及机制。通过构建筛选敲低或者敲除GR（编码基因Nr3c1）的LLC细胞系,经体外增殖实验,体内成瘤实验,荧光定量PCR实验,转录组测序等实验探究GCs非受体依赖途径在肿瘤进展中的作用机制。实验结果表明在免疫正常的C57BL/6小鼠中,经地塞米松（Dexamethasone,DEX）干预的小鼠脾脏转录组学分析发现免疫球蛋白重（轻）链可变区（IGH（L）V）基因显着性降低,进一步确证了DEX的免疫抑制作用。在免疫系统正常的C57BL/6荷瘤小鼠中,经不同浓度的DEX干预,发现较高剂量的DEX能显着性降低肿瘤体积,改善血管浸润程度,延长生存期,降低细胞增殖阳性标志物（Ki67,c-Myc）的表达量,促进cleaved caspase 3的表达。免疫检查点PD-1H,属于CD28-B7家族,表达于T细胞表面而抑制其活化。在PD-1H基因敲除免疫系统激活荷瘤小鼠中,肿瘤体积以及细胞增殖阳性标志物（Ki67）的表达量显着性降低,而联合DEX干预,可以更进一步显着性抑制肿瘤进展。经DEX干预的免疫系统正常或免疫激活的荷瘤小鼠肿瘤组织中与Th1和CD8+T细胞招募、功能密切相关的基因（Cxcl9,Cxcl10,Cd3e,Gzmb,Ifng）表达水平显着性下降。DEX具有调控糖脂代谢的作用,经DEX干预后可以显着性降低免疫正常或免疫激活荷瘤小鼠肿瘤组织糖脂代谢关键基因的表达水平（Glut1,Idh3a,Gpam,Agpat2,Dgat1,Cpt1a,Pnpla2,Fabp1）。体外试验,进一步确证DEX能够显着性降低糖脂代谢通路关键基因的表达。此外,经DEX干预后,可以显着性增加免疫系统正常或者激活荷瘤小鼠血糖含量,而降低甘油三脂及游离脂肪酸（NEFA）的含量。实验表明DEX通过非受体依赖途径抑制体外肿瘤细胞增殖,抑制免疫正常或免疫激活荷瘤小鼠体内肿瘤的进展;DEX通过非受体依赖途径促进下游靶基因的转录（Klf9,Snai2,Vim）。经转录组测序分析发现,DEX在GR存在或敲除的情况下,均可影响肿瘤细胞的糖脂代谢通路;经q PCR验证发现,Sh-CTL LLC细胞系中给予DEX干预后显着性降低糖脂代谢通路重要基因的转录水平,在Sh-GR LLC细胞系中,经DEX干预后糖脂代谢通路重要基因无显着性差异（Idh3a,Agpat2,Fabp1,Slc27a4,Acadm）而仍显着性降低Glut1,Hk2,Dgat1,Cpt1a的表达。经转录组测序分析发现,DEX不完全依赖GR的作用途径调控TNF信号通路,钙信号通路,PPAR等肿瘤相关信号通路而影响肿瘤进展。综上所述,在免疫系统正常或者免疫系统激活的机体中,尽管GCs具有强大的免疫抑制作用,一定程度上抑制了Th1和CD8+T细胞的活化,但其可以通过不完全依赖GR的作用途径直接阻断肿瘤内部糖脂代谢通路以及影响TNF信号通路,钙信号通路,PPAR等肿瘤相关信号通路而抑制肿瘤进展。
朱涛[8]（2021）在《miR-15a/16-1对NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞生物学活性的影响及其机制》文中指出miR-1 5a/16-1基因复合体位于人13q14区域的DLEU2基因内含子内,其主要通过特异性结合多个靶基因发挥抑制肿瘤以及免疫调节的作用,miR-15a/16-1在多种类型的肿瘤疾病中处于较低水平,是一种公认的抑癌基因。NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞是一类具有免疫调节功能的细胞,其主要通过分泌TGF-β1进而抑制树突状细胞、NK细胞、和CD8+T细胞发挥免疫负调控效应。课题组前期通过模拟肿瘤微环境发现,经CD3抗体、CD3抗体+sRAE-1体外刺激后,野生型（WT）小鼠脾脏CD4+T细胞表面NKG2D的表达显着增加,同时发现miR-16-1的表达水平呈不同程度的下降趋势,并且通过CD3抗体、IL-2、IL-21、IL-15、IL-4等细胞因子模拟炎症微环境后也发现了同样的现象,初步明确miR-16-1与CD4+T细胞表面NKG2D呈负相关。此外,课题组前期引进了 miR-15a/16-1基因敲除（KO）小鼠,对该小鼠免疫功能进行初步分析发现,相较于WT小鼠,KO小鼠脾脏中NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的频率显着增加,同时生物信息学分析显示NKG2D 3’-UTR存在miR-16-1的特异性结合区域,提示miR-16-1可能通过调控CD4+T细胞NKG2D的表达影响其功能。为了深入探讨CD4+T细胞中NKG2D表达的调控机制,以及该调控方式下是否影响CD4+NKG2D+T细胞的生物学功能,本研究拟通过流式细胞术（FCM）、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、双荧光素酶报告基因实验进一步证实miR-16-1是否可以特异性结合NKG2D的3’-UTR。以WT、TG、KO小鼠荷瘤模型及临床肿瘤患者样本资料为研究对象,探讨miR-15a/16-1对CD4+NKG2D+T细胞生物学活性的影响及其在结肠癌进展中的作用。研究内容分为两个部分:研究内容一:miR-15a/16-1对CD4+T细胞NKG2D表达的影响目的:分析miR-15a/16-1是否影响CD4+T细胞NKG2D的表达及其分子机制。方法:（1）应用FCM检测生理状态下KO小鼠脾脏中NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的频率以及CD4+T细胞表面CD25,CD44,CD69,CD28活化分子的表达。（2）应用双荧光素酶报告基因实验验证miR-16-1是否可以特异性结合NKG2D 3’-UTR。（3）构建miR-15a/16-1转基因（TG）小鼠;应用PCR、FCM对TG小鼠进行常规鉴定;应用RT-qPCR检测TG小鼠组织miR-16-1的表达水平;应用RT-qPCR检测生理状态下KO小鼠、TG小鼠脾脏CD4+T细胞中miR-16-1与NKG2D mRNA水平;FCM检测生理状态下TG小鼠脾脏中NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的频率以及CD4+T细胞表面CD25,CD44,CD69,CD28活化分子的检测;通过CD3抗体、CD3抗体+sRAE-1体外诱导TG小鼠脾脏中NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞的产生,FCM检测该群细胞的频率以及CD25,CD44,CD69,CD28活化分子的变化。结果:（1）与WT小鼠相比,生理状态下KO小鼠脾脏NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的频率显着增加;与WT小鼠相比,KO小鼠CD4+T细胞表面CD28、CD25的表达无明显变化,而CD44、CD69的表达显着升高。（2）共转染pGL3-NKG2D-WT、pRL-TK（海肾内参质粒）和miR-16-1模拟物后,293T细胞中萤火虫荧光/海肾荧光比值显着低于对照组,而转染pGL3-NKG2D-MUT的293T细胞中该比值无明显变化,结果证实miR16-1直接特异性结合NKG2D 3’-UTR,抑制CD4+T细胞NKG2D表达。（3）与WT小鼠相比,TG小鼠PCR可以扩增出特异性的条带且鼠尾外周血GFP阳性率显着升高;TG小鼠组织miR-16-1的表达水平较WT小鼠明显上调;NKG2D mRNA水平在TG小鼠脾脏CD4+T细胞中显着下调,而其水平在KO小鼠中上调;生理状态下TG小鼠脾脏NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的频率无明显变化且CD4+T细胞表面活化分子CD25,CD44,CD69,CD28均无明显变化;与WT小鼠相比,经CD3抗体、CD3抗体+sRAE-1活化后,TG小鼠脾脏NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的诱生能力下降,同时相应的活化分子CD25,CD44,CD69,CD28无明显变化,提示miR-16-1通过特异性结合NKG2D 3’-UTR参与NKG2D的表达。结论:miR-16-1可特异性结合NKG2D 3’-UTR,抑制CD4+T细胞NKG2D的表达。研究内容二:miR-15a/16-1对CD4+NKG2D+T细胞的功能影响及其在结直肠癌发生发展中的作用目的:观察miR-15a/16-1是否影响CD4+NKG2D+T细胞功能,是否与结肠癌的进展有相关性。方法:（1）通过FCM检测生理状态下KO小鼠脾脏中NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞IL-10、TGF-β1的分泌情况;将CD8+T细胞分别与WT,KO小鼠NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞共培养,FCM分别检测共培养体系中有或没有TGF-β1中和抗体条件下CD8+T细胞IFN-γ的分泌情况。（2）制备WTMC38荷瘤小鼠模型,将KO小鼠来源的NK1.11-CD4+NKG2D+T细胞通过尾静脉过继输入到该荷瘤小鼠模型体内,观察荷瘤小鼠的肿瘤生长情况。（3）制备WT、TGMC38荷瘤小鼠模型,记录肿瘤生长曲线,应用FCM检测WT、TGMC38荷瘤小鼠脾脏、肿瘤中NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的频率;制备WT、TG B16BL6荷瘤小鼠模型,记录肿瘤生长曲线,应用FCM检测WT、TGB16BL6荷瘤小鼠脾脏、肿瘤中NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的频率。（4）收集52例结直肠癌（CRC）患者临床样本,检测CRC患者外周血单个核细胞（PBMC）中CD4+NKG2D+T细胞的频率,以胞内染色法检测该细胞IL-10、TGF-β1的分泌,并分析上述指标在CRC不同临床分期中的差异;通过RT-qPCR检测11例CRC 患者 PBMC 中 CD4+NKG2D+T细胞与 CD4+NKG2D-T 细胞中 miR-16-1 的表达,分析miR-16-1与CD4+T细胞NKG2D、IL-10、TGF-β1水平的关联性。结果:（1）与WT小鼠相比,KO小鼠脾脏NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞分泌IL-10、TGF-β1的能力显着增强;相较WT小鼠而言,与KO小鼠共培养的CD8+T细胞IFN-γ的产生能力下降,当在共培养体系中加入TGF-β1中和抗体后,CD8+T细胞产生IFN-γ的能力基本得到恢复。以上结果提示miR-15a/16-1水平下调后NK1.1-CD4+ NKG2D+T细胞的免疫调节活性增强。（2）与PBS对照组相比,过继输入KO小鼠来源的NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞明显加剧了 WT荷瘤小鼠肿瘤的生长。进一步证实miR-15a/16-1水平下调后NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞的免疫调节活性增强从而促进肿瘤的进程。（3）与WT MC38荷瘤小鼠相比,MC38细胞在TG小鼠体内形成的肿瘤略大,WT、TG MC38荷瘤小鼠脾脏和肿瘤中NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞频率无明显变化;与WT B16BL6荷瘤小鼠相比,B16BL6细胞在TG小鼠体内增长的速度稍快于WT小鼠,WT、TG B16BL6荷瘤小鼠脾脏和肿瘤中NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞频率无明显变化。（4）结直肠癌患者PBMC中CD4+NKG2D+T细胞的频率均显着增加,且该群细胞IL-10、TGF-β1的分泌能力较健康对照组显着增强,同时上述指标与Dukes分期呈正相关趋势（Dukes A期至D期）;同一个体CD4+NKG2D-T细胞miR-16-1的表达高于 CD4+NKG2D+T 细胞;在结直肠癌患者 PBMC 中,miR-16-1 与 NKG2D、IL-10、TGF-β1的荧光强度呈负相关。结论:低水平的miR-15a/16-1可以增强CD4+NKG2D+T细胞的负向免疫调节活性从而促进肿瘤的进展;结直肠癌患者PBMC中CD4+NKG2D+T细胞频率增加,且该群细胞低表达miR-16-1,可能与结直肠癌疾病的发生发展有一定的相关性。
李豪斌[9]（2021）在《SHKBP1缺失通过调控CD4/CD8抑制黑色素瘤生长的作用及机制研究》文中研究表明研究背景:肿瘤危害着人类健康,肿瘤治疗是世界医疗领域面临的难题,近年来免疫检查点的靶向治疗能够显着提高患者生存率,如针对PD1、CTLA4等靶点设计的PD1抗体、CTLA4抗体相继应用于临床并受到较好的治疗效果。还有相关研究表明联用PD1/CTLA4抗体比单用效果更显着。除了对已有靶点进行更深入的研究和应用,我们仍需要寻找是否还有其他未被发现的靶点,进一步拓宽靶向治疗的应用广度,让更多患者获益。SHKBP1是2008年发现的一种蛋白编码基因,有相关研究表明该基因可以通过中断c-Cbl-CIN85复合体并抑制EGFR降解从而促进EGFR信号通路,促进肿瘤细胞的转移。本课题通过构建的SHKBP1基因缺失小鼠,发现SHKBP1基因缺失小鼠脾脏中T细胞的分布以及数量有显着变化,这一发现提示SHKBP1可能对免疫功能有调控作用。而目前SHKBP1在调控免疫功能方面的相关研究尚未见报道,本课题的开展将围绕SHKBP1对T细胞的影响及其对T细胞各亚群的调控关系,探讨SHKBP1在肿瘤免疫治疗中的作用,为肿瘤免疫治疗提供新的潜在靶点和新的思路。目的:（1）明确SHKBP1与免疫细胞的关系及SHKBP1缺失后对其影响;（2）探索SHKBP1缺失能否影响肿瘤的生长,观察比较T细胞亚群的数量、分布等变化,探究SHKBP1在肿瘤免疫过程中起的潜在作用机制。方法:（1）利用TIMER、THE HUMAN PROTEIN ATLAS等数据库进行生物信息学分析,分析SHKBP1在临床肿瘤样本、免疫器官和免疫细胞中的表达及分布情况。（2）通过对SHKBP1-/-小鼠脾脏进行转录组测序,分析SHKBP1对免疫细胞及效应分子相关基因的影响,探究其在免疫过程中所起到的作用。同时利用实时荧光定量（q RT-PCR）、苏木素伊红染色（H&E）、免疫组化（IHC）、流式细胞术（FCM）,蛋白质印迹法（WB）等技术方法观察SHKBP1基因敲除小鼠的脾脏免疫细胞的变化;（3）建立小鼠皮下移植瘤模型,观察SHKBP1缺失对肿瘤及脾脏的组织及病理变化;（4）根据测序结果:CCL3分泌因子表达显着升高,通过ELISA方法来检测细胞因子CCL3变化。结果:（1）SHKBP1主要在血液及免疫细胞中表达,且集中表达在αβT细胞中;（2）SHKBP1缺失后脾脏中的CD4/CD8蛋白表达增加,T细胞的上游激活分子以及下游效应分子表达也相应增加;（3）与SHKBP1+/+小鼠相比,荷瘤SHKBP1-/-小鼠的肿瘤生长受到抑制,并且血清中的CCL3表达上升。结论:（1）本研究发现SHKBP1在免疫器官,免疫细胞上表达,基因缺失导致血液中嗜酸性粒细胞表达增加、脾脏结构中红髓、白髓分布异常;（2）本研究明确SHKBP1缺失能够上调脾脏中T细胞下游相关分子与激活因子的表达,CD4与CD8蛋白水平表达增加,;（3）机体免疫器官缺失SHKBP1后,免疫能力加强,黑色素瘤发生发展受到抑制,且趋化因子CCL3表达增加,肿瘤组织内免疫细胞浸润增加。
项琼[10]（2020）在《益气除瘤方对介入术后肝细胞癌的干预及诱导肿瘤细胞凋亡的机制研究》文中研究指明目的:研究益气除瘤方治疗介入术后肝细胞癌患者的临床疗效及预后分析,通过动物实验进一步探寻益气除瘤方抑制肝癌进展的分子机制,为益气除瘤方的临床应用提供依据。方法:第一部分文献研究:对肝癌中医病因病机及治疗现状进行综述总结,并对益气除瘤方的源流与现代研究进行论述。第二部分临床研究:回顾性分析益气除瘤方在介入术后肝细胞癌患者治疗中的临床疗效及与终点事件的相关性。1.收集2018年1月至2019年6月武汉大学人民医院、武汉大学人民医院东院等2个院区中医科和介入科住院诊断及门诊诊断为肝细胞癌病例,筛选符合纳入标准和排除标准病例。记录患者基线数据,包括:性别、年龄、有无合并肝炎、肝癌分期、Child-pugh分级、介入手术治疗方式、有无合并其他疾病及使用益气除瘤方的时间等。调取病历记录介入治疗前后三个月中医症状及生存质量情况,收集肿瘤标志物、血清酶学指标及肝脏影像学等结果,以生存时间作为观察结局,查阅死亡病历方式或电话追踪其总生存时间。以是否使用益气除瘤方三个月或三个月以上为分组条件,分为观察组（益气除瘤方为主方联合对症治疗）和对照组（仅接受对症治疗）。2.比较两组患者基线资料、介入治疗3个月前后的肿瘤进展情况、中医症状积分、生存质量评分（KPS）、肿瘤标志物水平（AFP、PIVKA）、血清酶学水平（ALT、AST、γ-GGT、ALP、CK、LDH）等,记录无进展生存时间（PFS）和总生存时间（OS）。3.采用Epidata3.1软件进行数据双重录入并进行一致性检验。使用SPSS23.0软件对数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料采用x±s表示,非正态分布计量资料采用M（Q25-Q75）,计数资料采用百分率表示。计量资料组间比较采用独立或配对样本t检验或Mann-Whitney U检验,计数资料比较采用?2检验进行分析。计算各组人群中不同结局的发生率,采用Kaplan-Meier法计算两组患者终点事件的累计发生率,并通过Log-rank检验比较各组的差异。采用Cox比例风险模型进一步探究两组患者不同结局事件风险比（HR）,并使用Cox比例风险模型分析各相关因素与肝癌相关不良事件发生之间的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。第三部分实验研究:益气除瘤方抑制H22荷瘤小鼠肝癌进展的可能分子机制。1.60只SPF级雌雄各半BALB/C小鼠,随机分为空白组、模型组、益气除瘤方低剂量组（简称YQCLL组）、益气除瘤方中剂量组（简称YQCLM组）、益气除瘤方高剂量组（简称YQCLH组）、槐耳颗粒组（简称HE组）,每组10只。除空白组外,其余小鼠构建H22肝癌小鼠模型。空白组、模型组小鼠每日予以生理盐水灌胃,YQCLL组予以益气除瘤方低剂量（5g/kg/d）灌胃,YQCLM组予以益气除瘤方中剂量（10g/kg/d）灌胃,YQCLH组予以益气除瘤方高剂量（20g/kg/d）灌胃,HE组小鼠予以槐耳颗粒（1.6g/kg/d）灌胃,测量并记录各组小鼠体重、腹径、进食量的变化。连续10d。2.10d后,处死小鼠,采集眼眶静脉取血。检测各组小鼠血液分析（WBC、Hb、PLT）、肝肾功能（ALT、AST、BUN、Cr）;ELISA法检测各组小鼠血清白介素6（IL-6）水平。取脾脏、胸腺、肝脏,计算各组小鼠胸腺指数、脾脏指数、肝脏指数。3.取各荷瘤组小鼠腹水,采用Hochest染色法观察各组小鼠腹水H22细胞凋亡情况,流式细胞仪检测H22细胞凋亡率。4.采用Westernblot法检测各组小鼠H22细胞JAK2/STAT3通路相关蛋白（JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3）的表达;检测凋亡相关因子（BAX、BCL-2、Caspase-3）的表达,计算相对光密度值。5.所有数据用SPSS23.0软件分析,以均数±标准差（x±s）表示。多个组间资料数据比较,先行方差齐性检验,若方差齐则采用方差分析（one-way,ANOVA）,方差不齐则采用秩和检验。组内两两比较选用t检验或多重比较t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。结果:第二部分临床研究结果:1.入组可评价病例112例,其中观察组58例,对照组54例。治疗后3个月,两组患者的各指标均有所好转,与治疗前比较,差异有统计学意义（P<0.05）。治疗后3个月,观察组较对照组肝癌实体瘤病灶稳定率更高,能明显改善胁痛、腹胀、纳呆食少、肢体倦怠乏力等症状,KPS评分提高显着,中医症状单项积分与总积分下降显着（P<0.05）;观察组的AFP、PIVKA及降低更显着,与对照组比较,差异有统计学意义;在血清酶学的比较上,观察组患者ALT、AST、LDH水平治疗后明显降低,与对照组比较,差异有统计学意义。2.在生存时间比较上,两组PFS结果相似,观察组（4.72±0.204）月VS对照组（4.47±0.193）月,差异无统计学意义;观察组OS延较对照组延长,观察组（13.97±0.638）月VS对照组（12.17±0.561）月,差异有统计学意义。3.Cox回归分析结果:单因素回归分析显示,患者生存时间与是否使用益气除瘤方、性别、肿瘤大小、肿瘤数目、Child-pugh分级、有无肝炎及肝癌分期有关,差异有统计学意义;而生存时间与患者的年龄、合并疾病及介入方式的选择无关;多因素回归分析中体现出相同的趋势,益气除瘤方的使用、肝癌分期、肿瘤大小、肿瘤数目均是影响HCC患者总生存期的关键性因素。亚组分析结果显示,以年龄分层,在55～64岁年龄组,对于早期肝癌、肿瘤大于5cm、多发肿瘤的患者,益气除瘤方可显着降低患者死亡风险;在18～54年龄组,其生存获益与有无肝炎、分期有关;在65岁以上年龄组,其生存获益与性别、肝癌分期、肿瘤大小有关。第三部分实验研究结果:1.各组小鼠在体重、腹径及进食量的结果比较上,各荷瘤组与空白组比较,差异有统计学意义。YQCLH组、HE组小鼠的体重和进食量有所增加,腹径有所减少,与模型组比较,差异有统计学意义;YQCLH组与HE组在三者的比较,差异无统计学意义。2.在胸腺指数、脾脏指数及肝脏指数的结果比较上,各荷瘤组与空白组比较,差异有统计学意义。YQCLH组、HE组的胸腺指数和脾脏指数较高,肝脏指数较低,与模型组比较,差异有统计学意义;YQCLH组与HE组比较,差异无统计学意义。3.在血液分析的结果比较上,各荷瘤组小鼠WBC及Hb数值下降,与空白组比较,差异有统计学意义;各荷瘤组小鼠组间比较,差异无统计学意义。各荷瘤组与空白组的PLT数值比较,差异无统计学意义。YQCLH组和HE组WBC数值略高,与模型组比较,差异有统计学意义;YQCLH组与HE组比较,差异无统计学意义。在肝肾功能的比较上,各荷瘤组与空白组比较,差异有统计学意义。YQCLH组和HE组ALT、AST、BUN、Cr较模型组低,与模型组比较,差异有统计学意义;YQCLH组与HE组比较,差异无统计学意义。4.在血清IL-6水平的比较上,各荷瘤组与空白组比较,差异有统计学意义。YQCLH组和HE组IL-6水平较模型组低,与模型组比较,差异有统计学意义;YQCLH组与HE组比较,差异无统计学意义。5.益气除瘤方对H22细胞凋亡的作用:⑴Hochest染色结果表明,模型组、YQCLL组、YQCLM组、YQCLH组、HE组蓝色荧光细胞数目均不一致。模型组中,可见少量的蓝色荧光细胞;YQCLH组、YQCLM组、YQCLL组、HE组均可见较多蓝色荧光细胞,其中,YQCLH组、HE组可见大量蓝色荧光细胞,同时出现典型的凋亡小体,染色质浓缩,核碎裂成大小不等的圆形小体。H22细胞在益气除瘤方剂量增大时逐渐出现凋亡,且药物浓度越大,凋亡特征越明显,具有正常形态的细胞越少见,结果优于HE组。⑵流式细胞仪检测H22凋亡率结果表明,YQCL各组和HE组的H22细胞凋亡率均较模型组明显增加;YQCLL组、YQCLM组、YQCLH组三组依药物浓度递增而出现凋亡率逐渐增加,与模型组比较,差异有统计学意义;YQCLH组的细胞凋亡率最高,和HE组比较,差异有统计学意义。6.益气除瘤方对JAK2/STAT3信号通路的干预作用:Westernblot结果显示,JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白在益气除瘤方各组与HE组的表达量均有所减少;其中,YQCLH组、YQCLM组和HE组蛋白表达下降明显,与模型组比较,差异有统计学意义。YQCLH组在JAK2、p-STAT3蛋白的表达水平下降,与HE组比较,差异有统计学意义。7.益气除瘤方对细胞凋亡通路的干预作用:Westernblot结果显示,BAX、Caspase-3在模型组中的表达量减少,而在YQCLL组、YQCLM组、YQCLH组与HE组的表达量明显增加,YQCLM组、YQCLH组、HE组与模型组比较,差异有统计学意义;YQCLH与HE组比较,差异无统计学意义。BCL-2在模型组中的表达量增加,在YQCLL组、YQCLM组、YQCLH组与HE组的表达量均有不同程度下降,YQCLH组、HE组与模型组比较,差异有统计学意义;YQCLH与HE组比较,差异有统计学意义。结论:益气除瘤方能明显改善介入术后HCC患者临床症状,提高患者生存质量,延缓肝癌进展,降低死亡风险,延长总生存期。益气除瘤方可能通过抑制血清IL-6水平,抑制JKA2/STAT3信号通路转导活化,调控线粒体细胞凋亡因子BAX、BCL-2、Caspase-3的表达,从而诱导肿瘤细胞凋亡。
二、肿瘤特异性凋亡基因对荷瘤小鼠基因治疗的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肿瘤特异性凋亡基因对荷瘤小鼠基因治疗的实验研究（论文提纲范文）
（1）艾可清颗粒减轻环磷酰胺心脏毒性的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 环磷酰胺诱导心脏毒性的分子机制 |
| 1.2 补肾健脾方对肿瘤化疗增效减毒的实验和临床研究进展 |
| 第二章 艾可清对环磷酰胺中毒小鼠毒副反应的影响 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 药品及试剂 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 动物分组及处理 |
| 1.2.2 生存曲线分析 |
| 1.2.3 血常规检测 |
| 1.2.4 生化指标检测 |
| 1.2.5 HE染色 |
| 1.2.6 统计学分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 实验动物的一般状况 |
| 1.3.2 生存曲线分析 |
| 1.3.3 AKQ对CTX染毒小鼠血常规的影响 |
| 1.3.4 AKQ对CTX染毒小鼠主要脏器生化指标的影响 |
| 1.3.5 主要脏器HE染色 |
| 1.4 讨论 |
| 第三章 艾可清对环磷酰胺中毒小鼠心脏毒性的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 药品及试剂 |
| 2.1.3 主要耗材 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 动物分组及处理 |
| 2.2.2 心脏指数计算 |
| 2.2.3 血清心肌酶及氧化指标测定 |
| 2.2.4 心脏组织HE染色 |
| 2.2.5 心肌凋亡相关蛋白免疫印迹 |
| 2.2.6 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 AKQ对CTX中毒小鼠心脏指数的影响 |
| 2.3.2 AKQ对CTX中毒小鼠心肌酶及氧化指标的影响 |
| 2.3.3 AKQ对CTX中毒小鼠心脏组织病理改变的影响 |
| 2.3.4 AKQ对CTX染毒小鼠心肌凋亡相关蛋白的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第四章 艾可清对丙烯醛所致心肌细胞损伤的影响及机制探讨 |
| 3.1 药物制备及作用剂量的确定 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 实验结果 |
| 3.2 AKQ对ACR所致H9C2损伤的影响 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 实验结果 |
| 3.3 AKQ缓解CTX心脏毒性的网络药理学分析 |
| 3.3.1 材料与方法 |
| 3.3.2 实验结果 |
| 3.4 AKQ缓解ACR心肌细胞毒性的通路靶点验证 |
| 3.4.1 实验材料 |
| 3.4.2 实验方法 |
| 3.4.3 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第五章 艾可清对荷瘤小鼠CTX心脏毒性的影响及机制探讨 |
| 4.1 AKQ对荷瘤小鼠CTX心脏毒性的影响 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.3 实验结果 |
| 4.2 AKQ对荷瘤小鼠CTX心脏毒性影响的血清代谢组学研究 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 实验结果 |
| 4.3 AKQ对肉瘤小鼠CTX心脏毒性影响的肠道菌群分析 |
| 4.3.1 实验材料 |
| 4.3.2 实验方法 |
| 4.3.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表的论文 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）疏肝化症方治疗三阴性乳腺癌临床疗效及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 第一章 疏肝化症方对三阴性乳腺癌的临床疗效研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 研究结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 疏肝化症方对乳腺癌小鼠的抑瘤作用研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 研究结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 疏肝化症方可通过PI3K/AKT/Bax通路抑制小鼠乳腺癌的发生和发展 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 研究结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简介 |
（3）扶正解毒方调控肿瘤相关成纤维细胞cGAS/Wnt16b/β-catenin轴介导癌细胞干性化逆转耐药的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 综述一 CAFs与化疗耐药的关系研究进展 |
| 1 CAFs的来源 |
| 2 CAFs的鉴定 |
| 3 CAFs与肿瘤耐药 |
| 参考文献 |
| 综述二 cGAS-STING通路在肿瘤发展中的作用及临床应用进展 |
| 1 cGAS-STING的抑瘤作用 |
| 2 cGAS-STING通路的促瘤作用 |
| 3 cGAS-STING通路与肿瘤转移 |
| 4 cGAS-STING通路与TME中其他细胞 |
| 5 cGAS-STING通路的临床应用 |
| 参考文献 |
| 综述三 中医药逆转耐药研究进展 |
| 1 耐药发生的病机 |
| 2 中医药逆转耐药的研究 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 技术路线图 |
| 第一部分 化疗诱导的DNA损伤CAFs模型构建及评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 第二部 分扶正解毒方对cGAS /Wnt-16b/β-catenin轴介导的胃癌细胞干性化逆转耐药的干预作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 5. 讨论 |
| 第三部分 5-FU耐药荷瘤小鼠模型构建及扶正解毒抗肿瘤作用及机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 5. 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究结论 |
| 创新之处 |
| 不足与展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 中医药科技查新报告书 |
（4）粘蛋白MUC1在结肠癌中诱导免疫抑制的作用机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 MUC1在小鼠结肠癌模型中诱导的免疫抑制作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 WUC1高表达的人结肠癌肿瘤组织中免疫细胞的功能变化 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 局限性与展望 |
| 附表 |
| 综述 癌症相关粘蛋白MUC在肿瘤免疫调节和转移中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章及科研项目情况 |
| 致谢 |
（5）TGF-β/Smad信号通路在肾母细胞瘤转移侵袭过程的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分:TGF-β/Smad信号介导肾母细胞瘤转移和侵袭的研究 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分:基于GEO和 TCGA数据库对肾母细胞瘤差异基因筛选与鉴定 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分:TGF-β调控MYC/CDC20 引起肾母细胞瘤细胞周期紊乱及上皮间质转化的机制研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 肾母细胞瘤肿瘤微环境靶及靶向治疗综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
（6）基于肿瘤神经新生学说探讨p75NTR介导的电针围刺的抑瘤机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 围刺法在肿瘤中的临床应用进展 |
| 1 围刺治疗单纯性囊肿 |
| 2 围刺治疗甲状腺结节 |
| 3 围刺治疗其他良性肿瘤 |
| 4 围刺治疗恶性肿瘤 |
| 5 瘤周注射治疗恶性肿瘤 |
| 6 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 神经新生及p75NTR在乳腺癌中的研究进展 |
| 1 神经新生在乳腺癌中的研究 |
| 2 p75NTR在乳腺癌中的研究进展 |
| 3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 电针与毫针围刺对4T1小鼠乳腺癌肿瘤生长的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 实验二 电针围刺对4T1小鼠乳腺癌神经新生的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 实验三 有参转录组测序探索电针围刺对肿瘤神经的作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 实验四 p75NTR对电针围刺调控肿瘤神经及癌细胞凋亡的机制 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 3 展望与不足 |
| 致谢 |
| 主要研究成果 |
（7）糖皮质激素非受体依赖性抑制肿瘤效应的研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 小鼠、细胞、菌株、质粒 |
| 1.2 试剂耗材 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 实验试剂配方 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 地塞米松干预免疫正常小鼠模型的构建 |
| 2.2 地塞米松干预免疫正常荷瘤小鼠模型的构建 |
| 2.3 地塞米松干预免疫激活荷瘤小鼠模型的构建 |
| 2.4 荷瘤小鼠肿瘤组织的石蜡包埋 |
| 2.5 荷瘤小鼠肿瘤组织的苏木素-伊红(H&E)染色 |
| 2.6 荷瘤小鼠肿瘤组织的免疫组化(IHC) |
| 2.7 总RNA的提取 |
| 2.8 逆转录 |
| 2.9 荧光定量聚合酶链式反应 |
| 2.10 载体构建 |
| 2.11 载体转化、鉴定及质粒的提取 |
| 2.12 细胞培养与慢病毒侵染建立稳转细胞株 |
| 2.13 免疫印迹 |
| 2.14 CCK8 实验 |
| 2.15 小鼠基因型鉴定 |
| 2.16 荷瘤小鼠血清中葡萄糖、甘油三脂(TG)及游离脂肪酸(NEFA)的定量检测 |
| 2.17 细胞周期检测 |
| 2.18 转录组测序及数据分析 |
| 2.19 数据统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 经地塞米松干预的免疫正常C57BL/6 小鼠脾脏中IGH(L)V基因表达量显着下降 |
| 3.1.1 转录组测序分析地塞米松干预C57BL/6 小鼠脾脏中差异基因的表达 |
| 3.1.2 地塞米松干预后显着性降低脾脏中IGH(L)V基因的表达 |
| 3.1.3 小结 |
| 3.2 经地塞米松干预的免疫正常C57BL/6 荷瘤小鼠中肿瘤进展显着性抑制 |
| 3.2.1 地塞米松注射干预后显着性抑制免疫正常C57BL/6 荷瘤小鼠肿瘤的进展 |
| 3.2.2 地塞米松注射干预后抑制了肿瘤血管生成、肿瘤增殖并促进了其凋亡 |
| 3.2.3 小结 |
| 3.3 地塞米松注射干预后显着性抑制PD-1H基因敲除免疫激活荷瘤小鼠肿瘤进展 |
| 3.3.1 PD-1H基因敲除联合地塞米松干预可以显着性抑制肿瘤的进展 |
| 3.3.2 PD-1H基因敲除联合地塞米松干预可以显着性降低肿瘤组织Ki67的表达 |
| 3.3.3 小结 |
| 3.4 地塞米松注射能显着性抑制荷瘤小鼠肿瘤微环境中抗肿瘤T细胞的功能 |
| 3.4.1 地塞米松注射能显着性抑制荷瘤小鼠肿瘤微环境中抗肿瘤CD8~+T和 CD4~+Th1 细胞的募集和功能 |
| 3.4.2 小结 |
| 3.5 地塞米松注射能显着性抑制荷瘤小鼠肿瘤微环境中糖脂代谢重要酶的表达 |
| 3.5.1 地塞米松注射能显着性抑制免疫正常荷瘤小鼠肿瘤微环境中糖脂代谢重要酶的表达 |
| 3.5.2 地塞米松注射能显着性抑制免疫激活荷瘤小鼠肿瘤微环境中糖脂代谢重要酶的表达 |
| 3.5.3 小结 |
| 3.6 地塞米松干预能显着性抑制LLC细胞系糖脂代谢重要酶的表达 |
| 3.6.1 体外试验发现经地塞米松干预后显着性抑制LLC细胞系糖脂代谢重要酶的表达 |
| 3.6.2 小结 |
| 3.7 地塞米松注射显着性降低荷瘤小鼠血清中TG和 NEFA的含量而增加血糖含量 |
| 3.7.1 地塞米松注射显着性降低荷瘤小鼠血清中TG和 NEFA的水平而增加血糖含量 |
| 3.7.2 小结 |
| 3.8 地塞米松可不完全依赖其受体(GR)作用途径抑制肿瘤进展 |
| 3.8.1 地塞米松干预后显着性升高肿瘤细胞GR及其下游靶基因的转录水平 |
| 3.8.2 构建GR敲除的LLC稳转细胞系 |
| 3.8.3 地塞米松通过非受体依赖途径抑制LLC细胞和Hepa1-6 细胞增殖 |
| 3.8.4 地塞米松通过非受体依赖途径抑制免疫正常荷瘤小鼠肿瘤进展 |
| 3.8.5 地塞米松通过非受体依赖途径抑制免疫激活荷瘤小鼠肿瘤进展 |
| 3.8.6 GR作为肿瘤抑制因子具有抑制肿瘤进展的作用 |
| 3.8.7 地塞米松通过依赖受体作用途径使得 LLC 细胞周期G1/S期阻滞 |
| 3.8.8 小结 |
| 3.9 地塞米松可通过非受体依赖途径促进靶基因转录水平 |
| 3.9.1 地塞米松可通过非受体依赖途径促进靶基因的转录水平 |
| 3.9.2 小结 |
| 3.10 地塞米松不完全依赖其受体作用途径调节肿瘤内糖脂代谢通路 |
| 3.10.1 筛选差异表达基因 |
| 3.10.2 地塞米松可调控糖脂代谢等信号通路 |
| 3.10.3 地塞米松通过非受体依赖途径调控糖脂代谢等信号通路 |
| 3.10.4 地塞米松不完全依赖受体作用途径调控糖脂代谢相关通路 |
| 3.10.5 地塞米松不完全依赖受体作用途径调控LLC细胞糖脂代谢通路 |
| 3.10.6 小结 |
| 3.11 地塞米松可能通过不完全依赖其受体作用途径调节肿瘤相关信号通路而影响肿瘤进展 |
| 3.11.1 地塞米松不完全依赖受体作用途径调控TNF信号通路 |
| 3.11.2 地塞米松不完全依赖受体作用途径调控钙离子和PPAR等肿瘤相关信号通路 |
| 3.11.3 小结 |
| 4 讨论 |
| 5 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 糖皮质激素(GCs)在肿瘤进展中的研究现状 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间论文发表情况 |
（8）miR-15a/16-1对NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞生物学活性的影响及其机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 研究内容一: miR-15a/16-1对CD4~+ T细胞NKG2D表达的影响 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 研究内容二: miR-15a/16-1对CD4~+ NKG2D~+T细胞的功能影响及其在结直肠癌发病中的作用 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述: miR-16参与调控炎症性疾病的研究进展 |
| 1. miR-16的概述 |
| 2. miR-16调控免疫细胞活性参与炎症性疾病的进展 |
| 3. miR-16与炎症性疾病 |
| 4. 小结与展望 |
| 5. 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（9）SHKBP1缺失通过调控CD4/CD8抑制黑色素瘤生长的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 机体免疫功能简介 |
| 1.1.2 肿瘤免疫 |
| 1.1.3 肿瘤微环境 |
| 1.1.4 肿瘤微环境中免疫细胞 |
| 1.1.5 SHKBP1 的研究现状 |
| 1.1.6 本研究着重点 |
| 1.2 技术路线 |
| 1.3 研究思路 |
| 1.3.1 生物信息学分析SHKBP1 缺失对免疫细胞及相关因子的影响。 |
| 1.3.2 验证SHKBP1 基因缺失对小鼠免疫功能的影响。 |
| 1.3.3 慢病毒处理小鼠SHKBP1,观察肿瘤生长情况。 |
| 1.4 研究意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验细胞系 |
| 2.1.3 实验仪器与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠饲养、扩群与基因鉴定 |
| 2.2.2 样品获取及处理 |
| 2.2.3 小鼠B16-F10 黑色素瘤细胞皮下移植瘤模型的构建 |
| 2.2.4 石蜡切片的制备 |
| 2.2.5 苏木素/伊红染色(H&E染色) |
| 2.2.6 免疫组织化学染色(IHC染色) |
| 2.2.7 蛋白质免疫印迹法(Western Blot) |
| 2.2.8 实时荧光定量(q RT-PCR) |
| 2.2.9 流式细胞术 |
| 2.2.10 慢病毒感染 |
| 2.2.11 ELISA检测细胞因子 |
| 2.2.12 统计学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 SHKBP1 在免疫细胞上表达 |
| 3.1.1 SHKBP1 在肿瘤组织中表达 |
| 3.1.2 SHKBP1 在免疫器官与免疫细胞中表达 |
| 3.1.3 SHKBP1 缺失影响小鼠外周血及脾脏 |
| 3.2 SHKBP1 缺失对小鼠免疫相关基因及T细胞数目、功能的影响 |
| 3.2.1 SHKBP1 缺失影响小鼠免疫系统相关基因 |
| 3.2.2 SHKBP1 缺失影响T细胞及其分泌因子表达 |
| 3.2.3 SHKBP1 缺失影响T细胞的活化及相关下游分子表达 |
| 3.2.4 SHKBP1 缺失影响CD4与CD8 在脾脏组织内的表达分布 |
| 3.3 建立小鼠皮下移植瘤模型,探究SHKBP1 缺失调节T细胞功能以及参与肿瘤免疫调控过程的作用 |
| 3.3.1 SHKBP1 缺失抑制黑色素瘤生长 |
| 3.3.2 SHKBP1 缺失影响对荷瘤小鼠脾脏及外周血中T细胞的比例 |
| 3.3.3 SHKBP1 的缺失对荷瘤小鼠肿瘤外周及内部T细胞浸润的影响 |
| 3.4 SHKBP1 慢病毒干扰处理对小鼠黑色素瘤生长的影响 |
| 3.4.1 慢病毒干扰的有效性筛选 |
| 3.4.2 SHKBP1 慢病毒干扰荷瘤小鼠,影响黑色素瘤生长 |
| 3.4.3 SHKBP1 慢病毒干扰处理后小鼠脾脏SHKBP1 的表达减少 |
| 3.4.4 SHKBP1 的缺失对血清中CCL3 表达的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望与不足 |
| 参考文献 |
| 附录一:缩写词中英文对照 |
| 附录二:攻读研究生期间学术成果 |
| 1.攻读硕士研究生期间论文发表情况 |
| 2.攻读硕士研究生期间参加的国内外学术会议 |
| 致谢 |
（10）益气除瘤方对介入术后肝细胞癌的干预及诱导肿瘤细胞凋亡的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 中医学对肝癌的认识 |
| 1.1.1 肝癌中医病名历史渊源 |
| 1.1.2 肝癌在中医学中的病位研究 |
| 1.1.3 肝癌的中医病因病机 |
| 1.1.4 肝癌中医治则治法探究 |
| 1.1.5 肝癌的中医证治要点 |
| 1.1.6 中医对肝癌预后的认识 |
| 1.1.7 现代中医治疗肝癌的现状 |
| 1.2 肝癌的发生机制与中药实验研究进展 |
| 1.2.1 肝癌发生机制的研究进展 |
| 1.2.2 治疗肝癌的中药复方及单体研究进展 |
| 1.3 益气除瘤方的源流与现代拆方研究进展 |
| 1.3.1 益气除瘤方治疗肝癌的理论依据及源流 |
| 1.3.2 益气除瘤方方解 |
| 1.3.3 益气除瘤方拆方治疗肝癌的实验研究进展 |
| 第二章 益气除瘤方干预介入术后HCC患者的回顾性临床研究 |
| 2.1 方法 |
| 2.1.1 临床资料收集方法 |
| 2.1.2 诊断标准 |
| 2.1.3 纳入标准 |
| 2.1.4 排除标准 |
| 2.1.5 研究方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 纳入病例基本特征 |
| 2.2.2 疗效评价结果 |
| 2.2.3 生存状态结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 AFP、PIVKA和血清酶学水平在HCC辅助诊断中的意义 |
| 2.3.2 HCC的中医临床疗效评价 |
| 2.3.3 多因素回归模型在本研究的意义 |
| 2.3.4 本研究的不足 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 益气除瘤方对H_(22)荷瘤小鼠抗肿瘤机制的实验研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验细胞 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 实验主要试剂 |
| 3.1.5 实验药品 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 实验中给药剂量换算 |
| 3.2.2 给药方法 |
| 3.2.3 BALB/C小鼠H_(22)荷瘤模型建立 |
| 3.2.4 小鼠的一般情况、体重、腹径及平均进食量的检测 |
| 3.2.5 标本处理及保存 |
| 3.2.6 检测各组小鼠血常规及肝肾功能 |
| 3.2.7 检测各组小鼠血清IL-6 水平 |
| 3.2.8 Hoechst法检测各组荷瘤小鼠腹水中H_(22)肝癌细胞凋亡情况 |
| 3.2.9 流式细胞仪检测各组荷瘤小鼠腹水中H_(22)肝癌细胞凋亡率 |
| 3.2.10 Westblot法检测各组荷瘤小鼠H_(22)细胞JAK2/STAT3 信号通路相关蛋白及细胞凋亡因子BAX,BCL-2,Caspase-3 的表达 |
| 3.2.11 统计方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 各组小鼠的一般情况,监测体重、腹径、平均进食量的变化 |
| 3.3.2 各组小鼠的脏器指数比较 |
| 3.3.3 各组小鼠WBC、Hb、PLT指标的比较 |
| 3.3.4 各组小鼠AST、ALT、Cr、BUN结果的比较 |
| 3.3.5 各组小鼠血清IL-6 水平的比较 |
| 3.3.6 各组小鼠腹水中H_(22)细胞Hochest染色的比较 |
| 3.3.7 各组小鼠H_(22)细胞凋亡情况的比较 |
| 3.3.8 各组小鼠H_(22)细胞JAK2/STAT3 信号通路相关蛋白表达水平的比较 |
| 3.3.9 各组小鼠H_(22)细胞凋亡蛋白表达水平的比较 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 动物造模 |
| 3.4.2 对照组药物选用 |
| 3.4.3 动物造模后表现 |
| 3.4.4 益气除瘤方(YQCL)对H_(22)荷瘤小鼠的抗肿瘤作用 |
| 3.4.5 IL-6 诱导JAK2/STAT3 信号通路激活及YQCL的干预作用 |
| 3.4.6 YQCL促 H_(22)细胞线粒体细胞凋亡的作用 |
| 3.5 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文及参编着作情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
四、肿瘤特异性凋亡基因对荷瘤小鼠基因治疗的实验研究（论文参考文献）
- [1]艾可清颗粒减轻环磷酰胺心脏毒性的作用及机制研究[D]. 钟鹏程. 广州中医药大学, 2021(02)
- [2]疏肝化症方治疗三阴性乳腺癌临床疗效及其作用机制研究[D]. 王博. 长春中医药大学, 2021(01)
- [3]扶正解毒方调控肿瘤相关成纤维细胞cGAS/Wnt16b/β-catenin轴介导癌细胞干性化逆转耐药的研究[D]. 吴喆. 中国中医科学院, 2021(02)
- [4]粘蛋白MUC1在结肠癌中诱导免疫抑制的作用机制研究[D]. 张颖慧. 昆明医科大学, 2021
- [5]TGF-β/Smad信号通路在肾母细胞瘤转移侵袭过程的作用机制研究[D]. 石秦林. 重庆医科大学, 2021(01)
- [6]基于肿瘤神经新生学说探讨p75NTR介导的电针围刺的抑瘤机制[D]. 田叶红. 北京中医药大学, 2021(01)
- [7]糖皮质激素非受体依赖性抑制肿瘤效应的研究[D]. 徐磊. 重庆医科大学, 2021(01)
- [8]miR-15a/16-1对NK1.1-CD4+NKG2D+T细胞生物学活性的影响及其机制[D]. 朱涛. 扬州大学, 2021(08)
- [9]SHKBP1缺失通过调控CD4/CD8抑制黑色素瘤生长的作用及机制研究[D]. 李豪斌. 广东药科大学, 2021(02)
- [10]益气除瘤方对介入术后肝细胞癌的干预及诱导肿瘤细胞凋亡的机制研究[D]. 项琼. 广州中医药大学, 2020(09)