一、恶性疟原虫青蒿素类抗疟药物结合蛋白的研究（论文文献综述）
高鹏[1]（2021）在《青蒿素及青蒿素联合疗法的抗疟机理研究》文中研究指明疟疾是一种由疟原虫属的原生寄生虫引起的致命性传染病,广泛流行于热带和亚热带等全球的90多个国家,世界上将近一半的人口面临感染疟疾的风险。世界卫生组织（WHO）将疟疾与艾滋病、结核病一起并列为全球三大公共卫生问题。最新世界疟疾报告显示,2018年全世界范围内约有2.28亿人感染疟疾,并造成约40.5万人的死亡,其中5岁以下儿童占死亡人数的67%。疟疾的防治主要集中在病媒控制、药物防治和接种疫苗三方面。然而随着疟原虫对拟除虫菊酯、双对氯苯基三氯乙烷（DDT）等杀虫剂产生广泛的耐药性以及缺少临床许可的疫苗,药物治疗成为目前治疗疟疾最主要的手段。早期的抗疟药主要是以奎宁为基础的喹啉类药物,如氯喹等,然而上世纪五十年代由于喹啉类等药物的滥用,使疟原虫产生了广泛的耐药性,全世界再次面对疟疾的威胁。因此更高效安全的抗疟药的出现变得尤为迫切。1971年我院中药研究所屠呦呦研究员首次从黄花蒿中发现并分离出青蒿素（ART）,并于20世纪80年代被用于临床治疗疟疾,自2001年以来一直被世界卫生组织推荐为治疗疟疾的一线药物。青蒿素的发现和以青蒿素为基础的联合疗法（ACT）的提出,使疟疾在全球范围内的流行得到了有效控制,缓解了对氯喹等药物出现广泛耐药性的严峻局面,挽救了数百万人的生命。屠呦呦研究员也因发现青蒿素而获得2015年诺贝尔生理学或医学奖。青蒿素是一种含有1,2,4-三氧六环和内过氧化桥的倍半萜内酯化合物,对于多种疟原虫具有非常好的杀灭作用,尤其是对造成死亡人数最多的恶性疟。虽然ART已经被用于临床近四十年,但其确切的作用靶点和抗疟机理依然不是十分明确,这极大的限制了其临床应用及新适应症的开发。因此,尽快明确ART的抗疟机理具有非常重要的意义。ART是目前唯一一种尚未产生广泛耐药性的抗疟药物,并且目前尚无其他抗疟药可替代。然而,本世纪初在大湄公河次区域出现了对ART和ACT耐药的报道,目前表现为体内疟原虫清除率的降低、清除时间延长和治疗后的复发,一旦出现对青蒿素的广泛耐药,人类将会面临无药可医的局面。而青蒿素抗疟机理研究是解开其耐药性产生的重要基础。所以,研究并明确ART的抗疟机理是当前迫切需要解决的问题,也是目前面临的最大挑战。同时,明确ART的抗疟机理对于ACT作用机理的揭示起到重要促进作用,有利于优化青蒿素和ACT的临床应用和新适应症的拓展以及开发新的ACT配对药物。本课题在实验室前期研究的基础上,围绕“青蒿素及ACT的抗疟机理研究”展开研究工作。主要采用基于活性的蛋白质组学技术（ABPP）、细胞热转移分析技术（CETSA）、蛋白的外源表达纯化和细胞共定位成像等方法进行研究。一、合成了以青蒿素为基础的新型光交联活性探针AP2探究青蒿素在疟原虫体内是否有以非共价形式结合的靶标蛋白。通过检测其对恶性疟原虫株3D7和氯喹耐药疟原虫株7G8的IC50来检测其活性。结果表明,ART经过修饰加上具有光亲和特性的双吖丙啶基团后依旧保持其高效特异的抗疟活性。原位荧光标记实验结果表明经过365 nm紫外光照射过,具有光亲和特性,光亲和基团被激活,与临近的蛋白产生交联作用,与非紫外照射组相比可以结合到更多蛋白。说明青蒿素类药物在疟原虫体内除了经血红素激活产生碳自由基将靶标蛋白烷基化,从而以共价结合的方式与靶标蛋白结合产生抗疟作用外,还可能存在以非共价结合方式结合的靶标蛋白。二、采用CETSA研究青蒿素衍生物青蒿琥酯（ATS）对疟原虫总蛋白的热稳定性的影响从而鉴定存在的靶标蛋白。首先通过熔融曲线实验（Melt curve）,监测疟原虫在37℃～73℃加热条件下可溶性蛋白含量的变化,确定其熔融温度（Tm,50%的蛋白质变性的温度）为52℃。随后进行等温剂量反应（ITDR）,选择在非变性温度37℃和变性温度52℃下监测不同药物浓度下可溶性蛋白的含量,经分析鉴定出了 145个与ATS结合后热稳定性发生明显升高或者降低的疟原虫蛋白,表明ATS在抗疟过程中存在多种靶标蛋白,通过干预多种生理进程从而产生抗疟效果。对靶标蛋白进行生物信息学分析表明,青蒿素类药物很可能通过影响疟原虫消化泡（DV）对血红蛋白的摄取过程和能量代谢过程,而产生高效特异的抗疟效果。三、通过采用以临床常用的ACT中的青蒿琥酯-阿莫地喹（ATS-AQ）为基础的活性探针AP1-AQP,外源表达纯化疟原虫蛋白,采用原位荧光标记和细胞共定位成像来研究ACT药物间的相互作用。实验结果表明,在ATS-AQ药对中,ATS在抗疟过程中占主导作用,与疟原虫蛋白的结合效率和结合能力更强。配伍药物AQ不仅通过延长血液中药物半衰期增强抗疟作用,还可以增强ATS在疟原虫体内与蛋白的结合能力,从而提高ATS的抗疟能力,起到协同作用。此外,研究结果还表明血红素不但可以激活青蒿素,而且可以增强AQ与疟原虫蛋白的结合能力,体现了血红素在ACT疗法中可能存在重要的协同作用。以上结果对于更加深入地研究ACT的抗疟机理,优化临床用药以及开发新的ACT药对具有重要意义。综上所述,青蒿素类药物在疟原虫体内不仅存在共价结合的靶标蛋白,也存在部分非共价结合的靶标蛋白,并且主要通过影响疟原虫消化泡对血红蛋白的摄取,影响有机物代谢和能量代谢过程产生抗疟作用。ACT疗法中青蒿素类药物起主要抗疟作用,配伍药物不但可以通过延长血液中抗疟药物的存在时间增强抗疟作用,而且可以增强青蒿素在疟原虫体内与蛋白的结合能力,从而提高抗疟能力,起到协同作用。
王华晶[2]（2021）在《从脾脏控制疟疾感染的角度初步探索青蒿素“耐药”的涵义》文中进行了进一步梳理据世界卫生组织（World Health Organization,WHO）统计,2019年全球约有疟疾病例2.29亿例,其中死亡病例40.9万例。大部分疟疾病例分布在非洲,其次是东南亚和地中海东部地区[1]。青蒿素及其衍生物对恶性疟原虫的红内期具有较高的抗疟活性,为避免单一用药可能带来的潜在耐药风险,WHO提出以青蒿素类药物为基础的联合用药疗法（Artemisinin-based combination therap,ACT）作为单纯性疟疾的一线治疗方法[2]。该治疗方法最初在全球范围内的抗疟效果显着,但在2009年以来,东南亚国家相继报道出ACT三日治疗以后部分疟疾患者体内的疟原虫清除时间延长。这引发了关于疟原虫对青蒿素产生耐药性的一系列讨论及研究。2015年,WHO将青蒿素耐药性定义为:单用青蒿琥酯或ACTs治疗后疟疾患者血液内疟原虫的清除半衰期≥5 h[3]。恶性疟原虫K13 falciparum kelchl3,Pfkelch13)基因突变被认为是疟原虫对青蒿素类药物产生耐药性的主要原因。但是,并非所有的K13基因突变都会造成疟原虫对青蒿素类药物产生耐药性,即使是同时感染K13突变疟原虫的患者,在抗疟治疗过程中,疟原虫的清除时间也有很大差异[4],K13突变可能只是青蒿素耐药性的机制之一,其涉及的分子机制还有待于进一步研究。青蒿素耐药性定义与传统药理学的耐药定义内涵不太一致,传统药理学对于药物耐药性的定义是:病原体与药物多次接触后,对药物的敏感性下降甚至消失,致使药物对该病原体的疗效降低或无效的一种可遗传的生理特性。病原体产生耐药性的机理是（1）细菌产生灭活抗菌药物的酶使抗菌药物失活;（2）抗菌药物作用靶位改变;（3）细菌外膜通透性改变[5]。传统药理学耐药性的定义重在微生物内在变化致使对药物的敏感程度降低甚至消失;青蒿素耐药性则强调寄生病原体本身在宿主体内的存留曲线变化。二者描述方面虽有部分生物学意义上的交叠,但本质上迥然相异,前者重视病原微生物本体基因型或者表观变化,而后者几乎纯属消除现象描述。疟原虫的体内清除是抗疟药物的杀虫功效、宿主免疫功能调节（如吞噬细胞的识别处理）、免疫器官（如脾脏）的外排异物功能等多方参与的复杂过程[6]。而且ACT三日疗法从未被确定为治愈疗法,延长治疗时间或调整联合用药方法,仍可达到疟疾治疗效果。无论宿主防御机制如何,以青蒿素类药物为基础的联合用药治疗以后疟原虫清除时间的延迟是否应定义为青蒿素“耐药”?疟疾的发病机理和临床表现受宿主年龄、免疫力和遗传背景、环境条件和寄生虫遗传学等因素的影响而存在复杂的变化[7-8]。在存在或不存在青蒿素治疗的情况下,宿主防御机制（例如通过脾脏和单核吞噬系统清除循环寄生虫）在快速控制感染中起着重要作用[9]。东南亚地区一直是对各抗疟药物产生耐药性的首发地,在对氯喹、磺胺多辛、奎宁、甲氟喹等抗疟药物产生抗药性以后,又首次发现P.falciparum对青蒿素类药物产生耐药性。而占全球90%疟疾病例的非洲地区却鲜有青蒿素“耐药”病例的报道。从宿主控制疟疾感染的角度寻找疟原虫清除时间延长的原因显得尤为必要。脾脏通过特异性孔蚀功能清除疟疾患者体内的疟原虫,但是脾脏对疟原虫的清除作用与ACTs治疗后出现的疟原虫清除时间延长即耐药有没有相关性,目前尚不明确。而且不同地域、初次感染疟疾或反复感染疟疾的人群,其脾脏清除疟原虫的能力是否存在差异,进而影响疟原虫的清除时间,都有待进一步研究。目的1.探究脾脏清除疟原虫的能力在控制疟疾感染中的重要性。2.探究脾脏清除血液循环中疟原虫的主要方式。3.探究影响脾脏清除血液循环中疟原虫的因素。4.探究青蒿素“耐药”现象的本质,为解决青蒿素“耐药”问题提供理论基础。方法使用C57BL/6、BALB/c、ICR及KM四个品系小鼠,每个品系分为对照组和感染组,感染组小鼠同时腹腔接种1×107个伯氏疟原虫K173青蒿素敏感株染虫红细胞（PbK173 iRBCs）,测生存期组感染后每天记录小鼠的体重、存活时间及尾静脉采血涂片计算染虫率,其他感染组分别在感染后第1、3、5、8天采集小鼠外周血液、心、肝、脾。用全自动血液分析仪检测小鼠外周血液参数,各脏器称重并计算脏器系数,脾脏分为两份:一份用4%多聚甲醛固定液固定24小时后做石蜡切片用于病理分析;用流式细胞计数仪检测剩余脾组织中的脾细胞。PbK173青蒿素敏感株与抗性株进行平行实验,使用C57BL/6小鼠,根据体重随机分为对照组与感染组,各感染组小鼠分别同时腹腔接种1×107个敏感/抗性株的iRBCs,测生存期组感染后每天记录小鼠的体重及尾静脉采血涂片计算染虫率,其他感染组分别在感染后第2、5、9天采集小鼠外周血液、心、肝、脾。观察各组小鼠外周血液参数、脏器系数、脾脏病理切片及脾细胞。PbK173青蒿素敏感株与抗性株进行平行药物治疗实验,使用C57BL/6小鼠,根据体重随机分为对照组与感染组,感染组分为模型组与药物治疗组,药物治疗组包括咯萘啶（MD）组（6 mg/kg）、双氢青蒿素-低剂量（DHA-L）组（10 mg/kg）、双氢青蒿素-中剂量（DHA-M）组（20mg/kg）、双氢青蒿素-高剂量（DHA-H）组（40mg/kg）。感染组分别腹腔接种1×107个敏感/抗性株的iRBCs,测生存期组在治疗及治疗结束后每天记录小鼠的体重及尾静脉采血涂片计算染虫率,其他组分别在治疗结束第一天,治疗结束第五天采集小鼠外周血液、心、肝、脾。观察各组小鼠外周血液参数、脏器系数、脾脏病理切片。结果1.不同品系小鼠对PbK173青蒿素敏感株的耐受性不同、各品系的病程存在差异,ICR小鼠起病急、死亡快;BALB/c小鼠虽起病时间较KM小鼠早,但生存期与KM小鼠无显着性差异,KM小鼠的致死染虫率是65%,而其他品系小鼠的致死染虫率大于80%;C57BL/6小鼠的虫率增长速度较其他品系慢,且生存期较其他品系长。2.脾脏肿大是感染疟疾的典型症状,但不同品系小鼠的脾脏,对疟原虫的耐受性或病理反应有所差异:感染PbK173第八天,C57BL/6和BALB/c染虫小鼠的脾实质结构完整,而ICR和KM染虫鼠的脾脏表现出严重的空泡状病理改变,脾实质结构不完整。KM染虫鼠的脾脏在第五天出现空泡状病理改变,且在红髓部位较明显;到感染第八天,空泡状的病理现象弥漫到整个脾脏。3.不同品系小鼠的脾脏,物理截留疟原虫的功能存在差异:各品系小鼠感染PbK173期间,滞留在C57BL/6、BALB/c染虫鼠脾脏中的疟原虫分布于疟原虫各生长阶段。KM染虫鼠在感染初期,各生长时期的疟原虫均可被截留在脾脏中;感染第八天,脾脏结构发生病理改变,滞留在脾脏中的疟原虫体积偏大。ICR染虫鼠在感染初期,滞留在脾脏中的滋养体时期疟原虫较多。4.本次研究中,PbK173青蒿素敏感株小鼠与抗性株小鼠的染虫率在感染后期无显着性差异,但敏感株小鼠生存期较抗性株小鼠的生存期短（p<0.01）,可以认为PbK173青蒿素抗性株的致死性或毒性降低。5.C57BL/6小鼠,感染PbK173青蒿素敏感株/抗性株,不经药物治疗时,抗性株染虫鼠的脾脏系数在感染第五天以后一直较敏感株染虫鼠的大（p<0.01）。6.100倍油镜下观察染虫小鼠外周血液涂片,正常红细胞呈圆形,显淡红色;感染疟原虫初期,虫体被染为蓝色,胞核为红色;感染中后期,随着虫体生长,红细胞体积明显增大,虫体及胞核均呈蓝色;MD与DHA-H对敏感株染虫鼠的治愈力达100%,在停药第一天,两组的血液涂片中红细胞大小不均,掺杂一些体积较大,无虫体的蓝色细胞（受损红细胞）;在停药第五天的血液涂片中,受损红细胞明显减少,红细胞体积大小较均一。这可能是抗疟药物虽抑制了疟原虫,但被感染过的红细胞仍留存在血液循环中,疟原虫感染造成小鼠血液系统功能紊乱并没有立即恢复,而是在停止治疗以后靠机体自身免疫力（如脾脏过滤清除受损红细胞）得以缓解。7.MD治疗组,PbK173青蒿素敏感株或抗性株染虫鼠的治愈率达100%,在停药第一天,两个虫株染虫鼠的脾脏系数、血液中红细胞计数无统计学差异;血液涂片中均存在受损红细胞,且细胞体积大小不均一。但是在停药第五天,敏感株染虫鼠外周血液中的红细胞计数、血红蛋白浓度较抗性株染虫鼠低（p<0.05）,敏感株染虫鼠的脾脏在停药以后持续增大,血液涂片中,受损红细胞明显减少,红细胞体积大小较均一。抗性株染虫鼠的脾脏在这期间没有继续增大,血液涂片中依然存在较多受损红细胞。这一反差可能是因为:脾脏具有截留血液循环中受损红细胞的功能,抗性株受损红细胞的柔韧性增加,更容易通过内皮细胞间隙;而敏感株受损红细胞容易被截留,所以敏感株染虫鼠的脾脏在治疗结束以后持续增大。结论1.脾脏通过脾静脉窦内皮细胞间隙的截留功能与巨噬细胞的免疫反应共同清除血液循环中的疟原虫。2.不同遗传背景宿主脾脏清除疟原虫的能力不同。3.脾静脉窦内皮细胞间隙的截留功能在脾脏清除疟原虫中发挥主要作用。4.脾静脉窦应力纤维的弹性与红细胞柔韧性影响脾脏的截留功能。5.对青蒿素敏感性不同虫株染虫红细胞的柔韧性可能存在差异。
李硕,李沧海,姜廷良[3]（2021）在《疟原虫脂质代谢与青蒿素抗疟机制研究进展》文中认为疟原虫作为单细胞生物,存在单一生物体中很少同时出现的多种脂质代谢途径,这些代谢途径通过疟原虫自身强大的酶促反应系统完成,满足了其在各个生命阶段快速生长、反复分裂繁殖所需的生物膜合成。不同的脂质有不同的代谢途径,如重要的磷脂类主要通过原核型CDP-二酰基甘油依赖性途径以及真核型从头途径合成,脂肪酸类主要通过Ⅱ型脂肪酸合成途径合成等。现有文献显示,一线抗疟药物青蒿素及其衍生物对疟原虫脂质代谢有值得重视的影响。因此该文对现有的已知疟原虫的脂质代谢途径以及青蒿素及其衍生物对这些途径的作用进行综述,以促进对疟原虫脂质合成代谢的理解,进而为青蒿素类抗疟药物的作用机制和耐药性问题提供理论基础和参考借鉴。
王建花[4]（2021）在《恶性疟原虫红内期发育过程中的蛋白质翻译后修饰研究》文中进行了进一步梳理疟疾是对人类危害最严重的疾病之一。恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）是致病力最强的疟原虫,其在人体红细胞内48 h的发育期是致病的主要时期。尽管基于青蒿素的治疗法是目前最有效的抗疟手段,然而抗青蒿素虫株的出现及世界性扩散使疟疾疫苗及新型抗疟药的研制迫在眉睫,但在疟原虫的生物学及致病机理还有待深入揭示。蛋白质翻译后修饰（Protein post-translational modifications,PTMs）是调节蛋白质功能的重要环节,参与蛋白质修饰和解除修饰的分子是研制生物药物的重要靶点。目前,针对恶性疟原虫翻译后修饰的研究已有不少,如恶性疟原虫组蛋白乙酰化、甲基化、棕榈酰化、磷酸化、小泛素（SUMO）化,非组蛋白磷酸化、乙酰化、泛素化等。这些研究在一定程度上解释了虫体发育和致病的调控机制,但目前的研究多针对虫体发育过程中的某个时间点的蛋白质翻译后修饰,没有解决虫体在整个发育过程的整体调控机制及各种修饰之间的动态变化与虫体发育繁殖的关系。此外,有关宿主红细胞蛋白质的翻译后修饰在虫体-宿主相互作用的意义还缺乏研究。本研究使用十种翻译后修饰泛抗体（酪氨酸磷酸化,赖氨酸乙酰化、巴豆酰化、2-羟基异丁酰化、泛素化、三甲基化、丙酰化、丙二酰化、戊二酰化、琥珀酰化）对恶性疟原虫红内期发育过程中的动态修饰水平进行了Western blotting鉴定;并采用TMT（Tandem mass tag）标记的方式对虫体发育过程的六个时间点（8,16,24,32,40,48 h）的染虫红细胞及健康红细胞样品进行了质谱鉴定,针对恶性疟原虫及其宿主红细胞六种翻译后修饰（磷酸化、乙酰化、巴豆酰化、2-羟基异丁酰化、泛素化、N-糖基化）的动态丰度变化进行了系统研究,从各修饰的功能、时空分布及相关性,疟原虫红内期发育繁殖调控,疟原虫基因表达调控及致病相关因子的调控四个方面进行生物信息学分析;全面分析了糖酵解、磷酸戊糖途径、嘌呤补救合成三个关键代谢通路相关调控酶的修饰种类和动态变化。本研究绘制了恶性疟原虫红内期虫体及宿主红细胞蛋白质的六种翻译后修饰的动态图谱,从修饰的角度揭示了恶性疟原虫在红内期的发育变化规律。其中,巴豆酰化、2-羟基异丁酰化、N-糖基化三种修饰的研究结果及恶性疟原虫对宿主红细胞蛋白质的动态修饰研究是在疟原虫相关研究方面最新的研究结果。研究发现,翻译后修饰广泛参与了基因表达、裂殖子对红细胞的入侵、红细胞重塑、免疫逃避、营养代谢等重要生物学过程。相比健康红细胞,染虫红细胞蛋白质的磷酸化和泛素化发生了明显变化,且在虫体刚入侵红细胞时这两种修饰最为明显。红细胞的N-糖基化在恶性疟原虫释放和入侵阶段的丰度发生了极其显着的变化,并且非唾液酸依赖的红细胞受体（如CR1,Basigin等）很多被糖基化修饰。本研究绘制了最全面的恶性疟原虫组蛋白及其变体的修饰图谱,并将以前研究中鉴定到的修饰位点进行了标注,为“组蛋白密码”的解析和组蛋白介导的基因表达调控研究奠定了重要基础。此外,我们筛选了调控基因转录与表达相关的蛋白质,针对已知的蛋白质互作关系及修饰位点的丰度变化水平绘制了相互作用网络图。研究发现,在基因表达过程中,含有组蛋白的核小体的结构变化与乙酰化关系最为密切,转录过程以及翻译起始主要被磷酸化调控,而翻译延伸和核糖体加工被多种修饰共同调控。恶性疟原虫代谢通路调控酶的修饰分析表明,糖酵解途径中的限速酶丙酮酸激酶（PK）在滋养体早期被乙酰化和2-羟基异丁酰化修饰。在红内期发育晚期这两种蛋白质被巴豆酰化、2-羟基异丁酰化和磷酸化修饰共同调控;嘌呤挽救途径的关键酶次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）发生了2-羟基异丁酰化修饰,乙酰化和巴豆酰化修饰;人体6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PD,磷酸戊糖途径关键酶）发生了磷酸化和2-羟基异丁酰化修饰。本研究完成了恶性疟原虫及及所寄生的红细胞蛋白质最为全面的动态表观遗传学分析,从翻译后修饰的角度解析了红内期恶性疟原虫的发育和致病机理,为揭示疟原虫生物学特征和新型抗疟药的研发奠定重要基础。
蒋惠宇[5]（2020）在《青蒿素类化合物与P-gp相互作用及抗疟QSAR研究》文中研究表明青蒿素是由我国化学家屠呦呦教授首次发现的抗疟特效药,具有高效低毒的特点。青蒿素的发现对全球范围内疟疾的控制与治疗做出了巨大贡献。随着对青蒿素研究的不断深入,人们发现除了优秀的抗疟活性外,青蒿素还具有抗肿瘤、抗炎、调节机体免疫、抗心律失常等药理活性。10-苯基醚类青蒿素化合物是一类具有新化学结构的青蒿素类抗肿瘤药物。P-gp介导的肿瘤多药耐药是导致临床上化疗失败的主要原因之一。因此对新型抗肿瘤化疗药物进行与P-gp的相互作用的系统研究是抗肿瘤新药研发中必不可少的环节之一。为系统、全面评价10-苯基醚类青蒿素类化合物与P-gp的相互作用,本文应用细胞毒试验和多柔比星流入实验分别对P-gp对该类化合物的转运作用及其对P-gp转运探针底物多柔比星转运的抑制作用进行研究,应用DS软件进行分子对接和药效团识别研究。结果表明:该类化合物虽然结构相似但与P-gp的相互作用类型却截然不同。23个化合物中,有12个为P-gp底物,8个为抑制剂,而另有3个表现为与P-gp无显着作用。分子对接研究结果表明:底物化合物和抑制剂化合物与P-gp有相同的活性结合区域;而该类化合物与P-gp对接的最小自由结合能和其对P-gp的转运抑制活性具有显着相关性。同时药效团结果显示,头部与P-gp没有结合而尾部有相互作用的化合物具有抑制P-gp转运功能的潜在活性。本文研究表明:10-苯基醚类青蒿素化合物可以克服甚至有效逆转P-gp介导肿瘤多药耐药,对青蒿素类抗肿瘤药物的研发具有重要意义,同时对于临床上基于青蒿素类化合物的抗肿瘤联合治疗方案的设计提供重要信息。青蒿素虽然具有优秀的抗疟活性,但其水溶性及脂溶性均较差。因此青蒿素药代动力学性质欠佳。目前针对青蒿素类化合物药代动力学性质改造的研究主要集中在C-10和O-11两个位点。为了在青蒿素类抗疟药物药代动力学性质改造过程中有效保持、提高其抗疟活性,本文应用Discovery Studio中的3D-QSAR模块对50个已知结构和抗疟疾活性的青蒿素C-10和O-11位衍生物进行构效关系研究,建立了一个准确、可靠的C-10和O-11位青蒿素衍生物抗疟疾的三维定量构效关系模型。该模型交叉验证系数q2为0.532,非交叉验证系数r2为0.997,预测相关系数r2pred为0.777。结果表明在青蒿素的10-C上引入较长且支链较少的侧链,或改变11-O为氮杂环,且在氮上修饰电负性小空间位阻小的基团均可能会提高其抗疟活性。该模型准确、可靠,可为青蒿素类抗疟药药代动力学性质改善相关结构改造研究提供有效的理论依据。
胡凌昊[6]（2020）在《新型抗中风神经保护剂、酰肼类PfHDAC抑制剂和姜黄素类极性荧光探针的发现与研究》文中研究说明本论文聚焦老药的二次研发,以上市抗真菌药物环吡酮胺和抗肿瘤药物quisinostat为先导化合物分别设计合成了一系列具有抗中风和抗疟疾活性的结构新颖的候选化合物,并系统研究了其活性、成药性和作用机制。此外,本论文还发现了基于姜黄素结构的极性荧光探针,可用于细胞成像以监测溶酶体内极性变化。论文由三部分组成:第一部分为N-羟基吡啶酮类抗脑卒中神经保护剂的设计合成与活性研究。缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury）加剧了缺血性中风（ischemic stroke）患者的脑组织损伤,而在溶栓后应用神经保护剂类药物可以缓解缺血再灌注损伤,促进神经功能的恢复。前期研究发现的先导化合物抗真菌上市药物环吡酮（ciclopirox,CPX）的神经保护活性不佳,并且代谢稳定性较差。因此,在本工作中,我们以环吡酮为先导化合物开展老药二次研发,旨在通过结构改造提高活性并改善药代动力学性质。我们对环吡酮进行结构修饰得到了N-羟基吡啶酮类衍生物A1-A31,并通过SH-SY5Y细胞构建的OGD（氧糖剥夺,oxygen-glucose deprivation）模型评价了这些衍生物的神经保护活性、血脑屏障透过性和氧自由基清除能力。衍生物A10的神经保护效果优于环吡酮且起效浓度更低,同时具有更强的氧自由基清除能力,其乙醇胺盐A10-Ola的水溶性优于环吡酮胺（CPX olamine）,而其透血脑屏障能力与之相近,因此被确立为优选化合物。A10·Ola在神经细胞模型上具有缓解兴奋性毒性和氧自由基损伤以及抑制细胞凋亡的效果,并可以维持细胞结构完整。A10·Ola和环吡酮胺对hERG钾离子通道的抑制活性均较弱,然而两者具有相近的细胞毒性。在大鼠MCAO（脑中动脉栓塞,middle cerebral artery occlusion）模型上,0.3 mg/kg的A10·Ola减小梗死体积的药效与3 mg/kg的环吡酮胺相当,1 mg/kg 的 A10·Ola 对 mNSS（modified neurological severity scores,神经缺陷评分）评分的改善优于3 mg/kg的环吡酮胺的药效,而3 mg/kg是前期研究中确立的环吡酮胺的最优药效剂量。鉴于A10·Ola在动物实验中的药效剂量远低于环吡酮胺,且两者细胞毒性相近,A10·Ola具有相对更好的安全性。此外,A10·Ola的代谢稳定性优于环吡酮胺。我们设计合成了含有环吡酮结构的探针AP1-AP3用于靶标垂钓。其中,环吡酮的1位和3位直接连接linker-生物素片段得到的探针AP1和AP2无活性,而含有双吖丙啶和炔基的探针AP3具有较好的神经保护活性,有望通过光交联和click反应间接标记潜在的靶蛋白,但以AP3为探针的靶标垂钓实验没有成功。我们转而通过bSDTNBI（balanced substructure-drug-target network-based inference,平衡的基于化合物子结构-药物-靶点相互作用网络推理方法）和铁离子螯合实验研究发现A10和环吡酮可以通过铁离子螯合上调HIF-1α发挥神经保护活性,其氧自由基消除效果也有助于神经保护活性。在这部分工作中,我们设计合成了 31个N-羟基吡啶酮类衍生物,并系统研究了其体内外药效和成药性。从中发现了神经保护活性、抗氧化活性和代谢稳定性均优于环吡酮且血脑屏障透过性与之相当的优选化合物A10,其乙醇胺盐—A10·Ola在远低于环吡酮胺的剂量上就可以发挥更好的神经保护活性,鉴于两者细胞毒性相当,药效剂量更低的A10·Ola具有更好的安全性。本研究取得的成果有助于新型抗中风候选药物的开发。第二部分是酰肼类PfHDAC抑制剂的设计合成与活性研究。PfHDAC（P.falciparum histone deacetylase,恶性疟原虫组蛋白去乙酰化酶）抑制剂的作用机制与青蒿素不同,有望用于治疗青蒿素耐药疟疾。抗肿瘤HDAC抑制剂quisinostat具有很强的抗疟活性,但具有很强的细胞毒性和人源HDAC抑制活性,其结构可以分为嘧啶异羟肟酸（锌离子结合基团）、4-氨甲基哌啶（连接链）和N-甲基吲哚片段三部分。课题组前期研究维持异羟肟酸结构不变,对连接链和N-甲基吲哚片段进行了结构优化得到了一系列衍生物。虽然这些衍生物的细胞毒性大大降低,但是仍然有强烈的人源HDAC抑制活性、代谢稳定性差和口服生物利用度低等缺陷。鉴于PfHDAC和人源HDAC的活性中心（锌离子结合基团作用位点）之间存在结构差异,并且异羟肟酸中的羟基是主要的代谢位点,所以在本工作中,我们设计合成了一系列具有新型锌离子结合基团的PfHDAC抑制剂B1-B64,以期提高选择性并优化药代动力学性质。其中,B1-B9的锌离子结合基团为N-酰基邻苯二胺或其类似物,但其抗疟活性较差或完全丧失。为此,我们进一步合成了以酰基肼为锌离子结合基团的衍生物B10-B18,其中衍生物B11（其锌离子结合基团为N2-丙基—N1—嘧啶甲酰基肼）不仅抗疟活性好,而且细胞毒性低。与quisinostat相比,B11对于人源HDAC多个亚型的抑制活性都大幅下降。因此,N2—丙基-N1-嘧啶甲酰基肼被确立为具有更高种属选择性的新型HDAC抑制剂的锌离子结合基团。在此基础上,我们对B11中的4-氨甲基哌啶连接链和N-甲基吲哚进行结构改造得到了衍生物B20-B64。其中变换连接链得到的衍生物B19-B23的活性和选择性较之B11大幅下降。于是,我们维持4-氨甲基哌啶连接链不变,将N-甲基吲哚替换成其他取代基得到了衍生物B24-B64。其中,B32、B35和B36的抗疟活性有所提高,活性最优衍生物B36对Pf3D7虫株的IC50值在25 nM左右。B36具有更低的细胞毒性,其选择性指数SI293T/Pf3D7为63,优于quisinostat和B11。此外,B36对人源HDAC的抑制活性与quisinostat相比下降了约70倍,并且其盐酸盐B36·HCl具有比异羟肟酸类衍生物更高的口服生物利用度。在这部分工作中,我们设计合成了 64个具新型锌离子结合基团的PfHDAC抑制剂,并研究了其抗疟活性、细胞毒性、选择性和对于人源HDAC的抑制活性。其中的优选化合物B36的抗疟活性较好,细胞毒性低,对人源HDAC的抑制活性大幅下降,种属选择性大幅提高,并兼具更高的口服生物利用度,有望开发为新一代具有更高选择性且更加安全的口服抗疟药物。第三部分是基于姜黄素的比率型溶酶体极性荧光探针的发现和应用研究。多种生理和病理过程中都伴随着溶酶体极性变化,溶酶体靶向性极性敏感型荧光探针可以作为相关研究的有力工具。因此,在本工作中,我们以全新的结构设计策略开发了基于姜黄素的溶酶体靶向性比率型极性探针。虽然姜黄素类衍生物的发射波长较长,但姜黄素结构本身的水溶性差且易受所处环境干扰。为了克服这些缺点,我们对姜黄素进行结构改造得到了探针C1-C5。其中,含有二乙胺结构的探针C1和C2的极性敏感性优于含有半刚性结构（4-甲基哌嗪）或刚性结构（久洛尼定）的探针C4和C5,说明二乙胺片段可以提高极性敏感性。与C1和C2相比,不含糖的探针C3不溶于水且在混合溶剂中对于极性变化的响应也与前两者不同,说明半乳糖片段提高了水溶性并改变了极性响应模式。探针C1和C2的抗干扰能力强,pH和粘度的变化和常见的干扰物质对于两者荧光发射光谱的影响很小。探针C1和C2在两个波长之间的荧光强度比率（C1:I602/I554;C2:I606/I545）与极性参数△f（定向极化度）之间呈现良好的线性关系。两者光稳定性好,其光学性能可以对复杂环境中的极性变化进行特异性地精确地实时监测。我们以探针C2为例研究了这类探针的极性响应机制,通过对一维和二维核磁共振谱的解析发现探针C2在不同极性的溶剂中的两种互变异构体β-二酮式和酮-烯醇式的比例是不同,这可能是荧光随着极性变化的原因。探针C1的细胞毒性比探针C2更低,我们因此选择C1用于细胞成像实验。探针C1在不同的细胞中均具有较好的溶酶体靶向性,并可通过荧光成像中红通道和绿通道荧光强度的比值变化反映出不同细胞系的溶酶体极性差异,可用于检测多种细胞的溶酶体极性。在蔗糖模拟的溶酶体贮积症或二甲亚砜刺激造成的HepG2和293T细胞内溶酶体极性变化的过程中,探针C1的红通道和绿通道荧光强度的比值也发生了显着的变化,说明探针C1可以实时监测细胞内溶酶体极性变化。综上所述,溶酶体靶向性比率型极性荧光探针C1具有良好的极性敏感性、抗干扰能力、光稳定性、水溶性和生物相容性,有望用于研究与溶酶体极性变化相关的生物过程。
王盼[7]（2020）在《青蒿素对斯氏按蚊传疟能力的影响及其分子机制研究》文中指出疟疾（malaria）是一种由疟原虫感染,通过按蚊叮咬为主要传播途径的严重危害人类健康的传染病。青蒿素（artemisinin,ART）类药物不仅是恶性疟治疗的首选药物,还常用于出现疟疾疫情区域的全民服药以消除潜在传染源。在全球很多疟疾流行区,当疟疾疫情出现或加重时,除了加大监测力度、及早发现疟疾感染者外,疫情流行区域的全民服药策略已被广泛推广。在全民服药中当按蚊叮咬了已服青蒿素类药物的正常人后,其体内的青蒿素及其代谢产物将有机会进入按蚊体内。如果该按蚊再次叮咬疟疾感染者时,其体内已吸入的青蒿素及其代谢产物是否影响该按蚊的疟疾传播能力,目前尚未见相关报道。因此,阐明青蒿素对按蚊传疟能力的影响对于判断青蒿素全民服药策略是否合理具有重要的现实意义和科学价值。天然免疫系统是斯氏按蚊（Anopheles stephensi）抵御外源病原体和有害刺激的主要途径,也是影响其传播疟疾能力的重要因素。Toll样受体（toll-like receptor,TLR）是目前发现最重要的模式识别受体,通过接头蛋白分子将胞外刺激信号传递至细胞内,活化髓样分化因子88（Myeloid differentiation factor 88,MyD88）并促进Rel 1核移位,激活斯氏按蚊体液免疫,产生抗菌肽（Antimicrobial peptide,AMPs）等效应分子,抑制疟原虫侵染从而降低按蚊传疟能力。同时,人群和动物研究发现,疟疾感染后可改变宿主肠道微生物群落构成,重塑宿主肠道菌群可影响蚊天然免疫状态和疟原虫的发育。然而,关于天然免疫系统和肠道菌群在青蒿素影响斯氏按蚊传疟能力中的作用和机制,目前尚无相关研究报道。本研究聚焦这一科学问题开展研究。方法:1、第一部分:青蒿素预处理对斯氏按蚊传疟能力的影响利用斯氏按蚊-约氏疟原虫动物模型,用青蒿素灌胃预处理的正常小鼠供3～5天龄斯氏按蚊饲血,3天后让该按蚊吸食约氏疟原虫感染的小鼠进行疟疾攻击感染,感染后第9天解剖蚊胃,检查疟原虫卵囊的发育情况并计数,分析比较两组按蚊的疟原虫感染率和感染度差异。2、第二部分:天然免疫Toll信号通路在青蒿素对按蚊传疟能力影响中的作用研究首先利用生物信息学方法对MyD88基因进行序列分析,并利用Real-time PCR方法比较分析斯氏按蚊在不同时期及疟原虫感染前后MyD88分子的转录水平,以探讨MyD88分子在斯氏按蚊抗约氏疟原虫感染中的作用;继而,利用Real-time PCR方法比较分析Toll信号通路抗疟关键分子MyD88、Rel 1和Cactus等在青蒿素处理组和对照组间的转录水平差异,以期阐明斯氏按蚊Toll信号通路在青蒿素对按蚊传疟能力影响中的作用。3、第三部分:肠道菌群在青蒿素对按蚊传疟能力影响中的作用研究利用16S rDNA高通量测序法对斯氏按蚊肠道菌群进行研究,比较分析青蒿素处理组和正常对照组在吸感染血前后肠道菌群变化情况;并根据蚊肠道菌群变化,分析肠道菌群是否参与了青蒿素对按蚊传疟能力的影响。结果:1、青蒿素预处理显着降低斯氏按蚊传疟能力。青蒿素处理组的感染率（88.15%）略低于对照组（90.4%）,两组间无统计学显着性差异（P=0.558）。但青蒿素处理组斯氏按蚊的疟原虫感染度显着低于对照组（P<0.001）。提示,青蒿素预处理可降低斯氏按蚊对约氏疟原虫的传播能力。2、天然免疫Toll信号通路在青蒿素对按蚊传疟能力影响中具有重要作用。本部分研究结果显示,MyD88是斯氏按蚊Toll信号通路的上游关键分子,在疟原虫感染后的多个时间点表达上调,提示该分子在蚊抗疟原虫感染中发挥重要作用。在青蒿素预处理及疟原虫感染后的不同时间点,斯氏按蚊Toll信号通路中的活化关键分子MyD88和Rel 1的转录水平在青蒿素处理组较对照组均有上调,而抑制分子Cactus则有下调趋势。该研究结果提示,青蒿素预处理可通过上调按蚊Toll信号通路而增强其对疟原虫的抵抗力,从而抑制按蚊的传疟能力。3、肠道菌群参与了青蒿素对按蚊传疟能力的影响。实验发现,青蒿素处理后按蚊肠道菌群发生明显变化,且部分抗疟菌群（如沙雷氏菌属等）显着增加,提示青蒿素可能通过改变肠道菌群影响按蚊的传疟能力。结论:1、本研究首次证实青蒿素预处理可降低按蚊传疟能力。2、蚊天然免疫Toll信号通路参与了青蒿素对按蚊传疟能力的影响。3、青蒿素可能通过改变蚊肠道菌群增强按蚊抗疟原虫能力。上述研究结果将有利于明确青蒿素的应用对按蚊传疟能力的影响及其分子机制,以指导青蒿素类药物的合理推广应用和制定相应的对策,为通过媒介防制阻断疟疾传播奠定理论基础。本研究也将为我国在消除疟疾行动中的策略制定提供参考,进一步巩固我国的疟疾防控成果。
李姗姗[8]（2019）在《恶性疟原虫入侵关键蛋白质P18和P187的发现及功能研究》文中认为疟疾是由疟原虫引起的严重危害人类健康的寄生虫病之一。据世界卫生组织统计,2017年全球范围内共有2.19亿疟疾病例,有44.5万人死于疟疾,且在2015年到2017年间疟疾病例数轻微上升,疟疾的全球防控仍然面临着巨大挑战。药浸蚊帐、快速诊断试剂盒、以青蒿素为基础的复方药物等防治措施效果显着,但按蚊对杀虫剂出现抗性的现象加剧、青蒿素抗性虫株的出现以及疟疾疫苗的缺失使全球范围内疟疾的防控形势更加严峻。在五种可以感染人类的疟原虫中,恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）流行范围广泛,致病力最强,危害最严重。恶性疟原虫的生活史具有宿主交替与世代交替的特点,该虫体经按蚊传播,在人的肝脏和红细胞内进行无性生殖,在按蚊体内进行配子生殖和孢子生殖。虫体在红细胞内寄生时期是疟原虫生存及致病的关键阶段,而裂殖子入侵宿主红细胞是其中的关键环节。更好地理解该时期虫体与人体细胞的相互作用和分子机制对于揭示疟原虫致病机理及疫苗靶点等方面都是非常重要的。现有的疟疾疫苗在小动物研究中多具有良好的保护效果,有的已经完成三期临床研究,但是有效率低、保护时间短、效果欠佳,目前原因尚不清楚。本课题组的前期研究发现,宿主针对高免疫原性裂殖子抗原产生的抗体不仅不具有保护性作用,反而能够掩护关键的疟原虫功能性靶点,甚至直接协助虫体入侵红细胞。而传统的疟疾疫苗候选抗原的筛选多基于血清学筛查高免疫原性抗原。因此开阔视角,开发新的疟原虫抗原,特别是功能性抗原,可能是打破疟原虫免疫耐受,制备切实有效的疟疾疫苗的关键。发掘关键的疟原虫功能蛋白,需要对疟原虫基因表达规律进行深入解析。恶性疟原虫3D7株核基因组由分布在14条染色体上的22.8兆碱基组成,共有大约5300个编码蛋白质的基因。据预测,这些基因编码的蛋白质有60%是疟原虫独有的。由于传统基因研究方法在恶性疟原虫研究中耗时长、效率低、技术要求高,因此许多高通量方法用于研究基因功能信息。其中,基因表达谱分析已经成为研究基因功能的重要手段。但是,现有的疟原虫转录组数据多基于早期的基因组测序信息,数据不完整,很多基因没有被包括在内,无法精准展现疟原虫在不同生长发育时期的基因转录规律,因此后期的研究无法直接采纳相关数据。本课题承担中国医学科学院医学与健康科技创新工程《重要寄生虫病基础与防治技术研究》部分研究任务,采集高度同步化的虫体,采用实时荧光定量PCR对恶性疟原虫红内期6个关键生长发育时间节点的虫体进行染色体基因精准转录分析,建立精准而全面的恶性疟原虫转录组数据库,利用该数据库的转录组信息,分析疟原虫生长发育过程中基因的表达规律,发掘入侵时期高表达的基因,继而对恶性疟原虫入侵宿主红细胞相关蛋白质进行筛选及功能研究。本课题收集入侵红细胞后Oh、8h、16h、24h、32h和40h等6个时间点发育高度同步化的红内期虫体,使用实时荧光定量PCR法对恶性疟原虫三号染色体243个编码蛋白质的基因和四号染色体246个编码蛋白质的基因进行转录水平分析。之后经过表达差异基因聚类分析,共发现63个基因在裂殖子期特异性高表达。经过文献检索及生物信息学分析,在三号染色体裂殖子期特异性高表达的基因中,4个基因为未知功能的基因,采用原核表达纯化技术制备了这四个蛋白的重组蛋白质。在红细胞结合实验中,发现两个重组蛋白质P18和P187具有与红细胞结合的能力,继而进行了深入研究。用免疫印迹实验证实相应蛋白质的确在裂殖子期高表达,免疫荧光实验获得其在虫体内的细胞定位。在后续功能实验中,发现这两个重组蛋白质的红细胞结合作用均不受胰蛋白酶、乳糜蛋白酶、神经氨酸酶的影响,表明这种结合与红细胞表面的唾液酸残基及血型糖蛋白A、B和C部分胞外区无关。转染表达目的蛋白质的中国仓鼠卵巢细胞与红细胞结合出现花环现象。肝素结合实验及结合抑制实验表明,重组蛋白质可能与广泛分布于红细胞表面的肝素样分子结合。这些结果提示这两个蛋白质可能在虫体入侵红细胞过程中发挥作用。体外入侵抑制实验表明,两个蛋白质的多克隆抗体血清能够影响虫体的增殖。酶联免疫吸附实验进一步揭示了蛋白质P18和P187的抗原性,进一步判断其可能的细胞功能及潜在的抗疟感染价值。综上所述,本课题利用实时荧光定量PCR法对恶性疟原虫第三、四号染色体编码蛋白质的基因进行全面精准的转录组学分析,确定了相关基因在虫体红内期表达的规律,为深入研究疟原虫红内期生长发育及致病机理奠定了基础。通过筛选裂殖子入侵红细胞时特异性高表达的基因编码的蛋白质进行后续功能研究,为发现新的入侵相关虫体抗原及潜在的疫苗候选抗原提供有价值的线索。
徐文慧[9]（2019）在《双氢青蒿素抗疟机制 ——铁死亡的作用研究》文中研究表明据2018年WHO发布的《世界疟疾报告》估计,2017年全世界共发生2.19亿例疟疾,全球有43.5万人死于疟疾,而2016年全球共有2.16亿疟疾病例,约44.5万人死于疟疾,消除疟疾仍然是一个严峻挑战。目前发现有五种疟原虫会使人类感染疟疾,包括恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）、三日疟原虫（Plasmodium malariae）、卵形疟原虫（Plasmodiumovale）、间日疟原虫（Plasmodium vivax）及诺氏疟原虫（Plasmodium knowlesi）。其中恶性疟原虫引发的疟疾危害最大,死亡率最高。据2018年《世界疟疾报告》,恶性疟原虫是撒哈拉以南非洲最流行的疟疾寄生虫,占2017年估计疟疾病例总数的92%。以青蒿素为基础的联合疗法是疟疾治疗的主要方法。青蒿素及其衍生物在疟疾治疗上挽救了全球数百万人的生命,但是其抗疟机制仍有待于进一步阐明。对青蒿素抗疟机制的研究不仅有助于青蒿素及其衍生物的合理利用,也有利于基于机制协同的联合应用,降低青蒿素类化合物的耐药问题,同时也会促进类似机制抗疟新药的筛选和研发。众所周知,青蒿素类化合物的激活主要依赖于血红素或者亚铁,产生活性氧及其他自由基。近几年,在肿瘤学研究中发现,青蒿素及其衍生物能诱导肿瘤细胞铁死亡（ferroptosis）,青蒿素及其衍生物是铁死亡的诱导剂;但是,其抗疟机制中是否有铁死亡的参与,尚未见报导。铁死亡是近年新发现的一种调节性细胞死亡模式,在形态学、基因学、生物化学特征方面与传统凋亡、坏死、自噬等死亡模式存在显着差异,本质表现为Fe2+依赖的脂质过氧化物超限蓄积导致的细胞质膜损伤。由于疟原虫与肿瘤细胞等在生物学上明显不同,铁死亡是否为恶性疟原虫的一种死亡方式,青蒿素类药物是否诱导恶性疟原虫铁死亡,哪些环节是主要靶点,均值得论证和探讨。目的研究铁死亡是否为恶性疟原虫死亡的一种方式,铁死亡是否是双氢青蒿素抗疟机制中的一个重要通路,并探索其深层机制。方法通过恶性疟原虫体外抑制实验,研究铁死亡诱导剂（erastin（ERA）、RSL3、索拉菲尼（SOR））和抑制剂（liproxstatin-1,去铁胺（DFO））对恶性疟原虫增殖的影响,双氢青蒿素（dihydroartemisinin,DHA）与铁死亡诱导剂和抑制剂联用对恶性疟原虫增殖的影响,其中重点考察了双氢青蒿素与铁死亡抑制剂（liproxstatin-1,Lip-1）联用对恶性疟原虫增殖的影响。用流式细胞术检测铁死亡两个关键指标即细胞内动态铁池和膜脂质过氧化物,考察双氢青蒿素、铁死亡诱导剂作用于恶性疟原虫后,对细胞内动态铁池和膜脂质过氧化物的影响,以及双氢青蒿素与铁死亡抑制剂（liproxstatin-1,去铁胺）共同作用于恶性疟原虫后,对细胞内动态铁池和膜脂质过氧化物的影响。由于铁死亡最终导致Fe2+依赖的膜脂质过氧化物的增多,涉及到两个方面:一是亚铁浓度升高的原因,二是膜脂质过氧化。用脂质组学技术,分析不同剂量的双氢青蒿素作用后质膜系统中脂质的变化,研究膜脂质过氧化物增多的分子水平的机制。用RT-PCR技术,分析不同剂量的双氢青蒿素作用于恶性疟原虫后,疟原虫铁硫簇蛋白和铁硫簇装配通路等相关基因的表达水平变化,研究亚铁水平升高的深层原因。结果1、铁死亡诱导剂可剂量依赖性地诱导恶性疟原虫死亡。通过恶性疟原虫体外抑制实验发现,DHA单独作用于恶性疟原虫72 h后,DHA能有效杀灭疟原虫,并随着剂量增加,抗疟效果增加,其IC50为4.37±0.82nM。铁死亡诱导剂ERA,RSL3,SOR单独作用于恶性疟原虫72 h后,均能显着杀灭恶性疟原虫,且与剂量正相关,其IC50分别为 6.40±0.67 μM,4.87±0.26 μ和 12.40±0.82 μM。2、铁死亡诱导剂与双氢青蒿素联合作用于恶性疟原虫后显示出协同或者相加的效果,上述发现为青蒿素类联合用药抗疟提供了一种新思路。从DHA/ERA间的剂量效应结果发现,在抗疟药效为40-90%时观察到DHA/ERA间的协同或者相加效应。从DHA/RSL3间的剂量效应结果发现,DHA与RSL3的联用后在50-90%之间显示相加或者协同性。从DHA/SOR间的剂量效应结果发现,DHA与SOR的组合在30-90%时显示相加或协同的抗疟作用。3、铁死亡抑制剂可降低双氢青蒿素的抗疟效果。DFO在一定剂量水平下能降低DHA抗疟作用,在10-90%的抗疟效果下观察到DHA/DFO的拮抗作用。与仅使用DHA或DFO处理相比,DHA/DFO的组合处理使DHA的抗疟作用降低,尤其是在低剂量的时候拮抗效果明显。Lip-1在所有剂量水平下均降低DHA的抗疟作用,DHA与Lip-1的组合在10-90%显示拮抗效果。虽然单用Lip-1,在超大剂量时对恶性疟原虫有损害（可能是非特异性的毒性）作用,但在无毒剂量下与双氢青蒿素联用均可阻断和拮抗其抗疟作用。用DHA（4.4 nM）预处理恶性疟原虫1小时或2小时,无毒剂量下的Lip-1仍然可以大部分阻断DHA的抗疟作用。DHA（20、40nM）与不同浓度的无毒剂量的Lip-1共同作用,发现Lip-1可以在高浓度的DHA中以不同浓度显着降低其对恶性疟原虫体外生长的抑制作用;在与致死剂量的DHA（20、40nM）联合作用恶性疟原虫72小时后,一定剂量的Lip-1也可以挽救20-50%的疟原虫;Lip-1（2.35 μM）与不同浓度的DHA共同作用发现,随着DHA剂量增大,Lip-1对DHA抗疟效果的阻断作用越来越弱,但还是会有少量疟原虫存活。4、对于铁死亡2大核心指标,细胞内自由Fe2+和膜脂质过氧化物,DHA与铁死亡诱导剂具有相似的作用特征,即同时升高恶性疟原虫细胞内亚铁离子和膜脂质过氧化物水平;反之亦然,铁死亡抑制剂能降低DHA诱导的恶性疟原虫内亚铁离子和膜脂质过氧化物浓度的升高。与铁死亡诱导剂处理类似,DHA（40-200 nM）以浓度依赖性方式显着增强滋养体阶段恶性疟原虫细胞内亚铁和膜脂质过氧化物水平。ERA（3.5-3500μM）,RSL3（50-250 μM）和SOR（6-600 μM）处理也有效增强恶性疟原虫细胞中的亚铁和膜脂质过氧化物水平。DHA杀疟具有与铁死亡诱导剂相似的特征,细胞内亚铁浓度的变化比膜脂质过氧化物的变化更严重。DHA同时增强疟原虫细胞中的亚铁和膜脂质过氧化物水平,而细胞内亚铁浓度的增加和膜脂质过氧化物的增加是铁死亡的主要特征。铁死亡抑制剂能降低DHA诱导的恶性疟原虫内亚铁和膜脂质过氧化物浓度的升高,所有剂量水平的DFO/Lip-1均能抑制DHA（20、40nM）诱导的亚铁和膜脂质过氧化物的升高。DFO以浓度依赖性方式显着降低疟原虫内非血红素亚铁,然后阻断膜脂质过氧化物的积累。Lip-1以浓度依赖性方式显着降低疟原虫内膜脂质过氧化物。因此,DFO和Lip-1均能降低DHA诱导的疟原虫内亚铁和膜脂质过氧化物的升高。5、脂质组学研究结果显示DHA确实能影响恶性疟原虫膜脂质代谢。将恶性疟原虫样本在高分辨质谱上分别做了正负离子两次扫描,负离子模式共计得到270种脂质分子,其中DHA作用后脂质变化1倍以上的脂质有8种,主要变化脂质包括磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰乙醇胺（PE）、心磷脂（CL）。正离子模式共计得到191种脂质分子,其中DHA作用后脂质变化1倍以上的脂质有13种,主要变化脂质包括磷脂酰胆碱（PC）、鞘磷脂（SM）、甘油三酯（TG）。恶性疟原虫经DHA作用后,从正负离子模式中共检测到有21种脂质含量发生变化,占被检测脂质总数的4.5%左右,其中含量降低较明显的4种膜脂质,3种属磷脂酰胆碱,1种为磷脂酰丝氨酸类,前者常定位于膜双脂层的外层,后者常定位于内层,它们均是含有十八碳的二、三或四烯酸,是易受亚铁离子攻击的对象。6、DHA能显着影响恶性疟原虫一些铁硫簇蛋白的表达。以滋养体期恶性疟原虫为材料,通过RT-PCR实验检测了 45个恶性疟原虫3D7铁硫簇蛋白相关基因,其中铁硫簇蛋白基因31个,铁硫簇装配通路基因14个。DHA作用后表达变化基因44个,没有明显变化基因1个。表达变化基因中基因上调11个,下调22个,出现低剂量下调高剂量上调基因11个。DHA主要影响顶质体、线粒体铁硫簇装配通路及顶质体、线粒体、细胞核和细胞质、部位不定的铁硫簇蛋白。DHA对顶质体、线粒体、细胞核和细胞质铁硫簇蛋白有一定影响,与剂量有关,能下调顶质体脂肪酸合成通路LipA、LipB等基因,对线粒体IRP、ISD、ATF等基因有调控作用。DHA对细胞核和细胞质铁硫蛋白基因影响较大,对部位不确定的DRE2、DLS等基因有调控作用。因此,DHA可能通过调节铁硫簇蛋白及其装配通路,引起恶性疟原虫细胞内亚铁离子的升高,为进一步阐明青蒿素调节铁代谢的深层机制提供了前期基础。结论铁死亡是诱导恶性疟原虫死亡的一种重要方式,也是双氢青蒿素抗疟机制中的一个重要通路。
刘影[10]（2019）在《高剂量维生素C与氯喹或青蒿素联用对疟原虫的作用研究》文中研究指明疟疾（Malaria）是一种以雌性按蚊为传播媒介的寄生虫疾病,严重威胁着非洲等发展中国家人民的生命,尤其是孕妇和儿童。目前流行最广泛且致死率最高的疟原虫种属是恶性疟原虫（Plasmodium falciparum,Pf）。由于恶性疟原虫耐药株的不断出现,全面消除疟疾仍未实现。因此,在尝试阻断疟疾传播的同时,继续寻找新的抗疟药物及治疗方案已成为亟待解决的问题。已有研究表明高剂量维生素C通过破坏肿瘤细胞内氧化还原状态、降低ATP水平和引起细胞凋亡等机制抑制肿瘤细胞的生长。由于寄生于红细胞的疟原虫主要依赖糖酵解获取能量,该特性与肿瘤细胞相似,因此我们推测高剂量的维生素C可能也会抑制疟原虫的生长。此前涉及维生素C与抗疟疾药物联合应用治疗疟疾的实验中,维生素C的剂量均未超过180mg/kg,且在此低剂量维生素C作用下疟原虫的虫血率并未受到影响。本课题组前期研究发现对患疟鼠腹腔注射高剂量维生素C（4g/kg）对虫血率有抑制作用;维生素C的氧化形式脱氢抗坏血酸（Dehydroascorbate,DHA）可以通过红细胞表面的葡萄糖转运体（GLUTs）以及恶性疟原虫表面的己糖转运体（Hexose Transporter,PfHT）进入红细胞和虫体内,破坏红细胞和疟原虫的氧化还原平衡,引起红细胞衰亡（eryptosis）和疟原虫凋亡。基于前期研究基础,本课题拟进一步明确高剂量维生素C与抗疟药联合应用治疗疟疾的效果,特别是针对耐药性疟原虫的作用,主要进行以下两部分研究。第一部分研究我们采用了恶性疟原虫药物敏感株（Pf3D7）、耐氯喹虫株（PfDd2）和耐青蒿素虫株（Pf803）,分别用不同浓度的维生素C每日处理上述三种虫株,通过连续的虫血率计数来观察不同浓度维生素C对这三种虫株的作用。结果表明,维生素C均可在生理安全剂量内显着抑制三种虫株的生长,即高剂量维生素C对耐药性恶性疟原虫也具有杀伤作用。此外,我们将维生素C与氯喹或青蒿素联合应用,分别作用于两种耐药虫株,结果提示氯喹或青蒿素不会影响维生素C对耐药虫株的抑制作用。第二部分研究我们首先构建了伯氏疟原虫感染小鼠的患疟鼠模型,并分为对照组、单一用药组和联合用药组,分别给予不同的药物组合:维生素C、氯喹、青蒿素、维生素C+氯喹、维生素C+青蒿素,通过每天计数虫血率观察各组治疗效果的差异。结果表明联合用药对伯氏疟原虫生长的抑制均比单一用药组明显。同时检测患疟鼠的肝功能生化指标、肝脾重量、炎症因子表达、内质网应激分子表达和细胞凋亡因子的表达水平,从各方面分析不同治疗方案对疟原虫的杀伤作用及对小鼠健康状况的影响。结果表明,与单一用药组相比,联合用药可显着改善患疟鼠的肝脾功能,抑制肝脾细胞炎症反应和内质网应激,抑制肝细胞凋亡。综上所述,高剂量维生素C可以在体外有效杀灭红内期的耐氯喹和耐青蒿素恶性疟原虫,且在体外进行联合用药时仍能正常发挥抗疟作用;高剂量维生素C在体内与氯喹或青蒿素联用时比单一用药更能有效抑制伯氏疟原虫生长、改善患疟鼠的脏器损伤,且无明显副作用。我们的研究结果为后续维生素C的抗疟性研究开拓了新的发展方向,为寻找新的抗疟药和抗疟方案提供了新的思路。
二、恶性疟原虫青蒿素类抗疟药物结合蛋白的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、恶性疟原虫青蒿素类抗疟药物结合蛋白的研究（论文提纲范文）
（1）青蒿素及青蒿素联合疗法的抗疟机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文略缩词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 疟疾概述 |
| 1.1 疟疾现状 |
| 1.2 疟疾的流行病学研究 |
| 1.3 疟疾的发病机理和临床表现 |
| 2 疟原虫 |
| 2.1 疟原虫的生活周期 |
| 3 疟疾的预防 |
| 3.1 媒介控制 |
| 3.2 化学预防 |
| 3.3 接种疫苗 |
| 4 疟疾的治疗 |
| 5 青蒿素 |
| 5.1 青蒿素的抗疟机理 |
| 5.2 青蒿素的耐药性 |
| 6 基于活性的蛋白质组学(ABPP) |
| 6.1 ABPP的原理 |
| 6.2 ABPP的工作流程 |
| 6.3 ABPP在天然产物和疟疾研究中的应用 |
| 7 细胞热转移分析(CETSA) |
| 7.1 CETSA的原理 |
| 7.2 CETSA的工作流程 |
| 7.3 CETSA的应用 |
| 8 立题依据和研究思路 |
| 第二章 青蒿素非共价结合靶标蛋白的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 溶液的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 恶性疟原虫体外培养 |
| 2.2 恶性疟原虫复苏 |
| 2.3 吉姆萨染色观察并评估寄生虫染虫率 |
| 2.4 恶性疟原虫同步化 |
| 2.5 青蒿素光交联探针AP2的合成 |
| 2.6 AP2探针的活性测定 |
| 2.7 AP2原位荧光标记实验 |
| 2.8 AP2与原药竞争实验 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 AP2的合成与表征 |
| 3.2 AP2活性的测定 |
| 3.3 AP2在恶性疟原虫体内的荧光标记实验 |
| 3.4 ATS与AP2的原位竞争实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 采用细胞热转移分析(CETSA)研究青蒿素抗疟机理 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 疟原虫的培养和同步化 |
| 2.2 样品准备 |
| 2.3 裂解疟原虫 |
| 2.4 梯度PCR仪设置 |
| 2.5 药物处理和加热处理 |
| 2.6 蛋白质还原、烷基化和消化 |
| 2.7 TMT标记 |
| 2.8 样品脱盐和预分馏 |
| 2.9 液质分析 |
| 2.10 肽段的匹配和蛋白质的鉴定 |
| 2.11 数据分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 CETSA-Melt curve |
| 3.2 CETSA-ITDR |
| 3.3 GO分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 ACT药物之间相互作用的探究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 疟原虫的培养 |
| 2.2 AQP的合成 |
| 2.3 AQP活性的测定 |
| 2.4 AQP原位荧光标记实验 |
| 2.5 AQP与原药竞争实验 |
| 2.6 ACT配伍药物间的相互作用 |
| 2.7 ACT药物与恶性疟原虫蛋白的作用 |
| 2.8 细胞共定位和细胞成像 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 AQP的表征 |
| 3.2 AQP的活性测定 |
| 3.3 AQP在疟原虫中的原位标记实验 |
| 3.4 AQP与AQ的原位竞争实验 |
| 3.5 ACT配伍药物间的相互作用 |
| 3.6 ACT药物与恶性疟原虫蛋白的相互作用 |
| 3.7 细胞共定位 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 博士期间科研成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）从脾脏控制疟疾感染的角度初步探索青蒿素“耐药”的涵义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 文献综述 |
| 一、疟疾概述 |
| 1 疟疾的流行现状 |
| 2 疟疾的临床症状 |
| 3 疟疾的治疗 |
| 二、青蒿素“耐药”研究进展 |
| 1 抗疟药的应用历史及现状 |
| 2 ACT疗法的应用 |
| 3 青蒿素“耐药”的定义 |
| 4 青蒿素“耐药”的分子机制研究进展 |
| 三、脾脏清除疟原虫机制研究进展 |
| 1 脾脏结构与功能 |
| 1.1 红髓的2条血液循环通路 |
| 1.2 白髓的免疫功能 |
| 1.3 边缘区的免疫功能 |
| 2 脾脏清除疟原虫的机制 |
| 2.1 免疫清除 |
| 2.2 孔蚀清除 |
| 3 影响孔蚀的因素 |
| 3.1 疟原虫生长周期 |
| 3.2 青蒿素类药物 |
| 4 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 不同品系小鼠的脾脏在控制疟疾感染中的差异研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验虫株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 实验耗材及器械 |
| 1.6 配制甘油磷酸冻存液 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 复苏PbK173虫株 |
| 2.2 小鼠尾静脉采血涂片计算染虫率 |
| 2.3 实验动物分组 |
| 2.4 建立感染PbK173的四种不同品系实验小鼠模型 |
| 2.5 冻存PbK173虫株 |
| 2.6 染虫鼠虫率及生存期分析 |
| 2.7 取样及实验样本分析 |
| 2.8 数据处理与统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 四种品系染虫鼠的感染率及生存期 |
| 3.2 四种品系染虫鼠的血液学参数分析 |
| 3.3 四种品系染虫鼠的脏器系数分析 |
| 3.4 四种品系染虫鼠脾脏的病理切片观察 |
| 3.5 四种品系染虫鼠的脾细胞分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 C57BL/6小鼠的脾脏在控制伯氏疟原虫K173青蒿素敏感株与抗性株感染中的差异研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验虫株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 实验耗材及器械 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 复苏PbK173青蒿素敏感株与抗性株 |
| 2.2 小鼠尾静脉采血涂片计算染虫率 |
| 2.3 实验动物分组 |
| 2.4 建立感染PbK173青蒿素敏感株/抗性株实验小鼠模型 |
| 2.5 冻存PbK173虫株 |
| 2.6 染虫鼠虫率及生存期分析 |
| 2.7 取样及实验样本分析 |
| 2.8 数据处理与统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 感染不同虫株染虫鼠的感染率及生存期 |
| 3.2 感染不同虫株染虫鼠的血液学参数分析 |
| 3.3 感染不同虫株染虫鼠的脏器系数分析 |
| 3.4 感染不同虫株染虫鼠脾脏的病理切片观察 |
| 3.5 感染不同虫株染虫鼠的脾细胞分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 PbK173青蒿素敏感株/抗性株对药物敏感性及染虫小鼠治疗期与恢复期的脾脏功能差异研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验虫株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验药物 |
| 1.5 实验试剂 |
| 1.6 实验耗材及器械 |
| 1.7 配制溶剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 复苏PbK173青蒿素敏感株/抗性株 |
| 2.2 小鼠尾静脉采血涂片计算染虫率 |
| 2.3 实验动物分组 |
| 2.4 建立感染PbK173青蒿素敏感株/抗性株实验小鼠模型 |
| 2.5 冻存PbK173虫株 |
| 2.6 给药、染虫鼠虫率及生存期分析 |
| 2.7 取材及实验样本分析 |
| 2.8 数据处理与统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 染虫鼠经治疗后的感染率及生存期 |
| 3.2 停药第一天及停药第五天外周红细胞参数分析 |
| 3.3 停药第一天及停药第五天血液涂片分析 |
| 3.4 停药第一天及停药第五天脾脏系数分析 |
| 3.5 停药第一天及停药第五天脾脏的病理切片观察 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 附件 |
（3）疟原虫脂质代谢与青蒿素抗疟机制研究进展（论文提纲范文）
| 1 疟原虫脂质概述 |
| 1.1 疟原虫主要脂质组成和功能 |
| 1.2 疟原虫主要膜区室组成 |
| 1.3 疟原虫及感染红细胞整体脂质变化 |
| 2 疟原虫脂质合成代谢途径 |
| 2.1 脂肪酸 |
| 2.1.1 脂肪酸合成 |
| 2.1.2 脂肪酸清理 |
| 2.2 磷脂类 |
| 2.2.1 前体来源 |
| 2.2.2 磷脂酸 |
| 2.2.3 磷脂酰胆碱 |
| 2.2.4 磷脂酰乙醇胺 |
| 2.2.5 其他磷脂 |
| 2.3 甘油脂类 |
| 2.4 鞘脂类 |
| 2.5 固醇类 |
| 3 青蒿素类药物对疟原虫脂质代谢的影响 |
| 3.1 青蒿素对膜结构的影响 |
| 3.2 青蒿素与脂质过氧化 |
| 3.3 青蒿素耐药现象与脂质代谢 |
| 4 小结与展望 |
（4）恶性疟原虫红内期发育过程中的蛋白质翻译后修饰研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 恶性疟原虫生物学概述 |
| 1.1.1 疟疾及恶性疟原虫 |
| 1.1.2 恶性疟原虫对人体宿主细胞的入侵 |
| 1.1.3 恶性疟原虫对红细胞的重塑 |
| 1.2 恶性疟原虫发育繁殖的调控 |
| 1.2.1 疟原虫基因组及基因水平的调控 |
| 1.2.2 疟原虫基因的转录后调控 |
| 1.2.3 疟原虫表观遗传学修饰 |
| 1.2.4 疟原虫蛋白质的翻译后修饰调控 |
| 1.3 恶性疟原虫蛋白质翻译后修饰研究进展 |
| 1.3.1 磷酸化 |
| 1.3.2 泛素化与类泛素化 |
| 1.3.3 甲基化 |
| 1.3.4 乙酰化 |
| 1.3.5 棕榈酰化 |
| 1.3.6 糖基化 |
| 1.3.7 巴豆酰化和2-羟基异丁酰化 |
| 1.3.8 其他酰化修饰 |
| 第二章 恶性疟原虫及宿主红细胞蛋白质动态翻译后修饰水平的初步鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 红内期不同时间点染虫红细胞样品制备方法 |
| 2.1.2 蛋白质提取和质控方法 |
| 2.1.3 蛋白质翻译后修饰泛抗体Western blotting检测方法 |
| 2.2 技术路线 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 蛋白质提取的质控结果 |
| 2.3.2 蛋白质翻译后修饰泛抗体检测结果 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第三章 恶性疟原虫及宿主红细胞蛋白质六种翻译后修饰联合分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 红内期不同时间点染虫红细胞样品制备方法 |
| 3.1.2 蛋白质组与翻译后修饰组的质谱鉴定方法 |
| 3.1.3 蛋白质组和翻译后修饰组生物信息学分析方法 |
| 3.2 技术路线 |
| 3.3 数据可信性分析 |
| 3.3.1 质谱质控检测 |
| 3.3.2 生物学重复性分析 |
| 3.4 恶性疟原虫及宿主红细胞六种翻译后修饰联合分析结果 |
| 3.4.1 恶性疟原虫及宿主红细胞蛋白质组和修饰位点鉴定结果 |
| 3.4.2 六种修饰的主要功能、时空分布及相关性 |
| 3.4.3 翻译后修饰对恶性疟原虫红内期48h内的发育繁殖调控 |
| 3.4.4 翻译后修饰对恶性疟原虫基因表达的调控 |
| 3.4.5 翻译后修饰对恶性疟原虫致病相关分子的调控 |
| 3.5 讨论与小结 |
| 第四章 翻译后修饰对恶性疟原虫关键代谢通路的调控及修饰酶抑制剂的抗疟作用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 恶性疟原虫的体外培养 |
| 4.1.2 修饰酶抑制剂的抗疟活性检测方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 翻译后修饰对恶性疟原虫关键代谢通路的调控 |
| 4.2.2 翻译后修饰酶抑制剂的抗疟作用 |
| 4.3 讨论与小结 |
| 第五章 讨论与结论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.2 结论 |
| 5.3 创新点 |
| 5.4 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
（5）青蒿素类化合物与P-gp相互作用及抗疟QSAR研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 青蒿素类化合物抗肿瘤研究 |
| 1.1.1 肿瘤与肿瘤治疗 |
| 1.1.2 肿瘤细胞的多药耐药性 |
| 1.1.3 P-gp结构、分布与其介导的肿瘤多药耐药 |
| 1.1.4 青蒿素类化合物与P-gp的相互作用 |
| 1.2 青蒿素类化合物抗疟疾研究 |
| 1.2.1 疟疾防治的发展 |
| 1.2.2 抗疟疾药物 |
| 1.2.3 青蒿素类抗疟疾药物 |
| 1.3 本论文研究工作的主要内容 |
| 2 10-苯基醚类青蒿素化合物与P-gp的相互作用研究 |
| 2.1 仪器与试剂 |
| 2.1.1 仪器 |
| 2.1.2 试剂、药品及细胞株 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 培养基及试剂配制 |
| 2.2.2 细胞的复苏及培养 |
| 2.2.3 细胞毒试验 |
| 2.2.4 多柔比星K562/A流入实验 |
| 2.2.5 分子对接及药效团研究 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 10-苯基醚类青蒿素化合物与P-gp的相互作用实验研究 |
| 2.3.2 10-苯基醚类青蒿素化合物与P-gp相互作用机理的计算机模拟研究 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 青蒿素C-10和O-11位衍生物抗疟疾三维定量构效关系研究 |
| 3.1 计算平台 |
| 3.2 数据来源及处理 |
| 3.3 3D-QSAR模型建立 |
| 3.3.1 小分子准备 |
| 3.3.2 分子叠合 |
| 3.3.3 建立3D-QSAR模型 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 3D-QSAR模型结果 |
| 3.4.2 3D-QSAR模型分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
（6）新型抗中风神经保护剂、酰肼类PfHDAC抑制剂和姜黄素类极性荧光探针的发现与研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 N-羟基吡啶酮类抗脑卒中神经保护剂的设计合成与活性研究 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 脑卒中防治的重要性和紧迫性 |
| 1.2 抗脑卒中药物研发现状 |
| 1.2.1 现有脑卒中治疗药物 |
| 1.2.2 缺血再灌注导致神经细胞死亡的分子机制以及潜在的药物靶标 |
| 1.2.3 处于临床研究阶段的抗脑卒中候选药物 |
| 1.3 先导化合物环吡酮的发现——表型筛选和老药二次研发 |
| 1.4 立题依据和研究目标 |
| 第2章 衍生物A1-A31的设计合成与优选化合物A10·Ola的发现 |
| 2.1 设计思路和合成路线 |
| 2.2 N-羟基吡啶酮类衍生物的神经保护活性评价以及构效关系 |
| 2.2.1 A1-A31对于SH-SY5Y细胞氧糖剥夺损伤的神经保护作用 |
| 2.2.2 衍生物的氧自由基清除能力和血脑屏障透过性评价 |
| 2.2.3 构效关系总结 |
| 2.2.4 A10及其乙醇胺盐A10·Ola的水溶性 |
| 2.2.5 A10-Ola对于OGD损伤引起的SH-SY5Y细胞凋亡的影响 |
| 2.2.6 A10·Ola可以缓解氧自由基和兴奋性毒性造成的神经细胞损伤 |
| 2.3 A10·Ola的动物药效评价 |
| 2.4 A10-Ola的安全性和肝微粒代谢稳定性的评价 |
| 2.5 A10·Ola和环吡酮胺的体内代谢性质的初步评价 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 N-羟基吡啶酮类衍生物抗中风作用机制探究 |
| 3.1 靶标确证在药物研究中的重要意义和小分子药物靶标确证的方法 |
| 3.2 探针AP1-AP3的设计与合成 |
| 3.3 bSDTNBI预测结果和铁离子螯合实验 |
| 第4章 第一部分总结 |
| 第5章 实验部分 |
| 5.1 衍生物A1-A31、探针AP1-AP3的合成方法与表征数据 |
| 5.2 细胞培养条件、细胞活力以及细胞毒性测试方法 |
| 5.2.1 SH-SY5Y、HT22和MRC-5细胞培养条件 |
| 5.2.2 细胞活力以及细胞毒测试方法 |
| 5.3 OGD损伤、双氧水和谷氨酸损伤实验方法 |
| 5.4 PAMPA-BBB实验方法 |
| 5.5 ORAC-FL实验方法 |
| 5.6 细胞凋亡检测实验方法 |
| 5.7 水溶性测试方法 |
| 5.8 大鼠MCAO模型实验方法 |
| 5.9 hERG钾离子通道膜片钳实验方法 |
| 5.10 小鼠肝微粒体代谢稳定性实验 |
| 5.11 大鼠体内代谢实验方法 |
| 5.12 bSDTNBI预测原理和铁离子螯合实验方法 |
| 5.13 统计分析 |
| 第二部分 酰肼类PfHDAC抑制剂的设计合成与活性研究 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 疟疾现有疗法和青蒿素抗性的出现 |
| 1.2 处于临床研究阶段的小分子抗疟疾候选药物 |
| 1.3 组蛋白去乙酰化酶作为治疗疟疾的潜在靶标 |
| 第2章 前期研究基础、立题依据和研究目标 |
| 2.1 前期研究基础 |
| 2.2 立题依据和研究目标 |
| 第3章 衍生物B1-B18的设计与合成以及苗头化合物B11的发现 |
| 3.1 HDAC抑制剂中的锌离子结合基团 |
| 3.2 N-酰基邻苯二胺类衍生物B1-B9的设计与合成及其抗疟活性的评价 |
| 3.3 酰肼类衍生物B10-B18的设计与合成及其抗疟活性和细胞毒性的评价 |
| 3.4 引入酰肼锌离子结合基团降低了人源HDAC的抑制活性 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 酰肼类衍生物B19-B64的设计合成与活性研究 |
| 4.1 衍生物B19-B23的设计与合成及其抗疟活性和细胞毒性的评价 |
| 4.2 衍生物B24-B64的设计与合成及其抗疟活性和细胞毒性的评价 |
| 4.3 B11、B35和B36对恶性疟原虫临床株的抑制活性的评价 |
| 4.4 Quisinostat、B11、B35和B36的抗疟活性、细胞毒性和人源HDAC抑制活性的比较 |
| 4.5 构效关系总结 |
| 4.6 衍生物B36的药代动力学性质研究 |
| 第5章 第二部分总结 |
| 第6章 实验部分 |
| 6.1 衍生物B1-B64的合成方法与表征数据 |
| 6.2 体外疟原虫抑制活性测试 |
| 6.3 细胞毒性测试 |
| 6.4 人源HDAC抑制活性测试 |
| 6.5 小鼠体内代谢实验方法 |
| 第三部分 基于姜黄素的比率型溶酶体极性荧光探针的发现和应用研究 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 检测溶酶体极性的重要意义 |
| 1.2 溶酶体靶向极性荧光探针的研究现状 |
| 1.3 姜黄素的光学性质 |
| 1.4 立题依据和研究目标 |
| 第2章 探针C1-C5的设计与合成 |
| 2.1 探针C1-C5结构设计思路 |
| 2.2 探针C1-C5的合成 |
| 第3章 探针C1-C5的光学性质与其发光机制的研究 |
| 3.1 探针C1、C2、C4和C5在不同溶剂中吸收和发射光谱 |
| 3.2 探针C1和C2的抗干扰能力和光稳定性的评价 |
| 3.3 探针C3和C-M2的光学性质 |
| 3.4 探针C1-C5的极性响应机制研究 |
| 第4章 探针C1的细胞成像应用 |
| 4.1 探针C1和C2的生物相容性的评价 |
| 4.2 探针C1的亚细胞定位研究 |
| 4.3 探针C1对HepG2、HL-7702和293T的细胞成像 |
| 4.4 探针C1监测细胞内溶酶体极性变化 |
| 第5章 第三部分总结 |
| 第6章 实验部分 |
| 6.1 探针C1-C5的合成方法与表征数据 |
| 6.2 光谱测试方法 |
| 6.3 细胞培养条件和细胞荧光成像实验方法 |
| 6.4 细胞毒实验测试方法 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 缩略词中英对照表 |
| 发表文章 |
| 专利 |
| 致谢 |
（7）青蒿素对斯氏按蚊传疟能力的影响及其分子机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 青蒿素预处理对斯氏按蚊传疟能力的影响 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 天然免疫Toll信号通路在青蒿素对按蚊传疟能力影响中的作用研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 肠道菌群在青蒿素对按蚊传疟能力影响中的作用研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 本研究的不足和下一步研究计划 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 青蒿素及其衍生物在相关疾病中的免疫调节作用 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 蚊先天免疫的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（8）恶性疟原虫入侵关键蛋白质P18和P187的发现及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一篇 研究背景 |
| 第1章 疟疾和疟原虫 |
| 1.1 疟疾的流行现状 |
| 1.2 疟疾的起源 |
| 1.3 疟原虫的生活史 |
| 1.4 疟原虫的基因组 |
| 1.5 疟疾的临床症状 |
| 1.6 疟疾的诊断与治疗 |
| 1.7 疟疾的疫苗研究 |
| 第2章 恶性疟原虫入侵宿主红细胞的分子机制 |
| 2.1 裂殖子的细胞结构 |
| 2.2 裂殖子入侵红细胞的分子基础 |
| 2.3 结论和展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 恶性疟原虫三号染色体和四号染色体红内期精准转录组学研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 探索发现恶性疟原虫入侵宿主红细胞关键虫体蛋白质 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ 实时荧光定量PCR的引物序列 |
| 附录Ⅱ 基因克隆的引物序列 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（9）双氢青蒿素抗疟机制 ——铁死亡的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 文献综述 |
| 一、青蒿素类化合物抗疟机制研究进展 |
| 二、铁死亡研究进展 |
| 三、青蒿素类化合物诱导铁死亡机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 双氢青蒿素、铁死亡诱导剂和抑制剂对恶性疟原虫增殖的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器及试剂 |
| 1.2 药物及溶液配制 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 红细胞 |
| 1.5 恶性疟原虫 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 恶性疟原虫体外培养、冻存和复苏 |
| 2.2 恶性疟原虫计数 |
| 2.3 恶性疟原虫同步化 |
| 2.4 恶性疟原虫体外抑制实验 |
| 2.5 药物浓度及分组 |
| 2.6 数据分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 双氢青蒿素对恶性疟原虫增殖的影响 |
| 3.2 铁死亡诱导剂对恶性疟原虫增殖的影响 |
| 3.3 铁死亡抑制剂对恶性疟原虫增殖的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 铁死亡诱导剂和抑制剂与双氢青蒿素联用对恶性疟原虫增殖的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 梯度稀释法测药物相互作用 |
| 2.2 倍比稀释法测药物相互作用 |
| 2.3 DHA与Lip-1拮抗作用实验 |
| 2.4 联合用药指数 |
| 2.5 数据分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 DHA和ERA相互作用 |
| 3.2 DHA和RSL3相互作用 |
| 3.3 DHA和SOR相互作用 |
| 3.4 DHA和DFO相互作用 |
| 3.5 DHA和Lip-1相互作用 |
| 3.6 DHA与Lip-1拮抗作用 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 双氢青蒿素、铁死亡诱导剂和抑制剂对疟原虫内亚铁和膜脂质过氧化物的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器及试剂 |
| 1.2 药物及溶液配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 恶性疟原虫动态铁池检测 |
| 2.2 恶性疟原虫膜脂质过氧化物检测 |
| 2.3 三标同时检测亚铁和膜脂质过氧化物 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 DHA对恶性疟原虫动态铁池的影响 |
| 3.2 DHA对恶性疟原虫膜脂质过氧化物的影响 |
| 3.3 铁死亡诱导剂与双氢青蒿素对恶性疟原虫内亚铁和膜脂质过氧化物影响 |
| 3.4 铁死亡抑制剂与双氢青蒿素联用对疟原虫内亚铁和膜脂质过氧化物影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 双氢青蒿素对恶性疟原虫脂膜脂质的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 疟原虫扩大培养 |
| 2.2 提取虫体 |
| 2.3 代谢物提取 |
| 2.4 上机检测 |
| 2.5 数据处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 概况 |
| 3.2 DHA对恶性疟原虫质膜脂质的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 双氢青蒿素对恶性疟原虫铁硫簇蛋白相关基因表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 分组及给药 |
| 2.2 恶性疟原虫分离纯化 |
| 2.3 总mRNA提取 |
| 2.4 反转录 |
| 2.5 引物设计 |
| 2.6 RT-PCR |
| 2.7 数据处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 DHA对恶性疟原虫铁硫簇蛋白基因的影响 |
| 3.2 DHA对恶性疟原虫铁硫簇装配通路基因的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 附件 双氢青蒿素对NADH型恶性疟谷氨酸合酶的影响 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（10）高剂量维生素C与氯喹或青蒿素联用对疟原虫的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、高剂量维生素C对耐药性恶性疟原虫的作用 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验对象 |
| 1.1.2 主要相关仪器 |
| 1.1.3 主要相关试剂 |
| 1.1.4 恶性疟原虫的复苏、培养及冻存 |
| 1.1.5 高剂量维生素C对耐药性恶性疟原虫的作用 |
| 1.1.6 疟原虫虫血率的检测 |
| 1.1.7 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 抗氯喹、青蒿素恶性疟原虫的耐药性验证 |
| 1.2.2 高剂量维生素C对耐药性恶性疟原虫的作用 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、高剂量维生素C与氯喹或青蒿素联用对伯氏疟原虫的作用 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 主要相关仪器 |
| 2.1.3 主要相关试剂 |
| 2.1.4 伯氏疟原虫的感染及冻存 |
| 2.1.5 维生素C与氯喹或青蒿素联合应用对伯氏疟原虫的作用 |
| 2.1.6 小鼠肝脾总RNA的提取及RT-PCR的过程 |
| 2.1.7 小鼠肝脏组织蛋白质的提取 |
| 2.1.8 蛋白质免疫印迹实验(western blot) |
| 2.1.9 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 高剂量维生素C和氯喹或青蒿素联合应用降低伯氏疟虫血率 |
| 2.2.2 高剂量维生素C和氯喹或青蒿素联合应用改善小鼠的肝脾功能 |
| 2.2.3 高剂量维生素C和氯喹或青蒿素联合应用可降低患疟鼠肝脾细胞炎症因子的表达 |
| 2.2.4 高剂量维生素C和氯喹或青蒿素联合应用可缓解患疟鼠肝脾内质网应激 |
| 2.2.5 高剂量维生素C和氯喹或青蒿素联合应用抑制患疟鼠肝脏细胞凋亡 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 维生素C在疾病预防和治疗中的作用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、恶性疟原虫青蒿素类抗疟药物结合蛋白的研究（论文参考文献）
- [1]青蒿素及青蒿素联合疗法的抗疟机理研究[D]. 高鹏. 中国中医科学院, 2021
- [2]从脾脏控制疟疾感染的角度初步探索青蒿素“耐药”的涵义[D]. 王华晶. 中国中医科学院, 2021
- [3]疟原虫脂质代谢与青蒿素抗疟机制研究进展[J]. 李硕,李沧海,姜廷良. 中国中药杂志, 2021
- [4]恶性疟原虫红内期发育过程中的蛋白质翻译后修饰研究[D]. 王建花. 沈阳农业大学, 2021
- [5]青蒿素类化合物与P-gp相互作用及抗疟QSAR研究[D]. 蒋惠宇. 大连理工大学, 2020(02)
- [6]新型抗中风神经保护剂、酰肼类PfHDAC抑制剂和姜黄素类极性荧光探针的发现与研究[D]. 胡凌昊. 华东理工大学, 2020(01)
- [7]青蒿素对斯氏按蚊传疟能力的影响及其分子机制研究[D]. 王盼. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020
- [8]恶性疟原虫入侵关键蛋白质P18和P187的发现及功能研究[D]. 李姗姗. 北京协和医学院, 2019(02)
- [9]双氢青蒿素抗疟机制 ——铁死亡的作用研究[D]. 徐文慧. 中国中医科学院, 2019(12)
- [10]高剂量维生素C与氯喹或青蒿素联用对疟原虫的作用研究[D]. 刘影. 天津医科大学, 2019(02)