一、乳腺癌患者MRP基因表达及临床意义（论文文献综述）
牛丽[1]（2021）在《CCL5在头颈鳞状细胞癌中的表达及对喉癌生物学特性影响研究》文中研究表明目的:研究CCL5在头颈鳞状细胞癌中表达,通过siRNA转染人喉鳞状细胞癌Hep-2、TU177,探索siRNA干扰喉鳞状细胞癌后对其增殖、迁移、周期、凋亡、耐药相关生物学特性的研究,从而为将来CCL5在喉鳞状细胞癌中的靶向治疗提供理论基础。方法:TCGA数据库挖掘并分析CCL5在头颈鳞状细胞癌患者中表达情况,细胞培养喉鳞状细胞系（TU177、Hep-2）,RT-PCR检测在不同细胞系的CCL5敲降效率,分别在不同的细胞系筛选敲降效率最高的siRNA进行后续实验。每个细胞系通过转染siRNA、NC两组,CCK8法检测各组细胞系的增殖情况,细胞划痕法检测各组的迁移情况,流式细胞法检测各组细胞的细胞周期及凋亡情况,RT-PCR、western blot检测耐药相关基因Bax、MRP2的mRNA、蛋白水平。实验结果采用SPSS 25.0软件进行分析,结果图由Graphpad Prism 8.0完成,细胞划痕、western blot实验由Image J软件进行分析。实验结果满足正态分布均采用两独立样本t检验评估两组间差异,单因素方差分析多组样本间统计学差异,若有统计学意义,采用LSD-t进行组间两两比较。计量资料用?x±s表示,如果实验结果不满足正态分布,则采用秩和检验,若多组间秩和检验有统计学意义,则进行组间两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.通过检测TCGA数据库发现CCL5在头颈鳞状细胞癌中表达明显高于头颈正常组织（P<0.001）。2.将三条siRNA均转染到喉癌鳞状细胞TU177、Hep-2中,利用RT-PCR检测其敲降效率发现:在TU177细胞系中si-1敲降效率最好,在Hep-2细胞系中si-2、si-3均有较高的敲降效率,由于si-2的敲降效率更高,因此选择si-2进行Hep-2细胞系后续实验。在TU177细胞系中分为si-1组、NC组,在Hep-2细胞系中分为si-2组与NC组,两细胞系分别对其增殖、迁移、周期、凋亡、耐药相关基因检测。结果显示:TU177细胞系中si-1组在24h、48h、72h、96h增殖率明显低于NC组（P<0.01）,si-1组在24h迁移率明显低于NC组（P<0.05）。si-1组的晚期凋亡率大于NC组晚期凋亡率（P<0.05）,si-1组Bax的相对表达量高于NC组（P<0.05）,说明在TU177细胞系中抑制CCL5的表达可抑制喉鳞状细胞癌的增殖、迁移,主要促进其晚期凋亡,提高顺铂敏感性。Hep-2细胞系中si-2组在24h、48h、72h、96h增殖率明显低于NC组（P<0.01）,si-2组在24h、48h迁移率均明显低于NC组（P<0.05）。si-2组的早期凋亡率和晚期凋亡率大于NC组（P<0.001）,si-2组MRP2的相对表达量低于NC组（P<0.05）,蛋白水平si-2组Bax的相对表达量高于NC组（P<0.001）。说明在Hep-2细胞系中抑制CCL5的表达可抑制喉鳞状细胞癌的增殖、迁移,促进其凋亡,增强顺铂敏感性,降低顺铂耐药性。然而,在Hep-2细胞系中统计学方法发现CCL5通过G2/M期抑制细胞周期（P<0.01）,但由于其抑制效果不明显,未能达到临床意义。结论:CCL5在头颈鳞状细胞癌中高表达,通过siRNA干扰CCL5抑制喉癌细胞增殖、迁移、顺铂耐药,促进凋亡、顺铂敏感性。
范爽[2]（2021）在《RUNX3在人结肠癌HCT-116/5-FU耐药细胞株中的表达及其与耐药的相关性研究》文中研究表明本课题通过建立耐5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）的人结肠癌细胞株HCT-116/5-FU,初步探讨RUNX3与结直肠癌耐药的关系。第一部分:采用低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击法建立人结肠癌耐药细胞株HCT-116/5-FU,cck-8法检测5-氟尿嘧啶对亲本株HCT-116及耐药株HCT-116/5-FU的半数抑制浓度（half maximal inhibitoryconcentration,IC50值）,绘制细胞生长曲线,并计算细胞倍增时间;q RT-PCR检测亲本株HCT-116细胞及耐药株HCT-116/5-FU细胞中RUNX3、P-gp、MRP1、LRPm RNA的表达,western-blot检测亲本株HCT-116细胞及耐药株HCT-116/5-FU细胞中RUNX3、P-gp、MRP1、LRP蛋白的表达;第二部分:通过si RNA技术敲低HCT-116细胞中RUNX3的表达,分为RUNX3敲低组（si-RUNX3-1组、siRUNX3-2组）和阴性对照组（si-NC组）,通过q RT-PCR和Western blot分别在m RNA水平和蛋白水平验证RUNX3的敲低效率,采用cck-8法测定si-RUNX3组和si-NC组的IC50值,通过western-blot测定两组中P-gp、MRP1、LRP的表达情况。成功构建了稳定的人结肠癌耐药细胞株HCT-116/5-FU,耐药倍数为7.7倍,HCT-116/5-FU耐药细胞株群体倍增时间较HCT-116亲本株延长,差异有统计学意义,P<0.001,耐药细胞群体倍增时间（TD）是亲本细胞的1.38倍,差异有统计学意义,P=0.002,耐药株细胞形态发生变化。耐药细胞HCT-116/5-FU的RUNX3m RNA表达水平较亲本细胞株HCT-116明显降低,差异有统计学意义,p=0.048,耐药细胞HCT-116/5-FU的P-gp、MRP1、LRPm RNA表达水平较亲本细胞株HCT-116明显升高,差异有统计学意义,p=0.008,p=0.001,p=0.001,耐药细胞HCT-116/5-FU的RUNX3蛋白质相对表达量较亲本细胞株HCT-116明显降低,差异有统计学意义,p<0.001,耐药细胞HCT-116/5-FU的P-gp、MRP1、LRP蛋白的相对表达量较亲本细胞株均明显升高,差异有统计学意义,p均<0.001;成功构建了RUNX3低表达的HCT-116细胞模型,si-RUNX3-1组RUNX3m RNA的表达和si-NC组比较,差异无统计学意义,P=0.064,si-RUNX3-2组RUNX3m RNA的表达量低于si-NC组,差异有统计学意义,P=0.034;si-RUNX3-1组和si-RUNX3-2组RUNX3蛋白的相对表达量低于siNC组,差异有统计学意义,p均<0.001;并且si-RUNX3-2组的敲低效率更高,选用si-RUNX3-2组完成后续试验,si-RUNX3组的IC50值较si-NC组明显升高,下调RUNX3的表达能够降低HCT-116细胞对5-FU的敏感性,差异具有统计学意义,p<0.001;si-RUNX3组的P-gp、MRP1、LRP蛋白的相对表达量较si-NC组均明显升高,差异有统计学意义,p均<0.001。综上,RUNX3表达下调能降低人结肠癌HCT-116细胞对5-FU的敏感性,考虑与RUNX3表达的降低上调Pgp、MRP1、LRP等耐药蛋白表达,从而增加细胞的耐药性有关。
王旭[3]（2021）在《GCS参与调控维拉帕米逆转胃癌化疗多药耐药的作用研究》文中认为研究背景:胃癌（gastric carcinoma）是消化系统最为常见的恶性肿瘤之一,其起源于胃腔内的粘膜上皮组织。据2021年资料数字统计,去年全球范围内新确诊胃癌的患者高达108万例,占比5.6%,位居第5位,因罹患胃癌而死亡的患者累计有76万例,高居恶性肿瘤死亡排行榜第4位。据2020年中国癌症年报统计,我国胃癌新发病几率和死亡人数均高居第三位。早期胃癌患者因无明显的症状通常被忽略,其具有隐蔽性且无特异性,可时隐时现,也可长期存在,等出现不适症状时就诊已确诊进展期,这也和由我国医学卫生资源的分配不平衡且癌症普查率较低有着密切关系,此时罹患胃癌的患者遗憾地错过了最佳的手术根治时机,临床上针对进展期胃癌患者则采用化学治疗、放射治疗、生物靶向精准治疗等综合治疗。同时由于胃癌对放疗的不敏感,而且放疗产生较多的副作用限制了放疗的使用,内科多线综合化疗已然成为治疗中晚期胃癌的主要手段之一,希望能以此延长患者的生命周期,提高患者的生活质量。对于早期胃癌患者,即使有机会行根治性手术,大约有80%的早期胃癌患者在手术根治治疗后的3年内出现局灶复发或远处脏器侵袭转移,其5年生存率低于30%。而中晚期胃癌的首选治疗方案是内科综合化疗,国内外多项研究表明:肿瘤多药耐药（multi drug resistance,MDR）是造成肿瘤内科化疗无效的关键因素。肿瘤多药耐药是指肿瘤细胞在一种抗癌药物治疗后所产生的耐药性,后期该肿瘤细胞对其它未曾接触过的、作用机制及分子结构完全不同的其它抗癌药物也同时产生交叉耐药的一种现象。肿瘤多药耐药分为天然耐药和获得性耐药。多因素共同导致的胃癌细胞对抗癌药物产生耐药性是当下治疗中晚期胃癌患者十分突出的问题。因此,如何克服肿瘤细胞的多药耐药,更进一步提高抗癌药物的疗效已然成为目前治疗肿瘤亟待解决的问题,进一步深入的研究胃癌细胞耐药所产生的分子机制、寻求能运用于临床的药物及方法,是研究胃癌治疗的重要契点。随着多种用于临床治疗的手段不断被发明和发展,特别是针对肿瘤治疗的方式也日益丰富,除手术、化疗、放疗外,新型的介入治疗学使肿瘤患者在整个治疗过程中受益。靶动脉灌注化疗是联合穿刺、插管,在X线引导下将导管精准地选择性插入瘤灶的供血靶动脉内,通过DSA对病灶的部位、数量、形态等进行分析、诊断后,将高浓度的抗癌药物通过导管精准地直接灌注于瘤体,而除瘤体外其它组织器官药物浓度低,极大地降低全身副反应。从19世纪80年代开始,有研究者开始尝试使用通过靶动脉精准局部灌注化疗药物以此来治疗食道恶性肿瘤,研究发现通过靶动脉灌注化疗药物的治疗方法能够显着提高抗癌治疗疗效,且副反应明显小于传统化疗。维拉帕米（Verapamil,VER）是一类Ca2+通道阻滞剂,是治疗心脏病的常见药物,同时维拉帕米也是早期发现的可以通过改变细胞内药物浓度从而降低肿瘤耐药性的药物。既往研究认为VER主要是通过抑制P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）的表达及活性来实现抗肿瘤多药耐药的,然而,近来多数研究发现VER还可通过其他非经典途径来增加其抗耐药性。体外实验表明,VER对多数肿瘤细胞具有抗耐药性,且有效作用浓度为6.0～10.0 μmol/L,但静脉用VER的安全浓度为1.0～2.0 μmoL/L,超出此范围则会导致心率下降、血压下降、房室传导阻滞等严重的不良反应,导致VER作为肿瘤耐药逆转剂不能在临床治疗晚期恶性肿瘤中广泛应用。本课题组通过前期犬实验证实,当VER在组织浓度是外周静脉血浓度的50-100倍时,VER能成功逆转肝恶性肿瘤的多药耐药,且实验犬未发生不良的心血管反应。本研究采用靶动脉灌注VER联合静脉应用抗癌药物治疗中晚期胃癌患者,结果表明能显着提高治疗疗效,但仍有近30%的患者治疗效果不理想。因此,寻找VER逆转肿瘤细胞耐药的关键基因,以期增强其疗效成为亟待解决的问题。有学者提出寻找凋亡相关因子,并验证其为肿瘤细胞多药耐药的新靶点。研究表明,抗凋亡基因Bcl-2在肿瘤耐药形成过程中表达量明显增高,导致肿瘤细胞的多药耐药。这些基因相互作用调控细胞的凋亡程序的同时,也在细胞耐药中也有一定影响。葡萄糖神经酰胺合成酶（glucosylcemmide synthase,GCS）是神经酰胺代谢合成葡糖脑苷脂的关键酶,其活性增高可导致肿瘤细胞获得性多药耐药的产生。本团队前期研究表明VER能够逆转部分晚期恶性肿瘤细胞的多药耐药。本研究通过筛选出有效预测VER逆转化疗耐药能力的个体差异的分子标志物,将为TACE+VER联合使用提供临床疗效预测手段和理论依据,对于完善VER个体化治疗有着重要意义。本课题组前期研究通过实时荧光定量PCR及Western blotting实验表明化疗联合VER通过抑制Bcl-2表达及活性从而促进恶性肿瘤细胞的凋亡、增强细胞对化疗敏感性,但其中的具体作用机制有待进一步深入研究,旨在寻找与VER逆转恶性肿瘤细胞耐药的关键基因,为靶动脉灌注VER治疗胃恶性肿瘤提供理论依据。第一章胃癌细胞hMDR1/P-gp表达水平与维拉帕米逆转化疗耐药能力相关性研究目的:探讨在胃癌细胞株中,hMDR1/P-gp水平与VER抗耐药能力差异的相关性。方法:1.实时荧光定量PCR和Western blot方法分别检测hMDR1/P-gp在3株胃癌细胞株（差分化人胃癌细胞株AGS、低分化人胃癌细胞株BGC-823和中分化人胃癌细胞株SGC-7901）中表达水平;2.CCK-8法分别检测不同胃癌细胞株对抗癌药物（5-Fu、ADM、DDP）的敏感性;3.CCK-8法分别检测胃癌细胞株对VER联合上述3种抗癌药物的药物敏感性;4.VER逆转胃癌化疗耐药能力的判断。结果:1.hMDR1/P-gp在基因和蛋白层面的表达水平在不同分化程度的胃癌细胞株中的表达水平差异明显,与SGC-7901相比,AGS中的表达量最高;2.BGC-823和AGS对顺铂耐药性大于SGC-7901;SGC-7901和AGS对阿霉素耐药性显着大于BGC-823,SGC-7901和AGS对5-氟尿嘧啶耐药性大于BGC-823;3.用固定浓度的VER（4.91μg/mL）联合抗癌药物分别处理胃癌细胞,均不同程度降低了胃癌细胞对3种抗癌药物的IC50值,提示VER提高了抗癌药物的敏感性;4.在SGC-7901细胞中,VER逆转ADM化疗耐药能力最强（Relative IC50=6.77）,与BGC-823细胞相比有显着性差异（Relative IC50=1.66）。结论:hMDR1/P-gp水平与VER逆转胃癌细胞对ADM化疗耐药能力之间无相关一致性。第二章胃癌耐药细胞株的构建并验证其耐药效率目的:建立人胃癌SGC-7901/5-Fu耐药细胞株。方法:应用间歇作用体外诱导法构建胃癌耐5-Fu细胞株SGC-7901/5-Fu,反复短期暴露并逐步增加5-Fu的浓度,每月做相关检测,CCK-8法对药物的敏感性进行检测,并在耐药细胞株成功构建后第3天、第15天、后每间隔15天对其稳定性进行检测。结果:经历6个月建成人胃癌5-氟尿嘧啶耐药细胞株SGC-7901/5-Fu,并与ADM抗癌药存在交叉耐药。结论:SGC-7901/5-Fu细胞株具有耐药性,且耐药性稳定。第三章介导维拉帕米逆转胃癌细胞化疗耐药能力差异性基因的筛选、验证及机制研究目的:筛选出介导VER逆转胃癌细胞化疗耐药能力的差异基因并验证,初步探讨其作用机制。方法:1.通过生物信息学分析及文献资料筛选出可能的差异基因;2.实时荧光定量PCR/Western blot法检测候选基因/蛋白在胃癌细胞中的表达;3.GCS基因表达沉默或过表达后,CCK-8法检测VER逆转胃癌耐药细胞对ADM化疗耐药能力的变化;4.GCS基因表达沉默及过表达后,Annexin V-PI双染法检测VER促胃癌细胞凋亡能力的变化。结果:1.我们筛选出8个候选基因,分别为hMDR1、LRP、GST-π、GCS、TOPO Ⅱ、PrPc、MGr1-Ag、CIAPIN1;2.实时荧光定量PCR验证表明经过VER处理后,LRP、GCS、TOPOⅡ的表达存在差异,其中GCS差异最为明显（p<0.01）;3.western blot验证经VER处理后GCS蛋白表达存在差异,结合实时荧光定量PCR结果,本研究着重从GCS出发,初步探讨其参与调控VER逆转耐药的可能机制;4.在SGC-7901和SGC-7901/5-Fu、SGC-7901/ADM细胞株中,过表达GCS基因（pEGFP-GCS）,VER逆转胃癌细胞ADM化疗耐药能力明显减弱,表达沉默GCS基因（siR-GCS）,VER逆转胃癌细胞ADM化疗耐药能力明显增强;5.过表达GCS基因（pEGFP-GCS）后,VER促进ADM胃癌细胞凋亡能力明显减弱,表达沉默GCS基因（siR-GCS）后,VER促进ADM胃癌细胞凋亡能力较前增强;6.western blot法检测沉默GCS基因（siR-GCS）后,VER促进ADM胃癌细胞凋亡蛋白Bcl-2及ERK表达量明显减弱。结论:GCS介导了 VER逆转胃癌细胞ADM化疗耐药能力差异,VER可能通过改变GCS基因表达水平,可明显改变其逆转ADM化疗耐药及促进细胞凋亡能力。第四章 临床研究P-gp、GCS蛋白在胃癌组织样本中的表达目的:临床研究P-gp、GCS蛋白在胃癌两组极端病例（治疗明显好转组/治疗疾病进展组）组织样本中的表达。方法:1.选取2014.1-2017.12入住我院就诊中晚期胃癌患者11例,均经胃镜技术提取病变标本,病理证实为胃癌,每位患者每月介入1次共介入2-4次,评估患者治疗疗效,分为两组:维拉帕米抗耐药治疗有效组（治疗明显好转病例,CR）7例,维拉帕米抗耐药治疗无效组（治疗疾病进展病例,PD）5例;2.免疫组化法检测P-gp、GCS蛋白在两组胃恶性肿瘤组织样本中的表达。结果:1.P-gp蛋白主要表达于癌细胞胞浆/胞膜中,有效组的P-gp蛋白平均光密度值与无效组比较无明显差异;2.GCS蛋白主要表达于癌细胞胞核/胞浆中,在癌组织中,有效组的GCS平均光密度值明显低于无效组（p<0.01）。结论:1.维拉帕米抗耐药治疗有效组P-gp蛋白表达水平与无效组比较无明显差异;2.维拉帕米抗耐药治疗有效组GCS蛋白表达水平明显低于抗耐药治疗无效组。
程国荣[4]（2021）在《中药逆转肿瘤多药耐药及侵袭转移作用机制研究》文中研究表明恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病,肿瘤细胞多药耐药（Multidrug resistance,MDR）和侵袭转移的发生是临床上肿瘤治疗失败的主要原因。针对MDR和侵袭转移机制从中药中寻找高效、低毒的活性成分是目前抗肿瘤研究的重要课题之一。本论文从分子水平和细胞水平两方面出发,利用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）筛选潜在的抗肿瘤活性成分,并基于代谢组学和细胞生物学相结合的研究策略对活性成分的逆转机制及抑制肿瘤侵袭转移作用机制进行深入研究。针对糖酵解过程中的关键限速酶-乳酸脱氢酶（LDH）在许多肿瘤细胞中高表达,被认为是浸润性癌重要靶点的特性,以LDH为靶分子,从中药中筛选其抑制剂。同时基于MDCK-MDR1细胞模型,进行P-糖蛋白（P-gp）介导的MDR逆转剂的筛选。1、中药中LDH抑制剂筛选建立固定化LDH方法,从大黄和虎杖中筛选潜在抑制剂。首先,以磁纳米粒子（MNPs）为载体,经氨基化修饰后,将LDH以共价键合的方式固定在MNPs表面,得到固定化LDH。为了获得最大的酶活力,采用单因素与响应面相结合的方法对固定化条件进行了优化,包括pH值、固定化时间和LDH浓度。在pH值为5.85、反应时间为3.14h、LDH浓度为0.37 mg/mL时,固定化LDH酶活性最佳,此时,LDH固定在MNPs上的量约为49μg/mg。随后,以galloflavin（阳性对照）、绿原酸和毛蕊花糖苷（阴性对照）为模型混合物,进行配体垂钓实验,对固定化LDH的特异性和选择性进行验证。最后,将固定化LDH方法与UPLC-MS/MS相结合,从两种富含蒽醌类化合物的天然产物（大黄和虎杖）中筛选潜在LDH抑制剂。从大黄和虎杖提取物中分别筛选并鉴定出9个和6个化合物,其中有3个化合物为二者所共有,这进一步证实了该方法的可行性。2、基于MDCK-MDR1细胞的P-gp抑制剂筛选利用P-gp过表达的MDCK-MDR1细胞,通过细胞毒性、罗丹明-123（Rh-123）蓄积与外排、Western blot实验和转运实验,对虎杖和白屈菜两种中药提取物及其主要成分进行P-gp抑制剂筛选研究。通过细胞毒性实验确定各个药物的IC20值,蒽醌类和多酚类化合物选择40、20、10 μM进行后续研究。Rh-123蓄积与外排实验显示虎杖提取物比白屈菜提取物对P-gp的抑制作用更强。对三类单体化合物比较,蒽醌类化合物对P-gp抑制作用最强,尤其是芦荟大黄素和大黄酚,其次是多酚类和3个毒性较大的生物碱。另外,通过不同药物处理时间对Rh-123蓄积的影响可以初步推测除虎杖苷、白藜芦醇三甲醚和白屈菜红碱外,其余化合物既能抑制P-gp的功能,又能抑制P-gp的表达。Western blot实验结果表明除虎杖苷和白屈菜红碱外,其余化合物均能抑制P-gp表达。选择效果最强的蕙醌类化合物芦荟大黄素、大黄酚和文献报道较多的白藜芦醇进行转运研究,结果表明芦荟大黄素和白藜芦醇能显着抑制P-gp底物地高辛的外排,而大黄酚没有这种抑制作用。此外,我们还补充了 5个结构相近且毒性较小的生物碱进行研究,发现苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、槐果碱、氧化槐果碱对P-gp均有较好抑制作用,有望成为MDR逆转剂。3、芦荟大黄素（AE）逆转MDR机制研究基于乳腺癌MCF-7/ADR细胞耐药模型,研究AE的逆转效果及机制。AE能显着逆转MCF-7/ADR细胞对阿霉素（ADR）的耐药性,其逆转指数为4.86。20μMAE与ADR联用对P-gp的表达没有抑制作用,但能显着促进ADR在耐药细胞中的蓄积。通过荧光显微镜观察,显示AE能使ADR更多的进入细胞核中,细胞核是ADR发挥抗肿瘤作用的场所。P-gp对ADR的外排需要ATP水解提供能量,而AE能降低细胞内ATP水平,因而推测AE通过抑制P-gp的外排功能来发挥逆转作用。能量代谢途径的研究结果表明,AE与ADR联用可抑制糖酵解、TCA循环、谷氨酰胺代谢及相关氨基酸合成途径。此外,我们还发现AE不仅可以逆转ADR诱导的耐药,还可以诱导自噬作为防御机制,抑制这一过程可增强AE的逆转活性。此外,AE与ADR联合用药还可以导致MCF-7/ADR细胞G2/M期阻滞并通过DNA损伤、ROS生成、caspase-3激活诱导细胞凋亡。4、芦荟大黄素（AE）和大黄素（EMD）抑制乳腺癌侵袭转移作用机制研究采用基于UPLC-Q-TOF/MS技术的代谢组学方法对乳腺癌MCF-7细胞与人脐血静脉内皮细胞HUVEC共培养模型进行了考察,筛选并鉴定出25个生物标志物,涉及谷胱甘肽代谢、甲硫氨酸循环、嘌呤代谢和TCA循环等代谢通路,这些代谢通路均与肿瘤的恶性表型有关。采用共培养模型研究AE和EMD这两个同分异构体对MCF-7细胞侵袭转移的抑制作用。结果表明AE可以抑制MCF-7细胞的黏附、侵袭及血管生成,而EMD主要是抑制黏附。通过代谢组学的方法研究AE和EMD抑制MCF-7细胞侵袭转移的作用机制。AE和EMD组分别筛选出27个和13个生物标志物,涉及多胺代谢、维生素B6代谢、甲硫氨酸循环、TCA循环、谷胱甘肽代谢、嘌呤代谢和天冬氨酸合成等通路。选择这些通路上的典型代谢物进行定量分析,发现AE能显着降低这些代谢物的含量且效果明显强于EMD。
董正远[5]（2021）在《外泌体lncRNAH19调控miR-340-3p诱导乳腺癌紫杉醇耐药的研究》文中指出目的:探讨耐药细胞来源的外泌体lnc RNA H19是否通过调控miR-340-3p诱导乳腺癌紫杉醇耐药及生物学活性改变的分子机制。方法:1.梯度离心法用于分离细胞上清液中的外泌体;2.使用透射电镜拍摄外泌体外形;3.Western Blot检测外泌体标志蛋白（CD63、TSG101）;4.通过激光共聚焦观察受体细胞对外泌体的摄取情况;5.实时荧光定量PCR（quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR）和Western Blot检测SKBR-3/PR来源的外泌体与受体细胞SKBR-3共培养后耐药指标（P-gp、BCRP、MRP）的表达;6.Transwell和细胞划痕验证外泌体与受体细胞共培养后对细胞侵袭以及迁移的作用;7.q RTPCR分析miR-340-3p和lnc RNA H19在SKBR-3细胞和SKBR-3/PR细胞中的表达;8.q RT-PCR分析敲低或过表达lnc RNA H19以及转染miR-340-3p mimics/inhibitor的效率;9.q RT-PCR分析敲低lnc RNA H19和过表达lnc RNA H19后miR-340-3p的表达;10.CCK-8、流式细胞技术、Transwell和细胞划痕检测lnc RNA H19和miR-340-3p对细胞侵袭、增殖、迁移和凋亡的作用;11.q RT-PCR和Western Blot检测敲低或过表达lnc RNA H19以及转染miR-340-3p mimics/inhibitor后耐药指标（P-gp、BCRP、MRP）的表达变化;12.生物信息学技术分析lnc RNA H19和miR-340-3p的结合序列,双荧光素酶实验验证二者的结构互补性;13.lnc RNA H19过表达或干扰分别联合miR-340-3p mimics或inhibitor的双向互补试验,采用Transwell和细胞划痕检测细胞的侵袭和迁移能力,q RT-PCR和Western Blot检测EMT相关指标（E-cadherin、Vimentin、snail）的表达。结果:1.相对于SKBR-3细胞源性外泌体（SKBR-3-exo）,SKBR-3/PR细胞源性外泌体（SKBR-3/PR-exo）的lnc RNA H19表达较高;2.SKBR-3/PR-exo与SKBR-3共培养后,SKBR-3细胞的lnc RNA H19表达上调;3.SKBR-3细胞与SKBR-3/PRexo共培养后,细胞侵袭和迁移能力增强;4.SKBR-3细胞与SKBR-3/PR-exo共培养后耐药相关指标P-gp、BCRP和MRP的蛋白及m RNA表达水平上调;5.LncRNAH19在SKBR-3细胞中的表达低于SKBR-3/PR细胞,miR-340-3p在SKBR-3细胞中的表达高于SKBR-3/PR细胞;6.过表达lnc RNA H19后,miR-340-3p的表达下降;而敲低LncRNAH19后,miR-340-3p的表达上调;7.过表达lnc RNA H19,细胞的迁移、增殖、侵袭能力增强,细胞凋亡率降低;然而,敲低lnc RNA H19,出现相反的生物学效应;8.过表达lnc RNA H19,耐药相关指标E-cadherin的蛋白和m RNA表达下调,Vimentin和snail的蛋白和m RNA表达上调。敲低lnc RNA H19则E-cadherin的蛋白和m RNA表达上调,Vimentin和snail的蛋白和m RNA表达下调;9.转染miR-340-3p inhibitor后,可增强细胞的迁移、增殖、侵袭能力,细胞凋亡数量下降。相反,转染miR-340-3p mimics时,则降低细胞的迁移、增殖、侵袭能力,提高细胞的凋亡率;10.转染miR-340-3p inhibitor后,耐药相关指标Ecadherin的蛋白和m RNA表达水平下调,Vimentin和snail的蛋白和m RNA表达水平上调。然而转染miR-340-3p mimics则会上调E-cadherin的蛋白和m RNA表达水平,而下调Vimentin和snail的蛋白和m RNA表达水平;11.miR-340-3p mimics转染至lnc RNA H19突变型载体细胞后荧光不变,而miR-340-3p mimics转染至lnc RNA H19野生型载体细胞后荧光减弱;12.在敲低或过表达lnc RNA H19的同时,分别转染miR-340-3p inhibitor/mimics可逆转其对细胞迁移的影响;13.敲低或过表达lnc RNA H19影响EMT表型,然而在敲低或过表达lnc RNA H19的同时,转染miR-340-3p inhibitor/mimics可逆转其对细胞EMT的影响。结论:1.耐药细胞源性外泌体可传递lnc RNA H19至受体细胞;2.外泌体lnc RNA H19调控miR-340-3p诱导乳腺癌细胞紫杉醇耐药,增强细胞迁移、侵袭、增殖能力和降低凋亡。
葛宁[6]（2021）在《KCNMA1的上调促进维拉帕米逆转食管鳞状细胞癌对顺铂的化学耐药》文中研究指明研究背景:食管癌（esophagus cancer,EC）是消化系统常见的恶性肿瘤之一,2018年,全球新增57万例EC患者,且有50万例患者死于EC[1]。全球食管癌新增和死亡病例约有一半发生在中国,其在我国的发病率和死亡率占第六和第四位[2]。食管癌主要包括食管鳞状细胞癌（sophageal squamous cell carcinoma,ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma,EAC）两个亚型,美国和欧洲国家主要以EAC亚型为主,而我国食管癌患者90%以上都是ESCC亚型。目前手术、放疗和化疗是ESCC三大主要治疗手段。手术是早期局限性病灶患者的首要治疗方式,但由于早期食管癌临床症状不明显,很多患者发现即为中晚期而不能手术。放疗做为食管癌局部治疗主要手段之一,对于颈段食管癌及非手术食管癌具有不可替代的作用,但对于病灶长度较长及放疗后复发的患者作用有限。化学治疗和靶向药物治疗可部分延长中晚期或术后食管癌患者生存时间,受肿瘤耐药性的限制,标准化疗方案对晚期食管癌的反应率只有30%左右。探索食管癌细胞对化疗药物的耐药性,对食管癌治疗具有非常重要的临床意义。肿瘤细胞的耐药性有单药耐药和多药耐药两种形式,多药耐药是较为多见的耐药形式。既往研究认为药物耐药性与细胞内药物的浓度与分布改变、抗氧化体系激活、DNA损伤修复系统活化和细胞外基质等各种因素相关。维拉帕米（Verapamil,VER）是一种L-型的钙离子通道抑制剂,主要用于治疗心脑血管系统疾病。随着对其深入研究发现它可逆转肿瘤细胞多药耐药性（multidrugresistance,MDR）,有效逆转肿瘤多药耐药的浓度为6.0-10.0umol/L。传统静脉注射的安全浓度为1.0～2.0umol/L,但此浓度达不到有效逆转耐药浓度,通过动脉灌注药物的方式可使其局部组织浓度达到外周血液浓度的3-10倍。研究表明,通过VER逆转肿瘤的多药耐药,改善了化学药物治疗临床疗效,其中包括肝细胞癌、大肠癌、胃癌、肺癌和恶性腹水等。最初研究表明VER是通过调节P-gp蛋白的表达抗肿瘤MDR,VER能够抑制或下调P-gp的表达,阻止药物外排提高肿瘤化疗药物的杀伤作用。最近研究表明VER逆转肿瘤多药耐药的机制很有可能与P-gp无关。我们通过高通量筛选实验发现 SLIT3、KCNMA1、KLK1、LPAR1、CHRDL1、NID1 这6个候选基因与维拉帕米逆转耐药相关。其中KCNMA1基因在VER逆转ESCC细胞对顺铂（DDP,cisplatin）耐药中表达显着升高。本课题通过细胞实验、动物实验及临床资料层面研究KCNMA1基因表达与VER逆转肿瘤顺铂耐药之间的关系。第一章:KCNMA1的表达在VER逆转ESCC细胞耐药中的作用目的:本研究通过研究KCNMA1基因在ESCC组织和细胞中的表达差异,来研究KCNMA1基因的表达差异与VER逆转ESCC肿瘤耐药可能存在的关系,为肿瘤耐药的ESCC患者靶向治疗提供理论依据。基于这些实验,我们检测了 KCNMA1基因在ESCC中的表达;通过过表达或沉默表达KCNMA1基因,研究肿瘤细胞对顺铂的敏感性差异;通过经增强KCNMA1表达研究对ESCC增殖和凋亡的作用。通过这些实验,我们对VER逆转肿瘤MDR的机制有了更深的认识,为治疗ESCC患者提供临床证据。方法:1.CCK-8实验和集落形成实验验证检测VER联合顺铂对KYSE150、KYSE180和KYSE450三种ESCC细胞活力影响;2.高通量筛选测序,比较KYSE150、KYSE180中DPP组和VER+DPP组中基因表达差异,同时用qRT-PCR验证这种差异;3.WB检测VER组、DPP组、以及VER+DPP组中KCNMA1蛋白的表达;4.免疫组织化学法检测VER联合顺铂治疗的ESCC患者组织样本中KCNMA1的蛋白表达;5.通过沉默或过表达KCNMA1基因的表达,再用CCK-8法检测ESCC细胞对顺铂的细胞活力;6.通过抗增殖实验和凋亡实验,研究KCNMA1基因的表达与ESCC细胞增殖和细胞凋亡关系。结果:1.CCK-8实验和集落形成实验结果显示VER增加了 ESCC细胞对顺铂的敏感性,尤其是对KYSE150细胞,而VER对KYSE180细胞的作用小。因此本实验选择KYSE150细胞作为VER逆转敏感细胞,选择KYSE180细胞作为抗逆转模型细胞进行进一步研究;2.高通量转录测序结果显示,SLIT3、KCNMA1、NID1、KLK1、LPAR1和CHRDL1基因表达均表现出差异,并通过qRT-PCR验证了这种差异。与KYSE150 DDP组相比,KYSE150 DDP+VER组的KCNMA1表达明显上调,且KYSE150细胞中的KCNMA1表达水平高于KYSE180细胞中的表达水平;3.WB结果显示在KYSE180 DDP组和KYSE180 DDP+VER组之间,KCNMA1的蛋白表达没有显着差异,而在KYSE150 DDP+VER组中,KCNMA1显着上调;4.免疫组化结果表明对VER逆转方案呈现阳性患者中,KCNMA1的表达显着升高,而阴性患者中KCNMA1的表达无显着差异;5.通过过表达KCNMA1基因,可以显着增加KYSE150细胞对顺铂的敏感性,而沉默KCNMA1基因的表达后,KYSE150细胞对顺铂的敏感性下降;6.增殖和凋亡实验结果表明,KCNMA1的表达能够增强了 VER对ESCC细胞的抗增殖作用,也可以增强VER对ESCC细胞的促凋亡作用。结论:VER能够促进KCNMA1的表达,增强KYSE150细胞对顺铂的敏感性,其存在的机制可能是KCNMA1的表达能够增强顺铂对KYSE150细胞的抗增殖和促凋亡作用。第二章:KCNMA1的表达促进顺铂对移植瘤裸鼠抑制作用研究目的:本研究旨在分析在食管鳞状细胞移植瘤裸鼠中,KCNMA1的表达与VER逆转肿瘤对顺铂敏感性的相关性,探讨KCNMA1对ESCC治疗中的作用.方法：1.构建过表达和沉默KCNMA1KYSE150细胞模型,2.将ESCC细胞经皮下注射裸鼠.构建食管鳞状细胞癌模型,分为五组包括Control组、DPP组、DPP+VER组、siRNA-KCNMAl组和Over-KCNMAl+DPP组.待肿瘤体积生长至50mm2时,腹膜内注射2.0mg/kg的顺铂和1.Omg/kg的VER,比较各组裸鼠的肿瘤大小、肿瘤抑制率;3.免疫组化实验比较各组裸鼠组织中KCNMA1蛋白表达;4.WB与qRT-PCR实验检测三组裸鼠中KCNMA1的表达;结果:1.通过质粒转染和慢病毒转染制备KCNMA1过表达和表达沉默的KYSE150细胞珠,qRT-PCR和WB结果显示,Over-KCNMAl组中KCNMA1蛋白的表达显着高于vector组,而siRNA-KCNMA1组中KCNMA1蛋白的表达显着低于sh-NC组,表示过表达和沉默表达KCNMA1细胞模型构建成功;2.本实验中所有裸鼠均成瘤,且在治疗期间各组裸鼠肿瘤体积均随着时间推移不断增大,Over-KCNMAl+DPP组和DPP+VER组在14天之后肿瘤体积大小明显小于单独DPP组,而沉默KCNMA1的表达后,肿瘤组织体积显着增加;3.裸鼠肿瘤组织WB和qRT-PCR结果显示,Over-KCNMAl组和DPP+VER组中KCNMA1蛋白表达显着高于Control组和DPP组.结论:过表达的KCNMA1能够提高食管鳞状细胞癌组织对顺铂的敏感性,抑制肿瘤组织体积的生长;而沉默KCNMA1的表达,降低顺铂对裸鼠肿瘤的抑制作用.第三章:临床研究KCNMA1基因在食管鳞状细胞癌患者组织样本中的表达目的：本研究旨在分析经过维拉帕米联合化疗动脉灌注治疗的食管鳞状细胞癌患者数据,通过免疫组化法对不同治疗效果病例KCNMA1基因表达情况检测,探讨KCNMA1在ESCC动脉灌注治疗中的作用。方法：1.所有患者釆用Seldinger技术经股动脉穿刺每月介入治疗1次,每例患者介入治疗2-3次,介人治疗结束后第4周对疗效进行评估。方案为:维拉帕米（25 mg）+化疗药物（顺钻+5-氟尿嘧啶）?方法为:术前常规静脉滴注喘啶（0.25 mg）和地塞米松（5?10mg）;灌注过程中用肝素盐水间断冲洗导管35次,同时静脉滴注昂丹司琼（816 mg）和地塞米松（510 mg）?2.收集经过维拉帕米联合化疗动脉灌注治疗的食管鳞状细胞癌患者临床病例3.根据治疗效果将上述食管鳞状细胞癌患者临床病例分为四组,包括临床治愈或显着改善（CR）、临床治疗改善（PR）、临床治疗疗稳定（SD）和进行性或恶化（PD）.将CR+PR组定义为治疗阳性组,SD+PD组定义为治疗阴性组4.免疫组化实验比较各组食管癌患者中KCNMA1表达;结果:1、在患有ESCC中期或晚期的患者中,11例完全缓解（complete remission,CR）,65例部分缓解（partial remission,PR）,13例未出现改变（SD）,5例进行性疾病（progressive disease,PD）.总缓解率（CR+PR）为80.85%2、通过免疫组织化学测定法测量对VER逆转治疗方案呈阳性（CR或PR）患者的组织样品中KCNMA1表达明显高于阴性（SD和PD）的患者。结论:经靶动脉灌注维拉帕米联合化疗药物治疗中、晚期食管鳞状细胞癌提高了食管鳞状细胞癌治疗的近期疗效,改善了患者的临床获益及临床症状。免疫组化结果显示对本治疗方案呈阳性患者组织中KCNMA1表达显着高于阴性反应组。
袁红玉[7]（2021）在《第一部分：内质网伴侣分子TMTC3通过内质网应激调控食管鳞癌EMT的分子机制研究 第二部分：ABC转运蛋白超家族成员ABC-X在食管鳞癌化疗耐药中的作用机制研究》文中认为食管鳞癌是一种具有中国特色的消化系统恶性肿瘤,起病隐匿、进展快。因此,阐明食管鳞癌发生发展的分子机制对食管鳞癌的诊治至关重要。肿瘤在进展过程中经历的癌基因突变、代谢需求增加、营养缺乏等多种内外环境压力的改变,引发内质网应激反应。为适应内质网应激,肿瘤细胞诱发非折叠蛋白反应,通过自噬、细胞重编程、上皮细胞-间充质转化（Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）等方式促进肿瘤的存活、转移和耐药。多项研究表明,靶向内质网应激的信号分子可有效治疗肿瘤,但内质网应激是否在食管鳞癌进展中发挥关键作用及相关机制仍不明确。在本研究中,我们通过血清饥饿使食管鳞癌细胞系KYSE450处于内质网应激状态并进行转录组测序,筛选并验证TMTC3在处于内质网应激状态的细胞中高表达。在本实验室86对食管鳞癌组织转录组测序结果中,TMTC3 mRNA在癌组织中的表达显着高于癌旁组织。75对食管鳞癌组织芯片的免疫组化结果显示,TMTC3蛋白在癌组织中的表达水平显着高于癌旁组织。临床资料分析发现,TMTC3高表达与食管鳞癌患者的不良预后正相关。结合TCGA可视化数据库分析发现TMTC3在食管鳞癌、肺鳞癌、头颈鳞癌中异常高表达,具有一定的鳞癌特异性,通过ChIP实验和双荧光素酶报告基因实验证实TMTC3基因的转录受鳞癌特异性转录因子TP63调控。体外细胞功能实验结果表明,敲降TMTC3可抑制食管鳞癌细胞的增殖、侵袭及迁移。动物实验研究TMTC3在体内对食管鳞癌的作用,裸鼠皮下成瘤实验表明,低表达TMTC3的食管鳞癌细胞裸鼠皮下瘤的生长速度显着低于对照组;裸鼠尾静脉注射实验结果显示,低表达TMTC3的食管鳞癌细胞发生肺转移显着低于对照组,同时可见肝转移及淋巴结转移也显着低于对照组。因TMTC3定位于内质网并参与内质网应激反应,我们首先通过免疫荧光实验确定TMTC3与内质网应激感受器及内质网伴侣分子GRP78存在共定位;进一步通过免疫共沉淀实验发现,TMTC3通过竞争性结合GRP78导致其与内质网应激相关因子PERK解离,导致PERK信号通路激活并促进ATF4入核发挥转录因子的作用。转录组测序分析稳定敲降TMTC3后,食管鳞癌细胞内下游分子的变化。结果表明,TMTC3可正向调控FAM3C的mRNA和蛋白水平,且染色质免疫共沉淀实验结合双荧光素酶报告基因实验证实ATF4可促进FAM3C基因的转录激活,数据库分析结果显示二者表达显着正相关。后续研究结果表明,TMTC3可通过FAM3C 调控 EMT 相关标志物 E-cadherin、N-cadherin 和 Vimentin 的表达。综上所述,受鳞癌特异性转录因子TP63调控的TMTC3在内质网应激过程中表达升高,可促进GRP78和PERK的解离,促进PERK信号通路中ATF4的核转位,激活FAM3C基因转录从而上调其表达,最终导致食管鳞癌的恶性进展。本研究可为研究食管鳞癌进展的分子机制提供新思路,且TMTC3有望成为食管鳞癌诊治的新靶点。由于食管鳞癌患者对化疗不敏感、易产生耐药,导致化疗失败、肿瘤复发。因此,阐述食管鳞癌的耐药机制、寻找增强化疗敏感性的靶点尤为重要。ABC转运蛋白超家族参与多种生理过程,与肿瘤的多药耐药密切相关。目前该家族中的ABCB1、ABCC1和ABCG2的作用机制相对比较明确,已有相应的靶向药物应用于临床,但该家族成员是否参与食管鳞癌的多药耐药、是否可作为食管鳞癌耐药的治疗靶点仍有待研究。基于本实验室前期86例食管鳞癌转录组测序并结合TCGA可视化数据库分析发现ABC-X在食管鳞癌中异常高表达,且具有鳞癌特异性,其高表达与基因拷贝数扩增无关,但与鳞癌特异性扩增的转录因子TP63和SOX2正相关。通过JASPAR数据库预测TP63、SOX2与ABC-X启动子区的结合位点,进一步通过ChIP实验和双荧光素酶报告基因实验证实TP63、SOX2可与ABC-X的启动子区结合并促进其转录。在食管鳞癌细胞中敲降TP63或SOX2,ABC-X的mRNA表达发生相应下调。以上结果表明,TP63和SOX2转录激活ABC-X基因的表达是ABC-X在鳞癌（食管鳞癌）中特异性高表达的原因之一。通过免疫荧光实验观察ABC-X在细胞内的亚定位,发现ABC-X与溶酶体标志物LAMP2有显着共定位,表明ABC-X定位于溶酶体。细胞功能实验结果表明,在食管鳞癌细胞中敲降ABC-X能明显抑制细胞的增殖能力,但不影响其侵袭迁移能力。顺铂处理敲降ABC-X的食管鳞癌细胞检测细胞凋亡情况,结果表明敲降组细胞的生长在加入顺铂后受到明显抑制,细胞凋亡的数量明显增加,促凋亡相关蛋白的表达上调。构建稳定敲降ABC-X的食管鳞癌细胞进行皮下成瘤,结果显示,低表达ABC-X的食管鳞癌细胞皮下成瘤能力显着降低。此外,对ABC-X在食管鳞癌中的作用机制进行了初步探索,利用稳定敲降ABC-X的细胞系进行全质谱分析,筛选得到对照组/实验组比值小于0.6的蛋白共501个,并对这些差异蛋白进行GO和Pathway富集分析,结果提示ABC-X的功能与膜结构运输相关。前期研究表明ABC-X在食管鳞癌耐药中发挥重要作用,有望成为食管鳞癌耐药患者新的治疗靶点。为了获得针对ABC-X的小分子化合物,我们根据ABC-X的氨基酸序列进行同源建模,与经FDA批准的1953种小分子化合物进行分子对接,根据结合打分值筛选得到41种小分子化合物。将上述41种小分子化合物分别处理食管鳞癌细胞,并通过ELISA检测ABC-X的表达,取相对表达量低于0.7的5种小分子化合物进行RTCA细胞增殖实验,最终确定一种可明显抑制食管鳞癌细胞增殖的小分子化合物,且这种小分子化合物可增强食管鳞癌细胞对顺铂的敏感性。综上所述,ABC-X有望成为食管鳞癌治疗的新靶点,但其作用的分子机制有待进一步探讨,而针对ABC-X的小分子化合物联合顺铂有望为食管鳞癌化疗抵抗的患者提供新的治疗策略。
陈颖[8]（2021）在《CALD1在MCF-7/ADR细胞阿霉素耐药中的机制研究》文中研究说明目的乳腺癌是全球女性的主要致命疾病之一,无法接受手术的女性通常必须依靠全身化疗来延长生存期。阿霉素（ADR）是最常用的乳腺癌化疗药物之一,但ADR获得性耐药会严重阻碍化疗的疗效,导致预后不良和癌症复发。我们基于GEO数据库中乳腺癌MCF-7细胞系和耐阿霉素乳腺癌MCF-7/ADR细胞系的转录组数据,结合生物信息学分析两种细胞系的基因表达的变化,并对耐药相关的分子靶标进行了分析与挖掘,通过以MCF-7/ADR细胞为模型,研究耐药相关的分子caldesmon 1（CALD1）在乳腺癌细胞耐药中的可能作用,探讨CALD1在MCF-7/ADR耐药过程中可能的机制。方法一、利用GEO数据库获得敏感株MCF-7和耐阿霉素株MCF-7/ADR的mRNA表达谱数据,比较MCF-7和MCF-7/ADR细胞之间基因表达的全局差异。利用edgeR分析软件和limma包进行差异表达分析,获得MCF-7/ADR耐药组中差异表达基因（DEGs）。并对7个与乳腺癌耐药相关的ABC基因（ABCA2、ABCB1、ABCC1、ABCC3、ABCC4、ABCC5、ABCC5）进行DEG分析,筛选DEGs的阈值为FDR<0.05和|log2（Fold Change）|>1。通过Kaplan-Meier和Progno Scan网站评估DEGs在乳腺癌患者中的整体生存（OS）和相关性。二、以乳腺癌MCF-7和MCF-7/ADR作为两种细胞模型,通过RTPCR和MTT法研究CALD1基因在两株细胞中的表达水平和耐药现象;构建过表达CALD1（CALD1-oe）/干扰（CALD1-sh）质粒,分别转染MCF-7和MCF-7/ADR细胞,筛选稳定过表达CALD1（M-cad）/CALD1干扰的（A-sh）稳转株,通过细胞显微镜初步观察细胞的转染效率,qRTPCR、WB法检测CALD1在稳转细胞中的表达情况。采用MTT检测稳转细胞的相对增殖活力以及对ADR的耐药能力,PI染色法流式检测细胞周期试验。评估CALD1的表达水平是否会影响MCF-7乳腺癌细胞ADR的化疗耐药性。三、结合GEO数据集和生信分析鉴定出ABC家族与耐药相关蛋白的DEGs（ABC-DEGs）,通过RT-PCR、qRT-PCR检测ABC-DEGs在对照（M-vec/A-vec）和过表达/干扰（M-cad/A-sh）四组细胞株中的mRNA的表达变化,通过WB验证ABC-DEGs蛋白表达水平的变化;结合生信分析,通过qRT-PCR、RT-PCR和WB检测CALD1、ABCC4、上皮间质转化（EMT）相关性分子Ecad、Ncad、Snail、Twist和Slug之间的表达情况;最后利用在线分析网站对这些基因进行相关性的分析。结果一、结合GEO数据集GSE76540和edgeR软件,对MCF-7敏感株（n=3）、MCF-7/ADR耐药株（n=3）的mRNA表达谱进行差异分析,共筛选出MCF-7/ADR组中4954个差异表达基因,包括2422个上调基因和2532个下调基因,差异倍数最高的前十位上调基因（CALD1、LY6K、GPX1、FOXG1、ETS1、SERPINB2、CNN3、SDHAF3、PSAT1、MMP1）,前十位下调基因（PDCD10、LXN、SULF2、IGFBP5、DNAJC15、SYTL5、AGR2、UBB、CDH1、KRT19）,其中CALD1是MCF-7/ADR组中差异倍数最大的基因;同时,对7个ABC耐药基因（ABCA2、ABCB1、ABCC1、ABCC3、ABCC4、ABCC5、ABCC5）进行DEG分析,获得2个上调基因（ABCB1、ABCC4）和2个下调基因（ABCC3、ABCC5）。经Kaplan-Meier生存分析网站评估,发现上调基因（CALD1、GPX1、CNN3、MMP1）高表达的乳腺癌患者OS较低,提示其高表达与乳腺癌患者预后不良有关（P<0.05）;下调基因（PDCD10、SULF2、DNAJC15、SYTL5、AGR2、CDH1）高表达的乳腺癌患者OS较高（P<0.05）,提示它们可作为乳腺癌患者预后良好的指标。此次DEG分析中,CALD1是MCF-7/ADR细胞内基因差异倍数最大的基因,且与乳腺癌不良预后密切相关,我们猜测CALD1可能与乳腺癌的ADR化疗后的药物抵抗过程有关。二、为了检测CALD1是否在MCF-7的ADR耐药中起作用,我们以天然低表达CALD1（MCF-7）的乳腺癌细胞和高表达CALD1乳腺癌耐药（MCF-7/ADR）细胞作为体外细胞模型,使用MTT法检测细胞的增殖活力和对ADR药物的耐药情况,得到MCF-7/ADR的耐药倍数为11.02±3.25,证实MCF-7/ADR细胞比其亲本MCF-7细胞具有更强的ADR抗性。接下来通过RT-PCR对两组细胞组进行CALD1 mRNA检测,鉴定出CALD1在MCF-7和MCF-7/ADR细胞中主要以二亚型（WI-38 L-CAD II）转录本的形式存在。同时,通过qRT-PCR和WB观察到CALD1在MCF-7/ADR耐药细胞中的含量高,这与生信分析的结果一致。我们进一步通过构建CALD1-oe/CALD1-sh重组质粒,获得稳定过表达CALD1（M-cad）和干扰CALD1（A-sh）的体外细胞模型,通过荧光显微镜下观察,以及qRT-PCR和WB检测四组细胞株（M-vec/Mcad、A-vec/A-sh）的表达情况,结果显示M-cad细胞中CALD1的表达明显上调51%,而干扰株A-sh细胞中CALD1的表达下调64%,表明成功构建了CALD1过表达和RNAi干扰的细胞模型。接下来用ADR药物处理4组细胞72小时,用MTT检测细胞的相对增殖活力以及对ADR的耐药性,结果显示,M-cad过表达组中增殖状态细胞明显增加,耐药倍数为2.15±1.56,而A-sh干扰组的细胞明显生长变缓慢,逆转耐药倍数为2.06±1.25,说明了CALD1的过度表达升高ADR的耐药倍数值和细胞增殖能力,而干扰CALD1表达能够逆转ADR耐药,恢复对ADR的敏感性。最后通过PI检测细胞周期,发现CALD1的缺失能够诱导细胞的G0/G1期停滞,而CALD1表达上调能够增加S期的细胞,说明CALD1能够促进MCF-7细胞的生长和提高细胞耐药性。三、结合GEO数据集和生信DEG分析得到的4个耐药相关ABCDEGs,包括2个上调基因（ABCB1、ABCC4）和2个下调基因（ABCC3、ABCC5）,通过RT-PCR、q PCR检测在CALD1过表达/干扰细胞株中表达情况,发现有2个与CALD1有正相关趋势基因（ABCB1、ABCC4）,通过WB检测鉴定这个2个基因的表达水平,结果显示,过表达CALD1不能增加ABCB1蛋白水平的上调,RNAi干扰CALD1也没有减少ABCB1的表达,因此ABCB1与CALD1变化无关。而ABCC4的mRNA和蛋白表达水平都随着CALD1表达的升高而上升,说明CALD1的改变会影响ABCC4的表达,且ABCC4在ADR细胞中含量明显高于敏感株,这说明了CALD1与ABCC4之间存在正向调控关系。我们猜测,CALD1可通过影响ABCC4的表达改变细胞的耐药性。接下来我们结合生信分析,通过qRT-PCR、RT-PCR和WB检测CALD1、ABCC4、EMT相关性分子Ecad、Ncad、Snail、Twist和Slug之间的表达情况,发现CALD1的过表达会导致MCF-7细胞出现上皮型（E-cad）的下调和间质型（Ncad、Snail、Twist和Slug）的上调（EMT）的现象,而降低CALD1基因水平可逆转MCF7/ADR细胞的EMT状态。同时,CALD1基因可影响EMT中的关键转录因子Snail、Twist和Slug的表达;最后利用在线分析网站对这些基因进行相关性的分析。我们推测,MCF-7/ADR细胞中CALD1基因通过引起EMT表型改变,上调EMT诱导的转录因子水平,从而促进ABC耐药蛋白的表达,最终导致乳腺癌MCF-7细胞对阿霉素耐药的过程。结论本研究结果表明,在MCF-7/ADR细胞的耐药形成中,CALD1基因的高表达可能导致了细胞的EMT表型改变,EMT相关转录因子Snail等的表达水平增高可能会增加ABCC4基因的表达,进而使MCF-7/ADR细胞的耐药性增强。我们的发现揭示了CALD1调控乳腺癌耐药的可能分子机制,CALD1具备成为耐药乳腺癌患者的候选治疗靶点。
蔡晓燕[9]（2021）在《MACC1、MRP、LRP与肺腺癌顺铂耐药的相关性研究》文中进行了进一步梳理背景肺腺癌是多发于支气管黏膜上皮或大支气管黏液腺的恶性肿瘤。肺腺癌易发于年龄偏小、无吸烟史的女性中,且临床症状不明显。肺腺癌虽然肿瘤组织生长缓慢,但多在早期就出现多发转移,因此化疗是目前临床治疗肺腺癌的主要方法之一,但大约三分之一的肺腺癌患者化疗后会产生多药耐药,导致化疗失败。多药耐药是肿瘤细胞对多种化疗药物产生的交叉耐药现象。当今国内外多项研究表明,多药耐药相关蛋白（MRP）、肺耐药蛋白（LRP）、结肠癌转移相关基因1（MACC1）与肺腺癌的多药耐药相关。顺铂是临床化学治疗肺腺癌的基本药物,肺腺癌患者对顺铂及顺铂类药物表现出的耐药性,是临床化疗肺腺癌疗效较差的直接原因,因此研发更有效的新型化疗药物已迫在眉睫。目的1.考察肺腺癌组织细胞对顺铂的耐药性。2.探究MACC1、MRP、LRP与肺腺癌顺铂耐药的相关性,为临床采用更为高效的顺铂化疗方案治疗肺腺癌提供实验室参考。方法1.取材及分组:收集手术切除的肺腺癌新鲜标本75例,所有患者进行手术前均未进行放化疗。每份标本均分为2份:1份进行原代细胞的体外培养,以噻唑蓝比色法（MTT法）检测肺腺癌细胞对含顺铂的药敏试验;1份标本处理后以免疫组化法检测腺癌组织细胞中MACC1、MRP、LRP的表达。2.药敏实验:采用MTT法检测肺腺癌细胞对顺铂的总体耐药性,考察不同分化程度、不同TNM分期肺腺癌细胞对顺铂的耐药性。3.MACC1表达与肺腺癌顺铂耐药之间的相关性:采用免疫组织化学实验考察肺腺癌组织细胞MACC1蛋白表达的情况,分析其表达情况与顺铂耐药之间的相关性。4.MRP表达与肺腺癌顺铂耐药之间的相关性:采用免疫组织化学实验考察肺腺癌组织细胞MRP蛋白表达的情况,分析其表达情况与顺铂耐药之间的相关性。5.LRP表达与肺腺癌顺铂耐药之间的相关性:采用免疫组织化学实验考察肺腺癌组织细胞LRP蛋白表达的情况,分析其表达情况与顺铂耐药之间的相关性。6.统计学方法:所有实验数据均带入SPSS17.0统计学软件系统处理。采用t检验进行组间比较,方差分析考察分化程度、TNM分期与肺腺癌对顺铂耐药的相关性,Spearman相关分析考察MACC1、MRP、LRP与肺腺癌对顺铂耐药性的相关性。检验水准α=0.05。结果1.在选取的75例肺腺癌组织中,采用MTT法检测肺腺癌细胞顺铂的耐药性可知:32例（42.67%）对8.0μg.ml-1的顺铂耐药,33例（44.00%）对6.0μg.ml-1的顺铂耐药,31例（41.33%）对4.0μg.ml-1的顺铂耐药,23例（30.67%）对2.0μg.ml-1的顺铂耐药,且对4.0μg.ml-1顺铂的耐药程度高于对2.0μg.ml-1顺铂的耐药程度（P<0.05）,对4.0μg.ml-1和6.0μg.ml-1顺铂的耐药性程度无差异,对6.0μg.ml-1和8.0μg.ml-1顺铂的耐药性程度无差异。肺腺癌细胞对顺铂的耐药性与分化程度和TNM分期无关（P>0.05）。2.MACC1在75例肺腺癌组织中的表达情况为16例（21.33%）-、21例（28.00%）+、27例（36.00%）++、11例（14.67）+++,MACC1的表达与肺腺癌细胞对顺铂的耐药性呈正相关（P<0.05）。3.MRP在75例肺腺癌组织中的表达情况为11例（14.66%）-、23例（30.67%）+、32例（42.67%）++、9例（12.00%）+++,MRP的表达与肺腺癌细胞对顺铂的耐药性呈正相关（P<0.05）。4.LRP在75例肺腺癌组织中的表达情况为0例（0.00%）-、25例（33.33%）+、31例（41.33%）++、19例（25.34%）+++,LRP的表达与肺腺癌细胞对顺铂的耐药性呈正相关（P<0.05）。结论1.肺腺癌存在对顺铂的化疗耐药性。2.MACC1的表达与肺腺癌细胞对顺铂的耐药性呈正相关,参与介导肺腺癌对顺铂的耐药。3.MRP的表达与肺腺癌细胞对顺铂的耐药性呈正相关,参与介导肺腺癌对顺铂的耐药。4.LRP的表达与肺腺癌细胞对顺铂的耐药性呈正相关,参与介导肺腺癌对顺铂的耐药。
陈宣宇[10]（2021）在《ABCC1转运蛋白过表达致桦木醇耐药的机制研究》文中指出桦木醇又称白桦脂醇,一种五环三萜,是传统中药桑白皮的提取物。它具有广泛的生物和药理特性,如抗炎、抗肿瘤、抗病毒和抗菌活性。在这里,我们探讨了可能导致桦木醇产生耐药的因素,特别是与ABCC1转运蛋白的相互作用。ABCC1是ATP结合盒（ABC）转运蛋白家族的重要成员,是导致天然衍生抗癌剂产生多药耐药（MDR）的重要因素。基于MTT的细胞生存能力测定表明,ABCC1过度表达能够使癌细胞系和基因转染耐药细胞系脱敏,并且这种由蛋白酶诱导的耐药性可以在25μM下被ABCC1抑制剂MK571对抗。此外,桦木醇以浓度依赖和时间依赖方式对ABCC1蛋白表达水平进行调节,同时可以阻断ABCC1的传输功能。随后,在分子对接实验中桦木醇的高亲和力得分表明了桦木醇与ABCC1的强烈交互作用。
二、乳腺癌患者MRP基因表达及临床意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、乳腺癌患者MRP基因表达及临床意义（论文提纲范文）
（1）CCL5在头颈鳞状细胞癌中的表达及对喉癌生物学特性影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 配制试剂 |
| 1.4 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 CCL5在头颈鳞状细胞癌中高表达 |
| 2.2 采用siRNA干扰CCL5检测其表达水平 |
| 2.3 siRNA干扰CCL5对TU177、Hep-2细胞系增殖活性的影响 |
| 2.4 siRNA干扰CCL5对TU177、Hep-2细胞系迁移的影响 |
| 2.5 siRNA干扰CCL5对TU177、Hep-2细胞系周期的影响 |
| 2.6 siRNA干扰CCL5对TU177、Hep-2细胞系凋亡的影响 |
| 2.7 siRNA干扰CCL5对MRP2和Bax的mRNA表达水平影响(耐药相关基因) |
| 2.8 siRNA干扰CCL5对MRP2和Bax的蛋白表达水平影响(耐药相关基因) |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 CCL5在恶性肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）RUNX3在人结肠癌HCT-116/5-FU耐药细胞株中的表达及其与耐药的相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 消化道肿瘤耐药机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）GCS参与调控维拉帕米逆转胃癌化疗多药耐药的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中文论文 |
| 英文缩略词表（Abbreviation) |
| 前言 |
| 第一部分 胃癌细胞hMDR1/P-gp表达水平与维拉帕米逆转化疗耐药能力相关性研究 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 主要仪器与耗材 |
| 2.1.4 主要试剂耗材与药物 |
| 2.1.4.1 试剂耗材 |
| 2.1.4.2 药物 |
| 2.1.5 主要试剂配制方法 |
| 2.2. 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 检测方法 |
| 2.2.2.1 RNA提取与RT-PCR |
| 2.2.2.2 实时荧光定量PCR |
| 2.2.2.3 CCK-8法检测胃癌细胞VER逆转抗癌药物耐药能力效率指数(IC_(50)值) |
| 2.2.2.4 Western印迹分析 |
| 3. 统计学分析 |
| 4. 结果 |
| 4.1 维拉帕米对3种胃癌细胞系(SGC-7901、BGC-823和AGS)3种化疗药物(5-Fu、ADM、DDP)逆转耐药能力判定 |
| 4.2 胃癌细胞株中hMDR1/P-gp基因对相对表达水平 |
| 4.3 hMDR1/P-gp表达水平与维拉帕米逆转胃癌细胞化疗耐药能力相关性 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 第二部分 构建胃癌耐药细胞株并验证其耐药效率 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 主要仪器与耗材 |
| 2.1.3 主要试剂耗材与药物 |
| 2.1.3.1 试剂耗材 |
| 2.1.3.2 药物 |
| 2.2. 方法 |
| 2.2.1 建立胃癌5-Fu耐药细胞株SGC-7901/5-Fu |
| 2.2.2 耐药细胞株SGC-7901/5-Fu稳定性测定 |
| 2.2.3 细胞培养 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR |
| 2.2.5 CCK-8法检测胃癌细胞VER逆转抗癌药物耐药能力效率指数(IC_(50)值) |
| 2.2.6 Western印迹分析 |
| 3. 统计学分析 |
| 4. 结果 |
| 4.1 胃癌耐药细胞株SGC-7901/5-Fu稳定性检测药物 |
| 4.2 胃癌耐药细胞株SGC-7901/ADM耐药性检测 |
| 4.3 胃癌耐药细胞株对3种抗癌药物(5-Fu、ADM、DDP)药物敏感性检测 |
| 4.4 胃癌耐药细胞株hMDR1/P-gp的相对表达水平 |
| 4.5 维拉帕米对胃癌耐药细胞株对3种抗癌药物(5-Fu、ADM、DDP)逆转耐药能力判定 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 第三部分 介导维拉帕米逆转胃癌细胞化疗耐药能力差异基因的筛选、确证及机制研究 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 主要仪器与耗材 |
| 2.1.4 主要试剂耗材与药物 |
| 2.1.4.1 试剂耗材 |
| 2.1.4.2 药物 |
| 2.1.4.3 主要抗体 |
| 2.1.4.4 菌株与质粒 |
| 2.2. 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 质粒抽提 |
| 2.2.3 质粒DNA转染 |
| 2.2.4 siRNA转染 |
| 2.2.5 实时荧光定量PCR |
| 2.2.6 Western印迹分析 |
| 2.2.7 Annexin V-FTC/PI双染细胞凋亡检测 |
| 2.2.8 介导维拉帕米逆转胃癌细胞化疗耐药能力差异基因的筛选 |
| 3. 统计学分析 |
| 4. 结果 |
| 4.1 胃癌耐药差异基因的筛选 |
| 4.2 实时荧光定量PCR法检测候选基因在胃癌细胞中的表达 |
| 4.3 Western blot法检测候选蛋白在胃癌细胞中的表达 |
| 4.4 胃癌SGC-7901细胞和SGC-7901/5-Fu细胞GCS基因表达沉默和过表达验证 |
| 4.5 改变GCS基因表达水平,VER逆转ADM化疗耐药能力变化 |
| 4.6 改变GCS基因表达水平,对VER干预后的胃癌细胞凋亡水平影响 |
| 4.7 改变GCS基因表达水平,凋亡信号通路蛋白Bcl-2变化 |
| 4.8 改变GCS基因表达水平,凋亡信号通路蛋白ERK变化 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 第四部分 临床研究P-gp、GCS蛋白在胃癌病例组织样本中的表达 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 胃癌组织标本 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 临床资料分类 |
| 2.3.1 纳入标准 |
| 2.3.2 排除标准 |
| 2.3.3 剔除标准 |
| 2.4 VER联合TACE治疗方式 |
| 2.5 疗效评价 |
| 2.5.1 肿瘤病灶的变化 |
| 2.5.2 临床收益判断 |
| 2.6 免疫组化 |
| 3. 统计学分析 |
| 4. 结果 |
| 4.1 肿瘤原发病灶治疗疗效评价 |
| 4.2 生存期评价 |
| 4.3 免疫组化法检测P-gp蛋白在胃癌临床标本中的表达情况 |
| 4.4 免疫组化法检测GCS蛋白在胃癌临床标本中的表达情况 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 图表索引 |
| 综述 肿瘤多药耐药机制的研究现状及进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表(含待发表)学术论文 |
| 附英文论文 |
| ABSTRACT |
| Abbreviation List (Abbreviation) |
| PREFACE |
| Chapter 1. The correlation between the expression level of P-gp and the reversal ofVER's resistance to chemotherapy in gastric carcinoma cells |
| 1.Introduction |
| 2. Materials and Methods |
| 2.1 material |
| 2.1.1 cell line |
| 2.1.2 primer |
| 2.1.3 Main instruments and consumables |
| 2.1.4 Main reagents, consumables and drugs |
| 2.1.4.1 Reagent consumables |
| 2.1.4.2 Medicine |
| 2.1.5 Preparation method of main reagents |
| 2.2. Method |
| 2.2.1 Cell culture |
| 2.2.2 Test Method |
| 2.2.2.1 RNA extraction and RT-PCR |
| 2.2.2.2 Real time fluorescent quantitative PCR |
| 2.2.2.3 CCK-8 method was used to detect the efficiency index (IC50 value) of VER reversing chemotherapy drug resistance of gastric cancer cells |
| 2.2.2.4 Western blot analysis |
| 3. Statistical analysis |
| 4. Results |
| 4.1 The ability of verapamil to reverse drug resistance of SGC-7901, BGC-823 and AGS cells to 5-FU, ADM and DDP |
| 4.2 Relative expression level of hMDR1/P-gp gene in gastric cancer cell lines |
| 4.3 Relationship between hMDR1/P-gp expression and VER+ADM resistance(Relative IC_(50)) |
| 5. Discuss |
| 6. Conclusion |
| Chapter2 Construct gastric cancer drug-resistant cell line and verify its drug-resistant efficiency |
| 1.Introduction |
| 2. Materials and Methods |
| 2.1 Material |
| 2.1.1 cell line |
| 2.1.2 Main instruments and consumables |
| 2.1.3 Main reagents, consumables and drugs |
| 2.1.3.1 Reagent consumables |
| 2.1.3.2 Medicine |
| 2.2. Method |
| 2.2.1 Establishment of gastric cancer 5-Fu resistant cell line SGC-7901/5-Fu |
| 2.2.2 Stability of drug resistant cell line SGC-7901/5-Fu |
| 2.2.3 Cell culture |
| 2.2.4 Real time fluorescent quantitative PCR |
| 2.2.5 CCK-8 method was used to detect the efficiency index (IC_(50) value) of verapamil reversing chemotherapy drug resistance |
| 2.2.6 Western blot |
| 3. Statistical analysis |
| 4. Results |
| 4.1 Stability of drug resistant gastric cancer cell line SGC-7901/5-Fu |
| 4.2 Detection of drug resistance in gastric cancer cell line SGC-7901/ADM |
| 4.3 Detection of drug sensitivity of gastric cancer cell lines to three chemotherapeutic drugs (5-FIJ, ADM, DDP) |
| 4.4 Relative expression level of drug resistant gastric cancer cell line hMDR1/P-gp |
| 4.5 The ability of verapamil to reverse drug resistance of gastric cancer cell lines SGC-7901/5-Fu and SGC-7901/ADM to three chemotherapeutic drugs (5-FU,ADM and DDP) |
| 5. Discuss |
| 6. Conclusion |
| Chapter3 Screening,confirmation and mechanism study of differential genes mediated by VER in the reversal of chemotherapy resistance of gastric carcinoma cells |
| 1 .Introduction |
| 2. Materials and Methods |
| 2.1 Material |
| 2.1.1 Cell line |
| 2.1.2 Primer |
| 2.1.3 Main instruments and consumables |
| 2.1.4 Main reagents, consumables and drugs |
| 2.1.4.1 Reagent consumables |
| 2.1.4.2 Medicine |
| 2.1.4.3 Major antibodies |
| 2.1.4.4 Strains and plasmids |
| 2.2 Method |
| 2.2.1 Cell culture |
| 2.2.2 Plasmid Extraction |
| 2.2.3 plasmid DNA transfection |
| 2.2.4 siRNA transfection |
| 2.2.5 qRT-PCR |
| 2.2.6 Western blot |
| 2.2.7 Detection of apoptosis by annexin V-FITC / PI double staining |
| 2.2.8 Screening of differentially expressed genes mediated by verapamil in reversing cell chemo resistance gastric cancer |
| 3. Statistical analysis |
| 4. Results |
| 4.1 Screening of drug resistance genes in gastric cancer |
| 4.2 Detection of candidate gene expression in GC ceils by qRT-PCR |
| 4.3 Western blot was used to detect the expression of candidate proteins in gastric cancer cells |
| 4.4 Verification of GCS gene silencing and overexpression in SGC-7901 cells and SGC-7901/5-Fu cells |
| 4.5 Change the expression level of GCS gene and the change in the ability of VER to reverse ADM chemotherapy resistance |
| 4.6 Changing the expression level of GCS gene affected the apoptosis level of gastric cancer cells after VER intervention |
| 4.7 Change the expression of GCS gene and Bcl-2 |
| 4.8 Change the expression of GCS gene and pERK |
| 5. Discuss |
| 6. Conclusion |
| Chapter4 Clinical study on the expression of P-gp and GCS in tissue samples of gastric cancer cases |
| 1. Introduction |
| 2. Materials and Methods |
| 2.1 Tissue samples of gastric cancer |
| 2.2 Main reagents |
| 2.3 classification of clinical data |
| 2.3.1 Inclusion criteria |
| 2.3.2 Exclusion criteria |
| 2.3.3 Exclusion criteria |
| 2.4 VER Combined TACE treatment |
| 2.5 Efficacy evaluation |
| 2.5.1 Changes of tumor focus |
| 2.5.2 Clinical benefit judgment |
| 2.5.2.1 Survival evaluation |
| 2.6 Immunohistochemical |
| 3. Statistical analysis |
| 4. Results |
| 4.1 Evaluation of therapeutic effect of primary tumor |
| 4.2 The PFS and OS |
| 4.3 The expression of P-gp protein in clinical specimens of gastric cancer was detected by immunohistochemistry |
| 4.4 The expression of GCs protein in clinical specimens of gastric cancer was detected by immunohistochemistry |
| 5. Discussion |
| 6. Conclusion |
| Discussion and Outlook |
| Reference |
| Attached The Chart Index |
| REVIEW Research status and progress of multi drug resistance mechanism incancer |
| Reference |
| Acknowledgement |
| Academic papers published (including to be published)during academic degree |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）中药逆转肿瘤多药耐药及侵袭转移作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 前言 |
| 1.1 肿瘤多药耐药的产生及分子机制 |
| 1.1.1 药物转运泵的外排 |
| 1.1.2 酶系统的改变 |
| 1.1.3 细胞周期的改变 |
| 1.1.4 膜脂的改变 |
| 1.1.5 细胞凋亡与自噬的改变 |
| 1.2 中药逆转肿瘤多药耐药的研究 |
| 1.3 肿瘤的侵袭转移 |
| 1.3.1 血管生成对肿瘤转移的作用 |
| 1.3.2 黏附分子在肿瘤转移过程中的作用 |
| 1.3.3 细胞降解机制在肿瘤转移过程中的作用 |
| 1.3.4 肿瘤微环境 |
| 1.4 细胞代谢组学研究 |
| 1.4.1 代谢组学概论 |
| 1.4.2 代谢组学研究流程 |
| 1.4.3 细胞代谢组学在肿瘤研究中的应用 |
| 1.5 本论文的研究思路 |
| 第2章 中药中乳酸脱氢酶抑制剂筛选研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 样品与试剂 |
| 2.2.2 LDH功能化磁纳米粒子的制备 |
| 2.2.3 表征 |
| 2.2.4 固定化LDH的活性测定及固载量计算 |
| 2.2.5 LDH固定化条件的优化 |
| 2.2.6 固定化LDH配体筛选条件优化 |
| 2.2.7 使用固定化LDH从大黄和虎杖提取物中筛选抑制剂 |
| 2.2.8 UPLC-MS/MS条件 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 固定化LDH的表征 |
| 2.3.2 LDH固定化条件优化结果 |
| 2.3.3 固定化LDH配体筛选条件优化结果 |
| 2.3.4 大黄中LDH抑制剂筛选及鉴定 |
| 2.3.5 虎杖中LDH抑制剂筛选及鉴定 |
| 2.4 结论 |
| 第3章 基于MDCK-MDR1细胞的P-gp抑制剂筛选研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 样品与试剂 |
| 3.2.2 细胞培养 |
| 3.2.3 毒性实验 |
| 3.2.4 细胞内Rh-123蓄积实验 |
| 3.2.5 细胞内Rh-123外排实验 |
| 3.2.6 Western Blot实验 |
| 3.2.7 转运实验 |
| 3.2.8 UPLC-MS/MS定量分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 中药提取物/单体化合物的细胞毒性研究 |
| 3.3.2 中药提取物/单体化合物对Rh-123蓄积的影响 |
| 3.3.3 中药提取物/单体化合物对Rh-123外排的影响 |
| 3.3.4 中药提取物/单体化合物对P-gp表达的影响 |
| 3.3.5 中药提取物/单体化合物的转运研究 |
| 3.4 结论 |
| 第4章 芦荟大黄素逆转肿瘤MDR作用机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 样品与试剂 |
| 4.2.2 细胞培养与毒性实验 |
| 4.2.3 细胞内ADR蓄积实验 |
| 4.2.4 Western Blot实验 |
| 4.2.5 实时荧光定量PCR实验 |
| 4.2.6 ADR在细胞内的分布 |
| 4.2.7 细胞内ATP含量的测定 |
| 4.2.8 能量代谢相关通路的定量分析 |
| 4.2.9 细胞周期实验 |
| 4.2.10 细胞内ROS水平的测定 |
| 4.2.11 Caspase-3活性测定 |
| 4.2.12 凋亡实验 |
| 4.2.13 定量与统计分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 AE逆转乳腺癌多药耐药 |
| 4.3.2 AE抑制P-gp的外排功能 |
| 4.3.3 AE对细胞内ADR分布的影响 |
| 4.3.4 AE降低细胞内ATP含量 |
| 4.3.5 AE对能量相关代谢通路的影响 |
| 4.3.6 AE能诱发MCF-7/ADR细胞自噬 |
| 4.3.7 AE对细胞周期的影响 |
| 4.3.8 AE对细胞凋亡的影响 |
| 4.4 结论 |
| 第5章 芦荟大黄素和大黄素抑制肿瘤侵袭转移作用机制研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 样品与试剂 |
| 5.2.2 细胞培养 |
| 5.2.3 细胞毒性实验 |
| 5.2.4 MCF-7细胞与内皮细胞黏附实验 |
| 5.2.5 MCF-7细胞侵袭转移实验 |
| 5.2.6 MMP-2、MMP-9和VEGF活性测定 |
| 5.2.7 软琼脂克隆实验 |
| 5.2.8 代谢组学细胞样品制备 |
| 5.2.9 UPLC-MS条件 |
| 5.2.10 数据处理和分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 MCF-7单独培养与共培养方式的比较 |
| 5.3.2 芦荟大黄素和大黄素的细胞毒性 |
| 5.3.3 芦荟大黄素和大黄素降低内皮细胞对MCF-7细胞的黏附 |
| 5.3.4 芦荟大黄素和大黄素抑制MCF-7细胞的侵袭转移 |
| 5.3.5 芦荟大黄素和大黄素对MCF-7细胞代谢的影响 |
| 5.3.6 生物标志物的定量分析 |
| 5.4 结论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 硕博连读期间发表的学术论文 |
（5）外泌体lncRNAH19调控miR-340-3p诱导乳腺癌紫杉醇耐药的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料和仪器 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A 英文缩略词对照表 |
| 附录B 主要试剂配制方法 |
| 附录C 个人简历 |
| 附录D 攻读学位期间发表文章情况 |
| 附录E 综述 14-3-3ζ 蛋白在乳腺癌发生发展中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
（6）KCNMA1的上调促进维拉帕米逆转食管鳞状细胞癌对顺铂的化学耐药（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表（Abbreviation) |
| 前言 |
| 第一章 KCNMA1的表达在逆转ESCC耐药中的作用 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3.统计学分析 |
| 4.结果 |
| 4.1 VER逆转ESCC细胞对顺铂的化学耐药性 |
| 4.2 高通量转录组测序筛选ESCC细胞中差异表达的基因 |
| 4.3 实时定置PCR法检测候选基因在食管鳞状癌细胞中的表达 |
| 4.4 WB检测ESCC细胞中KCNMA1的蛋白表达 |
| 4.5 KCNMA1影响VER逆转ESCC细胞对顺铂的化学耐药性 |
| 4.6 KCNMA1增强VER对ESCC细胞的抗增殖和促凋亡作用 |
| 5.讨论 |
| 6.结论 |
| 第二章 介导维拉帕米KCNMA1的表达与逆转顺铂耐药移植瘤裸鼠作用研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3.统计学分析 |
| 4.结果 |
| 4.1.建立过表达和沉默KCNMA1 KYSE150细胞模型 |
| 4.2 移植瘤BALB/C-nu裸鼠一般情况观察 |
| 4.3 移植瘤裸鼠肿瘤体积和顺铂对肿瘤抑制率的影响 |
| 4.4 移植瘤裸鼠各组中KCNMA1的表达 |
| 5.讨论 |
| 6.结论 |
| 第三章 临床研究KCNMA1基因在食管鳞状细胞癌患者组织样本中的表达 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 临床样本和试剂 |
| 2.2 临床资料、分组 |
| 2.3 VER联合化疗靶动脉灌注治疗方式及疗效评价标准 |
| 2.4 免疫组化方法及结果分析 |
| 3.统计学分析 |
| 4.结果 |
| 4.1 两组食管鳞状细胞癌患者治疗前后典型病例展示 |
| 4.2 免疫组织化学法检测患者组织样本中KCNMA1的蛋白表达 |
| 5.讨论 |
| 6.结论 |
| 参考文献 |
| 综述 肿瘤MDR的发病机制以及MDR抑制剂或调节剂药物研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表(含待发表)学术论文 |
| 附英文论文1 (已发表) |
| 附英文论文2 (未发表) |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（7）第一部分：内质网伴侣分子TMTC3通过内质网应激调控食管鳞癌EMT的分子机制研究 第二部分：ABC转运蛋白超家族成员ABC-X在食管鳞癌化疗耐药中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词 |
| 第一部分 内质网伴侣分子TMTC3通过内质网应激调控食管鳞癌EMT的分子机制研究 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 1. 细胞培养 |
| 2. 食管鳞癌组织标本来源 |
| 3. 质粒构建及菌种保存 |
| 4. 主要试剂 |
| 5. 主要仪器 |
| 6. 引物设计与合成 |
| 7. siRNA序列合成 |
| 8. 溶液配制 |
| 二、实验方法 |
| 1. 细胞培养 |
| 2. 细胞瞬时转染 |
| 3. 稳转细胞系的筛选 |
| 4. 细胞增殖实验 |
| 5. 细胞侵袭迁移实验 |
| 6. 细胞总蛋白提取、浓度测定及Western Blot |
| 7. 细胞总RNA提取、浓度测定、逆转录及qPCR |
| 8. 质粒转化及超量无内毒素质粒大提 |
| 9. 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 10. 裸鼠尾静脉注射实验 |
| 11. 免疫组化实验 |
| 12. 免疫荧光实验 |
| 13. 免疫共沉淀 |
| 14. 核浆分提 |
| 15. 染色质免疫共沉淀(按照说明书操作) |
| 16. 双荧光素酶报告基因实验 |
| 17. 统计分析 |
| 实验结果 |
| 1. 内质网应激诱导TMTC3的表达 |
| 2. TMTC3在食管鳞癌中异常高表达 |
| 3. TMTC3在食管鳞癌组织中高表达,且与临床预后相关 |
| 4. 敲降TMTC3抑制食管鳞癌细胞的侵袭迁移和生长 |
| 5. TMTC3干扰GRP78与PERK之间的相互作用 |
| 6. 敲降TMTC3减少ATF4的核定位 |
| 7. 转录组测序分析 |
| 8. TMTC3通过FAM3C影响食管鳞癌的EMT过程 |
| 9. ATF4增强FAM3C的转录活性 |
| 10. TMTC3受鳞癌特异性转录因子ΔNp63调控 |
| 11. 敲降TMTC3抑制食管鳞癌细胞的裸鼠体内转移及皮下成瘤 |
| 12. TMTC3发挥功能的模式图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 展望 |
| 第二部分 ABC转运蛋白超家族成员ABC-X在食管鳞癌化疗耐药中的作用机制研究 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 1. 细胞培养 |
| 2. 质粒及慢病毒 |
| 3. 食管鳞癌组织标本来源 |
| 4. 主要试剂 |
| 5. 主要仪器 |
| 6. 引物设计与合成 |
| 7. siRNA序列合成 |
| 8. 溶液配制 |
| 二、实验方法 |
| 1. ChIP实验 |
| 2. 双荧光素酶报告基因实验 |
| 3. 免疫组化 |
| 4. 免疫荧光 |
| 5. 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 6. Annexin V-FITC/PI凋亡检测(按照说明书) |
| 7. 顺铂敏感性检测 |
| 8. TUNEL细胞凋亡检测 |
| 9. ELISA实验 |
| 10. 小分子化合物筛选 |
| 11. IC50值计算 |
| 12. 全质谱分析 |
| 13. 统计分析 |
| 实验结果 |
| 1. 筛选具有鳞癌特异性表达的ABC转运蛋白 |
| 2. ABC-X具有鳞癌表达特异性 |
| 3. ABC-X在食管鳞癌组织中高表达 |
| 4. ABC-X受鳞癌特异性转录因子TP63/SOX2调控 |
| 5. 敲降ABC-X抑制了食管鳞癌细胞的增殖及裸鼠皮下成瘤能力,不影响侵袭迁移过程 |
| 6. 敲降ABC-X增强食管鳞癌细胞对顺铂的敏感性 |
| 7. ABC-X具有溶酶体定位,与囊泡运输相关 |
| 8. 靶向ABC-X的小分子化合物筛选 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 在读期间已发表或待发表文章 |
| 文献综述 ABC转运蛋白超家族参与肿瘤细胞多药耐药过程的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）CALD1在MCF-7/ADR细胞阿霉素耐药中的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一章 基于生物信息学分析筛选CALD1基因 |
| 引言 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 GEO数据库筛选差异表达的耐药相关基因 |
| 1.2.2 DEGs的表达水平对Bca患者的临床生存期和预后的影响 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 GEO数据库筛选与阿霉素耐药相关的差异表达m RNA |
| 1.3.2 耐药相关基因ABC家族展示 |
| 1.3.3 Kaplan-Meier分析差异基因对BCa患者的临床生存期和预后的影响 |
| 1.3.4 钙调蛋白结合蛋白(caldesmon,CALD1)高表达与耐药Bca患者的临床预后不良相关 |
| 1.4 本章小结 |
| 第二章 CALD1在MCF-7、MCF-7/ADR细胞中的表达及功能的研究 |
| 引言 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 实验材料的合成 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 观察MCF-7、MCF-7/ADR细胞形态和检测细胞增殖情况 |
| 2.2.2 检测MCF-7、MCF-7/ADR细胞中CALD1基因的表达情况及阿霉素敏感性 |
| 2.2.3 构建CALD1过表达和RNAi干扰的细胞模型及细胞形态学观察 |
| 2.2.4 检测CALD1基因在稳定转染的细胞中的表达情况 |
| 2.2.5 检测CALD1基因在稳定转染的细胞中的相关表型 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 MCF-7、MCF-7/ADR细胞形态和细胞增殖情况 |
| 2.3.2 MCF-7、MCF-7/ADR细胞中CALD1基因的表达情况 |
| 2.3.3 过表达CALD1和sh RNA干扰CALD1质粒构建 |
| 2.3.4 CALD1过表达和干扰细胞模型的细胞形态学观察 |
| 2.3.5 检测转染后细胞中CALD1基因的表达情况 |
| 2.3.6 检测不同处理组细胞的耐药性及细胞周期情况 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 CALD1通过改变细胞耐药性影响机制的探讨 |
| 引言 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞系 |
| 3.1.2 实验材料的合成 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 CALD1与7种显着性差异表达的ABC转运蛋白之间的关系 |
| 3.2.2 CALD1与EMT相关标志分子的表达相关性情况 |
| 3.2.3 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 CALD1与7种ABC转运蛋白的基因表达 |
| 3.3.2 CALD1与EMT相关标志分子的表达具有显着相关性 |
| 3.3.3 ABCC4与CALD1、EMT相关标志分子的表达具有显着相关性 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 讨论与总结 |
| 4.1 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录一 英文缩略词表 |
| 附录二 质粒图谱 |
| 附录三 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（9）MACC1、MRP、LRP与肺腺癌顺铂耐药的相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述:MACC1、MRP、LRP的相关研究 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）ABCC1转运蛋白过表达致桦木醇耐药的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 ABC转运蛋白底物中的天然来源抗癌剂综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、乳腺癌患者MRP基因表达及临床意义（论文参考文献）
- [1]CCL5在头颈鳞状细胞癌中的表达及对喉癌生物学特性影响研究[D]. 牛丽. 山西医科大学, 2021
- [2]RUNX3在人结肠癌HCT-116/5-FU耐药细胞株中的表达及其与耐药的相关性研究[D]. 范爽. 河北北方学院, 2021(01)
- [3]GCS参与调控维拉帕米逆转胃癌化疗多药耐药的作用研究[D]. 王旭. 山东大学, 2021(10)
- [4]中药逆转肿瘤多药耐药及侵袭转移作用机制研究[D]. 程国荣. 中国科学技术大学, 2021(09)
- [5]外泌体lncRNAH19调控miR-340-3p诱导乳腺癌紫杉醇耐药的研究[D]. 董正远. 蚌埠医学院, 2021(01)
- [6]KCNMA1的上调促进维拉帕米逆转食管鳞状细胞癌对顺铂的化学耐药[D]. 葛宁. 山东大学, 2021(11)
- [7]第一部分：内质网伴侣分子TMTC3通过内质网应激调控食管鳞癌EMT的分子机制研究 第二部分：ABC转运蛋白超家族成员ABC-X在食管鳞癌化疗耐药中的作用机制研究[D]. 袁红玉. 北京协和医学院, 2021
- [8]CALD1在MCF-7/ADR细胞阿霉素耐药中的机制研究[D]. 陈颖. 广东药科大学, 2021(02)
- [9]MACC1、MRP、LRP与肺腺癌顺铂耐药的相关性研究[D]. 蔡晓燕. 新乡医学院, 2021(01)
- [10]ABCC1转运蛋白过表达致桦木醇耐药的机制研究[D]. 陈宣宇. 河北医科大学, 2021(02)