一、丁酸钠抑制人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤生长的研究（论文文献综述）
谢秋波[1]（2020）在《LSD1上调LEF1促进上皮间质转化及膀胱癌进展》文中研究指明研究背景:表观遗传调控的异常在肿瘤细胞的发生和进展中有着重要作用。上皮间质转化（EMT）是包括膀胱癌在内的众多肿瘤进展的原因之一。表观遗传调控EMT介导的膀胱癌进展的详细机制目前尚未完全明了。研究发现,组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶LSD1,在多种肿瘤中促进EMT进展进而影响肿瘤细胞的增殖,转移和耐药。我们此前的研究发现,LSD1的高表达和膀胱癌的分级相关。本研究中,我们探讨了LSD1在膀胱癌上皮间质中的作用及机制。研究材料和方法:1.细胞模型:（1）采用不同膀胱癌细胞系T24、BIU87等,以及正常膀胱上皮细胞系SV-HUC-1细胞,分别敲低LSD1及过表达LSD1后检测其增殖、侵袭、迁移和成瘤能力。（2）采用膀胱癌细胞系T24,敲低LSD1后送RNA-seq,分析其测序结果。2.病人标本:收集本院膀胱尿路上皮癌病人组织标本,制作组织芯片,收集随访信息,用免疫组化检测LSD1及上皮间质转化相关标记物的表达并比较其对预后的影响;收集本院膀胱尿路上皮癌病人膀胱癌组织标本及对应的正常膀胱上皮组织,提取蛋白,WB检测其LSD1的表达水平;分别收集本院膀胱尿路上皮癌病人在膀胱灌注前后及新辅助化疗前后的膀胱癌组织标本,免疫组化检测LSD1及上皮间质转化相关标记物的表达。3.动物模型:（1）采用Balb/c裸鼠,接种T24细胞后建立裸鼠皮下移植瘤模型,观察并检测LSD1对其成瘤情况的影响。（2）采用Balb/c裸鼠,尾静脉注射T24细胞后建立裸鼠尾静脉注射肺转移模型,观察并检测LSD1对其转移情况的影响。（3）分别采用严重免疫缺陷的NPG/Vst小鼠接种T24细胞后建立裸鼠皮下移植瘤模型及分组,一组用LSD1特异性抑制剂GSK2879552处理,一组不使用抑制剂,观察并检测其成瘤的变化情况。（4）采用严重免疫缺陷的NPG/Vst小鼠,接种人源膀胱癌组织建立异种移植模型（Patient-Derived tumor Xenograft,PDX）成瘤后,分组,一组用LSD1特异性抑制剂GSK2879552处理,一组不使用抑制剂,观察并检测其成瘤的变化情况。4.实验方法:本研究采用了蛋白印迹（Western blot,WB）,免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）,Transwell实验,划痕实验（Wound healing）,克隆形成（Colony forming）,免疫荧光（Immunofluorescence）,细胞周期（Cell cycle）,免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）,染色质免疫共沉淀（Chromatin-immunoprecipitation,Ch IP）等方法。研究结果:在该研究中,我们首先分析了GEO数据库及本中心根治性膀胱癌组织芯片免疫组化检测及随访生存数据,结果发现:LSD1在膀胱癌标本中表达升高,在化疗后的膀胱癌标本中升高尤为明显,LSD1的高表达与膀胱癌的分级,转移状态和预后高度相关。体外实验发现,敲低LSD1抑制T24、BIU87膀胱癌细胞增殖、阻滞细胞周期由G1期进入S期,降低膀胱癌的迁移和侵袭能力;体内实验进一步证明,敲低LSD1抑制裸鼠皮下成瘤模型及裸鼠尾静脉注射肺转移模型膀胱癌的增殖和转移。体内及体外实验进一步证明,LSD1特异性抑制剂GSK2879552可以显着抑制膀胱癌细胞的增殖和肿瘤进展。分子技术研究发现,敲低LSD1下调膀胱癌细胞间质标记物N-cadherin、Vimentin、Twist的表达,上调上皮标记物E-cadherin的表达。进一步的研究发现,LSD1与β-catenin形成复合物结合促进LEF1转录调节、膀胱癌细胞EMT及肿瘤进展。研究结论我们的研究发现,LSD1的表达和膀胱癌的分级、转移和不良预后相关。敲低或抑制LSD1可以抑制膀胱癌细胞的增殖和上皮间质转化。我们还探讨了LSD1对膀胱癌进展的促进作用及其可能机制——通过与β-catenin形成复合体结合在LEF1启动子区上调LEF1的表达,进而促进EMT及膀胱癌进展。此外,LSD1特异性抑制剂GSK2879552能抑制膀胱癌细胞的增殖和肿瘤进展。总之,我们的结果提示LSD1既可以作为判断膀胱癌预后生物标记物也可以作为治疗膀胱癌的靶点。
王凤杰[2]（2020）在《基于MAPK通路调控GRASP65探讨二氢杨梅素抗卵巢癌的作用及机制研究》文中指出目的:1.检测高尔基体堆叠蛋白65（GRASP65）在卵巢浆液性和粘液性肿瘤组织中的表达水平,探讨GRASP65蛋白表达与临床病理指标之间的关系。2.探讨二氢杨梅素（DHM）对卵巢癌SKOV3和A2780细胞的侵袭及迁移能力、细胞凋亡、细胞自噬及超微结构等方面的影响,明确DHM通过JNK和ERK通路调控GRASP65发挥抗卵巢癌作用的机制。3.探讨DHM干预处理对卵巢癌裸鼠的体内移植瘤生长的抑制作用及机制。方法:1.收集湖北民族大学附属民大医院收治确诊后进行手术切除、经病理诊断为卵巢肿瘤的患者118例,取患者术后肿瘤组织的石蜡标本,及6例卵巢浆液性癌患者术后的新鲜癌组织及癌旁组织为研究对象,采用免疫组织化学染色（IHC）和蛋白免疫印迹技术（Western blot,WB）检测GRASP65蛋白在组织细胞内的阳性定位及表达水平,并分析GRASP65表达与肿瘤患者的临床病理各指标之间的关系。2.不同浓度的DHM分别处理卵巢癌SKOV3和A2780细胞至既定时间后,采用CCK8法检测各组细胞的活力;划痕（Wound healing）实验和Transwell分析癌细胞迁移及侵袭能力的变化;流式细胞术（FCM）分析各组细胞的凋亡率;免疫荧光染色（IF）检测DHM处理后各组细胞内GRASP65蛋白和促凋亡蛋白Caspase-3的定位表达情况;WB检测促凋亡蛋白Bax、Caspase-3及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平,及MAPK通路蛋白的表达;采用si RNA转染下调GRASP65的表达,及GRASP65过表达质粒上调其表达,再分别用DHM干预处理,检测细胞活力、迁移能力及凋亡的改变;JNK和ERK通路抑制剂分别预处理后,再用DHM干预,WB检测细胞内p-JNK/ERK、JNK/ERK蛋白、GRASP65蛋白及Caspase-3的表达水平;透射电子显微镜（TEM）观察DHM处理后细胞内高尔基体等的结构改变及自噬水平的变化。3.构建SKOV3和A2780两种裸鼠皮下移植瘤的模型,分别用DHM混悬液及生理盐水对照进行腹腔注射来干预处理,检测裸鼠皮下瘤的体积大小、肿瘤重量、及裸鼠肝肾功能等指标;并取瘤组织,采用IHC和WB检测分析促凋亡蛋白Caspase-3及自噬相关蛋白LC3的表达,及检测GRASP65蛋白的表达水平;TEM观察DHM处理对瘤组织细胞内的高尔基体结构及自噬体的影响。结果:1.118例卵巢肿瘤患者中包括良性肿瘤82例、交界性肿瘤14例、及恶性肿瘤22例;从组织学的类型来分,浆液来源的肿瘤65例、粘液来源的48例、及特殊类型的5例。石蜡组织标本的IHC结果显示GRASP65表达呈棕黄或棕褐色、细颗粒样,分散于胞浆内。统计分析结果显示,与良性肿瘤组织相比,GRASP65蛋白在卵巢交界性、恶性肿瘤中高表达（χ2=12.57,P<0.01）;且在粘液性瘤内的表达高于浆液性瘤（χ2=5.23,P<0.05）。六例卵巢浆液性癌患者手术后切除的新鲜组织标本中,WB检测同一个体来源的癌及癌旁组织中GRASP65表达的情况,结果显示与癌旁组织相比,癌组织内GRASP65蛋白的表达明显增加（P<0.01）。上述结果表明GRASP65表达的异常可能与卵巢肿瘤的性质及组织学类型有关。2.DHM（0,10,20,40,80,120,160,240,320μM）处理两种卵巢癌细胞（SKOV3和A2780）,发现DHM处理可降低癌细胞的活力、抑制细胞迁移和侵袭的能力、及诱导细胞凋亡,且有一定的剂量性关系。根据计算所得DHM对SKOV3和A2780细胞的IC50值,后续实验中选择干预两种细胞48h时,DHM作用浓度分别为120μM和80μM。3.DHM分别处理SKOV3和A2780细胞后,检测其对细胞内GRASP65蛋白水平的影响,WB结果显示DHM可降低两种细胞内GRASP65的表达（P<0.05及0.01）;IF结果显示DHM处理后细胞内GRASP65的荧光染色强度减弱、且分散,形态上与高尔基体碎裂相似。Caspase-3特异性抑制剂预处理细胞30min后,再用DHM干预,WB分析结果显示在两种癌细胞中,与单独DHM处理相比,预处理后均可降低DHM诱导的Caspase-3的活化（P<0.01）,伴GRASP65表达水平增加（P<0.05及0.01）;FCM结果亦显示,与单独DHM处理相比,Caspase-3抑制剂预处理可降低细胞凋亡率（P<0.01）,表明DHM可能通过激活Caspase-3、进而引起GRASP65蛋白的裂解和下调,且Caspase-3的活化对DHM引起的GRASP65下调有重要作用。4.si RNA转染下调A2780细胞内GRASP65的表达,发现癌细胞的活力下降、迁移能力降低、及细胞凋亡率增加。WB及FCM结果显示,与单独DHM处理相比,DHM与si GRASP65转染共处理对细胞活力和迁移能力的抑制、及细胞凋亡的诱导均有相加作用。相反的是,过表达GRASP65质粒转染与DHM共处理可减弱DHM对细胞活力和迁移能力的抑制、及细胞凋亡的诱导作用。5.40,80及120μM DHM处理A2780细胞可呈剂量依赖性增加p-JNK和p-ERK的水平（P<0.05及0.01）,而对p-p38水平无明显影响（P>0.05）,提示ERK和JNK信号通路可能参与了DHM的抗卵巢癌作用。与空白对照组相比,si GRASP65组内p-JNK和p-ERK水平无显着性变化;而且DHM组与DHM+si GRASP65共处理组之间的p-JNK和p-ERK水平亦无明显差异,表明下调GRASP65表达对各组细胞内的p-JNK和p-ERK水平没有明显影响。采用JNK和ERK通路的抑制剂SP600125和U0126,分别预处理A2780细胞2 h后,再用DHM干预,WB结果发现与单独DHM处理组相比,两种抑制剂与DHM共处理均可抑制DHM诱导的Caspase-3的激活（P<0.05）,伴GRASP65水平的增加（P均<0.01）,及p-JNK和p-ERK水平的下降（P均<0.01）。上述结果表明DHM处理可能通过JNK和ERK通路激活Caspase-3,进而下调GRASP65的水平,来促进卵巢癌细胞凋亡,而且GRASP65可能处在DHM诱导JNK和ERK通路活化的下游。6.TEM观察DHM处理A2780后细胞内高尔基体等形态结构的变化,发现DHM处理组、si GRASP65组、及共处理组的细胞内均可见到高尔基体水肿、碎裂样改变,另有较多自噬体形成,表明DHM处理可能通过下调GRASP65引起高尔基体碎裂、诱导细胞凋亡,同时提高了癌细胞内的自噬水平。7.SKOV3和A2780细胞分别种植至裸鼠皮下,构建卵巢癌移植瘤的模型,再用DHM混悬液腹腔注射处理,分别设立生理盐水为对照组,结果发现DHM处理对各组裸鼠肝肾功能无明显影响。与对照组相比,DHM处理可抑制两种模型鼠体内肿瘤的生长（P均<0.01）;IHC及WB分析结果显示DHM处理后可下调瘤组织内的GRASP65表达水平（P均<0.05）、上调促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3的水平及自噬相关蛋白LC3II的水平（P均<0.05）;TEM结果发现DHM处理裸鼠后,瘤组织内可见高尔基体肿胀及自噬体数量明显增多,伴有内质网明显水肿、扩张等现象。结论:1.GRASP65蛋白在卵巢交界性、恶性肿瘤组织中表达增加,且GRASP65的高表达与卵巢肿瘤的性质及组织学类型有关。2.DHM通过激活JNK和ERK通路下调GRASP65表达,引起卵巢癌细胞内的高尔基体水肿、碎裂改变及细胞凋亡,从而发挥抗卵巢癌作用。
陈亚歌[3]（2020）在《核蛋白PCNP对人甲状腺癌细胞生长的调节作用研究》文中提出背景甲状腺具有重要的人体内分泌功能。甲状腺癌属于内分泌腺肿瘤,其发病机制大部分与以下原因有关,例如地理、化学物质和内分泌等经过综合临床治疗包括手术切除、内分泌治疗和放射性核素治疗,分化良好甲状腺乳头状癌和滤泡状癌可以获得较好的预后,但是分化不良的甲状腺癌例如甲状腺髓样癌和未分化癌等,对现有的临床治疗方法反应欠佳,预后仍然很差。恶性肿瘤最显着的生物特征是转移和侵袭,这对病理学家、外科医师和肿瘤学家们有了更高的要求。因此本课题用人甲状腺癌乳头状细胞系TPC-1和未分化癌细胞系ARO对人甲状腺癌细胞生长的调节作用进行研究。PCNP（PEST-containing nuclear protein）是一种能够泛素化的蛋白连接酶,是位于细胞核内并有 PEST 序列（proline（P）,glutamic acid（E）,serine（S）,and threo nine（T））蛋白,PCNP可以调控以下生命活动,例如细胞增殖、分化、细胞周期和信号传递等。PCNP最早由日本研究发现,PCNP作为泛素连接酶NIRF（Np95/ICBP90-like RING finger protein）的底物和其共同形成一条新的信号转导途径。PCNP普遍存在于多种组织内,我们通过对大数据分析发现,PCNP在大多数正常组织中呈现高表达的蛋白水平,然而,PCNP蛋白在相应肿瘤组织中的表达水平显着降低。而在肝和皮肤组织中PCNP表达较少,但PCNP蛋白表达却在卵巢癌、甲状腺癌和皮肤癌中相对提高。因而我们猜测PCNP可能与甲状腺癌的产生有关,为探究PCNP在甲状腺癌发生发展中的作用,本课题研讨了 PCNP在人甲状腺癌中的表达及其对人甲状腺癌细胞生长调节作用的研究。目的研究核蛋白PCNP对人甲状腺癌细胞生长的调节作用。方法通过构建质粒、转染、细胞传代、RT-PCR、qPCR、Western blot、EDU、MTS、提蛋白、提RNA、划痕、Transwell、软琼脂集落形成、Invasion、TUNEL染色、平板克隆、裸鼠成瘤和小鼠鉴定等实验方法从细胞模型,动物模型和分子机制三个方面探讨PCNP对甲状腺癌细胞凋亡、增殖、迁移和侵袭的影响。如果PCNP真的能减弱癌细胞的生长能力,那它适用于癌症治疗是很重要的。结果1.免疫组化和蛋白免疫印迹结果显示PCNP在癌组织中的表达量比癌旁组织高;2.成功构建人甲状腺癌细胞PCNP过表达及敲低稳定转染细胞;3.MTS、EDU和平板克隆实验显示PCNP过表达组细胞增殖比敲低组慢;4.迁移法和划痕法得出PCNP过表达组降低人甲状腺癌细胞转移能力,敲低组增加细胞转移能力。5.侵袭和软琼脂实验表明,PCNP过表达组细胞侵袭能力降低,而敲低组增加细胞侵袭能力。6.Tunel凋亡染色法结果显示PCNP过表达能够加快人甲状腺癌细胞凋亡,敲低加快人甲状腺癌细胞增殖;7.蛋白免疫印迹检测MAPK和Wnt/β-Catenin信号通路相关分子蛋白表达情况,结果显示PCNP过表达组Cleaved PARP、Cleaved Caspase 3蛋白量增加,并且磷酸化的Erk、JNK和P38蛋白量同样增加,Wnt3a蛋白量减少,p-GSK-3β和p-β-catenin蛋白量减少;而PCNP敲低后Erk、J-NK和P38磷酸化水平表达减少,GSK-3β和β-catenin磷酸化水平表达增多,因此PCNP核蛋白调控人甲状腺癌细胞凋亡可能通过MAPK和Wnt/β-Catenin信号转导通路;8.蛋白免疫印迹检测周期蛋白表达情况,发现PCNP过表达组cyclinE,cyclinD1,Cdk2和Cdk4均表达减少,Cip/p21和Kip/p27表达增多,而PCNP敲低组相反。9.裸鼠成瘤实验,发现PCNP高表达组肿瘤体重和体积低于对照组,KI67和CD31和Beclin-1阳性率小于对照组,Cleaved caspase 3和P21的染色结果则呈现相反的变化趋势。结论核蛋白PCNP抑制人甲状腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡且可能通过MAPK和Wnt/β-C atenin通路调控细胞凋亡,从而抑制人体甲状腺癌的发展。
朱丽娟[4]（2020）在《基于代谢组学及自噬和凋亡调控途径研究蛇葡萄素抑制结直肠癌生长的作用机制》文中指出目的:结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是全球最常见的癌症之一,其在癌症中发病率和死亡率均位于前列,严重威胁着全人类的生命健康。目前对于结直肠癌的治疗以外科手术切除为主,辅助放、化疗等综合治疗措施,但随之产生的抗免疫、骨髓抑制、脏器受损、肿瘤细胞耐药等副作用,严重制约了放化疗的效果。天然药物具有复杂的成分、多重的作用靶点,对于肿瘤发展的多个环节会产生影响,同时其毒性较低,不容易产生肿瘤耐药,已成为结直肠癌辅助治疗方案重要的组成部分。蛇葡萄素（Ampelopsin,AMP）是从植物蛇葡萄根皮及叶中提取出的一种小分子黄酮类化合物,对多种肿瘤细胞具有细胞毒作用,而且能够诱导肿瘤细胞凋亡。近年研究发现自噬在肿瘤的治疗中也是非常重要的靶点,其与凋亡之间的关系对肿瘤的进程及治疗具有重要的影响,但是,蛇葡萄素对肿瘤细胞自噬和凋亡的调控尚不明确。因此,本研究以多种人结直肠癌细胞系作为研究对象,一方面基于色谱—质谱联用的代谢组学技术平台对蛇葡萄素干预人结直肠癌细胞移植瘤裸鼠肿瘤组织代谢谱进行分析,筛选出与其抑制结直肠癌生长相关的差异性代谢物,并对其代谢通路进行分析,有助于从代谢层面上阐述蛇葡萄素抑制结直肠癌生长的作用机理。另一方面从细胞水平、组织水平及分子水平,探讨蛇葡萄素对人结直肠癌细胞凋亡和自噬的调节以及相关的分子机制,为结直肠癌的治疗提供新的线索和途径,为蛇葡萄素抗肿瘤作用的进一步研究和开发利用提供理论参考。方法:（1）用不同浓度的AMP（6.25、12.5、25、50和100μg/ml）分别作用于人结直肠癌HCT-116、SW480、SW620、LOVO、Colo 205、LS174T细胞48、72及96 h,MTT法检测不同浓度的AMP对这些细胞增殖抑制率的影响。用50、100μg/ml的AMP作用于人结肠癌HCT-116、SW480细胞,克隆形成实验观察AMP对细胞克隆形成率的影响。用50μg/ml的AMP作用于人结肠癌HCT-116、SW480细胞24 h,细胞创伤愈合实验观察AMP对细胞迁移能力的影响。（2）利用人结肠癌HCT-116细胞裸鼠皮下移植瘤模型,观察AMP体内抗结直肠癌活性,组织切片HE染色观察AMP对动物主要脏器是否有毒性作用。（3）用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用（UPLC-TOFMS）非靶标代谢组学技术,研究人结肠癌HCT-116细胞皮下移植瘤模型小鼠和AMP处理组小鼠瘤块组织样本,初步筛选与AMP抑制结直肠癌生长有关的差异代谢物,并通过KEGG通路富集分析其相关代谢通路。（4）用50、100μg/ml的AMP作用于人结肠癌HCT-116、SW480细胞,流式细胞分析仪观察AMP对细胞周期和凋亡的影响,倒置显微镜下观察细胞形态。吖啶橙（Acridine orange,AO）染色后,荧光显微镜下观察AMP对细胞中发出红色荧光的酸性自噬囊泡的影响。并用电镜观察AMP对人结肠癌HCT-116细胞自噬的影响。免疫印迹法（Western-blotting）分析25、50、100μg/ml的AMP对细胞及移植瘤模型裸鼠瘤块组织中凋亡相关蛋白BCl-2、Bax、Cleaved-Caspase-3及自噬相关蛋白LC3、Beclin-1、Atg5表达的影响。（5）分别加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）和自噬促进剂雷帕霉素（Rapamycin,RAPA）作用于人结肠癌HCT-116、SW480细胞,MTT法检测自噬抑制剂和促进剂与AMP合用后对细胞增殖抑制率的影响,流式细胞术观察细胞凋亡率的变化,荧光显微镜下观察自噬抑制剂和自噬促进剂与AMP合用后细胞中酸性自噬囊泡的红色荧光比例。Western-blotting分析细胞中抗凋亡蛋白BCl-2和促凋亡蛋白Bax的比率,以及Cleaved-Caspase-3的表达,同时分析细胞中自噬标志物LC3、自噬相关蛋白Beclin-1、Atg5表达的变化。（6）Western-blotting分析AMP对人结肠癌HCT-116、SW480细胞及移植瘤模型裸鼠瘤块组织中PI3K,p-mTOR、Total-mTOR,p-Akt,Total-Akt及p-P70S6K、Total-P70S6K蛋白表达的影响。结果:（1）体外抗肿瘤实验表明,AMP对受试的六种结直肠癌细胞均有显着的抑制作用,且具有浓度依赖性。在48、72、96 h作用点,AMP对人结肠癌HCT-116、SW480及Colo 205细胞增殖的抑制作用具有时间依赖性,对人结肠癌SW620、Lovo及LS174T细胞而言,作用72 h时,增殖抑制作用最强,此后,随时间延长抑制作用逐渐降低。克隆形成实验和细胞创伤愈合实验表明,AMP能够抑制人结肠癌HCT-116、SW480细胞的克隆形成能力,抑制细胞迁移。（2）体内抗肿瘤实验表明,200 mg/kg的AMP能够明显抑制人结肠癌HCT-116细胞裸鼠移植瘤的生长,具有良好的体内抗结直肠癌活性。对动物的肝脏、肾脏、心脏、脾脏、肺脏指数均无明显影响,组织切片HE染色结果显示,动物重要脏器组织无明显异常。（3）基于超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用（UPLC-TOFMS）非靶标代谢组学技术平台,对人结肠癌HCT-116细胞皮下移植瘤模型小鼠和AMP处理组小鼠瘤组织代谢谱进行了检测,筛选差异性代谢产物,涉及三羧酸循环、氨基酸代谢、核苷酸代谢、氨基酰tRNA的生物合成等通路。（4）流式细胞仪分析结果显示,AMP能够将人结肠癌HCT-116、SW480细胞阻滞于G1期,干扰细胞的有丝分裂,使细胞生长停滞。同时,细胞凋亡率明显增加。AO染色后,荧光显微镜下可见细胞内红色荧光比例明显增加,电镜下可见细胞胞浆中出现了双层或者单层膜包绕着线粒体等细胞器的自噬小体和自噬溶酶体。Western-blotting分析结果显示,AMP作用后,细胞和瘤块组织中BCl-2/Bax比率下调,Caspase-3剪切活性片段Cleaved-Caspase-3的表达上调,同时LC3-Ⅱ、Beclin-1及Atg5蛋白的表达均显着增加。（5）AMP与自噬抑制剂3-MA合用后,细胞增殖加快,与自噬促进剂RAPA合用后,细胞增殖减慢。细胞AO染色后荧光显微镜下可见,AMP与自噬抑制剂3-MA合用后,细胞内呈红色荧光的酸性自噬泡的比例减少,而与自噬诱导剂RAPA合用后,细胞内呈红色荧光的酸性自噬泡比例显着增加。Western-blotting分析显示,3-MA与AMP合用,可以使自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1及Atg5的表达降低,而RAPA与AMP合用后,这些蛋白的表达均明显增加。流式细胞术Annexin-PI双染结果显示,3-MA单独应用时,细胞凋亡率没有太大的变化,当其与AMP合用后,凋亡率明显低于AMP处理组。RAPA与AMP合用后,细胞凋亡率明显增加,高于AMP处理组。Western-blotting分析结果显示,3-MA与AMP合用后,凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax的比例没有显着变化,但Cleaved-Caspase-3的表达显着低于AMP处理组,RAPA与AMP合用后,细胞凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax的比例明显降低,Cleaved-Caspase-3的表达显着上调。（6）25、50、100μg/ml AMP作用于人结肠癌HCT-116、SW480细胞以及HCT-116细胞移植瘤裸鼠模型后,细胞及瘤块组织中的PI3K、p-Akt、p-mTOR和p-P70S6K的表达均呈降低的趋势。结论:（1）AMP具有显着的体外抗结直肠癌活性,能够抑制人结肠癌HCT-116、SW480细胞的克隆形成及迁移能力。（2）AMP具有显着的体内抗结直肠癌活性,且对动物的主要脏器无明显毒性。（3）AMP主要影响结直肠癌组织异常的能量代谢,特别是氨基酸代谢。（4）AMP能够形成结肠癌细胞G1期阻滞,诱导细胞凋亡和自噬。（5）自噬能够促进AMP诱导的细胞凋亡作用,与凋亡合作,共同促进细胞死亡。（6）AMP能够抑制PI3K/Akt/mTOR信号转导通路。
葛建林[5]（2019）在《rhIL-24对食管鳞癌细胞KYSE450中CSC亚群体内增殖的抑制作用研究》文中研究表明目的:我国是食管癌高发区,其中90%是食管鳞状细胞癌。食管癌患者的预后一直不佳。而肿瘤干细胞（Cancer stem cells,CSCs）与肿瘤发生、发展、转移和治疗耐药性密切相关,可能是肿瘤治疗失败的重要原因。白细胞介素24（Interleukin 24,IL-24）具有广谱而特异的抗瘤活性,重组IL-24腺病毒可以抑制乳腺癌CSC的增殖,但对正常干细胞无影响。与重组IL-24腺病毒相比,重组人IL-24蛋白（recombinant human IL-24,rhIL-24）具有特异性强、毒性低、功能明确等优点,临床应用更具优势。本研究旨在明确rhIL-24对食管鳞癌CSC体内增殖的抑制作用,为将rhIL-24开发为一种可用于临床食管癌治疗的生物制剂提供实验依据。方法:首先,采用Hoechst33342染色的方法,检测ESCC细胞系KYSE450中是否有CSC的存在;采用无血清成球培养法来富集KYSE450细胞中的CSC亚群;并利用免疫荧光染色与流式细胞仪鉴定成球细胞中干性标志物（CD44、CD133、CD90、CD271）的表达,同时采用有限稀释法对其体内成瘤能力进行鉴定。其次,制备KYSE450-CSC的裸鼠皮下移植瘤,用分泌表达rhIL-24的工程细胞株FCHO/IL-24处理,分析rhIL-24对KYSE450-CSC体内增殖的影响,并通过检测KYSE450细胞表面IL-24受体（IL-20R1、IL-22R1和IL-20R2）的表达,探讨其可能的作用机制。最后,收集食管癌患者组织标本,免疫组化检测干性标志物（CD44、CD133、CD90、CD271）和IL-24表达水平,分析CSC标志物表达水平与患者临床信息的相关性,以及与IL-24表达水平的相关性;结果:（1）食管鳞癌细胞KYSE450中存在能外排Hoechst33342染料的细胞亚群,即肿瘤干细胞,经流式细胞仪检测其比例约为0.5%。（2）采用无血清成球培养法富集KYSE450中的CSC,流式检测结果表明,与贴壁细胞相比,KYSE450成球细胞干性标记物 CD44（**p<0.01）、CD133（*p<0.05）、CD90 和 CD271（*p<0.05）表达水平均上调。（3）KYSE450成球细胞的肿瘤起始频率（1/3523）明显高于贴壁培养的亲本细胞（1/62348）（**p<0.001）。（4）IL-24工程细胞株FCHO/IL-24可抑制KYSE450成球细胞的裸鼠皮下异位移植瘤的体内增殖。（5）细胞免疫荧光染色显示,KYSE450细胞表面有IL-24受体IL-20R1、IL-20R2和IL-22R1表达。（6）食管鳞癌组织标本中CD271和CD44表达水平更高;CD133高表达与患者病理分级正相关（*p<0.05）,与患者生存时间负相关（**p<0.01）。（7）食管癌和食管鳞癌组织中IL-24与CD133表达水平正相关（*p<0.05）。结论:IL-24工程细胞株FCHO/IL-24能够抑制食管鳞癌细胞KYSE450中成球培养富集的肿瘤干细胞的体内增殖;食管癌组织中CD133的表达水平可能是食管癌患者预后的潜在指标。
王建敏[6]（2019）在《Rab25及TAM M2极化介导NSCLC厄洛替尼耐药机制及干预研究》文中进行了进一步梳理第一部分:Rab25调控β1 integrin/AKT/β-catenin通路促进NSCLC厄洛替尼耐药背景:EGFR-TKI在有EGFR敏感突变的非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中取得令人瞩目的治疗效果。多项临床研究提示相对于传统化疗,EGFR-TKI在NSCLC患者中表现出明显的治疗优势。在2018版的CSCO原发性肺癌诊疗指南中,厄洛替尼仍然是有EGFR敏感突变的NSCLC患者一线治疗方案之一。但是几乎所有接受EGFR-TKI治疗的患者在9-13月后会出现耐药,尽管许多的EGFR-TKI耐药机制已被揭示,如T790M突变,c-Met基因扩增,IGF-1R激活等,仍有30%左右的耐药原因不明。其中T790M突变能被三代的EGFR-TKI奥希替尼有效控制,并且奥希替尼在2018年被FDA批准用于NSCLC的一线治疗。但是一些新的突变,如C797S、T790M突变丢失仍会导致奥希替尼耐药。而对于那部分无T790M突变的NSCLC患者,能反映或预测EGFR-TKI耐药的指标对于指导治疗、预后预测仍有重要的意义。Rab25是一种小GTP酶,属于Rab11超家族,调节着物质在细胞内的转运,而一些异常的物质转运在肿瘤的生物学行为中起着重要作用,如细胞增殖、侵袭以及细胞极性维持等。我们的前期研究发现NSCLC患者的肿瘤组织中Rab25表达明显高于癌旁组织,且Rab25高表达患者的OS较Rab25低表达患者短,提示Rab25在NSCLC中可能起着促癌作用。我们课题组前期用厄洛替尼长时间作用于肺腺癌细胞株而诱导成了稳定的厄洛替尼耐药肺腺癌细胞株,并经检测确认不含T790M突变。我们发现厄洛替尼耐药细胞株中有Rab25高表达,并在NSCLC患者中证实高表达的Rab25与更差的EGFR-TKI疗效相关。我们推测Rab25能使肺癌细胞避免EGFR-TKI的抑制作用而持续存活、增殖,导致了非T790M突变依赖的EGFR-TKI耐药发生。接下来,我们对Rab25导致厄洛替尼耐药的机制进行了深入探索。方法:1、NSCLC细胞株中EGFR通路相关蛋白以及Rab25的检测 采用western blot检测厄洛替尼敏感的PC9、HCC827细胞以及厄洛替尼耐药的PC9/ER、HCC827/ER细胞中EGFR、ERK、AKT、Rab25蛋白表达。并采用慢病毒感染方法构建了Rab25过表达的PC9/Rab25,HCC827/Rab25细胞,以及Rab25敲除的PC9/ER/shRab25、HCC827/ER/shRab25细胞。在上述细胞中用CCK-8检测厄洛替尼的IC50。2、Rab25调控wnt信号通路促进细胞增殖 采用western blot检测Rab25过表达、敲除细胞中wnt信号通路关键分子—p-GSK-3βandβ-catenin及其下游靶基因cycling D1的表达。并分别采用EdU、PI染色检测Rab25过表达、敲除对细胞周期、细胞增殖能力的影响。3、Rab25与β1 integrin直接结合并激活wnt信号通路 采用免疫共沉淀论证Rab25与β1 integrin的直接结合,并通过免疫荧光染色观察PC9、HCC827以及PC9/ER、HCC827/ER细胞中Rab25与β1 integrin蛋白的定位。采用siRNA转染以沉默PC9/Rab25,HCC827/Rab25细胞中的β1 integrin,并用western blot论证β1 integrin沉默对p-GSK-3βandβ-catenin的影响。4、体内实验论证Rab25调控wnt信号通路并导致厄洛替尼耐药 给予裸鼠皮下注射PC9、HCC827和相应的Rab25过表达细胞,以及PC9/ER、HCC827/ER和相应的Rab25敲除细胞,以构建皮下移植瘤模型。厄洛替尼的治疗效果用肿瘤体积变化表示。采用免疫组化染色检测肿瘤组织中Rab25、β1 integrin、β-catenin、ki-67的表达,其中细胞增殖能力由ki-67阳性细胞数判断。5、Rab25影响EGFR-TKI的疗效 收集经EGFR-TKI治疗的NSCLC患者肿瘤组织切片,并根据RECIST1.1标准评估这些患者对EGFR-TKI治疗的反应。采用免疫组化染色检测这些组织切片中Rab25的表达。采用Kaplan-Meier曲线分析Rab25表达与这些患者的PFS、OS的关系。结果:1、Rab25与厄洛替尼耐药相关 PC9/ER、HCC827/ER细胞的Rab25表达增高,且不能被厄洛替尼抑制。过表达Rab25可使厄洛替尼的IC50值明显升高;而敲除Rab25使厄洛替尼的IC50值明显降低。2、Rab25调控wnt信号通路诱导厄洛替尼耐药 Rab25过表达诱导p-GSK-3β、β-catenin、cyclin D1表达增高,同时伴S期的细胞比例以及EdU阳性细胞比例增加;而Rab25敲除有相反表现。LiCl可使PC9/ER/shRab25、HCC827/ER/shRab25细胞中的wnt通路被重新激动,并促进细胞增殖。3、Rab25与β1 integrin直接结合并激活wnt信号通路 Rab25与β1 integrin可直接结合,且PC9、HCC827细胞中Rab25与β1 integrin共定位在胞质中,而PC9/ER、HCC827/ER中,β1 integrin被转运到了细胞膜上。过表达Rab25可诱导β1 integrin、p-AKT表达增加;而沉默Rab25有想反表现。另外,沉默β1integrin可抑制Rab25对p-GSK-3β、β-catenin的诱导作用。提示Rab25可促使β1 integrin转运到胞膜,并激活wnt信号通路,促进细胞增殖,导致厄洛替尼耐药。4、Rab25在小鼠体内可介导厄洛替尼耐药 Rab25过表达细胞的移植瘤体积较其亲本细胞明显增大,而Rab25沉默细胞的移植瘤体积较其亲本细胞明显缩小。同时,Rab25过表达的移植瘤组织切片中,β1 integrin,β-catenin and ki-67表达明显增加;而Rab25沉默的移植瘤组织切片中,β1 integrin,β-catenin and ki-67表达明显减少。5、Rab25表达与EGFR-TKI的疗效相关 NSCLC患者中,EGFR-TKI疗效较好的患者肿瘤组织中Rab25表达较低,而EGFR-TKI疗效较差的患者肿瘤组织中Rab25表达较高。Rab25高表达患者的PFS、OS较Rab25低表达患者短。结论:1、NSCLC患者中,Rab25高表达与更差的EGFR-TKI疗效相关,并预示着不良预后。2、过表达Rab25可明显减弱厄洛替尼对NSCLC细胞以及移植瘤的抑制作用,而敲除Rab25可恢复厄洛替尼对NSCLC细胞以及移植瘤的抑制作用。3、Rab25可与β1 integrin直接结合,并使其转运到细胞膜重新发挥作用。4、β1 integrin可激活PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路,诱导cyclin D1表达,促进细胞增殖。第二部分:安罗替尼抑制肿瘤相关巨噬细胞M2极化改善厄洛替尼耐药背景:肿瘤微环境（Tumour microenvironment,TME）由细胞外基质和间质细胞构成,其中细胞外基质包括层粘连蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白等,而间质细胞,包括成纤维细胞、免疫细胞（T细胞、巨噬细胞、NK细胞、树突状细胞等）、血管内皮细胞等。肿瘤的生物学特性与其微环境息息相关。当肿瘤增长到2-3mm3大小时,新生血管是肿瘤继续生长所依赖的必要条件之一。但是不同于正常血管,肿瘤血管具有高通透性和低灌注量,导致肿瘤组织缺氧以及渗透压增高,而这样的环境使免疫细胞浸润减少伴免疫功能减弱,并促使一些趋化因子分泌。许多趋化因子可招募免疫抑制性细胞,如调节性T细胞、巨噬细胞,导致TME呈现免疫抑制状态。一些抗血管生成的药物可是肿瘤血管在一定时间内“正常化”,可改善肿瘤血管的低灌注和高通透性,并纠正缺氧,从而增加抗肿瘤药物的有效递送量和免疫细胞的浸润。此外,有研究提示EGFR-TKI耐药的肿瘤细胞及基质细胞能分泌大量VEGF,激活VEGFR信号通路,并与EGFR发生相互作用,最终促进细胞增殖,抗血管生成治疗联合EGFR-TKI或许可抑制这一作用,并改善EGFR-TKI耐药。单核细胞可被肿瘤细胞及间质细胞分泌的趋化因子招募到TME中,并分化为巨噬细胞,即肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophage,TAM）,TAM是TME中数量最多的免疫细胞,且有向M2极化的特性。巨噬细胞可分为经典活化型（M1）和替代活化型（M2）,其中M1巨噬细胞表达MHC II、CD86、NO、iNOS,表现出促炎症反应、抗肿瘤的特点,而M2巨噬细胞表达IL-10、arg-1、CD206、CD163、TGF-β,表现出免疫抑制性、促肿瘤的特点。所以,一般认为TAM扮演着促肿瘤进展的功能。除了免疫抑制功能外,TAM在缺氧环境中TAM还能分泌一些促血管生成的细胞因子,包括VEGFA、VEGFC、PDGF,促进肿瘤血管生成。一些抗血管生成的药物除了作用于肿瘤血管外,还能作用于其他细胞。有研究提示一种具有抗血管生成功能的药物—内皮抑素（engineered endostatin）,能通过TAM表面的nucleolin以及α5β1整合素进入胞内,并抑制其M2极化,减少M2型TAM分泌的促血管生成的细胞因子和免疫抑制因子,抑制肿瘤血管生成,改善免疫抑制状态。安罗替尼（anlotinib）是我国研发的一种多靶点的小分子抑制剂,能抑制VEGFR、PDGFR、FGFR、c-Kit等多个靶点,具有抗肿瘤血管生成的作用,且已被2018版的CSCO肺癌指南推荐为NSCLC患者的三线治疗方案。EGFR-TKI耐药机制包括肿瘤细胞本身的信号通路异常激活和TME的异常调节。而TAM参与了免疫抑制、血管生成、血管重塑等多个病理过程,且TAM的M1/M2转化与其功能息息相关。于是,我们以安罗替尼是否可以影响TAM而改善厄洛替尼耐药作为研究内容,以期为EGFR-TKI耐药患者提供新的治疗选择。方法:1、TAM模型建立 巨噬细胞由单核细胞株经PMA诱导而来,并经流式细胞仪检测有巨噬细胞标记分子CD45、CD68阳性表达。将巨噬细胞和NSCLC细胞共培养建立TAM模型。2、M1、M2 TAM的检测 采用流式细胞仪检测与厄洛替尼敏感、耐药细胞共培养的TAM的M1型分子标记HLA-DR以及M2型分子标记CD206。并采用CCK-8检测与M1、M2 TAM共培养的NSCLC细胞的厄洛替尼IC50值。3、TAM的M2极化相关蛋白的检测 厄洛替尼敏感、耐药的NSCLC细胞上清中的VEGF蛋白含量用ELISA检测。用或不用安罗替尼处理TAM后,Western blot检测TAM的VEGFR2、AKT、mTOR蛋白表达。结果:1、TAM的M2极化与厄洛替尼耐药相关 单核细胞经PMA刺激能分化为巨噬细胞,且CD45+/CD68+巨噬细胞高达90%左右。将巨噬细胞与NSCLC细胞共培养构建的TAM有M2极化的特点(CD45+/CD68+/CD206high),但厄洛替尼可抑制与厄洛替尼敏感的PC9、HCC827细胞共培养的TAM的CD206表达,而不能抑制与厄洛替尼耐药的PC9/ER、HCC827/ER细胞共培养的TAM。与M2 TAM共培养的PC9、HCC827细胞的厄洛替尼IC50值明显升高。2、安罗替尼诱导TAM的M1极化并改善厄洛替尼耐药 安罗替尼处理与PC9/ER、HCC827/ER细胞共培养的TAM,可使其表现出M1极化的特点(CD45+/CD68+/HLA-DRhigh)。且与M1 TAM共培养的PC9/ER、HCC827/ER细胞的厄洛替尼IC50值明显降低。3、安罗替尼通过VEGF/VEGFR2/AKT通路抑制TAM的M2极化相对于PC9、HCC827细胞,PC9/ER、HCC827/ER分泌较多VEGF。且与PC9/ER、HCC827/ER细胞共培养的TAM表达更多的VEGFR2以及与M2极化相关的信号分子p-AKT、mTOR,而安罗替尼可抑制p-VEGFR2以及p-AKT、mTOR的蛋白表达。结论:1、厄洛替尼敏感的NSCLC细胞与M2 TAM共培养后出现厄洛替尼耐药。2、安罗替尼处理与M2 TAM共培养的耐厄洛替尼NSCLC细胞后,能部分恢复厄洛替尼的抑制作用。3、厄洛替尼耐药的NSCLC细胞分泌大量VEGF,并诱导TAM的VEGFR2高表达。4、安罗替尼可抑制p-VEGFR2,并影响AKT/mTOR通路,抑制TAM的M2极化。
蒋玮[7]（2019）在《正丁酸钠联合多西他赛通过抑制Gli1调控肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的研究》文中研究表明背景:在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中,腺癌的发生比例逐年升高,目前已经达到60%。多西他赛与铂类联合是晚期NSCLC标准的一线化疗方案,但是疗效已经到达平台期,将不同作用机制的有效低毒药物与化疗药物联合是进一步提高疗效的可行途径。作为一种组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase,HDAC）抑制剂,正丁酸钠在多种恶性肿瘤中均显示出抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋亡的作用。正丁酸钠也是一种结构简单的肠道天然产物,与化疗药物多西他赛的协同抗肿瘤作用值得我们进一步研究。胶质瘤相关癌基因同源物1（Glioma-associated oncogene homolog,Gli1）是Hedgehog（Hh）通路中关键的转录因子。Gli1可以不依赖于Hh配体,实现Hh信号通路的非经典激活。例如HDAC调控的Gli1的去乙酰化作用可以激活Hh信号通路,但Hh通路的激活反过来又可以诱导HDAC1的表达,这就形成了一个正反馈的恶性循环机制从而促进肿瘤发展。现已证实,在肺腺癌中存在着Gli1过表达导致的Hh信号通路过度激活,如果使用去乙酰化酶抑制剂正丁酸钠,是否有可能通过抑制Gli1的转录活性而起到抗肿瘤治疗的作用,这值得我们进一步研究。第一部分正丁酸钠和多西他赛单药及联合使用对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响目的:在肺腺癌A549细胞株中探索正丁酸钠和多西他赛分别单药和联合使用使用对细胞增殖和凋亡的影响。方法:通过CCK-8、克隆形成实验、细胞形态观察以及Hoechst 33258染色法检测不同浓度的正丁酸钠和多西他赛分别对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响。根据前期实验结果选择浓度为10 mmol/L的正丁酸钠和100 ng/mL多西他赛进行联合作用,使用前述方法以及流式细胞术检测两药联合作用对A549细胞增殖和凋亡的影响。结果:正丁酸钠和多西他赛均呈浓度依赖性以及时间依赖性的抑制A549细胞增殖和促进其凋亡（P<0.05）。而正丁酸钠联合多西他赛作用于A549细胞较单药处理能更加显着的抑制A549细胞增殖并促进其凋亡（P<0.05）。结论:正丁酸钠对肺腺癌A549细胞有抑制增殖和促进凋亡作用,正丁酸钠与多西他赛联合对化疗有增敏作用。第二部分正丁酸钠和多西他赛单药及联合使用通过调控Gli1对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响目的:通过体外实验基于转录因子Gli1探讨正丁酸钠和多西他赛分别单药及联合使用对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法:1.通过实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）方法检测正丁酸钠与多西他赛单药及联合作用对A549细胞Gli1 mRNA表达的影响并通过蛋白免疫印迹法（Western blot）检测Gli1蛋白表达水平。2.将A549细胞转染过表达Gli1的慢病毒以及空载体对照慢病毒,荧光显微镜下观察转染效率,并用qRT-PCR和Western Blot方法验证Gli1的过表达效果。通过CCK-8、克隆形成实验、细胞形态观察、Hoechst 33258染色法以及流式细胞术检测正丁酸钠和多西他赛分别单药及联合作用对过表达Gli1的肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响。3.通过qRT-PCR方法检测正丁酸钠与多西他赛分别单药及联合作用对过表达Gli1的A549细胞Gli1 mRNA水平的影响,通过Western Blot方法检测以上各组细胞中Gli1蛋白及其下游与增殖和凋亡相关蛋白（Ki-67、CDK1、CDK2、Cyclin A、Cyclin D1、p21、Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase 3以及Survivin蛋白）的表达水平。结果:1.正丁酸钠和多西他赛单药及联合处理显着抑制Gli1 mRNA和蛋白表达水平（P<0.05）,且以联合组更为显着（P<0.05）。2.转染过表达Gli1的慢病毒后,A549细胞的增殖受到促进（P<0.05）。无论是空载体组还是Gli1过表达组,经过正丁酸钠和多西他赛单药及联合处理后,A549细胞的增殖均受到抑制而凋亡均受到促进（P<0.05）,且以联合组更为显着（P<0.05）。但是Gli1过表达可以在一定程度上逆转药物对A549细胞增殖的抑制作用和对凋亡的促进作用（P<0.05）。3.转染过表达Gli1的慢病毒后,A549细胞中Gli1 mRNA和蛋白表达显着增加（P<0.05）。无论是空载体组还是Gli1过表达组,正丁酸钠和多西他赛单药及联合处理均显着抑制其Gli1 mRNA和蛋白表达,且以联合组更为显着（P<0.05）。但是无论是何种药物处理,Gli1过表达组的mRNA和蛋白表达水平仍然高于相应的空载体组（P<0.05）。4.过表达Gli1可以显着提高Ki-67、CDK1、CDK2、Cyclin D1、Bcl-2和Survivin蛋白的表达水平（P<0.05）,而降低Cyclin A、p21、Bax和cleaved-Caspase 3蛋白的表达水平（P<0.05）。无论是Gli1过表达组还是空载体组,正丁酸钠和多西他赛单药或联合处理都可以显着降低Ki-67、CDK1、CDK2、Cyclin D1、Bcl-2和Survivin的表达（P<0.05）,增强Cyclin A、p21、Bax和cleaved-Caspase 3的表达（P<0.05）,在联合组中更为显着（P<0.05）。Gli1过表达可以在一定程度上逆转药物对促癌相关蛋白的抑制作用和抑癌相关蛋白的促进作用（P<0.05）。结论:Gli1激活对肺腺癌A549细胞增殖具有促进作用而对凋亡具有抑制作用。下调Gli1而进一步影响其下游与增殖和凋亡相关蛋白的表达,是正丁酸钠对肺腺癌细胞抑制增殖和促进凋亡作用以及化疗增敏作用的潜在机制之一。第三部分正丁酸钠联合多西他赛通过调控Gli1对肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长的影响目的:通过体内实验基于转录因子Gli1探讨正丁酸钠和多西他赛联合使用对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法:建立过表达Gli1的A549细胞裸鼠移植瘤模型。荷瘤鼠予腹腔注射正丁酸钠加多西他赛联合处理,并设立相应对照组。观察各组荷瘤鼠的一般情况,测量荷瘤鼠体重、肿瘤体积指标。药物处理结束后颈椎脱臼处死各组裸鼠,剥离肿瘤组织进行拍照记录并测量肿瘤质量。免疫组化和Western Blot方法检测各组移植瘤组织中Gli1蛋白表达水平,TUNEL法检测各组移植瘤组织中的细胞凋亡情况。Western Blot方法检测各组移植瘤组织中Gli1下游与肿瘤增殖和凋亡相关蛋白（Ki-67、CDK1、CDK2、Cyclin A、Cyclin D1、p21、Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase 3以及Survivin蛋白）的表达水平。结果:Gli1过表达显着促进A549细胞荷瘤鼠的移植瘤体积增大及质量增加（P<0.05）。在分别接种空转和Gli1过表达A549细胞的荷瘤鼠,正丁酸钠联合多西他赛处理对荷瘤鼠的体重没有显着影响（P>0.05）,但是可以显着抑制移植瘤的体积增大和质量增加（P<0.05）,而Gli1过表达可以在一定程度逆转药物对肿瘤生长的抑制作用（P<0.05）。药物处理显着增加移植瘤组织细胞凋亡指数（P<0.05）,但Gli1过表达能在一定程度上逆转药物处理对肿瘤细胞凋亡的促进作用（P<0.05）。药物处理显着降低Gli1蛋白表达水平,但Gli1过表达药物治疗组仍然高于空载体药物治疗组（P<0.05）。与体外实验结果一致,Gli1过表达可以促进促癌相关蛋白的表达并抑制抑癌相关蛋白的表达（P<0.05）,而Gli1过表达可以在一定程度逆转药物对促癌相关蛋白的抑制作用和抑癌相关蛋白的促进作用（P<0.05）。结论:体内实验进一步证实,对Gli1及其下游与增殖和凋亡相关蛋白的调控是正丁酸钠对肺腺癌A549细胞增殖的抑制和凋亡的促进作用以及化疗的增敏作用的潜在机制之一。全文结论本研究通过体内外实验,证实Gli1激活对肺腺癌增殖具有促进作用而对凋亡具有抑制作用。同时明确了正丁酸钠对肺腺癌A549细胞有抑制增殖和促进凋亡作用,其与化疗药物多西他赛联合使用对化疗有增敏作用,并且正丁酸钠能够下调Gli1而进一步影响其下游与增殖和凋亡相关的信号分子的表达,是正丁酸钠对肺腺癌细胞抑制增殖和促进凋亡以及化疗增敏作用的潜在机制之一。
张蕾[8]（2019）在《基于Rap1GAP介导FAK/ERK信号探讨淫羊藿苷干预结肠癌增殖转移的作用及机制》文中进行了进一步梳理2018年,美国癌症协会（ACS）发布的统计数据指出,在美国的肿瘤患者中,结肠癌（Colorectal cancer,CRC）发病率和病死率均位列第三。由于环境,饮食,生活方式的改变,我国的结肠癌近几年发病率和死亡率不断攀升。目前,结肠癌的诊治强调早期诊断和手术治疗,而结肠癌的诊断主要依赖肠镜等手段,大多患者确诊时已处于癌症中晚期,只能依赖放疗、化疗、姑息治疗等提高5年生存率,因此寻找特异的早期诊断新型生物标志物及分子治疗靶点有重要意义。Rap是一种小分子G蛋白,参与细胞的多种功能,Rap活性的失调与恶性肿瘤的发生发展有关。RaplGAP是Rap特异的GTP酶活化蛋白,能够使Rap从GTP结合形式失活转变成GDP形式,而甘丙肽受体（galanin receptor,GALR）能够激活Rap活性。作为调控Rap活性的Rap1GAP和GALR与肿瘤也会有密切关系。在正常-结肠腺瘤-结肠癌这一发展过程中Rap1GAP和GALR发挥的作用是未知的。粘着斑激酶（Focal Adhesion Kinase,FAK）是一种在生长因子受体和整合素介导的信号中十分关键的调节因子,通过高度协调的信号网络调节致瘤和转移潜能来促进恶性肿瘤,这些信号网络协调各种细胞过程,如细胞存活,增殖,侵袭,上皮-间质转化等。细胞外信号激酶（Extracellular signal kinase,ERK）是丝裂活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPKs）通路的主要成员之一,能够被多种生长因子和细胞因子磷酸化激活,主要调节细胞增殖和分化。因此调控FAK/ERK活性是癌症治疗的潜在靶标。目前尚不清楚在结肠癌中Rap1GAP能否通过抑制FAK/ERK通路发挥抗肿瘤作用。传统医学无肠癌一词,其症与“积聚“、“肠蕈”、“锁肛痔”等病接近,总病机为正虚邪实,肾藏精,为先天之本,古籍记载:“足于精者,百病不生,穷于精者,万邪蜂起”,肾气不足与肠癌的发生有紧密关系,中医在治疗肠癌时强调补肾法。淫羊藿（Epimedium brevicornu Maxim）是常用的补肾药,淫羊藿苷（Icarrin,ICA）是植物淫羊藿中提取的异戊烯化黄酮醇苷,通过各种机制如诱导细胞凋亡,调节细胞周期,抑制血管生成,抑制转移对广泛肿瘤细胞有抑制作用,是用于治疗癌症的潜力药物。然而淫羊藿苷抑制结肠癌的机制并不清楚,其调控Rap1GAP的研究未见报道。基于此,我们以Rap1GAP为切入点,对淫羊藿苷干预结肠癌增殖和转移作用和机制进行了初步探讨。第一部分Rap1GAP和GALR在结肠腺瘤和结肠癌患者中的表达及临床意义目的:研究Rap1GAP和三种甘丙肽受体（GALR1、GALR2、GALR3）在结肠癌,结肠腺瘤和正常人组织和粪便中的表达,并分析其与大肠癌病理分型、分化程度等相关临床病理因素的关系。方法:收集石蜡包埋标本,结肠癌、结肠腺瘤各40例,正常结肠组织13例,收集粪便标本,结肠癌、结肠腺瘤各40例,健康人10例。采用qRT-PCR方法检测Rap1GAP和 GALR1、GALR2、GALR3 的表达。脾脏注射建立小鼠结肠癌肝转移膜型,成瘤后随机分为正常组、对照组（含0.5%生理盐水）、结果:大肠粘膜正常组织、腺瘤组织、大肠癌组织中Rap1GAP的表达量依次降低,差异有统计学意义（P<0.001）。在结肠腺瘤组织中,Rap1GAP的表达与性别、年龄、腺瘤大小无关;与腺瘤病理分型有关,绒毛状腺瘤低于管状腺瘤（P<0.05）;与腺瘤分级有关,高级别瘤变低于低级别瘤变（P<0.05）。在结肠癌组织中,Rap1GAP的表达与性别、年龄无关、肿瘤大小无关;与肿瘤病理分型有关,在隆起型、溃疡型、浸润型组织中依次降低（P<0.05）;与分化程度有关,在高分化、中分化、低分化组织中的依次降低（P<0.05）;与肿瘤浸润深度有关,T1+T2期高于T3+T4期（P<0.05）;与淋巴结转移有关,无淋巴结转移高于有淋巴转移（P<0.05）;与远处转移有关,无远处转移高于远处转移（P<0.05）。健康人、腺瘤及大肠癌患者粪便中Rap1GAP的表达量依次降低,差异有统计学意义（P<0.001）。在结肠腺瘤患者粪便中,Rap1GAP的表达与性别、年龄、腺瘤大小无关;与腺瘤病理分型有关,绒毛状腺瘤低于管状腺瘤（P<0.05）;与腺瘤分级有关,高级别瘤变低于低级别瘤变（P<0.05）。在结肠癌患者粪便中,Rap1GAP的表达与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤病理、分化程度无关;与肿瘤浸润深度有关,T1+T2期高于T3+T4期（P<0.05）;与淋巴结转移有关,无淋巴结转移高于淋巴结转移（P<0.05）;与远处转移有关,无远处转移组高于远处转移（P<0.05）。GALR1、GALR2、GALR3在正常结肠、结肠腺瘤、结肠癌组织中无显着变化（y>0.05）。GALR1、GALR2、GALR3在健康人、结肠腺瘤、结肠癌患者粪便中无显着变化（P>0.05）。结论:Rap1GAP的表达水平在正常结肠、结肠腺瘤、结肠癌中逐渐降低,说明其可能参与了结肠细胞的早期瘤变,并且在恶性肿瘤发生发展阶段发挥着抑癌基因的作用,具有一定的临床价值,为结肠癌的早期诊断提供了新的思路。第二部分淫羊藿苷抑制荷瘤鼠结肠癌的增殖和转移作用及机制目的:观察淫羊藿苷对裸鼠皮下移植瘤生长的影响,探讨淫羊藿苷对荷瘤鼠结肠癌生长的抑制作用;观察淫羊藿苷对结肠癌肝转移小鼠肝脏转移的影响,研究淫羊藿苷对荷瘤鼠结肠癌生长和转移的抑制作用。方法:将对数期的结肠癌HCT116细胞注射在裸鼠皮下,建立裸鼠皮下移植瘤膜型,成瘤后随机分为正常组、对照组（含0.5%生理盐水）、淫羊藿苷低、中、高剂量组（40、80、160mg/kg）,希罗达组（267mg/kg）,灌胃给药。每天观察各组裸鼠的饮食、精神、活动情况,每3天称量体重并测量肿瘤的长短径,绘制体重和肿瘤大小曲线;治疗结束后,将所有裸鼠处死,取出肿瘤组织称量,比较各组的抑瘤率;Western blot检测肿瘤组织Rap1GAP、FAK、pFAK、ERK、pERK蛋白水平的变化。将对数期的结肠癌CT26细胞经脾脏注射建立小鼠结肠癌肝转移膜型,成瘤后随机分为正常组、对照组（含0.5%生理盐水）、淫羊藿苷低、中、高剂量组（40、80、160mg/kg）,希罗达组（267mg/kg）,灌胃给药。每天观察各组小鼠的饮食、精神、活动和腹部情况,治疗结束后,将所有小鼠处死,HE染色观察各组肝脏转移瘤组织形态,免疫组织化学染色比较各组小鼠肝脏肿瘤中的Rap1GAP和pFAK、pERK蛋白水平。结果:成功建立裸鼠皮下移植瘤和小鼠结肠癌肝转移膜型。在皮下移植瘤膜型治疗过程中未发现各组裸鼠饮食、精神、活动情况、体重有显着差异;处死后发现淫羊藿苷呈剂量依赖性抑制了移植瘤的体积和质量（P<0.05）;淫羊藿苷治疗后,Rap1GAP蛋白上调,FAK和ERK蛋白不变,pFAK和pERK蛋白下调,且呈剂量依赖性。在结肠癌肝转移膜型中,淫羊藿苷组小鼠的饮食、精神、活动等情况均好于对照组;处死小鼠后,各组小鼠肝脏均发现转移瘤。与对照组相比,淫羊藿苷组体重、肝重、瘤重均较轻,瘤/肝重比较小,肺和腹膜转移较少,差异有统计学差异（P<0.05）,该结果表明淫羊藿苷在体内能够抑制结肠癌肝转移,并且呈剂量依赖性;HE染色发现淫羊藿苷能够促进肿瘤组织坏死;免疫组化结果表明淫羊藿苷能够上调Rap1GAP,下调pFAK和pERK。结论:淫羊藿苷能够抑制荷瘤鼠的生长和转移,并且该作用可能与调控Rap1GAP和FAK/ERK活性有关。第三部分Rap1GAP调控FAK/ERK途径抑制结肠癌细胞增殖和侵袭、迁移目的:研究Rap1GAP对结肠癌细胞增殖和侵袭、迁移的影响,探讨是否与FAK/ERK通路有关。方法:比较Rap1GAP在人正常结肠上皮细胞NCM460、人结肠癌细胞HT29、HCT116,DLD1中的表达;构建慢病毒表达载体pLVPT-Rap1GAP（过表达Rap1GAP）,三质粒系统病毒包装转染293T细胞,收集病毒上清感染HCT116细胞,培养阳性单克隆细胞株;构建PX459-sg-Rap1GAP质粒（敲除Rap1GAP）,转染HT29细胞,培养阳性单克隆细胞株;MTT法检测Rap1GAP对细胞增殖的影响;流式细胞术检测Rap1GAP对细胞周期和凋亡的影响;Transwell实验检测Rap1GAP对细胞侵袭和迁移的影响;Western blot检测FAK、pFAK、ERK、pERK、cyclin D1、cyclin E、MMP9、MMP2 蛋白表达;Western blot 检测 FAK 抑制剂 Y15 和 EPAC2 激活剂 8-CPT-2’-O-Me-cAMP 干预 HCT116 后 Rap 活性和 FAK、ERK 等蛋白;Western blot检测组蛋白去乙酰化酶抑制剂NaB、TSA,DNA甲基化抑制剂5-Aza干预结肠癌细胞后Rap活性和FAK、ERK等蛋白。结果:成功筛选出HCT116-pLVPT-Rap1GAP单克隆细胞和HT29-PX459-sg-Rap1GAP单克隆细胞。在HCT116-pLVPT-Rap1GAP细胞中,细胞的增殖能力受到明显抑制（P<0.05）,在HT29-PX459-sg-Rap1GAP细胞中,细胞的增殖能力明显增强（P<0.05）;在 HCT116-pLVPT-Rap1GAP 细胞中,G0/G1 期细胞增多（P<0.05）,在 HT29-PX459-sg-Rap1GAP 细胞中,G0/G1 期细胞减少（P<0.05）;在 HCT116-pLVPT-Rap1GAP 细胞中,细胞的侵袭和迁移能力受到明显抑制（P<0.05）,在HT29-PX459-sg-Rap1GAP细胞中,细胞的侵袭和迁移能力明显增强（P<0.05）;在HCT116-pLVPT-Rap1GAP细胞中,FAK、ERK 不变 pFAK、pERK、cyclin D1、cyclin E、MMP9、MMP2 蛋白下调（P<0.05）,在HT29-PX459-sg-Rap1GAP 细胞中,FAK、ERK 不变,pFAK、pERK、cyclin D1、cyclin E、MMP9、MMP2 蛋白上调（P<0.05）;8-CPT-2’-O-Me-cAMP 作用后,HCT116 细胞中 Rap2-GTP增加,pFAK、pERK、Cyclin D1、Cyclin E、MMP9、MMP2 上调（P<0.05）,FAK 阻断剂Y15完全抑制这种作用。在HCT116和DLD1细胞中,NaB使Rap1GAP上调,Rap2、FAK、ERK 不变,Rap2-GTP、pFAK、pERK 下调（P<0.05）;TSA 也能使 Rap1GAP 上调（P<0.05）,5-Aza则无明显作用。在HT29细胞中,用NaB、TSA和5-Aza处理对Rap1GAP表达没有影响。结论:Rap1GAP抑制结肠癌细胞的增殖和侵袭、迁移,机制可能与Rap1GAP抑制FAK/ERK活化有关。结肠癌细胞HCT116和DLD1中Rap1GAP的表达受乙酰化调节,并且与调节Rap2的活性和ERK/FAK的磷酸化有关。第四部分淫羊藿苷通过Rap 1 GAP介导的FAK/ERK通路抑制结肠癌细胞增殖和侵袭、迁移目的:研究淫羊藿苷对结肠癌细胞HCT116增殖和侵袭、迁移的影响,并探讨其作用机制是否与调控Rap1GAP介导的FAK/ERK通路有关。方法:不同浓度的淫羊藿苷（5、10、15、20、25μmol/L）作用于对数生长期的HCT116细胞,采用MTT法检测淫羊藿苷对结肠癌细胞HCT116的增殖影响;通过Transwell侵袭实验和迁移实验比较淫羊藿苷对结肠癌细胞HCT116侵袭和迁移影响;流式细胞技术检测淫羊藿苷对结肠癌细胞HCT116凋亡和周期的影响;qRT-PCR检测淫羊藿苷对结肠癌细胞HCT116中Rap1GAP的mRNA的影响;Western blot方法检测淫羊藿苷对结肠癌细胞HCT116 中 Rap1GAP、FAK、pFAK、ERK、pERK、cyclin D1、cyclin E、MMP9、MMP2蛋白表达的影响。结果:不同浓度的淫羊藿苷对HCT116细胞的增殖能力有明显抑制作用（P<0.05）,一定范围内具有时间剂量依赖性,作用于HCT116细胞24h,48g,72h的半数抑制浓度（IC50）为21.04μmol/L,18.80μmol/L,17.26μmol/L;淫羊藿苷对HCT116细胞的侵袭和迁移能力有明显抑制作用（P<0.05）,并且呈浓度依赖性;淫羊藿苷能够诱导HCT116细胞发生凋亡（P<0.05）,并且呈浓度依赖性;淫羊藿苷作用后G0/G1期的HCT116细胞百分比升高（P<0.05）,并且呈浓度依赖性;HCT116细胞中Rap1GAP的mRNA和蛋白质水平上调,FAK、ERK 蛋白不变,pFAK、pERK、cyclin D1、cyclin E、MMP9、MMP2 蛋白水平下调（P<0.05）。结论:淫羊藿苷能够抑制结肠癌细胞HCT116的增殖和侵袭能力,其机制可能与作用Rap1GAP调控FAK/ERK通路有关。本研究利用qRT-PCR检测首次发现Rap1GAP在正常-腺瘤-癌这一疾病的动态发展过程中越来越低,而且其表达与恶性程度更高的分型分期分级呈负相关,然而三种甘丙肽受体（GALR1、GALR2、GALR3）在不同组织和粪便中并没有显着差异;通过建立裸鼠结肠癌皮下移植瘤和小鼠结肠癌肝转移瘤膜型,首次发现淫羊藿苷在体内对结肠癌生长和转移具有抑制作用,并且可能与干预Rap1GAP和FAK/ERK活性有关;此外,在结肠癌细胞中发现Rap1GAP能够通过干预FAK/ERK信号通路调节细胞的增殖和迁移,并且发现在结肠癌细胞HCT116和DLD1中Rap1GAP通过乙酰化修饰调控Rap2的活性;最后,在体外实验证明了淫羊藿苷能够抑制结肠癌细胞增殖和迁移,并且与Rap1GAP调控FAK/ERK活性有关。这些结果初步明确了淫羊藿苷抑制结肠癌的一部分作用靶点,丰富了中医补肾法治疗肠癌的法则,为中药淫羊藿的药理研究和临床治疗提供了一定的理论基础。
苏佳佳[9]（2018）在《酮体对HeLa细胞生长与凋亡的影响》文中研究说明正常细胞可以利用葡萄糖和酮体提供能量,多数恶性肿瘤细胞由于线粒体缺乏利用酮体供能的一种或多种关键酶,主要依赖葡萄糖而不能利用酮体供能,因此酮体可能对于癌细胞增殖具有重要的抑制作用。生酮是指高脂肪。脂肪分解产生脂肪酸,脂肪酸在肝内分解氧化时特有的中间代谢物是酮体,包括乙酰乙酸、β-羟基丁酸和丙酮。其中,酮体中β-羟基丁酸的含量约为78%。生酮饮食是一种由高比例脂肪、适量蛋白质、低碳水化合物以及其他营养素组成的饮食。生酮饮食实际上是酮体在细胞、分子水平上起的作用,关于生酮饮食的研究主要在小鼠等个体水平,而关于酮体对癌细胞影响的研究则更少。本文研究酮体对HeLa细胞生长与凋亡的影响,探讨酮体诱导HeLa细胞凋亡的作用机制,为临床上酮体用于癌症治疗提供理论依据。实验方法与结果培养HeLa细胞,以25 mmol/L葡萄糖（高糖DMEM完全培养基糖浓度）的培养基作为对照组,以不同糖浓度条件下添加酮体的培养基作为实验组。1在25mmol/L 葡萄糖的培养基中,添加1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L、7mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、50 mmol/L 的酮体（DL-3-羟基丁酸钠）,分别处理HeLa细胞48 h,MTT法检测细胞活力。结果显示,细胞增殖抑制率分别为21.0%、24.6%、33.1%、30.7%、33.5%、44.1%、46.8%、69.9%与 79.5%。选择 25 mmol/L酮体进行后续实验。2.建立HeLa细胞与脐带正常细胞共培养方法。为了更好的模拟人体内环境,有效的研究酮体对肿瘤细胞与正常细胞的影响。将HeLa细胞接种于正方形玻片上,人脐带正常细胞接种于圆形玻片上,贴壁后在PBS中充分漂洗,除去未贴壁的细胞,把HeLa细胞玻片和人脐带正常细胞玻片置于同一培养皿中进行共培养,研究药物在同一环境条件下对不同细胞的影响。与其他直接接触共培养或Transwell培养小室（上下两室分别接种细胞）相比具有成本低,操作便捷,便于研究单个细胞生理状态及活性的优势。3.HeLa细胞与人脐带正常细胞共培养于5 mmol/L葡萄糖0 mmol/L酮体组（G5K0组）、5mmol/L葡萄糖25mmol/L酮体组（G5K25组）、25mmol/L葡萄糖0mmol/L酮体组（G25K0组）、25mmol/L葡萄糖25mmol/L酮体组（G25K25组）培养基中,倒置显微镜观察细胞生长状态,结果表明72 h时,G5K0组少数人脐带正常细胞收缩变圆,处于早期凋亡状态,而HeLa细胞密度显着减小,呈晚期凋亡状态;G5K25组、G25K25组人脐带正常细胞状态良好,而G25K25组HeLa细胞密度明显减小,细胞贴壁性变差,少数细胞收缩变圆。AO/EB双重荧光染色检测细胞凋亡与坏死,结果表明,72 h时,G5K0组人脐带正常细胞少数处于凋亡状态,而HeLa细胞多数已凋亡;G5K25组人脐带正常细胞仅有少数处于凋亡状态,而HeLa细胞几乎全部凋亡。4.HeLa 细胞培养于0mmol/L、1mmol/L、5mmol/L与25mmol/L 葡萄糖;0 mmol/L、1mmol/L、5mmol/L与25 mmol/L酮体的培养基中,分别处理24 h、48 h、72 h后,MTT法检测细胞活力。结果表明,在5 mmol/L葡萄糖时,酮体能够显着抑制HeLa细胞的增殖,与酮体浓度呈正相关;25 mmol/L葡萄糖时,高浓度酮体能够抑制HeLa细胞增殖。在同一酮体浓度处理下,酮体作用72 h（58.5%）后HeLa细胞存活抑制率显着高于 24 h（25.1%）、48 h（43.2%）。5.酮体处理HeLa细胞,倒置显微镜观察表明,酮体处理组细胞密度明显降低,折光性降低,立体感减弱,少数细胞皱缩变圆,细胞活力降低。AO/EB双重荧光染色结果表明,酮体处理72 h后,G25K25组少数HeLa细胞的细胞核被染成黄色,呈早期凋亡状态,细胞密度降低;G5K25组多数HeLa细胞的细胞核被染成橘黄色,出现凋亡小体,呈晚期凋亡状态。单细胞凝胶电泳检测结果表明,酮体可以使HeLa细胞核DNA受到损伤,且低浓度葡萄糖+酮体处理后,细胞核DNA的损伤程度更严重。线粒体绿色荧光探针表明,HeLa细胞线粒体活性补偿性增强。流式细胞仪检测表明,酮体可将HeLa细胞的细胞周期阻滞于G1期,抑制HeLa细胞增殖。6.HeLa细胞经酮体处理48 h,Western Blot检测表明,与对照组相比,实验组Caspase-3主带明显减少,促凋亡蛋白Bim、Bad表达量逐渐增多,CyclinE1、CyclinD1、CDK2、CDK4和cdc2蛋白表达明显降低,P27、P21蛋白表达量明显增多。结论:在共培养条件下,酮体对HeLa细胞增殖具有明显抑制作用,而对正常细胞无明显抑制作用。后续实验证明酮体能够抑制HeLa细胞增殖,且与药物浓度及处理时间呈正相关。酮体可以将HeLa细胞的细胞周期阻滞于G1期,并通过损伤核DNA诱导HeLa细胞凋亡,且酮体+低糖作用效果更明显。酮体能够补偿性增强HeLa细胞线粒体活性。酮体通过细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p27蛋白的表达上调,抑制CyclinE-CDK2复合物的活性,使细胞无法顺利通过G1/S转换期,从而抑制HeLa细胞的增殖;通过Caspase依赖性细胞凋亡途径诱导HeLa细胞凋亡。本研究为癌症的酮体治疗法（血液中低糖高酮体）提供了理论依据。
史红阳,纪玉强,张德信,刘昀,方萍[10]（2017）在《丁酸钠联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对肺癌干细胞生物学行为的影响》文中进行了进一步梳理背景:丁酸钠是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂,能够抑制多种肿瘤细胞的增殖、诱导细胞凋亡及分化,但其联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对肺癌干细胞的影响尚未见报道。目的:研究丁酸钠单独或联合给药对肺癌干细胞生物学行为的影响。方法:利用免疫磁珠细胞分选技术从人肺腺癌A549细胞中分选CD133+肺癌干细胞,将CD133+肺癌干细胞分4组培养,对照组以DMEM/F12培养基培养,丁酸钠组以含5 mmol/L丁酸钠的DMEM/F12培养基培养,TRAIL组以含50μg/L肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的DMEM/F12培养基培养,联合组以含5 mmol/L丁酸钠+50μg/L肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的DMEM/F12培养基培养。检测培养96 h内的细胞增殖、培养24 h后的细胞凋亡、培养48 h内的细胞迁移能力,以及培养48 h后的多能性转录因子Oct4、Sox2及Nanog蛋白表达。结果与结论:（1）细胞增殖:联合组培养不同时间点的细胞增殖抑制率显着高于丁酸钠组、TRAIL组（P<0.05）;（2）细胞凋亡:丁酸钠组、TRAIL组、联合组细胞凋亡率高于对照组（P<0.05）,联合组高于丁酸钠组、TRAIL组（P<0.05）;（3）细胞迁移能力:丁酸钠组、TRAIL组、联合组细胞划痕距离大于对照组（P<0.05）,联合组大于丁酸钠组、TRAIL组（P<0.05）;（4）多能性转录因子表达:丁酸钠组、TRAIL组、联合组多能性转录因子Oct4、Sox2及Nanog蛋白表低于对照组（P<0.05）,联合组低于丁酸钠组、TRAIL组（P<0.05）;（5）结果表明:丁酸钠与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体联合用药,对肺癌干细胞有协同抑制作用。
二、丁酸钠抑制人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤生长的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、丁酸钠抑制人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤生长的研究（论文提纲范文）
（1）LSD1上调LEF1促进上皮间质转化及膀胱癌进展（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料、耗材、试剂与仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 LSD1表达升高和膀胱癌预后不良密切相关 |
| 3.2 LSD1促进膀胱癌细胞的迁移、侵袭和增殖 |
| 3.3 LSD1 在体内和体外均能促进膀胱癌细胞EMT |
| 3.4 LSD1 在膀胱癌细胞中通过调节LEF1 的表达进而促进EMT |
| 3.5 LSD1抑制剂在体内体外均可减弱膀胱癌细胞的增殖 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 EMT在膀胱癌中的作用 |
| 4.2 表观遗传对膀胱癌的作用 |
| 4.3 LSD1对EMT的作用 |
| 4.4 LSD1特异性抑制剂抗肿瘤的作用 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 上皮间质转化在膀胱癌转移中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（2）基于MAPK通路调控GRASP65探讨二氢杨梅素抗卵巢癌的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 高尔基体蛋白GRASP65在人卵巢肿瘤组织中的表达及临床意义 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 二氢杨梅素通过MAPK通路下调GRASP65 抗卵巢癌的作用及机制 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 二氢杨梅素抑制卵巢癌裸鼠体内肿瘤生长的作用及机制 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 展望 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文 |
（3）核蛋白PCNP对人甲状腺癌细胞生长的调节作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 2 材料、试剂与仪器设备 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 主要试剂配置 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细菌培养 |
| 3.2 细胞培养及转染 |
| 3.3 RNA提取及逆转录 |
| 3.4 总蛋白的提取及BCA蛋白定量 |
| 3.5 免疫印迹 |
| 3.6 细胞增殖 |
| 3.7 细胞凋亡 |
| 3.8 细胞迁移 |
| 3.9 细胞侵袭 |
| 3.10 流式周期实验 |
| 3.11 裸鼠成瘤实验 |
| 3.12 HE染色 |
| 3.13 免疫组织化学染色 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 人甲状腺癌组织中PCNP蛋白水平高于邻近非肿瘤组织 |
| 4.2 成功构建稳定的PCNP过表达及敲低的人甲状腺癌细胞株 |
| 4.3 PCNP抑制人甲状腺癌细胞增殖和细胞克隆的形成 |
| 4.4 PCNP抑制人甲状腺癌细胞迁移和侵袭 |
| 4.5 PCNP通过Wnt/β-Catenin信号通路促进人甲状腺癌细胞凋亡 |
| 4.6 PCNP通过MAPK信号通路促进人甲状腺癌细胞凋亡 |
| 4.7 PCNP通过细胞周期蛋白调控人甲状腺癌细胞周期 |
| 4.8 PCNP抑制裸鼠体内甲状腺癌异种移植瘤的生长和血管形成 |
| 5 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 核蛋白与肿瘤关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间参加的学术会议及研究成果 |
（4）基于代谢组学及自噬和凋亡调控途径研究蛇葡萄素抑制结直肠癌生长的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 结直肠癌的病因及治疗进展 |
| 1.2 天然药物治疗结直肠癌的研究进展 |
| 1.3 蛇葡萄素的研究进展 |
| 1.4 代谢组学在结直肠癌研究中的应用 |
| 1.5 凋亡和自噬在肿瘤发生发展中的作用 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 第二章 蛇葡萄素体外抗结直肠癌作用研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 药物及主要试剂配制 |
| 2.2.3 增殖抑制实验 |
| 2.2.4 细胞克隆实验 |
| 2.2.5 细胞创伤愈合实验 |
| 2.2.6 统计学方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 MTT法检测不同浓度AMP对人结直肠癌细胞增殖的影响 |
| 2.3.2 AMP对人结肠癌HCT-116、SW480 细胞克隆的影响 |
| 2.3.3 AMP对人结肠癌HCT-116、SW480 细胞迁移的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 蛇葡萄素抗人结直肠癌HCT-116细胞裸鼠皮下移植瘤药效实验 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 人结肠癌HCT-116细胞裸鼠皮下移植瘤模型建立 |
| 3.2.2 分组及给药方法 |
| 3.2.3 检测指标 |
| 3.2.4 统计学方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 AMP对 HCT-116 细胞裸鼠移植瘤模型动物体重的影响 |
| 3.3.2 AMP对 HCT-116 细胞裸鼠移植瘤模型动物瘤体积的影响 |
| 3.3.3 AMP对人结肠癌HCT-116细胞移植瘤动物瘤重及抑瘤率的影响 |
| 3.3.4 AMP对人结肠癌HCT-116细胞移植瘤动物脏器系数的影响 |
| 3.3.5 人结肠癌HCT-116细胞移植瘤模型动物主要脏器组织切片HE染色结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 基于代谢组学研究蛇葡萄素抑制结直肠癌生长的作用机制 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 样品前处理 |
| 4.2.2 LC-MS/MS分析 |
| 4.2.3 数据统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 样本代谢质谱TIC图 |
| 4.3.2 偏最小二乘判别分析结果 |
| 4.3.3 正交偏最小二乘判别分析结果 |
| 4.3.4 单变量统计分析结果 |
| 4.3.5 显着性差异代谢物 |
| 4.3.6 层次聚类分析结果 |
| 4.3.7 相关系数矩阵热图 |
| 4.3.8 KEGG通路富集分析结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 蛇葡萄素对人结直肠癌细胞凋亡和自噬的影响 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 细胞培养 |
| 5.2.2 受试药配制 |
| 5.2.3 人结肠癌HCT-116细胞裸鼠皮下移植瘤模型建立 |
| 5.2.4 动物分组及给药方法 |
| 5.2.5 流式细胞仪分析细胞周期 |
| 5.2.6 流式细胞仪分析AMP对人结肠癌HCT-116、SW480细胞凋亡的影响 |
| 5.2.7 倒置显微镜观察细胞形态 |
| 5.2.8 AO染色观察AMP对人结肠癌HCT-116、SW480细胞自噬的影响 |
| 5.2.9 透射电镜观察HCT-116细胞自噬 |
| 5.2.10 Western-blotting观察AMP对人结肠癌HCT-116、SW480细胞及移植瘤裸鼠瘤块组织中凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax、Cleaved-Caspase-3及自噬相关蛋白LC3、Atg5、Beclin-1表达的影响 |
| 5.2.11 统计学方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 AMP对人结肠癌细胞周期的影响 |
| 5.3.2 AMP对人结肠癌细胞凋亡的影响 |
| 5.3.3 倒置显微镜观察细胞形态 |
| 5.3.4 荧光显微镜和透射电镜观察细胞自噬情况 |
| 5.3.5 细胞及瘤块组织中凋亡相关蛋白的表达 |
| 5.3.6 细胞及瘤块组织中自噬相关蛋白的表达 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 自噬在蛇葡萄素诱导人结肠癌细胞凋亡中的作用以及相关分子机制研究 |
| 6.1 材料 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 细胞培养 |
| 6.2.2 药物及主要试剂配制 |
| 6.2.3 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对结肠癌细胞增殖的影响 |
| 6.2.4 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对结肠癌细胞凋亡的影响 |
| 6.2.5 AO染色观察AMP联合自噬抑制剂和促进剂对细胞自噬的影响 |
| 6.2.6 Western-blotting观察自噬抑制剂和促进剂对细胞凋亡和自噬蛋白表达的影响 |
| 6.2.7 统计学方法 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对细胞增殖的影响 |
| 6.3.2 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对细胞凋亡的影响 |
| 6.3.3 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对细胞凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 6.3.4 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对细胞自噬的影响 |
| 6.3.5 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对细胞自噬相关蛋白表达的影响 |
| 6.3.6 AMP对 PI3K/Akt/mTOR信号转导途径的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 结论 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（5）rhIL-24对食管鳞癌细胞KYSE450中CSC亚群体内增殖的抑制作用研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 引言 |
| 1.1 食管癌 |
| 1.2 肿瘤干细胞概述 |
| 1.2.1 概念 |
| 1.2.2 生物学特性 |
| 1.2.3 分离纯化和鉴定 |
| 1.2.3.1 基于表面标记物的纯化鉴定法 |
| 1.2.3.2 基于ALDH的纯化鉴定法 |
| 1.2.3.3 成球悬浮培养 |
| 1.2.3.4 侧群细胞法 |
| 1.2.3.5 基于放化疗抗性的筛选鉴定法 |
| 1.2.3.6 体内成瘤 |
| 1.3 食管癌干细胞的研究进展 |
| 1.3.1 食管癌干细胞的分子标记物 |
| 1.3.2 食管癌干细胞的分离富集和鉴定方法 |
| 1.3.3 抑制食管癌干细胞增殖的研究进展 |
| 1.4 IL-24抑制食管癌干细胞的研究进展 |
| 1.4.1 IL-24简介 |
| 1.4.2 IL-24抑制食管癌研究进展 |
| 1.4.3 IL-24抑制肿瘤干细胞研究进展 |
| 1.5 本研究目的和意义 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 细胞株和实验动物 |
| 2.2 组织标本 |
| 2.3 试剂 |
| 2.4 仪器设备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.1.1 细胞复苏 |
| 3.1.2 细胞培养和传代 |
| 3.1.3 细胞冻存 |
| 3.1.4 成球培养 |
| 3.2 Hoechst33342染色检测侧群细胞 |
| 3.2.1 荧光显微镜检测 |
| 3.2.2 流式细胞仪分析 |
| 3.3 细胞免疫荧光 |
| 3.4 流式细胞仪检测 |
| 3.5 动物实验 |
| 3.5.1 有限稀释法鉴定肿瘤干细胞体内致瘤能力 |
| 3.5.2 rhIL-24对肿瘤干细胞体内增殖能力的影响 |
| 3.6 石蜡切片的制备 |
| 3.6.1 组织包埋 |
| 3.6.2 切片 |
| 3.7 H&E染色 |
| 3.8 免疫组化染色 |
| 3.9 数据分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 食管鳞癌细胞中肿瘤干细胞的富集培养与鉴定 |
| 4.1.1 食管鳞癌细胞系中侧群细胞的检测 |
| 4.1.2 无血清成球培养法富集肿瘤干细胞 |
| 4.1.3 成球培养后肿瘤干细胞的鉴定 |
| 4.1.3.1 肿瘤干细胞标记物的鉴定 |
| 4.1.3.2 肿瘤干细胞体内成瘤能力的鉴定 |
| 4.2 rhIL-24抑制食管鳞癌细胞KYSE450-肿瘤干细胞的体内增殖 |
| 4.2.1 裸鼠移植瘤变化情况 |
| 4.2.2 裸鼠移植瘤组织学检测 |
| 4.2.3 KYSE450细胞表达IL-24受体 |
| 4.3 食管癌组织标本肿瘤干细胞标志物与IL-24表达水平相关性 |
| 4.3.1 肿瘤干细胞标志物的免疫组化检测 |
| 4.3.2 肿瘤干细胞标志物的表达水平与病理信息的相关性 |
| 4.3.3 食管癌组织标本中IL-24表达水平的检测 |
| 4.3.4 IL-24与肿瘤干细胞标记物表达水平的相关性 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A 英文缩略词表 |
| 附录B 主要试剂配制 |
| 作者简历及攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 学位论文数据集 |
（6）Rab25及TAM M2极化介导NSCLC厄洛替尼耐药机制及干预研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一部分:Rab25 调控β1 integrin/AKT/β-catenin通路促进NSCLC厄洛替尼耐药的研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 Rab25 促进厄洛替尼耐药 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器与材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 研究结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 Rab25 通过wnt信号通路促进NSCLC细胞增殖 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验仪器与材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 Rab25 调控β1 integrin细胞内转运并激活wnt通路 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验仪器与材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 过表达、敲除Rab25对裸鼠NSCLC皮下移植瘤增殖的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验仪器与材料 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 NSCLC患者Rab25表达与EGFR-TKI疗效的关系 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验仪器与材料 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.5 讨论 |
| 第二部分:安罗替尼抑制肿瘤相关巨噬细胞M2极化改善厄洛替尼耐药 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 安罗替尼抑制肿瘤相关巨噬细胞M2极化改善厄洛替尼耐药 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器与材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 研究结果 |
| 2.5 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 肿瘤相关巨噬细胞的治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（7）正丁酸钠联合多西他赛通过抑制Gli1调控肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 正丁酸钠和多西他赛单药及联合使用对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响 |
| 引言 |
| 1 材料和仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 正丁酸钠和多西他赛单药及联合使用通过调控Gli1对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响 |
| 引言 |
| 1 材料和仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 正丁酸钠联合多西他赛通过调控Gli1对肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长的影响 |
| 引言 |
| 1 材料和仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四部分 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 中英缩略词表 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（8）基于Rap1GAP介导FAK/ERK信号探讨淫羊藿苷干预结肠癌增殖转移的作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 Rap1GAP和GALR在结肠腺瘤和结肠癌患者中的表达及临床意义 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 淫羊藿苷抑制荷瘤鼠结肠癌的增殖和转移作用及机制 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 Rap1GAP调控FAK/ERK途径抑制结肠癌细胞增殖和侵袭、迁移 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 淫羊藿苷通过Rap1GAP介导的FAK/ERK通路抑制结肠癌细胞增殖和侵袭、迁移 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 淫羊藿苷抗肿瘤作用研究概况 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（9）酮体对HeLa细胞生长与凋亡的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1 酮体与生酮饮食 |
| 2 酮体的合成与分解 |
| 2.1 酮体的合成 |
| 2.2 酮体的分解 |
| 3 酮体与疾病治疗 |
| 3.1 酮体防治糖尿病研究现状 |
| 3.2 酮体防治脑部疾病研究现状 |
| 3.3 酮体防治恶性肿瘤研究现状 |
| 4 酮体与生酮饮食抗肿瘤的作用机制 |
| 5 生酮饮食概述 |
| 5.1 生酮饮食与疾病治疗 |
| 6 酮体与肿瘤细胞能量代谢的关系 |
| 6.1 肿瘤细胞线粒体异常 |
| 6.2 缺氧微环境 |
| 7 癌症及其治疗现状 |
| 8 本课题研究的目的及意义 |
| 第二章 酮体对HeLa细胞和正常细胞共培养的影响 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料、试剂与仪器 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 主要溶液配制 |
| 3.2 完全培养基配置 |
| 3.3 HeLa细胞的复苏、传代及冻存 |
| 3.4 原代脐带细胞分离 |
| 3.5 细胞培养 |
| 3.6 MTT检测细胞活力 |
| 3.7 脐带细胞与HeLa细胞共培养 |
| 3.8 吖啶橙/溴化乙锭双重荧光染色观察核染色质分布 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 酮体浓度对HeLa细胞活力的影响 |
| 4.2 酮体对共培养HeLa细胞和正常细胞生长状态的影响 |
| 4.3 酮体对共培养细胞的细胞核染色质分布的影响 |
| 5 讨论 |
| 第三章 酮体对HeLa细胞生长的影响 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料、试剂与仪器 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 MTT法检测细胞活力 |
| 3.3 倒置显微镜观察法检测细胞生长状态 |
| 3.4 统计方法 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 酮体对HeLa细胞的活力的影响 |
| 4.1.1 葡萄糖为0mmol/L时酮体对HeLa细胞活力的影响 |
| 4.1.2 葡萄糖为1mmol/L时酮体对HeLa细胞活力的影响 |
| 4.1.3 葡萄糖为5 mmol/L时酮体对HeLa细胞活力的影响 |
| 4.1.4 葡萄糖为25 mmol/L时酮体对HeLa细胞活力的影响 |
| 4.2 酮体对HeLa细胞形态的影响 |
| 4.2.1 葡萄糖为0 mmol/L时酮体对HeLa细胞生长状态的影响 |
| 4.2.2 葡萄糖为1 mmol/L时酮体对HeLa细胞生长状态的影响 |
| 4.2.3 葡萄糖为5 mmol/L时酮体对HeLa细胞生长状态的影响 |
| 4.3.4 葡萄糖为25 mmol/L时酮体对HeLa细胞生长状态的影响 |
| 5 讨论 |
| 第四章 酮体对HeLa细胞核形态与结构的影响 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料、试剂与仪器 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 吖啶橙/溴化乙锭双重荧光染色观察核染色质分布 |
| 3.3 单细胞凝胶电泳检测DNA损伤 |
| 3.4 Mito-Tracker Green(线粒体绿色荧光探针)线粒体染色 |
| 3.5 流式细胞分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 酮体对HeLa细胞的细胞核染色质分布的影响 |
| 4.2 酮体对HeLa细胞的细胞核DNA的影响 |
| 4.3 酮体对HeLa细胞线粒体活性的影响 |
| 4.4 酮体对HeLa细胞周期的影响 |
| 5 讨论 |
| 第五章 酮体对HeLa细胞生长和凋亡影响的分子机制 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料、试剂与仪器 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 蛋白的提取 |
| 3.3 Western Blot检测细胞凋亡和周期相关蛋白的表达量 |
| 4 结果 |
| 4.1 酮体对HeLa细胞周期相关蛋白表达量的影响 |
| 4.2 酮体对HeLa细胞凋亡相关蛋白表达量的影响 |
| 5 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（10）丁酸钠联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对肺癌干细胞生物学行为的影响（论文提纲范文）
| 0引言Introduction |
| 1 材料和方法Materials and methods |
| 1.1 设计 |
| 1.2 时间及地点 |
| 1.3 材料 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 细胞培养 |
| 1.4.2 免疫磁珠细胞分选技术分离CD133阳性细胞 |
| 1.4.3 式细胞仪检测肺癌CD133阳性细胞比例 |
| 1.4.4 四甲基偶氮唑盐 (MTT) 法检测细胞增殖 |
| 1.4.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率 |
| 1.4.6 细胞划痕实验检测细胞迁移能力 |
| 1.4.7 Western blot分析 |
| 1.5 主要观察指标 |
| 1.6 统计学分析 |
| 2 结果Results |
| 2.1 肺癌干细胞分选结果 |
| 2.2 丁酸钠单独或联合用药对肺癌干细胞增殖的影响 |
| 2.3 丁酸钠单独或联合用药对肺癌干细胞凋亡的影响 |
| 2.4 丁酸钠单独或联合用药对肺癌干细胞迁移的影响 |
| 2.5 丁酸钠单独或联合用药对肺癌干细胞自我更新的影响 |
| 3 讨论Discussion |
四、丁酸钠抑制人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤生长的研究（论文参考文献）
- [1]LSD1上调LEF1促进上皮间质转化及膀胱癌进展[D]. 谢秋波. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [2]基于MAPK通路调控GRASP65探讨二氢杨梅素抗卵巢癌的作用及机制研究[D]. 王凤杰. 重庆医科大学, 2020(01)
- [3]核蛋白PCNP对人甲状腺癌细胞生长的调节作用研究[D]. 陈亚歌. 河南大学, 2020(03)
- [4]基于代谢组学及自噬和凋亡调控途径研究蛇葡萄素抑制结直肠癌生长的作用机制[D]. 朱丽娟. 兰州大学, 2020(01)
- [5]rhIL-24对食管鳞癌细胞KYSE450中CSC亚群体内增殖的抑制作用研究[D]. 葛建林. 北京交通大学, 2019(01)
- [6]Rab25及TAM M2极化介导NSCLC厄洛替尼耐药机制及干预研究[D]. 王建敏. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [7]正丁酸钠联合多西他赛通过抑制Gli1调控肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的研究[D]. 蒋玮. 广西医科大学, 2019(07)
- [8]基于Rap1GAP介导FAK/ERK信号探讨淫羊藿苷干预结肠癌增殖转移的作用及机制[D]. 张蕾. 扬州大学, 2019(06)
- [9]酮体对HeLa细胞生长与凋亡的影响[D]. 苏佳佳. 浙江师范大学, 2018(12)
- [10]丁酸钠联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对肺癌干细胞生物学行为的影响[J]. 史红阳,纪玉强,张德信,刘昀,方萍. 中国组织工程研究, 2017(21)