一、异基因小鼠胸腺细胞微囊移植治疗SLE的实验观察（论文文献综述）
雍翔智[1]（2019）在《异基因造血干细胞移植后患者外周血差异表达miRNA与口腔cGVHD关系的研究》文中研究指明背景:口腔慢性移植物抗宿主病（Oral chronic graft versus host disease,cGVHD）是一种异基因造血干细胞移植（allogenetic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT）后的常见并发症,是影响患者移植后长期生存质量的因素之一。但目前口腔cGVHD病因尚不明确。非编码微小RNA（micro RNA,mi RNA）可通过调节相关靶基因的表达,从而调控各种免疫细胞的产生、增殖、发育以及免疫应答。目前mi RNA已被发现可作为多种疾病发生发展及预后的生物学标志。目的:通过分析口腔cGVHD与无口腔cGVHD患者外周循环血mi RNA的表达差异,通过生物信息学分析与验证,初步分析mi RNA在口腔cGVHD发生发展中可能的调控作用。方法:1.回顾分析94例HLA全相合的异基因干细胞移植患者病史资料,探讨口腔cGVHD的临床特点及其发生与患者性别、预处理方案ATG使用情况等患者性别、女供男移植、移植物来源、回输单个核细胞数等临床指标的相关性。2.口腔cGVHD、无口腔cGVHD、健康对照各8例取外周静脉血,构建mi RNAs文库,采用Illumina Hiseq 2500平台进行测序,分析mi RNAs差异表达,通过Go term和KEGG等生物信息学技术分析探索与口腔cGVHD发生有关的信号通路。3.采用定量实时荧光定量PCR（quantitative real time PCR,q RT-PCR）检测15例口腔cGVHD、15例无口腔cGVHD、15例健康对照外周静脉血mi RNA-505-5p、mi RNA-769-5p表达情况,通过Go term和KEGG等生物信息学分析其靶基因及作用信号通路。4.采用q RT-PCR检测口腔cGVHD和无口腔cGVHD各15例外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）中Smad2（Drosophila mothers against decapentaplegic protein 2）表达水平,采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测各组血浆中Smad2蛋白含量。结果:1.在94例HLA全相合的异基因干细胞移植患者中,46.8%出现口腔cGVHD。移植后300天内未发生口腔cGVHD的患者在其后发生口腔cGVHD的可能性较低。口腔cGVHD表征多样,除了特征性的网状白色条纹样病损,口干、溃疡/糜烂是最常见的口腔表征,出现比例分别为63.63%与50%。这些病损可单独伴随网状白色条纹样病出现或多种同时出现。口腔cGVHD组患者口腔表征评分为3.81±2.06,VAS评分为3.31±2.13,两者呈正相关。未发现患者性别、预处理方案ATG使用情况、女供男移植、移植物来源、回输单个核细胞数等临床指标与口腔cGVHD的发生存在相关性。2.口腔cGVHD与无口腔cGVHD组比较发现,在两组中均有表达mi RNA为549个,具有显着性差异为72个,包括上调表达32个,下调表达40个;口腔cGVHD组与健康对照组比较发现,在两组中均有表达mi RNA为547个,具有显着性差异为327个,包括上调表达164个,下调表达163;无口腔cGVHD组与健康对照组比较发现,在两组中均有表达mi RNA为546个,具有显着性差异为245个,包括上调表达160个,下调表达85个;三组比较发现三组中均有表达mi RNA为518个,显着差异191个。mi RNAs靶基因主要集中在生化过程中的转录环节、细胞组分中的膜蛋白及分子功能中的蛋白结合。差异基因主要集中在癌相关通路、调节磷脂酰肌醇3—激酶/蛋白激酶B（Phosphatidylinositol 3-Protein kinase B,PI3K-Akt）等信号通路。3.非口腔cGVHD患者外周血循环mi RNA-769-5p、mi RNA-505-5p表达最高,口腔cGVHD患者次之,健康对照最低。通过ROC分析mi RNA-769-5p、mi RNA-505-5p在口腔cGVHD诊断上具有一定价值,通过生物信息学方法分析得知口腔cGVHD发生可能与PI3K-Akt信号通路,TGF-β/Smad信号通路相关。4.口腔cGVHD组患者血浆中Smad2蛋白及PBMC中Smad2 m RNA表达较无口腔cGVHD组增高。外周血Smad2 m RNA表达与mi RNA-769-5p呈负相关。结论:1、口腔cGVHD是allo-HSCT后的常见并发症,常发生于移植后300天内。口腔cGVHD表征多样,除了特征性的网状白色条纹样病损,口干、溃疡/糜烂是最常见的口腔cGVHD表征。尚未发现患者性别、预处理方案ATG使用情况等患者性别、女供男移植、移植物来源、回输单个核细胞数等临床指标与口腔cGVHD的发生存在相关性。2、口腔cGVHD、非口腔cGVHD、健康对照之间外周血循环mi RNA存在差异性表达。mi RNA可能通过影响PI3K-Akt、TGF-β/Smad等信号通路参与口腔cGVHD的发生,mi RNA-769-5p、mi RNA-505-5p在口腔cGVHD诊断上具有一定价值。3、外周循环血内的高表达的Smad2可能与口腔cGVHD发生有关。
徐太哲,李丽,王长山[2]（2016）在《小鼠胚胎胸腺移植方法和实验研究》文中研究说明目的:探讨T细胞剔除的同种胎胸腺在老龄小鼠肾被膜下血运重建、免疫功能和外周血T细胞池重建恢复。方法:对10只胸腺老化萎缩的BALB/c老龄（16月龄）小鼠施行胚胎胸腺移植,供体为BALB/c小鼠妊娠14d（E14d）的胎鼠,将胎鼠胸腺小叶移植于受体BALB/c老龄（16月龄）小鼠肾被膜下,无菌缝合结扎逐层结扎封闭腹腔。术后连续5d给予环孢素A10mg/kg体重静脉注射。结果:受体BALB/c老龄（16月龄）小鼠10只全部存活,无排斥反应,移植后移植胸腺恢复血运,重建免疫、恢复免疫功能。结论:老龄小鼠胸腺组织在肾被膜下移植3周后血运重建良好,术后6周恢复发挥对新生T淋巴细胞选择发育功能。
张翊[3]（2013）在《超声介导的微泡破坏促进MSCs归巢并修复糖尿病肾病的实验研究》文中研究表明研究背景：糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是终末期肾脏疾病（end-stage renal disease,ESRD）的主要原因，与ESRD较高的死亡率密切相关。目前广泛认为小管间质损害是ESRD可靠的预测因子并与肾功能障碍密切相关。微量白蛋白尿是糖尿病肾病的早期征象。现有许多证据表明对糖尿病肾病进行早期干预和精确调控可以减缓，甚至逆转糖尿病肾病的进程。因此，对早期糖尿病肾病进行及早干预、提高治疗物质在肾间质的聚集是目前医学领域亟待解决的问题。目前治疗糖尿病肾病的常用方法诸如调控血糖、胰腺和肾脏移植、透析治疗等虽然能改善肾功能，却因当前药物治疗和治疗技术的有限性，导致并发症多、生存质量不高，效果并不显着。骨髓来源的间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs）移植治疗是近年来国内外研究的重点，其易于分离提取，具有高度的扩增潜能，有良好的基因稳定性、组织相容性好、不涉及伦理道德问题，为受损组织和器官的修复开辟了一条新途径。MSCs能够分化为功能性的胰岛素生成细胞，逆转糖尿病大鼠高血糖状态，也能够分化为肾脏细胞修复受损肾脏。因而，MSCs移植治疗被认为是改善高血糖和肾功能的、具有极大吸引力的治疗手段。但骨髓中MSCs含量极少，远远小于肾脏修复所需要细胞的量，加上目前干细胞移植治疗移植后细胞存活率较低、干细胞靶向归巢能力欠佳等问题，均极大地限制了其应用。因此，如何调控骨髓干细胞的肾向性、提高干细胞靶向归巢能力和移植的有效性是干细胞移植治疗肾脏疾病的关键。超声介导的微泡破坏（Ultrasound-mediated microbubble destruction）作为一种新的、极具前景的治疗方法应用于多个领域，例如将药物和基因传递到心血管系统，开放血脑屏障和血瘤屏障，增强毛细血管和血管通透性以及促进干细胞归巢等。肾脏是高滤过器官，对生物学效应较为敏感，对于肾脏疾病的干细胞移植治疗，超声介导的微泡破坏作用是否同样有效呢？研究显示，超声基因转染治疗仪（1.0W/cm2）联合自制微泡能有效促进MSCs归巢至肾脏，使急性肾损伤大鼠肾功能得到明显改善。该研究还发现，超声+微泡组大鼠肾脏ICAM-1mRNA表达高于对照组、超声+微泡+MSCs组大鼠肾脏ICAM-1mRNA表达高于单纯MSCs移植组，说明超声介导的微泡破坏可以增加MSCs的靶向黏附、提高MSCs归巢至肾脏的能力，进而更有效地实现MSCs靶向移植治疗肾脏疾病的效果。然而，关于慢性肾脏疾病的干细胞治疗，超声介导的微泡破坏作用对其影响的研究较少，本实验尝试利用超声介导的微泡靶向破坏作用，经静脉移植MSCs治疗链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）诱导的1型糖尿病肾病大鼠，并试图探索其安全性及可能机制，期望能提供一种新的、非侵入性的方法，对糖尿病肾病患者给予系统性药物治疗的前提下选择性增强干细胞在肾脏的聚集，最大化提高糖尿病肾病的治疗效果，为提高干细胞无创、有效地靶向归巢及减缓疾病进程、或是逆转糖尿病肾病病程进展提供一种新思路和新方法。研究目的：1.探讨诊断超声介导的微泡破坏促进经静脉移植的同源异体MSCs归巢糖尿病肾病大鼠肾脏的可行性和安全性；2.探讨在诊断超声介导的微泡破坏作用下，经静脉移植的MSCs对修复大鼠糖尿病肾病的有效性；3.初步探讨诊断超声介导的微泡破坏技术对促进静脉移植的MSCs靶向归巢并修复大鼠糖尿病肾病的可能机制。研究方法：1.采用全骨髓培养法对SD （Sprague Dawley）大鼠骨髓MSCs进行分离、培养、及纯化，检测其生物学特性。流式细胞仪检测细胞表面标记分子，成脂、成骨诱导分化进行细胞鉴定。为便于对体内干细胞的追踪，采用携带增强型绿色荧光蛋白的慢病毒对培养的MSCs进行转染，并观察转染后MSCs表达绿色荧光情况及细胞毒性反应。2.腹腔单次注射60mg/Kg SZT建立稳定的大鼠1型早期糖尿病肾病模型，随机血糖浓度和尿白蛋白排泄率（urinary albumin excretion rate, UAER）评价模型是否成功建立。3.①观察eGFP标记的MSCs归巢肾脏的情况。模型大鼠被随机分为MSCs组和超声+微泡+MSCs组，两组均经尾静脉移植MSCs，72h后采用激光共聚焦显微镜观察eGFP标记的MSCs在肾脏的定植情况，观察MSCs在MSCs组与超声+微泡+MSCs组肾脏内的荧光分布并进行阳性细胞计数和统计学比较。②超声介导的微泡破坏对糖尿病肾病模型大鼠肾脏通透性的影响。模型大鼠被随机分为三个批次，每一批次均分为对照组（未处理组）、超声组、微泡组与超声+微泡组。第一批次大鼠在注射伊文思蓝（evans blue, EB）同时接受相应处理，1小时后检测EB含量、激光共聚焦显微镜及透射电镜观察各组毛细血管通透性改变，实时荧光定量PCR （Real-Time PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）检测E选择素（E-selectin）的mRNA和蛋白表达，肾脏组织学观察超声介导的微泡破坏对组织结构的可能损害；第二批次大鼠（处理同第一批次）24小时后检测UAER评价超声介导的微泡破坏对肾脏滤过功能可能的影响；第三批次大鼠（恢复组）接受相应处理后24小时再接受EB注射，观察毛细血管通透性的恢复。4.模型大鼠被随机分为正常非糖尿病肾病组、未治疗组、超声+微泡组、MSCs组与超声+微泡+MSCs组。给予相应处理后1、2、4、8周每周固定时间点检测各组随机血糖浓度。8周后，检测大鼠UAER和血浆胰岛素水平、透射电镜观察肾小球和肾小管超微结构、肾脏PAS染色和胰腺HE染色观察肾脏和胰腺病理结构，胰腺组织免疫荧光双标技术观察胰岛β细胞和α细胞分布及数量恢复，酶联免疫吸附测定（Enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA）检测抗炎因子白细胞介素10（IL-10）的蛋白表达，免疫组织化学法（Immunohistochemistry, IHC）检测促纤维化因子TGF-β1在肾内的分布和表达，并进行半定量分析。结果：1.培养的MSCs贴壁生长，形态以梭形为主；细胞表面高表达CD44（99.44%）和CD90（99.37%），几乎不表达CD34（1.17%）和CD45（7.12%）。成脂诱导培养1周后油红O染色显示胞浆红色脂滴形成，成骨诱导2周后茜素红S染色显示红色钙结节形成。选择感染复数（Multiplicity of infection, MOI）为10转染MSCs，转染后72h荧光显微镜下观察，绝大部分MSCs呈现明亮的绿色荧光，eGFP转染阳性率约90%。转染后MSCs形态仍为梭形，生长良好，未见明显毒性反应，传代后荧光表达稳定。2. STZ注射3天后，大鼠逐渐出现多饮、多食、多尿、精神萎靡、活动减少、反应迟钝、鼠毛稀疏、晦暗无光泽等体征，连续3天监测随机血糖浓度均大于16.7mmol/L，提示1型糖尿病模型建立成功。糖尿病模型成功建立后4周，血糖值稳定在20.8-33.8mmol/L之间，大鼠出现微量白蛋白尿，UAER值从（18.64±6.43μg/mg，对照组）升高至（46.79±15.42μg/mg，糖尿病肾病组）。胰腺及肾脏病理学均提示早期糖尿病肾病模型成功复制。3.①荧光显微镜计数并比较MSCs组与超声+微泡+MSCs组肾内eGFP阳性细胞数，分别为（5.7±0.8）个，（18.3±2.9）个，差异有统计学意义（P＜0.01）。eGFP标记的MSCs主要位于肾间质毛细血管外、管周区域，少数位于肾小球。②超声联合微泡组肾内EB蓝染面积最明显，表面与冠状面蓝染面积分别为（49.12±7.31）%和（37.99±4.36）%，超声组肾内有轻微蓝染，表面与冠状面蓝染面积分别为（9.37±3.45）%和（10.10±3.24）%，对照组和微泡组未见蓝染。③超声联合微泡组的EB含量（37.267±4.948μg/g）明显高于对照组（13.942±2.848μg/g）、超声组（14.126±2.570μg/g）、微泡组（13.969±2.076μg/g）和恢复组（14.658±3.916μg/g）。④激光共聚焦结果显示超声+微泡组肾间质毛细血管周围EB渗出较其他组为明显，似呈“渔网状”，余各组未见EB渗出。⑤透射电镜观察到超声辐照后间质毛细血管壁变薄，变得不连续、不光滑，对照组、超声组和微泡组的间质毛细血管保持完整。⑥超声+微泡组E-selectin的mRNA和蛋白表达明显高于对照组、超声组和微泡组。⑦肾脏HE染色后观察，各组肾脏组织没有出血、坏死和肾脏结构的改变。⑧各组之间UAER值没有统计学差异。⑨各组未见血尿。4.①细胞治疗后1周，MSCs组和超声+微泡+MSCs组血糖浓度明显降低。细胞移植后第2周，血糖浓度降到最低水平并持续至整个实验阶段。细胞治疗后8周，MSCs组和超声+微泡+MSCs组，血糖浓度无明显差异（23.8±5.5mmol/L&24.0±4.6mmol/L,P=0.395）。未治疗组和超声+微泡组直至实验结束仍保持较高血糖水平，浓度分别为（28.4±6.2） mmol/L及（27.9±6.5） mmol/L。②细胞治疗后8周，与正常组（25.27±2.34mIU/L）相比，未治疗组和超声+微泡组的血浆胰岛素水平明显降低，分别为（16.42±2.17） mIU/L和（16.67±2.33） mIU/L，二者之间无明显统计学差异，而MSCs组和超声+微泡+MSCs组的血浆胰岛素水平有所上升，分别为（19.31±1.68） mIU/L和（19.53±1.59） mIU/L，二者之间也无明显统计学差异。③细胞治疗后8周，未治疗组和超声+微泡组的UAER值均保持较高水平，分别为（643.25±204.58） μg/mg和（637.29±212.24） μg/mg。该值约4倍高于同时期正常组大鼠UAER值（128.57±36.93μg/mg）。MSCs组和超声+微泡+MSCs组的UAER值明显降低，分别为（302.41±49.21） μg/mg和（252.83±39.58） μg/mg。尽管MSCs组和超声+微泡+MSCs组的UAER值均未降至正常水平，但超声+微泡+MSCs组的UAER水平明显低于MSCs组。④MSCs治疗后8周，未治疗组和超声+微泡组大鼠肾小球基底膜增厚，细胞外基质增生，系膜区增宽，足突广泛融合、增宽；肾小管上皮细胞胞浆内可见髓鞘样结构，小管上皮细胞微绒毛肿胀，线粒体肿胀并伴大量空泡变。MSCs组大鼠肾小球基底膜增厚、细胞外基质增生以及系膜区增宽情况减轻，小部分足突融合，大部分修复；肾小管上皮细胞部分线粒体肿胀伴少量空泡变性。超声+微泡+MSCs组大鼠肾小球基底膜大部分未见明显增厚，细胞外基质增生明显减轻，系膜区未见增宽，足突融合明显好转；肾小管上皮细胞线粒体轻度肿胀，未见明显空泡变性。⑤肾脏PAS染色显示，至整个实验结束，未治疗组与超声+微泡组的肾小球和肾小管在光镜下有类似改变，均表现为肾小球硬化、体积增大、基底膜增厚、系膜区增宽、系膜基质增生和肾小管扩张，肾小管上皮细胞空泡变性。MSCs组和超声+微泡+MSCs组上述情况均明显好转，MSCs组仅有一小部分肾小球硬化和肾小管扩张，超声+微泡+MSCs组光镜下可观察到几乎正常的肾小球和肾小管结构。⑥胰腺HE染色和胰腺组织免疫荧光双标检查均显示，未治疗组和超声+微泡组胰岛和胰岛β细胞大面积破坏，与正常组胰岛或胰岛β细胞相比，胰岛形态不规则、体积减小、胰岛素生成细胞数量减少并向周边分布，而胰高血糖素生成细胞数量增多并向中央分布。MSCs移植治疗后8周，MSCs组和超声+微泡+MSCs组胰岛或胰岛β细胞无论在数量、结构或是体积上均明显改善，经治疗后的胰岛素生成细胞重新向胰岛中央分布，胰高血糖素生成细胞重回周边分布。⑦免疫组织化学法检测TGF-β1在正常组中有少量表达，在未治疗组和超声+微泡组中强表达，MSCs组表达次之，超声+微泡+MSCs组弱表达，半定量分析后显示，超声+微泡+MSCs组与MSCs组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。⑧ELISA法检测IL-10在正常肾组织中高表达，未治疗组和超声+微泡组中表达明显降低，而MSCs组表达增加，超声+微泡+MSCs组表达进一步增加。结论：1.成功实现大鼠MSCs的分离、培养及纯化，骨髓贴壁法是获取、纯化、扩增MSCs简便、易行的方法。通过生长曲线、细胞周期、透射电镜等生物学特性检测，提示培养的MSCs呈低分化状态，有较强的自我更新能力。通过流式细胞仪检测细胞表面标记分子，以及体外成脂、成骨诱导分化，初步判定所获细胞为MSCs。2.腹腔单次注射链脲霉素（60mg/Kg）可建立稳定的大鼠1型糖尿病肾病模型，随机血糖浓度和UAER可有效评价模型是否成功建立。3. eGFP转染MSCs可有效示踪MSCs在靶器官的分布，按照MOI=10转染细胞，细胞转染后无明显毒性且荧光表达稳定，其方法简便，操作便捷，可应用于MSCs的标记。4.诊断超声介导的微泡破坏技术可增加糖尿病肾病大鼠肾间质毛细血管通透性，为经静脉移植的MSCs归巢并修复受损肾脏提供了研究基础。其可能机制为超声介导的微泡破坏所产生的空化效应可刺激超声辐照区域肾间质毛细血管的破裂及局部炎症发生，上调E-selectin炎症因子的表达，改变微环境，进而增加移植的MSCs向受损肾脏聚集与归巢。5.超声介导的微泡破坏技术在合适的参数下对肾脏可能是安全的，对大鼠肾脏滤过功能没有影响。肾间质毛细血管通透性的增加是可逆的，24小时后可恢复到正常水平。6.诊断超声介导的微泡破坏产生的空化效应通过增加间质毛细血管通透性、增加炎症因子E-selectin的表达，局部改变微环境，促进更多的外源性MSCs黏附、聚集、归巢至肾间质，抑制促纤维化因子TGF-β1表达，减轻肾小管和间质损害，阻止糖尿病肾病的进程。7. MSCs移植通过旁分泌效应产生抗炎因子IL-10，调节炎性细胞因子/抗炎细胞因子的产生，抑制机体炎症反应，从而减轻肾小球增大和肾小管扩张程度，延缓肾损害，保护肾脏。8. MSCs移植降低血糖浓度，促进胰岛恢复，有效遏制糖尿病肾病的进程，对促进肾脏修复产生积极作用。
刘伟[4]（2012）在《输注FasL基因转染的血管内皮细胞抑制大鼠肝移植急性排斥反应的研究》文中研究指明背景：免疫豁免区域表达有高水平的FasL,仔细的研究表明这些免疫豁免区域的细胞通过表达的FasL和渗透的炎症细胞上表达的Fas相互作用并诱导其凋亡来实现其免疫豁免的效果。我们合理的设想这种FasL和Fas的相互作用可以用于保护移植物免受急性排斥。我们进一步设想血管内皮细胞,因为其不受FasL的杀伤作用可以用作FasL基因表达的载体。方法：我们先行建立了慢病毒rFasL/嘌呤霉素表达体系,以进一步使转染的内皮细胞特异性而且持续的表达FasL。具体实验中我们先建立大鼠急性肝移植排斥模型的并将其分为四组：第一组为肝移植后规律使用FK506抗排斥的阳性对照组,第二组为肝移植后不做任何其他处理的阴性对照组,第三组为在肝移植过程中输注转染FasL基因的内皮细胞的实验组,第四组为输注携带FasL基因慢病毒的对比组。每组24对供受体大鼠。我们分别观察术后各组大鼠的AST和BIL数值和各组的术后生存天数。结果：输注转染FasL的内皮细胞组和输注携带FasL基因病毒组的AST和BIL数值介于使用FK506的阳性对照组和不做任何处理的阴性对照组之间。术后输注转染FasL的内皮细胞组和输注携带FasL基因病毒组的大鼠的生存天数明显长于阴性对照组,但短于使用FK506的阳性对照组。结论：这个在体实验清楚地证明转染FasL基因的内皮细胞和携带FasL基因的慢病毒输注能显着保存移植物的功能和延长其生存天数。
葛锦峰[5]（2012）在《IDO基因过表达诱导小鼠肺移植慢性排异免疫耐受的实验研究》文中研究指明背景：肺移植是目前治疗终末期肺病唯一有效方法，术后一年生存率可达71%，但5年生存率低于50%，为目前实体器官移植中最低。影响肺移植患者长期生存的主要原因为移植后的慢性排异，其特征性表现为闭塞性细支气管炎（ObliterativeBronchiolitis，OB），而现有的免疫抑制剂常无法逆转。诱导供体或受体自身免疫抑制或免疫耐受，对预防和治疗移植后急慢性排异的发生，延长移植物存活、提高受体的生活质量都具有重要的意义。IDO（indoleamine2，3-dioxygenase，吲哚胺2，3二加氧酶）为细胞内一种色氨酸沿犬尿酸途径分解代谢的限速酶，在诱导自身免疫疾病、母胎免疫耐受、肿瘤免疫逃逸及移植免疫耐受等方面均发挥重要的调节作用，被称为免疫抑制酶。研究发现，通过基因治疗调控IDO的表达可以保护细胞和组织移植物，诱导产生移植后免疫耐受。本课题设计建立小鼠颈部异位气管移植模型来模拟肺移植慢性排异过程，并构建重组腺病毒IDO基因表达载体转染供体小鼠气道上皮，使之高表达IDO，研究移植气道上皮IDO过表达在减轻闭塞性细支气管炎，诱导肺移植慢性排异免疫耐受中的作用及可能机制，为今后适用于临床提供理论依据。第一部分Gateway技术构建重组腺病毒IDO基因表达载体目的：利用Gateway分子克隆技术构建含报告基因EGFP的重组腺病毒IDO基因表达载体，并对经菌落PCR筛选、测序鉴定的重组腺病毒载体进行病毒包装、纯化及滴度测定。方法：利用Gateway分子克隆技术方案，由重叠PCR先扩增、合成含attB1-kozak-IDO1/IRES/EGFP-attB2目的基因片段，再经BP反应合成pDown-IDO1/IRES/EGFP目的基因入门克隆，最终由LR反应合成pAV.Ex1d-CMV>IDO1/IRES/EGFP重组腺病毒目的表达载体。将以上经菌落PCR筛选、测序鉴定正确的载体质粒转染HEK293A包装细胞扩增，收集、纯化含病毒颗粒上清液，采用TCID50法测定病毒滴度。结果：基因测序鉴定经菌落PCR筛选的pDown-IDO1/IRES/EGFP及pAV.Ex1d-CMV>IDO1/IRES/EGFP载体质粒，其基因序列与实验设计IDO基因序列完全一致。导入HEK293A包装细胞后，可见报告基因EGFP亮绿色荧光蛋白表达。TCID50法测定病毒滴度为3.16×1010PFU/ml。结论：成功构建含报告基因EGFP的重组腺病毒IDO基因表达载体，导入HEK293A包装细胞后能产出高滴度的重组腺病毒用于转基因治疗。第二部分IDO基因转染小鼠气道上皮的可行性研究目的：将携带IDO基因的重组腺病毒载体转染体外培养的小鼠气道上皮，观察气道上皮细胞IDO基因转染的表达效率及酶活性；同时建立经气道病毒转染模型，探讨IDO基因活体转染气道上皮的可行性。方法：原代提取、培养小鼠气道上皮细胞，行IDO基因重组腺病毒转染，同时设空载体转染组和空白组对照。荧光显微镜下观测各组气道上皮细胞生物活性及病毒转染效率，并经qRT-PCR、Western blot技术检测上皮细胞IDO mRNA及蛋白表达水平。收集各组培养液上清，采用高效液相色谱法（HPLC）检测上清液中色氨酸及犬尿氨酸含量以评估气道上皮细胞中IDO酶活性。建立小鼠经气道病毒转染模型，观察小鼠气道上皮IDO基因转染的表达时效及生物安全性。结果：采用感染复数MOI=50病毒量体外转染气道上皮24h后，其转染效率可达100%，但荧光较弱，提高MOI值，荧光随之增强，而细胞状态没有太大的差异。qRT-PCR、Western blot检测IDO基因转染后气道上皮细胞IDO mRNA及蛋白表达水平较空载体组、空白组明显增高（P<0.01）。经气道转染腺病毒，IDO基因大部分表达于气道上皮且持续时间超过3周，无呼吸系统损伤。HPLC检测发现，无论培养液上清，还是气道组织，IDO基因转染组的IDO活性皆显着高于空载体组和空白对照组（P<0.01）。结论：携带IDO基因的腺病毒在体内外皆可稳转气道上皮过表达IDO基因及蛋白，且具有酶活性。经气道途径转染腺病毒载体，气道上皮转染率、安全性高，时效可超过3周。第三部分IDO基因过表达诱导CD4＋T细胞/BMDCs免疫耐受第一节IDO基因过表达诱导CD4＋T细胞增殖抑制目的：通过建立小鼠气道上皮细胞与CD4＋T细胞体外共培养体系，探讨气道上皮细胞IDO基因过表达对CD4＋T细胞增殖活性、早期凋亡的影响及在上调CD4+CD25+Treg细胞FoxP3表达，诱导免疫耐受中的作用。方法：分别建立空白组、IDO转染组、GFP转染组、1-MT干预组小鼠气道上皮细胞与磁珠分选、纯化的CD4＋T细胞共培养体系。经CD3/CD28刺激共培养72h后，采用CCK8法、AnnexinV-FITC与PI双染法检测各组CD4＋T细胞增殖活性、早期凋亡率。采用混合淋巴细胞反应（MLR）、流式细胞分析检测各组共培养后CD4＋T细胞免疫功能及CD4+CD25+Treg细胞中FoxP3表达变化。采用HPLC检测各组共培养液上清中IDO活性。结果：经体外刺激共培养72h后，CCK8法检测IDO转染组CD4＋T细胞增殖刺激指数（SI）明显低于对照组、GFP空载体组（P<0.01）；当加入IDO特异性抑制1-MT后，增殖指数明显升高（P<0.01）。AnnexinV-FITC与PI双染法检测IDO转染组早期凋亡率明显高于对照组、GFP转染组（P<0.01），加入1-MT后早期凋亡率下降（P<0.01）。流式细胞分析CD4＋T细胞表型发现，IDO转染组Treg细胞FoxP3表达比例显着高于对照组、GFP空载体组（P<0.01）；加入1-MT后，FoxP3表达下降（P<0.01）。MLR检测各组共培养后CD4＋T细胞刺激脾淋巴细胞增殖能力显示：IDO转染组脾淋巴细胞增殖抑制率明显高于对照组、GFP空载体组（P<0.01），当加入1-MT处理后，其刺激脾淋巴细胞增殖抑制率下降（P<0.01）。HPLC检测各组共培养液上清中IDO活性，其IDO转染组显着高于对照组及GFP转染组（P<0.01）；加入1-MT后IDO活性下降（P<0.01）。结论：共培养体系中，气道上皮IDO基因过表达能明显抑制CD4＋T细胞活化增殖，诱导其凋亡；并可上调CD4+CD25+Treg细胞表达FoxP3，产生免疫耐受；此种效应为IDO依赖性，可被其阻滞剂1-MT所阻断。第二节IDO基因过表达对BMDCs成熟分化的影响目的：体外扩增、培养BMDCs细胞，观察其成熟、表型分化特点。通过建立小鼠气道上皮细胞与BMDCs刺激共培养体系，探讨气道上皮细胞IDO基因过表达对BMDCs成熟、表型分化的影响及在诱导BMDCs免疫耐受中的作用。方法：采用rGM-CSF（10ng/ml）、rIL-4（4ng/ml）体外扩增、培养BMDCs，观察其形态学及表型成熟分化特点。于培养第7d分别建立与空白组、IDO转染组、GFP转染组、1-MT干预组小鼠气道上皮细胞在LPS（1ug/ml）刺激下共培养体系。72h后，采用流式细胞分析检测各组BMDCs中MHCII、CD86/80表型分化变化，并由混合淋巴细胞反应（MLR）评价其免疫功能，HPLC检测各组共培养液上清中IDO活性。结果：体外扩增、培养BMDCs，7d前为未成熟DCs，经LPS（1ug/ml）刺激培养72h后可分化为成熟DCs。未成熟BMDCs与各组气道上皮细胞经LPS刺激共培养72h后，IDO转染组BMDCs表面MHCII、CD80/86分子表达明显低于对照组、GFP转染组（P<0.01）；加入1-MT后DCs细胞表面分子表达增强（P<0.01）。MLR评价各组共培养后BMDCs刺激脾淋巴细胞增殖能力显示：IDO组BMDCs刺激脾淋巴细胞增殖率明显低于对照组、GFP转染组（P<0.01）；加入1-MT后，其刺激脾淋巴细胞增殖能力增强（P<0.01）。HPLC检测各组共培养液上清中IDO活性，IDO组显着高于对照组、GFP转染组（P<0.01），加入1-MT后IDO活性下降（P<0.01）。结论：共培养体系中，气道上皮细胞IDO基因过表达可明显抑制BMDCs表面MHCII、CD80、CD86分子的表达，阻碍其进一步分化成熟，诱导其产生耐受性。且此种效应为IDO依赖性，可被其阻滞剂1-MT所阻断。第四部分小鼠异位气管移植模型模拟肺移植慢性排异目的：建立小鼠异位气管移植模型来模拟肺移植后慢性排异特征性表现闭塞性细支气管炎（OB）的病理过程，为研究肺移植慢性排异提供实验平台。方法：30只小鼠随机分入实验组、对照组，每组各15只，分别进行小鼠颈部异位气管移植。其中实验组受体为C57BL/6（H-2b）近交系小鼠，对照组为BALB/c（H-2d）近交系小鼠，两组供体气管皆取自BALB/c近交系小鼠。各组分别于术后7d、14d、28d随机处死5只受体鼠，取移植气管进行组织病理学评价、CD3+T细胞免疫组化染色分析、并测定其气管闭塞程度。结果：实验组移植气道免疫病理损伤随移植时间延长而加重，28d移植气道完全闭塞，与临床闭塞性细支气管炎的病理过程相似。实验组病理评分、CD3+T细胞浸润及气管闭塞程度显着高于对照组（P<0.01）。结论：小鼠异位气管移植模型可模拟肺移植后慢性排异-闭塞性细支气管炎的免疫病理过程。该模型操作简单，建模稳定，可用于肺移植慢性排异的相关研究。第五部分IDO基因过表达减轻肺移植慢性排异-闭塞性细支气管炎的研究目的：在小鼠异位气管移植模型基础上，探讨小鼠移植气道上皮IDO基因过表达在诱导肺移植慢性排异免疫耐受，减轻闭塞性细支气管炎中的作用及可能的机制。方法：60只受体C57BL/6（H-2b）小鼠随机平均分入对照组、IDO转染组、GFP转染组、1-MT干预组，建立颈部异位气管移植模型。供体移植气管皆取自BALB/c（H-2d）小鼠，其中IDO组供体气管经重组IDO腺病毒转染，GFP组供体气管经空载体转染7d后移植。各组于术后7d、14d、28d随机处死5只受体鼠，取异位移植气管进行组织病理学、CD3+T细胞免疫组化检查，并对IDO组移植气管进行冰冻切片，荧光显微镜下观察移植后IDO基因表达情况。建模第7d，取各组移植气管及旁淋巴结组织，进行组织内T淋巴细胞增殖活性及Th17、Treg细胞流式检测。实验末，采用HPLC检测外周血、移植气管及旁淋巴组织内IDO活性。结果：各实验观察点IDO组移植气道免疫病理损伤明显较其他组为轻，其病理评分、CD3+T细胞浸润及气管闭塞程度显着低于对照组、GFP转染组、1-MT干预组（P<0.05）。对IDO组移植气管进行冰冻切片，荧光显微镜下观察：移植后IDO基因表达可持续4周。流式细胞检测移植后7d气道组织及旁淋巴结T细胞增殖活性，IDO组T细胞增殖率明显低于其他各组，同时Treg细胞比例增多，Th17细胞比例相应减少，差异有统计学意义（P<0.01）。HPLC检测移植气道、旁淋巴组织及血浆内IDO活性，IDO组明显高于其他各组（P<0.01）；而血浆内各组IDO活性比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论：移植气道上皮IDO基因过表达能减轻闭塞性细支气管炎免疫病理损伤，诱导肺移植慢性排异免疫耐受，其机制可能与移植气道上皮局部IDO活性增高，减轻组织T淋巴细胞浸润，抑制T淋巴细胞增殖活化，诱导初始T细胞分化由Th17细胞向Treg细胞偏移有关。
刘歆春[6]（2011）在《IL-17在大鼠肝移植急性排斥反应模型中的表达及作用研究》文中研究表明第一部分大鼠肝移植急性排斥反应模型的建立目的：建立稳定的近交系大鼠肝移植急性排斥反应模型。方法：（1）预实验中采用改良Kamada s "双袖套法”建立大鼠肝移植模型。实验动物采用封闭群雄性SD大鼠,本阶段共实施大鼠肝移植120例,术后均不使用免疫抑制剂。（2）在预实验的基础上,建立30例Lewis→BN近交系大鼠的肝移植急性排斥反应模型,并根据Banff分级评分方案来评价排斥反应的强度。结果：（1）120例封闭期SD大鼠肝移植分为建模训练期40例,建模成熟稳定期前期40例和后期40例。在建模成熟稳定后期的40例手术中：手术成功率为92.50%,1W存活率为82.5%,无肝期为17.23+2.32min。（2）30例Lewis→BN近交系大鼠的肝移植模型中,急性排斥反应评分在术后第1、3、5、7和9天逐渐上升。结论：采用改良Kamada s’‘双袖套法”,成功建立了稳定的Lewis→BN近交系大鼠原位肝移植急性排斥反应模型,术后3-9天为本实验研究的最佳时间。第二部分大鼠肝移植急性排斥反应模型中IL-23对NKT细胞生成IL-17的影响目的：（1）研究在大鼠肝移植急性排斥反应中NKT细胞能产生IL-17。（2）IL-23能影响NKT细胞生成IL-17。方法：实验动物分成2组,各组18对,采用改良的Kamada s"双袖套法”建立肝移植模型。A组为同种同基因移植组,即Lew→Lew;B组为同种异基因移植组（急性排斥组）,即Lewis→BN。于移植术后第3、7和9天分别在两组中随机挑选受体鼠6只,用ELISA检测肝组织匀浆中IL-17和IL-23水平；应用流式细胞术检测肝组织中NKT细胞分泌IL-17的情况；应用单向混合淋巴细胞培养法证实IL-23是否对NKT细胞分泌IL-17产生影响。结果：在移植术后第3、7和9天,和A组比较,B组肝细胞匀浆中IL-17和IL-23的水平均显着升高（P<0.05）；在移植术后第7天,与A组比较,B组中IL-17阳性细胞占NKT细胞的比值呈显着性增加（P<0.05）；在单向混合淋巴细胞培养中,使用重组IL-23能促进NKT细胞生成IL-17,而使用抗IL-23单克隆抗体则抑制NKT细胞生成IL-17（P<0.05）。结论：（1）大鼠肝移植急性排斥反应中,NKT细胞能生成IL-17。（2）大鼠肝移植急性排斥反应中,IL-23能影响NKT细胞生成IL-17。第三部分IL-17在大鼠肝移植急性排斥反应模型中的表达和作用目的：（1）研究IL-17在大鼠肝移植急性排斥反应中的表达情况。（2）研究IL-17在大鼠肝移植急性排斥反应中可能的作用机制。方法：实验动物分成3组,各组6对,采用改良的Kamada’s’‘双袖套法”建立肝移植模型。A组为同种同基因移植组,即Lew→Lew;B组为同种异基因移植组（急性排斥组）,即Lewis→BN。C组为同种异基因移植+抗IL-17单抗组,即Lewis→BN,在术后第1、2和3天在受体鼠内注射抗IL-17单克隆抗体。于移植术后第7天处死各组的受体鼠后检测血清ALT、AST、TBIL水平；ELISA法检测血清IL-17水平；肝组织行HE染色,观察病理组织学改变；RT-PCR检测肝组织IL-17、INF-γ、ICAM-1及MIP-2mRNA的水平。结果：大鼠肝移植后第7天,与A组比较,B组血清ALT、AST和TBIL均明显升高（P<0.05）；病理学出现明显急性排斥反应改变；血清IL-17的表达明显升高（P<0.05）；移植肝中IL-17、IFN-y、ICAM-1及MIP-2mRNA表达均明显增高（P<0.05）,差异均具有显着性。与B组比较,C组血清ALT、AST口TBIL均明显降低（P<0.05）；病理学变化中急性排斥反应明显改善,RAI评分降低（P<0.05）；血清IL-17的表达均明显降低（P<0.05）；移植肝中IL-17、IFN-γ、ICAM-1及MIP-2mRNA表达均出现明显下降（P<0.05）,差异均具有显着性。结论：（1）IL-17参与了肝移植急性排斥反应,并且可能起到了促进急性排斥反应发生发展的作用。（2）IL-17参与急性排斥反应的作用机制可能是促进IFN-γ、ICAM-1及MIP-2等致炎因子的释放。
辛海明[7]（2009）在《CCR7基因转染小鼠未成熟树突状细胞诱导皮肤移植免疫耐受的研究》文中研究说明研究背景及研究目的临床上同种异体皮肤移植是目前大面积深度烧伤患者早期创面覆盖最直接、最有效的治疗方法,但是由于皮肤的强烈抗原特性,导致移植后3周左右外源皮肤就会发生不可逆的排斥反应,极大地限制了自体微粒皮混合大张异体皮移植效果。如何成功诱导出皮肤移植后的免疫耐受,临床上至今未发现非常有效的措施。树突状细胞（dendritic cells,DCs）是目前已知的功能最强大的专职抗原提呈细胞,在免疫反应中发挥了极其重要的作用。DCs的分化发育过程伴随着DCs由未成熟的前体细胞分化发育为成熟细胞,细胞的形态、表面标志以及生物学功能等都发生了相应变化。未成熟树突状细胞（immature dendritic cells,imDCs）因为其功能上最显着的特点就是可以诱导T淋巴细胞的特异性低应答而成为当前研究免疫耐受策略的热点,这也在我们前一个国家自然科学基金项目（No.30271341）中得到证实。利用imDCs或者基因修饰DCs进行的联合移植实验已经在肾、肝、心脏、胰腺和小肠等器官中取得了令人较为满意的效果,这为皮肤移植实验提供了非常有利的依据。DCs的发育成熟过程伴随着其表型的变化,包括摄取能力的减弱和MHC类分子、共刺激分子的表达上调,最终变成强大的抗原提呈细胞。研究发现imDCs在炎性介质作用下逐渐迁移成熟的过程中,其表面趋化因子受体-7（Chemokine receptor-7,CCR7）表达上调。通过CCR7与其配体MIP3β（即CCL19）和SLC（即CCL21）的相互作用,引导DCs趋化迁移至淋巴结,由此CCR7被认为是成熟树突状细胞（mature dendritic cells,mDCs）迁移归巢完成抗原递呈从而激活初始T细胞的主要受体之一。目前CCR7趋化迁移的能力在部分恶性肿瘤的转移中得到证实,研究表明CCR7严格调控了肿瘤细胞的转移。肿瘤细胞这种非随机的、有组织器官选择性的转移过程类似于免疫刺激过程中DCs的定向迁移。基于CCR7具有非常重要的趋化迁移功能,若DCs成熟度越高,CCR7表达更强,则免疫系统呈现更为强劲的免疫应答,反之则诱导免疫耐受。然而,由于imDCs缺乏CCR7的表达,向淋巴结的趋化迁移能力较弱,长时间处于非T细胞区易受各种炎症因子或者外来抗原的刺激而发育为mDCs,严重影响其诱导免疫耐受的效果。基于以上分析,本研究拟通过构建含有小鼠CCR7的重组腺病毒,尝试在imDCs上建立CCR7的表达,使imDCs获得原本mDCs才具有的高效迁移能力,避免imDCs在外周组织向成熟状态的分化,有效地确保其诱导免疫耐受功能的发挥,为临床上大面积深度烧伤患者早期创面覆盖引起的免疫排斥提供新的解决方法和思路。研究方法1、小鼠骨髓源树突状细胞的培养及鉴定小剂量rmGM-CSF和rmIL-4联合体外诱导培养BALB/c小鼠骨髓来源的imDCs,第5天收获得到一定数量的imDCs,加入rmTNF-α刺激细胞成熟而获得mDCs。通过光学显微镜及扫描电镜观察细胞的形态学变化,应用流式细胞仪检测细胞表面标志分子的表达水平。2、CCR7基因转染小鼠骨髓源未成熟树突状细胞及其功能鉴定采用梯度离心法将Ad空载体和Ad-ccr7腺病毒转染入imDCs,通过光学显微镜和扫描电镜来观察细胞形态学上的变化,应用流式细胞仪检测细胞表面的相应标志物,从而来观察Ad-ccr7腺病毒转染对小鼠骨髓源imDCs的成熟状态及形态的影响。采用Real-time PCR法、细胞免疫荧光法、Western Blot法检测Ad-ccr7腺病毒转染前后小鼠骨髓源树突状细胞CCR7mRNA及蛋白水平的表达变化。通过体外趋化试验和混合淋巴细胞反应比较观察Ad-ccr7腺病毒转染前后小鼠骨髓源DCs的体外迁移能力和体外刺激T淋巴细胞增殖能力。3、CCR7基因转染imDCs对小鼠异基因皮肤移植的影响在小鼠异基因皮肤移植实验中,我们将供者源imDCs、供者源mDCs、供者源imDCs+Ad、供者源imDCs+Ad-ccr7和供者源imDCs+Ad-ccr7+IL-10通过腹腔注射入受体小鼠体内,观察各组细胞对小鼠异基因移植皮片存活状况的影响,并通过组织学检查观察移植皮片的结构改变。实验结果1、小鼠骨髓源DCs的培养及鉴定结果体外培养的DCs经光学显微镜及扫描电镜观察发现:imDCs表面光滑,凹凸不平,毛刺状突起较少,而mDCs表面伸出许多较长的树枝样突起,突起长短不一,形态各异。流式细胞仪检测发现在imDCs中CD11c、CD80、CD83、MHCⅡ的阳性率分别为24.7%、9.4%、20.5%和20.5%,而在mDCs中CD11c、CD80、CD83、MHCⅡ的阳性率分别为86.5%、88.4%、76.9%和92.4%。这表明体外培养的DCs符合其典型形态学特征和表面标志水平。2、CCR7基因转染对小鼠骨髓源imDCs的影响2.1采用高速离心法将Ad-ccr7腺病毒转染入小鼠骨髓源imDCs内,其感染效率在MOI达到100时约有70%左右。在扫描电镜中可见imDCs转染腺病毒空载体和Ad-ccr7后,细胞形态不规则,表面粗糙,细胞表面的不规则膜性树枝状突起较未转染imDCs增多,而IL-10组细胞膜表面不规则突起明显减少,这说明IL-10可一定程度地抑制imDCs的成熟。小鼠骨髓源imDCs经腺病毒转染2天后,流式细胞术检测发现imDCs+Ad组细胞中CD11c、CD80、CD83、MHCⅡ的阳性率分别为40.0%、27.7%、28.5%和37.8%。imDCs+Ad-ccr7组细胞中CD11c、CD80、CD83、MHCⅡ的阳性率分别为37.8%、27.4%、21.3%和37.0%,而imDCs+Ad-ccr7+IL-10组细胞中CD11c、CD80、CD83、MHCⅡ的阳性率分别为20.5%、15.5%、21.6%和32.9%。这表明转染Ad空载体和Ad-ccr7腺病毒可促使imDCs表面标志略微升高,即向成熟方向发展,但加入细胞因子IL-10可略微下调这些表面标志的表达,在一定程度上抑制imDCs的成熟。2.2 Real-time PCR结果显示, imDCs中CCR7mRNA水平较低, mDCs中CCR7mRNA含量是imDCs的1.544倍。imDCs转染Ad空载体后,其CCR7mRNA含量是imDCs的1.115倍,imDCs转染Ad-ccr7腺病毒后,其CCR7mRNA含量是imDCs的2.941倍,而IL-10组中CCR7mRNA含量为imDCs的1.556倍,接近正常mDCs含量。这也说明Ad-ccr7腺病毒转染可以明显增加未成熟树突状细胞CCR7mRNA水平的表达,同时IL-10在一定程度上可以抑制转染过程中imDCs的成熟。2.3细胞免疫荧光结果显示imDCs和imDCs+Ad组细胞不表达CCR7,而mDCs细胞可表达CCR7。imDCs转染Ad-ccr7腺病毒后CCR7的表达增加,说明CCR7基因有效转入imDCs并表达蛋白。Western Blot结果通过Qulitity One软件分析显示:imDCs、imDCs+Ad、imDCs+Ad-ccr7、imDCs+Ad-ccr7+IL-10和mDCs中CCR7蛋白表达的相对含量分别为0.09、0.15、0.96、0.46和0.35。结果表明,imDCs和imDCs+Ad组中CCR7在蛋白水平几乎不表达,而转染Ad-ccr7腺病毒后imDCs的CCR7蛋白含量明显上升,其蛋白相对含量可以高于正常mDCs的含量。加入IL-10可以抑制imDCs朝成熟方向转化,但是其CCR7蛋白的表达含量仍可以达到mDCs的水平。2.4体外迁移实验结果表明imDCs细胞的体外趋化迁移率均低于5%,而mDCs、imDCs+Ad-ccr7、imDCs+Ad-ccr7+IL-10组细胞在CCL19作用下体外趋化迁移率均较imDCs组明显上升（aP<0.05）。而CCL19+anti-CCR7mAb组,在CCL19对抗剂anti-CCR7mAb作用下迁移率均有下降（dP <0.05）,但仍高于各自的空白组。这表明能够表达CCR7蛋白的转染病毒后imDCs及mDCs可在其配体CCL19的作用下增强体外迁移能力,同时anti-CCR7mAb可以在体外部分的拮抗其配体CCL19的作用。2.5混合淋巴细胞反应结果表明,imDCs以1:5比率与同种异体未致敏T淋巴细胞混合后imDCs组刺激T淋巴细胞增殖能力较弱,刺激指数为1.6±0.1,而mDCs组刺激T淋巴细胞增殖能力明显增强,刺激指数为5.6±0.3（aP<0.05）。腺病毒转染后细胞刺激T细胞增殖的能力较imDCs组增强但是弱于mDCs组,刺激指数分别为3.4±0.2和3.1±0.2,但是加入IL10可以明显降低刺激能力,刺激指数为1.8±0.1（bP<0.05）。表明腺病毒转染可部分增强imDCs的刺激增殖能力,但还是弱于mDCs,IL-10可抑制其促增殖能力。3、CCR7基因转染imDCs对小鼠异基因移植皮片的影响3.1通过与对照组（NS）相比较,供者源imDCs、供者源imDCs+Ad-ccr7、供者源imDCs+Ad-ccr7+IL-10组皮肤移植物的MST均明显延长（aP<0.05）,而供者源mDCs和imDCs+Ad组MST与对照组相比无显着性差异（P>0.05）,说明单纯使用供者源mDCs对移植皮片的存活无明显影响,但供者源未成熟DC的应用可延长皮片的存活时间。同时,供者源imDCs+Ad-ccr7+IL-10组MST较供者源imDCs组显着延长（bP<0.05）,而供者源imDCs+Ad-ccr7组MST较供者源imDCs组差异不明显（P>0.05）,显示供者源imDCs在转染腺病毒Ad-ccr7后,其诱导免疫耐受的能力较转染前提高,加入IL-10更能够显着提高皮片存活的时间。3.2组织切片活检显示皮肤组织结构较清楚,纤维组织结构排列有序,成纤维细胞多,真皮层内血管腔丰富,结构完整,大小不一,局部有炎性细胞浸润。表明皮片生长情况良好,白细胞的趋化功能正常。结论1、小鼠骨髓来源细胞在应用低剂量rmGM-CSF和rmIL-4联合刺激诱导后获得具有典型形态特征的imDCs和mDCs。2、Ad-ccr7腺病毒成功转染入小鼠骨髓源imDCs内。转染后小鼠imDCs在形态学及细胞表面标志分子上可向成熟状态分化,但IL-10可一定程度地抑制imDCs的成熟。3、Real-time PCR结果表明Ad-ccr7腺病毒转染可以明显增加未成熟树突状细胞CCR7mRNA水平的表达,同时IL-10在一定程度上可以抑制转染过程中imDCs的成熟。4、细胞免疫荧光及Western Blot结果表明,转染Ad-ccr7腺病毒后imDCs的CCR7蛋白含量明显上升。加入IL-10可以抑制imDCs朝成熟方向分化,但其CCR7蛋白的表达含量仍可以达到mDCs的水平。5、体外迁移实验表明imDCs细胞的体外趋化迁移率均较低,而转染Ad-ccr7腺病毒后imDCs在CCL19作用下体外趋化迁移率均较imDCs组明显上升。同时anti-CCR7mAb可以在体外部分的拮抗其配体CCL19的作用。6、混合淋巴细胞反应实验显示imDCs组刺激T淋巴细胞增殖能力较弱,而mDCs组刺激T淋巴细胞增殖能力明显增强。Ad-ccr7腺病毒转染后其刺激T细胞增殖的能力较imDCs组增强但是弱于mDCs组,加入IL10可以明显降低刺激能力。7、小鼠异基因皮肤移植实验表明,单纯使用供者源mDCs对移植皮片的存活无明显影响,供者源imDCs在转染Ad-ccr7腺病毒后可明显延长皮片的存活时间,加入IL-10更能够显着提高皮片存活的时间。
陆楠[8]（2009）在《急性移植排斥反应过程中HLA-G表达动态变化的实验及临床研究》文中认为背景:器官和组织移植是20世纪的医学壮举,为挽救人类生命做出了超乎寻常的贡献。随着组织配型、器官保存、移植手术、术后抗感染等一系列临床技术的不断进步,移植器官的存活率以及患者的生活质量和生存率都得到了很大的提高,使得器官移植成为治疗终末期器官功能衰竭最有效的治疗手段。然而,移植术后的排斥反应,尤其是急性排斥反应,仍然是导致移植器官功能丧失、甚至患者死亡最主要的原因。尽管移植物局部组织的病理活检可以对排斥反应做出明确诊断,而且一直被公认为是诊断移植排斥反应的金标准,但由于其具有创伤性、容易诱发并发症等缺点,在临床上难以成为常规的检查手段;临床常用的生化学等检查只有在移植器官组织结构明显异常,影响到器官功能时才能做出诊断。而目前研究较多的细胞因子、抗体等检查,则往往由于其准确性、敏感性、特异性方面的不足而无法得到广泛的应用。到目前为止,仍没有一种可以及时、准确诊断排斥反应的公认的检测方法。在无法准确了解患者免疫状态的情况下,免疫抑制剂是预防排斥反应发生的最有效的手段,但过量的免疫抑制剂往往导致严重感染和肿瘤等恶性疾病的发生。因此如何通过一种无创性的检测方法准确地反映患者的免疫状态并及时发现、预测排斥反应的发生是移植研究领域一个亟待解决的重大课题。只有这样,才能在预防排斥反应和减少免疫抑制剂用量之间寻找到一个适宜的平衡点,制定个性化的治疗方案,达到最佳的治疗效果。以往相关研究主要从淋巴细胞活化的角度加以研究,但从另一方面看,移植术后稳定的患者大多处于免疫抑制或免疫耐受状态,而发生排斥的患者则是打破了业已建立的免疫抑制状态而使得免疫细胞重新激活并发挥同种异体杀伤作用。那么能否从免疫耐受的角度着手,借观察宿主免疫耐受相关因素的变化来预测排斥反应的发生呢?胚胎植入是诱导免疫耐受最成功的典范,从本质上看,胚胎植入的过程,其实就是母体对带有父方异体抗原成分的胚胎的免疫耐受过程。器官移植和胚胎植入是两个密切相关的研究领域,虽然同样是同种异体之间的免疫应答,胚胎植入和器官移植的结局却截然相反,这其中涉及很多种蛋白和分子的参与。其中非经典主要组织相容性复合体（MHC）,尤其是HLA-G的差异性表达,引起了越来越多胚胎学研究和病理妊娠研究领域专家的重视。HLA-G是一种非经典MHC-Ⅰ类抗原,与经典MHC-Ⅰ类抗原的基因高度同源,蛋白结构也很相似。不同的是,HLA-G分子不具有丰富的多态,也不像经典MHC-Ⅰ抗原那样分布广泛。生理状态下HLA-G仅表达于胚胎滋养层和一些免疫豁免部位。从功能上看,HLA-G分子可与NK细胞、T细胞和APC细胞等免疫细胞的抑制性受体结合,传递抑制性信号,从而抑制母体免疫细胞的活性,诱导母体对胚胎抗原的免疫耐受。母胎界面HLA-G表达下降与流产、子痫等病理妊娠的发生密切相关。胚胎学的研究成果为器官移植免疫的研究提供了新的思路。那么从器官移植的角度来看,移植术后HLA-G的表达是否呈现出规律性的变化?排斥反应发生时,HLA-G的表达是否会有相应的变化?是否有助于临床上排斥反应的诊断呢?免疫抑制剂对机体HLA-G的表达有怎样的影响作用呢?这一系列问题尚未引起人们的重视。如果解决了上述问题,将有助于阐述HLA-G分子在器官移植中的作用机制,为临床排斥反应的诊断提供新的思路。临床上,移植受者术后常规接受免疫抑制剂治疗以诱导耐受,因此难以区分移植排斥反应和免疫抑制剂对HLA-G的不同作用,因而有必要利用动物模型来系统研究移植排斥反应发生过程中HLA-G分子表达的变化规律,并独立探讨免疫抑制剂对其的影响作用。小鼠的Qa-2分子与人类HLA-G分子在结构和功能上均具有高度的同源性,而且纯系小鼠之间的皮肤移植模型是最经典的排斥反应动物模型,手术简便,易于观察。因此小鼠皮肤移植模型成为本次研究的理想动物模型。为了系统的研究移植排斥反应发生过程中HLA-G分子表达的变化规律以及免疫抑制剂的影响作用,我们首先以近交系小鼠皮肤移植模型研究了移植术后不同时间移植物、浸润淋巴细胞、外周血淋巴细胞（PBLs）以及血浆中Qa-2的表达,分析了其与移植排斥反应分级之间的相关性和不同剂量免疫抑制剂的影响作用。并在动物研究的基础上,动态监测了临床肾移植术后稳定患者和排斥患者术后不同时间外周血单个核细胞以及血浆HLA-G的不同表达,探讨了HLA-G对移植物排斥反应的诊断价值,并分析了其与患者免疫耐受状态之间的关系,以期为临床制定个性化免疫抑制方案提供实验依据。目的:1、利用成功建立的小鼠皮肤移植模型,动态监测用药和不用药状态下移植受者术后不同时间小鼠Qa-2分子在移植物、浸润淋巴细胞、外周血淋巴细胞、血浆中的表达变化,揭示移植受者Qa-2分子在移植排斥反应发生过程中的变化规律,探讨其与同种异体急性移植排斥反应发生进程之间的对应关系。2、通过检测不同种类、不同剂量免疫抑制剂单一或联合作用下小鼠Qa-2表达的变化,分析免疫抑制剂种类和剂量对Qa-2表达的不同作用,探讨Qa-2表达对机体免疫抑制状态的监测价值,以期为指导临床制定个性化治疗方案提供实验依据。3、动态监测肾移植患者术前和术后不同时间外周血单个核细胞HLA-G转录和蛋白水平以及血浆可溶性HLA-G表达的变化规律,对比稳定组和排斥组的差异,探讨HLA-G对于移植排斥反应的诊断价值、最佳检测方法以及对患者免疫状态的监测作用。方法:1.建立小鼠皮肤移植动物模型:为研究不同鼠系之间的差别,分别以SPF级近交系C57BL/6（简称C57）和BALB/C（简称BA）两种鼠系作为研究对象,分别随机分为正常对照组和手术组,其中手术组又分为自身移植组、同系移植组和异系移植组。为了观察免疫抑制剂的影响,同系和异系移植组又分别分为不用药组和用药组。用药组模拟临床环孢素A（CsA）、皮质激素（Horm）及霉酚酸酯（MMF）中等剂量三联用药。手术组采用经典的小鼠背—背皮肤移植手术方法,建立动物模型,术后每天观察皮肤移植物大体改变,记录肉眼排斥时间。每天取移植皮片进行HE染色,根据移植物病理组织学改变将其分为排斥反应Ⅰ-Ⅳ级,记录移植物病理排斥进展情况。观察用药和不用药对移植物存活时间和病理组织学改变的影响2.动态检测移植术后Qa-2的表达:利用成功建立的小鼠皮肤移植模型,术后每天每组处死5只小鼠,采集移植皮片、外周血淋巴细胞和血浆,采用免疫组化、Real-Time荧光定量PCR、流式细胞术和ELISA等方法动态监测不同组别小鼠移植受者术后不同时间点小鼠Qa-2分子在移植物、浸润淋巴细胞、外周血淋巴细胞、血浆中的表达变化,分析上述指标与排斥反应发生和免疫抑制剂应用之间的关系。3.免疫抑制剂对Qa-2表达的影响:将SPF级C57BL/6小鼠随机分为对照组、环孢素组、激素组、霉酚酸酯组和联合用药组,其中三种单一用药组又分为低、中低、中等、中高、高共5个剂量组,收集外周血淋巴细胞、血浆以及移植物,采用Real-Time荧光定量PCR、流式细胞术、ELISA及免疫组化等方法检测不同种类、不同剂量免疫抑制剂单一作用或联合作用下小鼠Qa-2表达的变化,分析了免疫抑制剂种类和剂量对Qa-2表达的不同作用,探讨了Qa-2表达对机体免疫抑制状态的监测价值,以期为指导临床制定个性化治疗方案提供实验依据。4.肾移植患者HLA-G的动态监测:连续收集57例肾移植患者（其中术后32例肾功能稳定、25例发生急性排斥反应）术前和术后不同时间（术后3天、7天、2周、3周、1月、2月、3月以上）外周血标本。怀疑排斥的患者及时进行肾活检明确诊断,并于冲击治疗前、排斥反应发生后3天、7天、2周、3周以上分别收集标本。采用Real-Time荧光定量PCR、流式细胞术和ELISA等方法动态检测移植受者外周血淋巴细胞HLA-G转录和蛋白水平以及血浆可溶性HLA-G表达的变化规律,对比分析稳定组和排斥组的差异,探讨HLA-G对于移植排斥反应的诊断价值、最佳检测方法。结果:1、小鼠皮肤移植模型术后移植物的大体改变级组织病理学变化自身移植和同系移植组小鼠移植皮片呈现免疫耐受状态,移植物缝合部位逐渐愈合,皮片红润柔软,毛发重新生长。两种鼠系交叉移植后,受体小鼠移植物呈现明显的排斥反应。C57和BA小鼠皮肤移植物肉眼完全排斥的时间分别为9±0.38天和10±0.24天。用药情况下,C57和BA两种鼠系移植物的存活时间均明显延长,分别为17±0.54天和18±0.36天。两种鼠系移植皮片存活时间没有明显差异。取移植小鼠皮肤移植物进行组织学观察并进行病理分级,结果显示:同系移植皮片与正常皮肤组织差别不明显,异系移植皮片淋巴细胞浸润随术后时间的延长呈现不断增强的趋势,最终导致移植物坏死脱落。按照淋巴细胞浸润和皮肤组织坏死程度将排斥反应分为轻度（Ⅰ级）、中度（Ⅱ级）、重度（Ⅲ级）和严重排斥（Ⅳ级）四个等级。不用药情况下,病理Ⅰ-Ⅳ级排斥反应分别发生于术后2-4天、5-7天、8-10天和11-观察结束。用药情况下,淋巴细胞浸润出现明显延缓趋势,病理排斥Ⅰ-Ⅳ级分别发生于2-8天、9-12天、13-18天、19天-观察结束。而且移植皮片的病理改变没有鼠系特异性。2、不用药情况下,急性排斥反应发生过程中小鼠Qa-2表达的变化规律同系移植术后,皮肤移植物、外周血Qa-2的表达均基本稳定,与术前保持一致,而异系移植组Qa-2的表达则随着术后时间的不同而呈现不同的变化。皮肤移植物免疫组化检测结果显示:正常和同系移植皮片呈Qa-2阴性表达,仅在皮脂腺细胞呈弱阳性表达。排斥反应发生时,移植物表达变化不大。浸润淋巴细胞呈阴性表达。Real-Time荧光定量PCR检测结果显示:异系移植组术后5天至术后9天左右Qa-2转录水平有所下调,但与同系移植同一时间点相比没有明显差异。与皮肤排斥反应病理分级结合分析发现,Ⅱ、Ⅲ级排斥反应发生阶段,Qa-2转录总体水平低于同系移植组。流式细胞检测结果显示:异系移植术后4-5天开始,CD4+T淋巴细胞Qa-2的平均荧光强度（MFI）以及CD8+T淋巴细胞Qa-2的阳性表达率均明显下降,直到术后第10天才恢复到术前或正常水平,之后甚至高于正常水平或同一时间点的同系移植组。与病理排斥反应分级结合分析,差异更加明显。ELISA检测血浆sQa-2水平与外周血淋巴细胞Qa-2变化趋势不同。同系移植组术后第2天,sQa-2水平高于正常水平,差异显着,之后恢复正常;异系移植术后2-3天迅速上升并达到峰值,之后下降,术后7天之后基本恢复到术前水平。BA小鼠PBLs Qa-2的表达明显低于C57小鼠,但变化趋势相似。3、用药情况下,急性排斥反应发生过程中小鼠Qa-2表达的变化规律皮肤移植物免疫组化检测结果:同系移植小鼠移植皮片呈明显阳性表达。异系移植术后早期,与不用药组相比,Qa-2表达明显增强,皮肤组织细胞和少量浸润淋巴细胞均呈强阳性表达。随着排斥反应的加重,皮肤移植物的阳性表达没有明显改变,但浸润淋巴细胞阳性表达率和表达强度均明显下降。当皮肤发生重度排斥反应时,浸润淋巴细胞Qa-2表达为阴性。排斥反应为Ⅳ级时,由于组织和大量淋巴细胞坏死,无法检测其Qa-2的表达情况,但深层皮肤结缔组织和浸润淋巴细胞均呈阳性表达。Real-Time荧光定量PCR结果显示:同系移植组术后Qa-2的转录水平虽仍保持基本稳定,但明显高于未用药组。而异系移植组术后早期和末期与同系移植组相同时间没有明显差异,但当排斥反应进展为Ⅱ、Ⅲ级,Qa-2的转录明显下降,甚至达到正常未用药水平。流式细胞检测结果显示:CD4+T淋巴细胞Qa-2表达的MFI以及CD8+T淋巴细胞Qa-2的阳性表达率的变化趋势与PBLs Qa-2转录水平的变化基本一致。ELISA检测血浆sQa-2水平结果显示:用药组术前水平明显低于未用药组。同系移植术后变化不明显。异系移植术后2-6天,sQa-2水平持续上升,但仍明显低于未用药组。术后第7天开始逐渐下降,到术后14天之后,恢复到术前水平。4、免疫抑制剂种类和剂量对小鼠Qa-2表达的影响连续用药7天以后,小鼠CsA血药浓度达到稳态,并与用药剂量呈明显正相关。免疫移植剂对PBLs Qa-2转录水平的影响:小剂量CsA、Horm和MMF组Qa-2转录水平与正常组没有明显差异。随着剂量的加大,Qa-2转录水平明显升高,CsA在中高剂量效果最为明显;随着剂量的增加,糖皮质激素对Qa-2的上调作用逐渐显着,有明显的剂量相关性,而且明显强于环孢素:与其他两种药物相比,MMF的作用相对较弱。值得注意的是,在所有用药组中,中等剂量混合用药对Qa-2转录水平的上调作用最为显着。免疫移植剂对PBLs亚群Qa-2膜蛋白表达的影响:对于CD4*T淋巴细胞Qa-2MFI的影响,小剂量CsA即有明显的上调作用,中等剂量作用最为显着。小剂量激素和MMF组与正常组没有明显差异,但较高剂量激素和MMF对CD4+T淋巴细胞Qa-2 MFI有明显的上调作用,并分别于中等剂量和中高剂量达到最大作用。与转录水平类似,中等剂量混合用药对Qa-2转录水平的上调作用较其他单一用药组更为显着。免疫抑制剂对于CD8+T淋巴细胞Qa-2的阳性表达率的影响明显较弱。小剂量激素和中等以下剂量CsA和MMF均没有明显调节作用。随着剂量增大,MMF和CsA的上调作用逐渐增强。联合用药作用比较明显。5、临床肾移植患者术前、术后不同时间HLA-G表达的变化规律稳定组:外周血单个核细胞HLA-G转录水平于术后3天明显低于术前水平。术后1周后上升到术前水平,并于术后1月左右达到高峰。之后下降,但术后2月和3个月以上的检测结果显示HLA-G转录水平仍明显高于术前。外周血淋巴细胞HLA-G膜蛋白表达总体较低。正常情况CD4+T淋巴细胞HLA-G阳性表达率只有2.269±0.71896。术后一周内淋巴细胞基本检测不到HLA-G膜蛋白的表达。术后2周后,CD4T淋巴细胞HLA-G表达明显增强,并逐渐达到高峰（＞14%）,术后2月仍然明显高于正常水平。与FK506血药浓度和临床药物剂量结合分析发现CD4+T细胞HLA-G表达与免疫抑制剂的用量明显相关。不论是术前还是术后不同时期,CD8+T淋巴细胞HLA-G膜蛋白表达均处于极低水平,基本建成不到阳性表达细胞。血浆可溶性HLA-G的表达术后一周内也明显低于正常水平,但术后2周之后,明显升高并保持较高水平。排斥组:排斥发生当天和随后3天,HLA-G表达明显低于排斥前最后一次随访检测的水平（膜结合型和可溶性）。但一周之后,升高明显。直到术后三周到2月后,HLA-G表达保持较高水平,明显高于术前。与转录水平和可溶性HLA-G检测结果相比,CD4+T细胞HLA-G表达的变化趋势更为明显,而且操作简单、误差较小。反复发生排斥反应的患者CD4+T细胞HLA-G表达始终处于较低的表达水平,加大免疫抑制剂药物剂量对HLA-G的表达影响较小。结论:1、通过动态监测移植术后不同时间小鼠Qa-2的表达变化规律,首次发现:移植术后早期,尤其是在用药状态下,移植物浸润淋巴细胞、外周血淋巴细胞Qa-2表达水平明显下调,发生于淋巴细胞活化的阶段。这一阶段尚未造成严重的移植物损伤,远远早于肉眼排斥的发生。2、免疫抑制剂可明显提高移植物、浸润淋巴细胞、外周血淋巴细胞HLA-G的表达,同时延长移植物存活时间,但过高剂量作用反而有所下降。免疫抑制剂中等剂量联合应用不但可以达到最大限度上调HLA-G表达的作用,而且对动物的毒性较小,是最佳选择。3、临床检测结果显示:肾移植术后外周血HLA-G的表达,尤其是CD4+T细胞HLA-G的动态改变,与免疫抑制剂用药时间和剂量密切相关,并在排斥反应发生时明显下调,有可能成为一种反映移植患者免疫耐受状态和诊断排斥反应发生的无创性检测指标。
徐竹蔚[9]（2009）在《CD226分子与肿瘤和实验性自身免疫性脑脊髓炎关系的研究》文中进行了进一步梳理免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily,IgSF）成员CD226分子是一种广泛表达于多种免疫细胞膜表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白,在2000年第七届国际人类白细胞分化抗原协作组大会上获得新的CD命名。此前,该分子被称为“T细胞谱系特异性活化抗原1（T lineage- specific activation antigen 1,TLiSA1）”、“血小板与T细胞活化抗原1（platelet and T cell activation antigen 1,PTA1）”和“DNAX辅助分子1（DNAX accessory molecule-1,DNAM-1）”。人CD226基因于1996年克隆成功,位于染色体18q22.3,其cDNA全长2664bp,开放读框编码336个氨基酸,其基因存在单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）。小鼠CD226基因由我室于2002年成功克隆,位于染色体18 E4,除了cDNA全长为2487bp的原型分子以外,还存在三种异型。完整的CD226分子由胞膜外区、跨膜区和胞浆区组成,分子量为6567 kDa,胞膜外区有2个IgSF V样结构域和潜在的糖基化位点,胞浆区有磷酸化及与信号分子相互作用的位点。不同种属的CD226分子在核苷酸水平和氨基酸水平均高度同源,蛋白结构也十分相似,是一个在进化上是一个相对保守的分子,提示该分子在机体免疫应答过程和其他生物学功能中可能扮演了极为重要的角色。此外,CD226分子与CD96以及其他Nectin和Nectin样分子（Nectin-like molecule,Necl）有较高的同源性。CD226广泛表达于T细胞、NK细胞、NK T细胞、活化的血管内皮细胞、巨核/血小板谱系、单核细胞、胸腺细胞、某些B细胞亚群、部分造血干细胞和肥大细胞等免疫细胞表面,在免疫系统以外则分布于海马和小脑皮质的神经突触部位。2003年,人CD226的两种配体鉴定成功,分别是CD112/Nectin-2和CD155/Necl-5/PVR（脊髓灰质炎病毒受体）。CD226与其配体的相互作用参与CTL和NK细胞的活化、分化和细胞毒作用,调节CD4+ T细胞的增殖和分化,介导内皮细胞与其他细胞的黏附,促进血小板的活化与聚集,参与造血调控,介导肥大细胞的脱颗粒作用,参与NK T细胞和胸腺细胞的抗凋亡作用、树突状细胞的成熟、免疫突触和神经突触的形成,并与肿瘤、自身免疫性疾病、移植排斥及病毒感染等疾病密切相关。人CD226除以膜型（mCD226）的形式表达在细胞膜表面外,还以可溶型（sCD226）的形式存在于血清和细胞培养上清中。前期小规模临床标本检测发现,在肿瘤和多种自身免疫性疾病患者的血清中,sCD226的水平均显着高于正常人,但是目前关于CD226与临床疾病的研究仅限于膜型和/或可溶型CD226的表达及其基因SNP与疾病的关系,而CD226在肿瘤及自身免疫性疾病中的作用和可能的分子机制尚不清楚。本研究首先制备和鉴定了一批抗人IgG Fc段、谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase,GST）、麦芽糖结合蛋白（maltose-binding protein,MBP）和硫氧化还原蛋白（thioredoxin,Trx）等常用标签蛋白（tag）的单克隆抗体（monoclonal antibody,mAb）,在此基础上建立或改良了定量检测GST、Fc、MBP和Trx或其融合蛋白的双抗体夹心ELISA试剂盒,敏感性分别达到了1.2、15.6、1和0.4 ng/ml。应用Fc ELISA试剂盒检测上清中hCD226-Fc水平的方法,克隆化了高水平分泌该融合蛋白的CHO-hCD226-Fc细胞株,大量制备细胞培养上清,并用抗Fc mAb标记的Sepharose 4B亲和层析柱纯化了hCD226-Fc融合蛋白,用SDS-PAGE、Western blot和流式细胞术（flow cytometry,FCM）鉴定其纯度和生物学活性,以此作为人sCD226 ELISA试剂盒的标准品以及体外杀伤实验中模拟天然sCD226作用的试剂。另外,还对我室前期研制的定量检测人sCD226的双抗体夹心ELISA试剂盒进行了改良。应用条件优化后的ELISA试剂盒检测了259例肿瘤患者（包括消化、呼吸、血液、妇科、骨骼、神经系统等多种来源的肿瘤）及129例正常人血清中sCD226的水平,发现肿瘤患者血清中sCD226的水平（0.2-60 ng/ml,中位数11.5 ng/ml）明显高于正常人（0.1-23 ng/ml,中位数6.3 ng/ml,P<0.001）;而在用FCM检测外周血单个核细胞（peripheral blood monouclear cell,PBMC）上mCD226的表达时,发现肿瘤患者PBMC上mCD226的表达（14例,1.1%-56.1%,中位数17.45%）明显低于正常人（12例,43.1%-77.8%,中位数65.3%,P<0.001）。在体外NK细胞杀伤肿瘤细胞的模型中用重组表达的可溶型hCD226-Fc融合蛋白模拟天然sCD226的作用,发现hCD226-Fc能显着抑制NK细胞对其靶细胞K562细胞的杀伤,浓度为1μg/ml时抑制率即可达到34%,而且这种抑制作用呈剂量依赖性。在佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA）活化的正常人PBMC和Jurkat细胞上,3种蛋白酶抑制剂（金属蛋白酶抑制剂1-10-phenanathroline、丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF和半胱氨酸蛋白酶抑制剂NEM）可以在上调mCD226的表达的同时下调培养上清中sCD226的水平,由于多种蛋白酶在许多肿瘤中含量可能有所增加,提示蛋白酶解作用可能是肿瘤患者血清中sCD226的形成机制。用免疫沉淀和Western blot的方法鉴定了血清和细胞培养上清中sCD226的分子量,发现在肿瘤患者和正常人血清以及PMA刺激的PBMC和Jurkat细胞培养上清中,均存在50 kDa的特异性条带,这与CD226分子的胞膜外区分子量相符。另外,血清样本中还存在一个45 kDa的条带,这一条带在PMA刺激的细胞培养上清中不存在,提示不同蛋白酶对CD226的酶解作用可能发生在该分子胞膜外区的不同位置。在搞清了肿瘤患者sCD226的表达、作用和来源的基础上,我们提出了如下假说:肿瘤患者中升高的蛋白酶可能通过酶解作用导致了PBMC上mCD226表达下调而血清中sCD226的水平上调,高水平的sCD226与其膜型配体CD112/CD155分子相结合,减弱了杀伤细胞上mCD226分子与肿瘤细胞表面膜型CD112/CD155的结合,从而抑制了杀伤细胞活化信号的产生,并最终导致肿瘤细胞发生免疫逃逸。本研究还用ELISA和胞内细胞因子染色的方法观察了抗人CD226的mAb LeoA1对混合淋巴细胞培养（mixed lymphocyte culture,MLC）和PBMC中细胞因子分泌格局及细胞亚群百分比的调控,发现被上调的有IL-10、GM-CSF和G-CSF等,被下调的有IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-12 p40、IL-15、IL-23和TGF-α等,相关的细胞亚群包括Th1、Th2、CTL、NK以及单核/巨噬和DC。采用信号分子阻断剂的手段,分析了CD226调控MLC细胞因子分泌格局的信号通路中可能涉及的信号分子主要有p38、JNK和PI3K。最后,成功建立了小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）模型,证实了抗CD226抗体对EAE的发生有明显的防治作用,其分子机制涉及中枢神经系统局部炎细胞浸润的减轻,脾脏CD25阳性的活化细胞数量的减少,以及脾脏IL-10+细胞和调节性T细胞百分率的增加。简言之,本研究的实验结果为阐明CD226分子在肿瘤和自身免疫性疾病中的作用提供了实验依据,并为深入研究CD226参与机体多种生理功能和病理过程的分子机制奠定了基础。
刘春蓉,苗军,余鹏,夏群[10]（2007）在《微囊化人工细胞技术及其应用》文中进行了进一步梳理目的:系统回顾当前国内外微囊化人工细胞技术的临床应用研究进展。资料来源:检索PubMed数据库中1980-01/2006-06有关人工细胞微囊技术进展的文章,检索词“microcapsule,artificial cell,transplantation”,并限定文献语言种类为English。同时检索中国知网医学文献数据库1994-01/2006-06的相关文章,检索词为“微囊化,人工细胞,移植”。资料选择:纳入标准:①人工细胞微囊的成囊材料、成囊工序及微囊发生器的研究。②人工细胞微囊生物特性的研究。③临床应用的研究。④动物实验。排除标准:①较陈旧的文献。②重复研究。资料提炼:共收集到符合上述要求的文献80篇,58篇符合纳入标准。其中研究内容相似的,以近3年内发表在较权威杂志者优先。排除的20篇为较陈旧的文献及重复研究;对符合标准的38篇文献进行分析。资料综合:适当的囊材、先进的制作工序和机械设备,能显着提高微囊的生物相容性、机械稳定性、免疫隔离效果,提高细胞移植的成功率。微囊化技术可明显提高移植细胞在体内的存活时间。微囊化人工细胞移植在甲状旁腺功能低下症、帕金森病、脊髓损伤、急性肝衰竭、肿瘤等疾病的治疗方面取得了良好的效果。结论:微囊化技术可以有效的避免免疫排斥反应对移植细胞的损伤,日益成熟的人工细胞微囊技术在临床疾病治疗方面的广阔的应用前景。
二、异基因小鼠胸腺细胞微囊移植治疗SLE的实验观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、异基因小鼠胸腺细胞微囊移植治疗SLE的实验观察（论文提纲范文）
（1）异基因造血干细胞移植后患者外周血差异表达miRNA与口腔cGVHD关系的研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 英文缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第1章 广西口腔cGVHD患者临床特点及相关危险因素分析 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 研究对象 |
| 1.2.2 移植相关处理 |
| 1.2.3 实验方法 |
| 1.2.4 统计学处理 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 研究对象基本情况 |
| 1.3.2 口腔cGVHD患者口腔表征情况 |
| 1.3.3 口腔cGVHD危险因素分析 |
| 1.4 讨论 |
| 第2章 口腔cGVHD患者外周血循环miRNA表达谱的建立与分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 实验仪器与主要试剂 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.2.4 统计学处理 |
| 2.2.5 质量控制 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 研究对象基本情况 |
| 2.3.2 测序原始数据及小RNA序列长度分布 |
| 2.3.3 miRNA鉴定和预测结果 |
| 2.3.4 miRNA表达和差异分析 |
| 2.3.5 miRNA靶基因预测和富集性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 口腔cGVHD患者外周血循环miRNA-769-5p、miRNA-505-5p差异表达及功能分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 研究对象 |
| 3.2.2 实验仪器与主要试剂 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.2.4 统计学处理 |
| 3.2.5 质量控制 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 研究对象基本情况 |
| 3.3.2 qPCR检测外周血循环miRNA-769-5p、miRNA-505-5p表达情况 |
| 3.3.3 外周血循环miRNA-769-5p、miRNA-505-5p诊断分析 |
| 3.3.4 外周血循环 mi RNA-505-5p、mi RNA-769-5p 与口腔状况评分及疼痛评分的相关性 |
| 3.3.5 miRNA-505-5p靶基因及其功能预测 |
| 3.3.6 miRNA-769-5p靶基因及其功能预测 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 口腔cGVHD患者外周血Smad2 的表达研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 研究对象 |
| 4.2.2 实验仪器与主要试剂 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.2.4 统计学处理 |
| 4.2.5 质量控制 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 研究对象基本情况 |
| 4.3.2 外周血单个核细胞Smad2 mRNA及血浆Smad2蛋白表达情况 |
| 4.3.3 miRNA-769-5p、Smad2 mRNA、Smad2蛋白与口腔状况评分及疼痛评分的相关性 |
| 4.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 Th17与Treg细胞在口腔疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（3）超声介导的微泡破坏促进MSCs归巢并修复糖尿病肾病的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 大鼠骨髓源性 MSCs 的分离、培养、鉴定与标记 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 大鼠早期糖尿病肾病模型的建立与评价 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 超声介导的微泡破坏促进 MSCs 归巢早期糖尿病肾病大鼠肾脏的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 超声介导的微泡破坏促进 MSCs 移植修复糖尿病肾病大鼠的研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（4）输注FasL基因转染的血管内皮细胞抑制大鼠肝移植急性排斥反应的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 序言 |
| 第一章 Fas/FasL系统及其在维持T细胞稳态、细胞毒性效应尤其是肿瘤免疫和移植免疫中的作用 |
| 1.1 Fas和FasL的结构和功能介绍 |
| 1.2 FasL-Fas信号途径诱导凋亡的机制 |
| 1.3 FasL在维持免疫稳态中的作用 |
| 1.4 FasL与细胞介导的细胞毒性 |
| 1.5 FasL的转录水平和转录后调控 |
| 1.5.1 FasL转录水平的调控 |
| 1.5.2 FasL的转录后调控 |
| 1.6 Fas反击和肿瘤的免疫豁免 |
| 1.6.1 直接的肿瘤Fas反击：体外和体内的证据 |
| 1.6.2 肿瘤抵抗Fas介导的凋亡 |
| 1.7 Fas/FasL通路与移植免疫耐受 |
| 1.7.1 异体来源的胰岛细胞与FasL阳性细胞共同移植 |
| 1.7.2 FasL基因转染树突状细胞 |
| 1.7.3 FasL基因转染肝细胞 |
| 1.7.4 FasL基因转染造血细胞 |
| 1.7.5 FasL基因转染CD34+细胞 |
| 1.7.6 FasL基因转染内皮细胞 |
| 1.8 结语 |
| 第二章 FasL慢病毒载体的构建 |
| 2.1 FasL ORF克隆构建的实验报告 |
| 2.1.1 实验目的 |
| 2.1.2 实验材料与设备 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.1.4 实验结果 |
| 2.2 Lenti-rFasl/puro的包装 |
| 2.2.1 实验目的 |
| 2.2.2 材料报表 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.2.4 转染效果 |
| 2.2.5 实验结果 |
| 2.3 MBS101017H01病毒滴度检测报告 |
| 2.3.1 实验目的 |
| 2.3.2 实验材料 |
| 2.3.3 实验方法 |
| 2.3.4 实验结果 |
| 2.3.5 实验结果判定 |
| 2.3.6 实验结论 |
| 第三章 Wistar大鼠血管内皮细胞的培养及FasL基因的转染 |
| 3.1 大鼠主动脉内皮细胞的分离培养鉴定 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 培养方法 |
| 3.1.3 实验结果 |
| 3.1.4 结果讨论 |
| 3.2 管内皮细胞的转染 |
| 3.2.1 实验目的 |
| 3.2.2 实验材料 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.2.4 实验结果 |
| 第四章 大鼠急性肝移植排斥反应模型的建立 |
| 4.1 实验目的 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 大鼠肝移植手术方法 |
| 4.3.1 供体手术 |
| 4.3.2 供肝准备 |
| 4.3.3 受体手术 |
| 4.3.4 大鼠肝移植的手术操作技巧 |
| 4.4 数据收集与分析 |
| 4.5 术后各组大鼠生存状态和病理检查 |
| 4.6 结论 |
| 第五章 输注转染FasL基因的内皮细胞对大鼠肝移植急性排斥反应的抑制作用研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 我们的实验和结果讨论 |
| 5.2.1 研究背景及引论 |
| 5.2.2 材料与方法 |
| 5.2.3 实验结果 |
| 5.2.4 结果讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的论文 |
| SCI接收函 |
（5）IDO基因过表达诱导小鼠肺移植慢性排异免疫耐受的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 Gateway 技术构建重组腺病毒 IDO 基因表达载体 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 IDO 基因转染小鼠气道上皮的可行性研究 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 IDO 基因过表达诱导 CD4~+T 细胞/BMDCs 免疫耐受 |
| 第一节 IDO 基因过表达诱导 CD4~+T 细胞增殖抑制 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 IDO 基因过表达对 BMDCs 成熟分化影响 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 小鼠异位气管移植模型模拟肺移植慢性排异 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第五部分 IDO 基因过表达减轻肺移植慢性排异-闭塞性细支气管炎的研究 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 附录 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（6）IL-17在大鼠肝移植急性排斥反应模型中的表达及作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 建立大鼠肝移植急性排斥反应模型 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物及实验器材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 近交系大鼠肝移植急性排斥反应模型的建立 |
| 1.4 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 ROLT模型的建立 |
| 3 讨论 |
| 3.1 “双袖套法”ROLT模型的建立 |
| 3.2 “双袖套法”ROLT模型主要并发症及防治 |
| 3.3 近交系大鼠ROLT模型的建立 |
| 4 结论 |
| 5 附图 |
| 第二部分 大鼠肝移植急性排斥反应模型中IL-23促进肝NKT细胞产生IL-17的作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器及器械 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验动物分组及标本处理 |
| 1.4 标本检测 |
| 1.5 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 两组大鼠肝组织匀浆内IL-17和IL-23的水平 |
| 2.2 肝组织CD4~+细胞中CD1d~+IL-17~+细胞的比值 |
| 2.3 外周血淋巴细胞中IL-17的水平 |
| 2.4 外周血淋巴细胞中CD1d~+IL-17~+CD4~+细胞的比值 |
| 3 讨论 |
| 3.1 在肝移植AR中NKT细胞分泌IL-17增加 |
| 3.2 IL-23影响NKT生成IL-17 |
| 4 结论 |
| 5 附图 |
| 第三部分 IL-17在大鼠肝移植急性排斥反应模型中的表达和作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器及器械 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验动物及分组 |
| 1.4 动物模型的制作方法(见第二部分) |
| 1.5 标本处理及病理组织学检查 |
| 1.6 ELISA测定血清IL-17的表达水平 |
| 1.7 RT-PCR检测移植肝组织IL-17、IFN-γ、ICAM-1及MIP-2mRNA的表达 |
| 1.8 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 各组大鼠的血清ALT,AST,TBIL水平 |
| 2.2 各组大鼠的病理组织学改变及排斥反应评分 |
| 2.3 各组大鼠的血清IL-17表达水平 |
| 2.4 各组大鼠肝组织中IL-17、IFN-γ、ICAM-1及MIP-2 mRNA的表达水平 |
| 3 讨论 |
| 3.1 IL-17与急性排斥反应 |
| 3.2 INF-γ与急性排斥反应 |
| 3.3 ICAM-1与急性排斥反应 |
| 3.4 MIP-2与急性排斥反应 |
| 4 结论 |
| 5 附图 |
| 研究总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（7）CCR7基因转染小鼠未成熟树突状细胞诱导皮肤移植免疫耐受的研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 CCR7 基因转染小鼠未成熟树突状细胞诱导皮肤移植免疫耐受的研究 |
| 前言 |
| 第一部分 CCR7 基因转染对小鼠未成熟树突状细胞成熟及迁移功能的影响 |
| 分题一 小鼠骨髓源树突状细胞的培养及鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 分题二 CCR7 基因转染小鼠骨髓源未成熟树突状细胞及其功能鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 CCR7 基因转染小鼠未成熟树突状细胞对异基因皮肤移植免疫耐受的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 照片 |
| 参考文献 |
| 文献综述 健康与疾病状态下树突状细胞的亚型分类及其作用 |
| 参考文献 |
| 博士研究生在读期间发表论文 |
| 英文论着 |
（8）急性移植排斥反应过程中HLA-G表达动态变化的实验及临床研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩写对照 |
| 第一部分 急性排斥反应过程中HLA-G表达的动物实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 免疫抑制剂对HLA-G影响的动物实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 肾移植术后HLA-G表达的临床研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间论文发表及课题参与 |
| 外文论文 |
（9）CD226分子与肿瘤和实验性自身免疫性脑脊髓炎关系的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 一、CD226 分子及其配体 |
| 1. CD226 的发现与命名 |
| 2. CD226 的基因与结构 |
| 2.1 人CD226 的基因 |
| 2.2 hCD226 的结构 |
| 2.3 其他种属的CD226 分子 |
| 3. CD226 的表达分布与存在形式 |
| 3.1 表达分布 |
| 3.2 存在形式 |
| 4. CD226 的配体及相关分子 |
| 4.1 配体 |
| 4.2 相关分子 |
| 二、CD226 分子的功能 |
| 1. CTL和NK细胞的活化、分化和细胞毒作用 |
| 2. CD4~+ T细胞的增殖和分化 |
| 3. 内皮细胞与其他细胞的黏附 |
| 4. 其他细胞 |
| 4.1 血小板 |
| 4.2 造血干/祖细胞 |
| 4.3 肥大细胞 |
| 4.4 胸腺细胞 |
| 4.5 CNS |
| 三、CD226 分子与临床疾病 |
| 1. CD226 与肿瘤 |
| 2. CD226 与自身免疫性疾病 |
| 2.1 多发性硬化症及其动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎 |
| 2.2 其他自身免疫性疾病 |
| 3. CD226 分子与其他疾病 |
| 3.1 移植排斥反应 |
| 3.2 病毒感染性疾病 |
| 正文 |
| 实验一定量检测人可溶型CD226 分子双抗体夹心ELISA试剂盒的制备和条件优化 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物与细胞 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 mAb的制备、纯化及鉴定 |
| 2.2 定量检测标签蛋白及含标签的融合蛋白的夹心ELISA的建立 |
| 2.3 克隆化建立稳定分泌hCD226-Fc融合蛋白的CHO-hCD226-Fc细胞株 |
| 2.4 hCD226-Fc融合蛋白的大量制备、纯化及鉴定 |
| 2.5 双抗体夹心ELISA试剂盒的条件优化 |
| 3 结果 |
| 3.1 标签蛋白mAb的制备、鉴定及相应夹心ELISA试剂盒的建立 |
| 3.2 hCD226-Fc融合蛋白的大量制备、纯化及鉴定 |
| 3.3 sCD226 夹心ELISA试剂盒的条件优化 |
| 4 讨论 |
| 实验二 可溶型CD226 分子在肿瘤中的表达、功能及其产生机制的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测标本与细胞 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 肿瘤患者及正常人血清中sCD226 的检测 |
| 2.2 肿瘤患者及正常人PBMC上mCD226 的检测 |
| 2.3 hCD226-Fc融合蛋白体外干预NK细胞对其靶细胞的杀伤 |
| 2.4 蛋白酶抑制剂对mCD226 及sCD226 的调节 |
| 2.5 sCD226 分子量的鉴定 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 肿瘤患者血清中sCD226 水平上调而PBMC上mCD226 表达下调 |
| 3.2 hCD226-Fc融合蛋白体外抑制NK细胞对其靶细胞的杀伤 |
| 3.3 蛋白酶抑制剂上调mCD226 而下调sCD226 |
| 3.4 血清及细胞培养上清中sCD226 的分子量的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 实验三 人CD226 分子调控MLC和PBMC细胞因子分泌格局的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 试剂和服务 |
| 2 方法 |
| 2.1 MLC的建立 |
| 2.2 培养上清中细胞因子的检测 |
| 2.3 胞内细胞因子染色 |
| 2.4 信号分子阻断剂对CD226 mAb调控细胞因子分泌的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 CD226 mAb调控MLC和PBMC培养上清中细胞因子的分泌 |
| 3.2 CD226 mAb调控MLC中细胞亚群 |
| 3.3 信号分子阻断剂对LeoA1 调控MLC细胞因子分泌的影响 |
| 4 讨论 |
| 实验四小鼠CD226 分子与EAE关系的初步研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 EAE模型的建立和评分 |
| 2.2 小鼠CNS组织的取材和免疫荧光或HE染色 |
| 2.3 小鼠脾细胞的分离、体外刺激及FCM分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 EAE模型的成功建立 |
| 3.2 CD226 与EAE小鼠CNS炎细胞浸润的关系 |
| 3.3 CD226 对EAE小鼠CD4~+ T细胞各亚群表型和功能的体内外调控 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
四、异基因小鼠胸腺细胞微囊移植治疗SLE的实验观察（论文参考文献）
- [1]异基因造血干细胞移植后患者外周血差异表达miRNA与口腔cGVHD关系的研究[D]. 雍翔智. 广西医科大学, 2019(07)
- [2]小鼠胚胎胸腺移植方法和实验研究[J]. 徐太哲,李丽,王长山. 黑龙江医药科学, 2016(03)
- [3]超声介导的微泡破坏促进MSCs归巢并修复糖尿病肾病的实验研究[D]. 张翊. 第三军医大学, 2013(11)
- [4]输注FasL基因转染的血管内皮细胞抑制大鼠肝移植急性排斥反应的研究[D]. 刘伟. 中南大学, 2012(12)
- [5]IDO基因过表达诱导小鼠肺移植慢性排异免疫耐受的实验研究[D]. 葛锦峰. 苏州大学, 2012(09)
- [6]IL-17在大鼠肝移植急性排斥反应模型中的表达及作用研究[D]. 刘歆春. 中南大学, 2011(01)
- [7]CCR7基因转染小鼠未成熟树突状细胞诱导皮肤移植免疫耐受的研究[D]. 辛海明. 第三军医大学, 2009(05)
- [8]急性移植排斥反应过程中HLA-G表达动态变化的实验及临床研究[D]. 陆楠. 山东大学, 2009(06)
- [9]CD226分子与肿瘤和实验性自身免疫性脑脊髓炎关系的研究[D]. 徐竹蔚. 第四军医大学, 2009(12)
- [10]微囊化人工细胞技术及其应用[J]. 刘春蓉,苗军,余鹏,夏群. 中国组织工程研究与临床康复, 2007(05)