一、恒河猴tPA基因的克隆、测序与真核表达（论文文献综述）
高楠[1]（2021）在《SHIV感染恒河猴体内产生针对HIV-1广谱中和抗体机制的研究》文中进行了进一步梳理获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS）又称艾滋病,是严重威胁人类公共健康的传染病之一。这种疾病由人免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）感染所引发。目前已有的治疗方案虽然可以有效地延长患者寿命,但由于无法完全清除HIV-1感染者体内的病毒潜伏库而不能彻底治愈艾滋病,治疗还会对患者产生一定的副作用并且由治疗引发的耐药性问题也亟待解决。因此,研发出有效的艾滋病疫苗是控制艾滋病传播的重要干预手段。广谱中和抗体（Broadly neutralizing antibodies,bn Abs）是人体经过长期感染HIV而逐渐产生的体液免疫应答,这是一类对大部分HIV-1流行株均具有较强中和能力的抗体,为HIV的治疗和预防策略提供了新的方向。因此能否诱导机体产生bn Abs也成为衡量一个疫苗有效性的重要标准。然而在HIV-1感染的人群中只有约20%患者体内能够产生这类bn Abs,并且通过对bn Abs在人体中进化过程的研究可以发现,这类抗体要经历2-4年的成熟进化才能够形成。人猴嵌合免疫缺陷病毒（Simian/human immunodeficiency virus,SHIV）感染的非人灵长类动物模型（Non-human primate,NHP）作为唯一可以用来评价HIV-1疫苗有效性的动物模型,但其能否和人类一样具有产生bn Abs的能力,且产生机制是否相同目前还不清楚。因此,建立合理的SHIV-NHP模型研究其体内bn Abs的产生及进化机制对于未来HIV-1疫苗的评价具有十分重要的意义。在先前的研究中,很少在SHIV感染的NHP体内检测到广谱中和抗体的产生,但在几项关于SHIV-NHP模型的报道中,极个别的恒河猴在感染SHIV后血浆中产生了具有交叉活性的中和抗体,但并未分离到单克隆bn Abs。这很大程度上是由于bn Abs的产生通常需要2-4年时间,而一般的猴体实验项目所持续的时间不超过2年,抗体没有足够的时间进化成熟为bn Abs。正是由于缺少合适的长期感染模型,因此目前还无法对恒河猴体内产生的中和抗体的性质及成熟过程进行细致深入的研究。因此在本篇论文的研究中,我们利用两种SHIVs分别建立感染模型,并持续跟踪6-7年。通过长期的SHIV感染在恒河猴体内诱导产生广谱中和活性,利用不同敏感度的HIV-1流行株对血浆中和活性进行分析,并分析血浆中和抗体的作用表位。在确定产生广谱中和活性的恒河猴体内分离出单克隆bn Ab,评价其中和广谱性,强度以及表位等特性。再通过分析猴体单克隆抗体（monoclonal antibodies,m Abs）的谱系以及猴体内病毒包膜蛋白的突变情况追溯bn Ab的进化过程以及与SHIV共同进化的过程,从而分析NHP体内与人体内产生广谱中和抗体的相关性,为更好地应用恒河猴模型来评价HIV-1疫苗提供理论和实验依据。首先我们选择了两种感染力较强的SHIVs(SHIV1157ipd3N4和SHIVSF162P3)通过高剂量静脉单次或者低剂量直肠多次的方式感染中国恒河猴,最终在31只恒河猴体内成功建立了感染。通过对猴体内病毒载量的检测可以发现,急性感染期猴体内的病毒载量很高,进入慢性感染期后猴体内有持续的病毒存在。我们对2只SHIV1157ipd3N4感染的恒河猴（G1015R和G1020R）持续监测至感染后6年,发现在感染后期病毒载量有持续升高的趋势,这为bn Abs的产生提供了持续的抗原刺激。随后我们对保留有不同纵向时间点血浆样本的6只恒河猴的进行了中和活性的评价,发现感染早期中和抗体的交叉活性很低,随着感染时间的延长,中和广谱度逐渐升高,感染超过6年的G1015R和G1020R可以中和超过65%的tier 2病毒。并且通过对比不同SHIVs感染恒河猴产生中和抗体的广谱度发现,SHIV1157ipd3N4诱导产生广谱中和活性的能力要强于SHIVSF162P3和SHIVCHN19P4,且直肠攻毒途径更易诱导bn Abs。中和表位特异性分析表明,V2,V3或CD4bs区域中已知bn Abs的抗性突变会降低G1015R和G1020R血浆中和抗体对病毒的敏感性,说明G1015R和G1020R产生的中和活性针对Env的V2,V3以及CD4bs区,这和人体产生的bn Abs具有相似的性质。为了进一步分析恒河猴体内产生的bn Abs,我们通过流式细胞术对猴体内的单克隆抗体进行分离。我们选择了G1015R感染后350周的外周血淋巴细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）样品,分选了针对V2区表位特异性的单个记忆B细胞,并进行抗体可变区基因的扩增,共获得了44对重轻链配对的Ig G基因,通过ELISA筛选其中对同源病毒具有结合活性的抗体,再经过大量表达纯化后进行中和抗体广谱度和强度的评价。我们共分离到12个具有中和活性的抗体,其中6个抗体具有中和多种tier 2病毒的能力。J038是其中中和能力最强的m Ab,可以中和54%的208个全球流行株,这也是目前报道的分离自SHIV感染的NHP体内广谱度最高的抗体。通过对抗体谱系进行分析可以发现6个具有交叉中和活性的抗体均来源于相同谱系（VH4-2*01 F/VK1-20*01 F）。对J038谱系抗体的识别表位进行分析,发现其识别Env主要依赖于N156位和N160聚糖以及V2环上的氨基酸残基。通过对J038 Fab-C1080 Env共结晶的晶体结构进行结合位点分析,可以发现J038所具备的18个氨基酸的HCDR3区并未插入Env V2顶端的内部,而是和V2环反向平行形成了氢键。但J038和聚糖的相互作用占据了抗体-抗原近一半的结合界面,这和分离自人体的V2特异性bn Abs的特征一致。随后,我们对J038谱系抗体的进化过程进行了追溯。通过进化树分析我们推测了J038谱系的共同祖先（Unmutated common ancestor,UCA）和各阶段的中间过渡抗体（Intermediates antibodies,IAs）,UCA和早期的IAs可以中和自体病毒但并不能中和异源病毒,表明J038谱系的广谱中和能力是通过感染过程中逐渐积累突变进化获得的。对各阶段过渡体的结合位点进行同源建模分析可以发现J038谱系抗体在进化的过程中逐渐积累了对包膜蛋白V2区N156和N160位聚糖的结合界面也验证了J038谱系广谱中和抗体的进化过程。通过比对G1015R各时期血浆中病毒env序列可以发现,J038谱系所识别的V2区已经逐渐积累了稳定的突变,其中I165L,K171R和V172A会造成病毒对J038谱系抗体的中和敏感度下降,表明在G1015R恒河猴体内病毒由于中和抗体的选择压力已经产生了逃逸突变。尽管在猴体内抗体选择压力下所产生的逃逸突变和人体内所检测到的突变不完全相同,但猴体内bn Abs和人体内bn Abs的进化过程具有很多相似之处。综上所述,本文成功建立了最长时间的SHIV-NHP感染模型,在其体内诱导产生了广谱中和活性,通过分离单克隆bn Abs获得了目前分离自SHIV感染恒河猴体内中和广谱度最高的的J038谱系抗体,通过对NHP体内产生的bn Abs的性质和进化过程进行了深入的研究发现J038识别与人源V2特异性广谱中和抗体相同的表位,在进化过程中通过积累对聚糖的结合增强广谱性。并且J038谱系的产生也对猴体的病毒产生了免疫选择压力且病毒在此压力下也积累了逃逸突变。通过这项研究对NHP体内是否能产生和人体类似bn Abs及其产生机制进行了合理的分析和阐释。通过本篇论文的研究,可以为更好地应用SHIV-NHP模型评价HIV-1疫苗提供一定的理论和实验依据。
郝勐[2]（2020）在《裂谷热病毒中和抗体的筛选及保护机制的初步研究》文中研究表明裂谷热（Rift Valley fever,RVF）是一种由蚊媒传播的人兽共患传染病,该病病原体分离于肯尼亚境内的东非裂谷区域,并得名为裂谷热病毒。裂谷热的临床症状在人类主要表现为发热、头疼,严重的可致神经紊乱、视力减退、出血热甚至死亡。1950-1998年,裂谷热疫情主要发生于非洲大陆,并造成了上千人的死亡。2000 年,暴发于沙特阿拉伯的裂谷热疫情是首次发生在非洲大陆以外地区的疫情,此次疫情造成了上百人死亡。2016年,我国也出现了首例输入性病例。这说明裂谷热已出现跨区域传播的趋势。目前尚无获批的疫苗或药物用于裂谷热的防控与治疗,因此研发裂谷热病毒疫苗及抗病毒药物对裂谷热的防治具有重要意义。基于此,本研究构建了重组人4型腺病毒为载体的裂谷热疫苗,将此候选疫苗免疫恒河猴,从恒河猴体内筛选裂谷热病毒中和抗体以期为裂谷热的治疗提供一种新的方法,并通过中和抗体表位鉴定以期为裂谷热疫苗的研发提供理论依据。首先是免疫原的制备。以人4型腺病毒为载体构建表达裂谷热病毒Gn和Gc蛋白的重组人4型腺病毒,并命名为HAdV4-GnGcopt。结果显示,HAdV4-GnGcopt可以在HEK293细胞中较好地表达裂谷热病毒Gn和Gc蛋白。同时,利用哺乳动物悬浮细胞Expi293F对截短型Gn蛋白（154-469aa）和Gc蛋白（691-1119aa）进行表达,结果显示Gn和Gc蛋白均得到了良好表达。最后,利用StrepTrap亲和层析柱对Gn和Gc蛋白进行纯化。利用HAdV4-GnGcopt对恒河猴进行两次免疫后,再利用纯化后的截短型Gn和Gc蛋白对恒河猴进行加强免疫。然后通过ELISA对Gn和Gc蛋白结合抗体的水平进行分析。结果显示,HAdV4-GnGcopt及Gn和Gc蛋白成功激发了恒河猴体内Gn和Gc蛋白结合抗体的产生。随后,利用单细胞分选技术对恒河猴外周血中的Gn或Gc蛋白特异的记忆B细胞进行筛选,总计分选记忆B细胞1253个,约占分选前总细胞数的0.2%。然后,利用单细胞PCR技术对188个记忆B细胞中的抗体基因进行扩增,共筛选获得配对的抗体有104株,其中57株抗体轻链为κ型,47株抗体轻链为λ型。最后,通过ELISA筛选获得Gn蛋白结合抗体11株,Gc蛋白结合抗体有24株。为了检测免疫后恒河猴血清中和抗体含量以及针对Gn和Gc蛋白的结合抗体中和活性的测定,利用反向遗传技术成功拯救了表达eGFP和Renilla luciferase的裂谷热病毒MP-12株,分别命名为RVFV-SeGFP和RVFV-SRluc。然后,对裂谷热病毒的易感细胞系进行了鉴定。结果显示,Huh7（人肝癌细胞系）为裂谷热病毒的易感细胞。利用RVFV-SeGFP对恒河猴首免后第210天的血清抗体效价进行了测定,结果显示HAdV4-GnGcopt及Gn和Gc蛋白成功激发了恒河猴体内针对裂谷热病毒的中和抗体。然后利用RVFV-SRluc对11株Gn蛋白结合抗体和24株Gc蛋白的结合抗体的中和活性进行了测定,结果显示只有2株针对Gn蛋白的结合抗体（1332F11和1331E4）具有较好的中和活性,且二者的IC50分别为0.1678 μg/mL和0.3388 μg/mL。利用构建Gn截短突变体的方法对1332F11和1331E4的结合肽段进行了初步鉴定,虽然1332F11和1331E4是两株不同的抗体,但结果显示二者都结合于多肽409GSKKCTGDAAFCSAY423。利用丙氨酸扫描突变对这两株抗体的关键氨基酸进行了鉴定,结果显示1332F11和1331E4的关键氨基酸较为相似。根据已得到的关键氨基酸位点,利用软件Discover Studio 4.5对1332F11和1331E4与Gn蛋白进行分子对接并筛选抗原-抗体复合物最优构象。结果显示,虽然1332F11和1331E4通过不同的方向与Gn结合,但是它们都靠近Gc蛋白中的融合环。最后,我们根据抗原-抗体复合物构象推测1332F11和1331E4是通过相同的方式来发挥中和作用的,当这两株抗体与病毒颗粒表面的糖蛋白结合后可以阻止糖蛋白的结构重排,使Gc蛋白中的融合环不能暴露于晚期内体膜。综上所述,本研究以人4型腺病毒为载体成功够建了表达裂谷热GnGc蛋白的重组腺病毒,且该重组腺病毒可以在恒河猴体内激发较高的结合抗体水平,因此可以进一步探究其作为裂谷热病毒候选疫苗的可行性。同时,构建了裂谷热病毒MP-12株的感染性克隆为裂谷热病毒疫苗的研发及抗病毒药物的筛选提供了重要的技术手段。最后,成功筛选获得了两株裂谷热病毒的猴源中和抗体并解释了其发挥中和作用可能的机制,为今后裂谷热感染患者的治疗和裂谷热疫苗的研发提供理论依据。
寇明星[3]（2020）在《猪MMP7和MMP9基因组织表达模式及其与哺乳仔猪腹泻的关联分析》文中研究表明基质金属蛋白酶7（Matrix metalloproteinases 7,MMP7）和基质金属蛋白酶9（Matrix metalloproteinases 9,MMP9）属于基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases,MMPs）基因家族中的成员。肠毒素大肠杆菌F18（Enterotoxigenic Escherichia coli F18,ETEC F18）是引起仔猪腹泻的主要病原菌,研究表明ETEC F18感染仔猪后,MMP7和MMP9基因在抗性个体十二指肠中的表达量高于敏感个体。鉴于此,本研究选择猪MMP7和MMP9基因作为仔猪腹泻的候选基因,利用q RT-PCR检测了MMP7和MMP9基因在断奶仔猪胃肠道等组织的表达模式;构建p EGFP-C1-MMP7和p EGFP-N1-MMP9真核表达质粒,进行融合蛋白亚细胞定位研究;在民猪和长白群体中进行MMP7和MMP9基因多态位点与哺乳仔猪腹泻评分和生长性状的关联分析;利用5’缺失试验分析鉴定MMP9基因启动子区域;主要研究结果如下:（1）采集28日龄断奶仔猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃肠道等组织,提取RNA,反转录c DNA,利用q RT-PCR检测MMP7和MMP9基因的组织表达模式,结果发现MMP7和MMP9基因在胃、十二指肠、空肠、回肠和结肠等组织均表达。（2）构建p EGFP-C1-MMP7和p EGFP-N1-MMP9重组质粒,分别转染猪肾细胞（Porcrne kidney-15,PK15）和猪小肠上皮细胞（Porcine intestinal epithelial cells line,IPEC-J2）,通过倒置荧光显微镜检测发现MMP7和MMP9融合蛋白定位于细胞质中。（3）利用直接测序法研究猪MMP7基因的遗传变异,使用Hae III PCR-RFLP方法对SNP rs327380117进行基因分型,在民猪和长白仔猪群体中进行单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）与腹泻评分和生长性状的关联分析。结果表明:在长白群体中TT基因型的腹泻评分显着低于TC基因型（P<0.01）,TT基因型个体的14日龄体重显着低于TC基因型个体（P<0.05）。对本课题组前期发现的猪MMP9基因的三个SNPs与民猪和长白仔猪的腹泻评分和生长性状进行关联分析。结果表明,在民猪群体中,AA基因型（g.48178429G>A）的腹泻评分低于GA基因型（P<0.05）;在长白猪群体中,AA基因型的35日龄体重和日增重都分别低于GG基因型（P<0.05）。对于rs336583561,民猪仔猪的GG基因型与AG基因型相比有着较低的腹泻评分（P<0.05）。对于g.48184777C>T,长白仔猪CC个体的出生重以及第3、7、14、21、28、35日龄体重均高于TC个体（P<0.05或P<0.01）。（4）生物信息学分析发现MMP7基因编码区的SNPs为同义突变。MMP9基因SNP g.48178429G>A位于MMP9-203转录本5’侧翼区域,5’缺失实验发现该区域没有启动子活性。综上,本研究发现猪MMP7和MMP9基因在断奶仔猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和胃肠道等检测的组织中均表达。EGFP-MMP7和EGFP-MMP9融合蛋白定位于PK15和IPEC-J2细胞的细胞质。MMP7基因SNP rs327380117与长白仔猪腹泻相关;猪MMP9基因SNP g.48178429G>A和rs33658361与民猪仔猪腹泻相关;g.48178429G>A和g.48184777C>T与长白仔猪生长性状相关。MMP9基因启动子活性区域位于MMP9-201转录本5’侧翼区域。
庞云丽[4]（2020）在《胞浆接头蛋白Dok5的表达纯化》文中研究说明Dok（downstream of tyrosine kinase/Docking protein）是酪氨酸激酶下游蛋白,在细胞信号转导中至关重要。该家族包含了 Dok1至Dok7共7个成员,它们具有相似的结构特征:N端PH结构域、中央PTB结构域以及C末端区域。PH结构域可以帮助某些蛋白定位于质膜上,中央PTB结构域主要结合磷酸化的酪氨酸,C末端可以结合信号分子调节下游信号通路。Dok5是Dok家族成员之一,已有研究报道,Dok5 可以结合 c-Ret（proto-oncogene encodes receptor tyrosine kinase,Ret）受体,通过 GDNF（Glial cell line-Derived Neurotrophic Factor,GDNF）信号通路促进神经细胞分化;同时也是受体酪氨酸激酶中的原肌球蛋白相关激酶（tropomyosin-related kinase,Trk）受体的底物,能通过PTB结构域的酪氨酸磷酸化与 TrkB/C 结合,并激活 MAPK（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路,参与神经细胞的分化和凋亡;并且可以被胰岛素受体磷酸化,参与胰岛素信号通路。这些信号通路均在神经系统的发育中发挥重要功能,因此,推测Dok5是一个神经发育相关蛋白。但目前关于Dok5在机体内的功能和分子机制研究未见报道。首先,我们对Dok5基因的序列和编码的氨基酸序列进行了分析。Dok5长度为921 bp,含8个外显子和7个内含子。编码306个氨基酸,包含PH结构域、PTB结构域和C末端区域。其相对分子质量为35.453 kDa,理论pI为9.0,其氨基酸序列在不同物种中高度保守。SignalP信号肽和TM跨膜域预测结果显示Dok5既没有信号肽结构,也没有跨膜区。通过ProtParam和Protscale在线分析显示,Dok5的不稳定系数为42.69,总平均亲水性系数为-0.519,尽管C端富含疏水区,但整体上仍是一个稳定的亲水性蛋白。NetPhos3.1 Server在线预测显示,Dok5含有50个潜在的磷酸化位点,其中包含33个丝氨酸磷酸化位点,14个苏氨酸磷酸化位点,3个酪氨酸磷酸化位点。作为一个信号蛋白,Dok5的众多磷酸化位点很可能作为信号分子的停泊位点,激活下游信号通路。这些基本信息为后续的蛋白表达提供指导意义。一方面,为了寻找Dok5的相互作用蛋白以揭示其在信号转导过程中的分子机制,我们在原核表达系统进行了 Dok5不同结构域蛋白的表达。分析了用PCR方法分别扩增编码Dok5全长（FL）、PTB/PH/C结构域的cDNA,并将其克隆入表达载体pGEX 6p-1中,获得了原核表达质粒pGEX 6p-1-Dok5 FL、pGEX 6p-1-Dok5 PH、pGEX 6p-1-Dok5 PTB、pGEX 6p-1-Dok5 C。将重组质粒转化大肠杆菌BL21,筛选高效表达GST融合蛋白的菌株。在0.1mM IPTG、16℃条件下,在大肠杆菌BL21中获得Dok5 FL、Dok5 PH、Dok5 PTB蛋白的表达,并进行了Glutathion Sepharose 4B亲和层析柱纯化。用Dok5特异性抗体进行Western blot检测,结果表明所表达纯化的融合蛋白与Dok5抗体具有良好的反应性,为后续通过GST pull down寻找Dok5相互作用蛋白奠定了实验基础。另一方面,原核表达蛋白缺少翻译后修饰,不能得到正确折叠的活性蛋白。为了进行Dok5在体水平的功能研究,获得能特异性识别Dok5的抗体至关重要。目前规模化生产的抗体均是用C末端的部分合成多肽免疫动物所得的多克隆抗体,能够识别原核表达的蛋白,但在哺乳动物细胞和动物组织中没有良好的特异性。而昆虫表达系统由于具有翻译后修饰功能,所获得的蛋白更接近于天然蛋白,以此为抗原制备的抗体能够特异识别天然蛋白。因此,我们在昆虫细胞表达系统中进行了 Dok5 FL和C端蛋白的表达,以作为抗原在后续工作中进行抗体的制备。将Dok5 FL和C端分别克隆到pFastBac1载体上,构建了 pFastBac1-Dok5 FL、pFastBac1-Dok5 C质粒。将重组质粒转化DH10感受态细胞,通过蓝白斑筛选得到高效产Bacmid的菌株,用Bacmid转染昆虫细胞SF21,分别获得P1/P2/P3病毒;用P3病毒感染High Five细胞,以期获得大量胞内表达的目的蛋白。同时,由于Dok5没有信号肽结构,我们在pFastBac1载体上引入了 Hemolin信号肽,构建了pFastBac1-Hemolin-Dok5 FL、pFastBac1-Hemolin-Dok5 C质粒,以尝试使蛋白能够分泌表达,提高蛋白表达纯化的效率,从而为制备Dok5特异性抗体提供活性蛋白抗原。
张胜男[5]（2020）在《裂谷热病毒eGn蛋白重组狂犬病病毒及细菌样颗粒免疫原构建与实验免疫研究》文中提出裂谷热（Rift Valley Fever,RVF）是由裂谷热病毒（Rift Valley Fever virus,RVFV）引起的一种主要感染牛、羊、骆驼、野生动物等的人兽共患烈性传染病。RVFV可通过蚊虫叮咬、直接接触病畜及其畜产品以及气溶胶传播。人感染RVFV后出现高烧不退、呕吐、四肢无力、腹泻等临床症状。感染RVFV可致使100%怀孕母羊流产、90%羔羊死亡、20%成年羊死亡。1931年于肯尼亚裂谷首次发现RVF后,开始在非洲国家和地区流行、传播。2000年,沙特阿拉伯和也门出现RVF疫情,象征着RVF开始向非洲以外的国家和地区蔓延、扩散。2001年《禁止生物武器公约》的监控、核查名单中、2015年（8+3）和2018年（9+X）世界卫生组织（WHO）提出的优先研究疾病名单中均包括RVF。世界动物卫生组织（OIE）也将RVF规定为法定呈报传染病。随着世界经济全球化,各个国家联系密切,往来频繁,增加了 RVF自然感染或输入性病例发生的几率。我国于2016年7月确定首例人RVF输入性病例。RVF疫情的暴发流行不但威胁到人类、家畜和野生动物的健康,产生的贸易壁垒还严重影响着国家的经济贸易发展。介于传统的灭活疫苗及弱毒疫苗存在病毒毒力返强、病毒发生重组等弊端,使其在RVF非流行地区使用受到严格限制。目前,对于RVF尚无获批疫苗或特异性治疗方法。进行疫苗和治疗性抗体研发,对于预防控制RVF传播扩散、保护患者以及降低经济损失具有重要意义。从动物源头开展防控,可以有效控制RVFV的传播、扩散,研制安全性高和免疫原性强的兽用RVF疫苗迫在眉睫。为此本研究以狂犬病病毒SRV9株为载体,构建表达RVFV eGn蛋白的重组狂犬病病毒rSRV9-eGn,同时利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达RVFV Gn head蛋白与乳酸乳球菌蛋白锚钩（PA）的融合蛋白,将其展示在乳酸乳球菌肽聚糖（GEM）颗粒表面制备成RVFV细菌样颗粒RVFV-BLPs,分别进行安全性及免疫原性研究,为研制安全性高、免疫原性强的RVF新型疫苗奠定基础。1.表达RVFV eGn蛋白重组狂犬病病毒rSRV9-eGn的构建与鉴定基于本实验室现有RABV弱毒SRV9株感染性克隆,本研究通过分子生物学技术将RVFV主要抗原表位Gn胞外区基因插入到SRV9基因组中,构建了包含RVFV eGn基因的重组狂犬病病毒感染性克隆rSRV9-eGn,与辅助质粒pD-N、pD-P、pD-G、pD-L共转染BSR细胞,成功拯救了重组病毒rSRV9-eGn。直接免疫荧光结果表明重组病毒rSRV9-eGn拯救成功;RT-PCR结果表明RVFV eGn基因已经成功插入到重组病毒rSRV9-eGn中且可稳定遗传;间接免疫荧光、SDS-PAGE和Western Blot结果表明RVFV eGn蛋白成功表达且与RABVG蛋白共同嵌合在病毒粒子表面,为将重组病毒rSRV9-eGn灭活使用奠定基础;电镜下观察重组病毒rSRV9-eGn具有典型的弹状形态特征;生长曲线显示重组病毒rSRV9-eGn与母本病毒rSRV9的生长动力学相似,培养72 h时为病毒的最佳收获时间;ICR乳鼠与成年鼠颅内注射不同病毒滴度的重组病毒rSRV9-eGn和母本病毒rSRV9结果表明,RVFV eGn基因的插入降低了 rSRV9毒株的神经毒性。综上所述,本部分研究成功拯救重组病毒rSRV9-eGn。2.表达RVFV eGn蛋白重组狂犬病病毒rSRV9-eGn免疫原性评价为了评估重组病毒rSRV9-eGn的免疫原性,活母本病毒rSRV9与活重组病毒rSRV9-eGn单剂量免疫小鼠、灭活重组病毒rSRV9-eGn单独或辅以不同佐剂三剂量免疫小鼠。结果显示,仅灭活重组病毒rSRV9-eGn辅以Poly I:C+ISA201VG复合佐剂组可以诱导小鼠产生抗RVFV eGn特异性IgG抗体,其中以IgG1为主导亚型,IgG1/IgG2a>1表明其可触发倾向于Th2型体液免疫应答反应。利用经基于VSV系统包装的RVFV假病毒与小鼠血清进行中和抗体验证,发现含有高效价抗RVFV eGn特异性IgG抗体的小鼠血清中无抗RVFV中和抗体。取该组小鼠血清及脾细胞进行细胞因子检测发现,灭活重组病毒rSRV9-eGn辅以Poly I:C+ISA201VG复合佐剂免疫小鼠后,可诱导小鼠的Th2型细胞分泌细胞因子。除此之外,灭活重组病毒rSRV9-eGn辅以Poly I:C+ISA201VG复合佐剂还可以诱导小鼠中央型和效应型记忆T细胞数量增加。灭活重组病毒rSRV9-eGn辅以Poly I:C+ISA201VG复合佐剂免疫小鼠,可以诱导小鼠产生抗RVFV特异性IgG抗体外,还可以产生抗RABV中和抗体。RABV体内外中和实验表明一免一周、一免两周、两免一周分别有30%、70%、100%小鼠血清抗RABV中和抗体阳性;CVS-11街毒于一免一周和两免一周对免疫小鼠进行攻击,小鼠存活率分别为30%和100%。以上结果表明,rSRV9毒株具有良好的免疫原性,是一个有潜质的病毒载体。3.GEM展示RVFV细菌样颗粒的构建与鉴定基于本实验室成熟的昆虫细胞-杆状病毒表达系统,制备GEM展示RVFV细菌样颗粒。一是通过融合PCR方法将RVFV Gn head基因与乳酸乳球菌MG1363 PA基因进行融合,转染Sf9细胞进而实现RVFV Gn head-PA融合蛋白表达。将食品级乳酸乳球菌MG1363进行酸化处理,制备GEM颗粒。RVFV Gn head-PA融合蛋白与GEM颗粒相互作用,通过非共价结合方式将RVFV Gn head-PA融合蛋白展示在GEM颗粒表面。PCR扩增结果表明,HBM-His-RVFV Gn head-PA融合基因已经成功插入到重组杆状病毒基因组中;间接免疫荧光、SDS-PAGE、Western Blot结果表明,RVFV Gn head-PA融合蛋白已成功分泌性表达,但此融合蛋白只能在重组杆状病毒中传至四代,第五代细胞培养物中未检测到融合蛋白;间接免疫荧光、流式细胞术、免疫电镜结果表明,RVFV Gn head-PA融合蛋白通过非共价结合已成功展示在GEM颗粒表面。电镜下观察超薄切片结果表明,未处理的乳酸乳球菌MG1363细胞壁清晰可见、内部质地均一;GEM颗粒保留乳酸乳球菌光滑形态结构的前提下去除了其自身的遗传物质及蛋白质、内部中空;RVFV Gn head-PA融合蛋白展示在GEM表面后,GEM表面附着一层絮状物。综上所述,基于昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达的RVFV Gn head-PA融合蛋白成功地展示在GEM颗粒表面,制备成RVFV细菌样颗粒RVFV-BLPs。4.GEM展示RVFV细菌样颗粒免疫原性评价为了评估RVFV-BLPs免疫原性及不同抗原量对其免疫原性的影响,设置20μg、50μg、100 μg抗原量的RVFV-BLPs免疫小鼠。结果显示,三种抗原量RVFV-BLPs均可诱导小鼠产生抗RVFV Gn head特异性IgG抗体,但特异性IgG抗体水平与免疫原量不成正比,其中以RVFV-BLPs（50 μg）组免疫效果最佳,呈现抗体出现早、持续时间长、消退慢等特点。通过检测IgG亚型发现,三种不同抗原量RVFV-BLPs刺激小鼠产生的IgG亚型也呈现不同的特点。RVFV-BLPs（20 μg）组仅检测到IgG1;RVFV-BLPs（50μg）组检测到较高效价的IgG1,之后在免疫不同时间点检测到了 IgG2a和IgG3;RVFV-BLPs（100 μg）组仅检测到以IgG1及IgG2a,其中IgG1为主导。三种不同抗原量的RVFV-BLPs免疫小鼠后产生的IgG抗体均是以IgG1亚型为主体,IgG1/IgG2a均是大于1。取三组小鼠血清进行细胞因子分析,发现不同抗原量RVFV-BLPs免疫小鼠后,可诱导小鼠产生不同种类及量的细胞因子,表明抗原量可能强烈影响免疫过程中诱导的功能效应细胞的类型。RVFV-BLPs（20 μg）组、RVFV-BLPs（50 μg）组小鼠可产生Th1型细胞因子也产生Th2型细胞因子;RVFV-BLPs（100 μg）组小鼠以Th2型细胞因子为主。综合免疫小鼠的特异性IgG亚型及血清中细胞因子种类结果分析,RVFV-BLPs免疫小鼠后,诱导小鼠产生倾向于Th2型体液免疫应答。基于抗RVFV Gn head特异性IgG抗体结果及其血清中细胞因子分析,本研究选择RVFV-BLPs（50 μg）组进行了深入研究。利用经基于VSV系统包装的RVFV假病毒与RVFV-BLPs（50 μg）组三免两周小鼠血清进行中和抗体检测,发现中和50%RVFV假病毒的小鼠血清稀释倍数为40倍。取RVFV-BLPs（50 μg）组小鼠脾细胞进行细胞免疫检测,发现RVFV-BLPs（50 μg）可促进小鼠淋巴细胞增殖,也可促进小鼠脾细胞产生IFN-γ和IL-4细胞因子。与PBS对照组相比,CD4+和CD8+T淋巴细胞的中央记忆T细胞数量增加,主导的效应记忆T细胞减少,表明RVFV-BLPs（50 μg）免疫小鼠后,诱导小鼠产生的中央记忆T细胞定居在外周免疫器官T细胞区,当受到抗原刺激后其分化成效应细胞及效应分子,不直接发挥效应,抗原再次刺激时重新分化为效应细胞,并快速发挥免疫效应作用。综上所述,本研究中制备的两种预防RVFV感染的免疫原,即RVFV eGn蛋白重组狂犬病病毒rSRV9-eGn与GEM展示RVFV细菌样颗粒RVFV-BLPs,均是首次将RABV载体与GEM展示的细菌样颗粒方法应用于新型RVF疫苗探索研究。二者特点各有不同:二者均可刺激机体产生特异性细胞免疫与体液免疫应答;灭活重组病毒rSRV9-eGn配伍佐剂使用有望研制成既可预防RABV感染又可预防RVFV感染的二联疫苗;GEM展示RVFV细菌样颗粒RVFV-BLPs易于生产、保存与运输。二者均具有开发成为RVF疫苗候选株的潜能,为RVF新型疫苗研究奠定基础。
李洪哲[6]（2019）在《肠道共生菌群改变引起Th细胞的偏向对CA16感染恒河猴的影响》文中指出目的 建立一种可以用于共生菌群研究的恒河猴动物模型,并对肠道共生菌群改变后机体免疫系统中T淋巴细胞亚群的变化与柯萨奇病毒A16型（Coxsackievirus A16,CA16）感染进程和病理学变化之间的关系进行研究。方法 本研究联合使用氨基糖苷类、青霉素类、糖肽类和硝基咪唑类等4类广谱抗生素,通过饲喂联合抗生素的方法来构建共生菌群被清除的灵长类动物模型;应用实时荧光定量PCR技术和扩增子测序技术相结合的方法检测肠道和呼吸道共生菌群多样性和丰富度,同时应用宏病毒组测序和代谢组学方法来分析机体微生物代谢产物和共生病毒组成的改变;在CA16感染后,观察恒河猴出现的发热、手足口疱疹等临床症状;RT-qPCR检测病毒血症和各组织器官中的病毒载量;H&E染色观察抗生素处理后和感染后各组织器官的病理变化;并通过流式细胞术、液相芯片技术、表达谱芯片和免疫荧光等方法对恒河猴机体免疫系统变化和CA16感染进行检测和观察。结果 本研究按实验设计分为两个部分。在第一部分建立动物模型的研究中,根据实时荧光定量PCR结果,在饲喂抗生素后第9天总16S rRNA基因相对丰度下降80%以上,随后菌群丰度保持着相对较低的水平。根据肠道菌群扩增子测序结果,抗生素处理后第9天恒河猴肠道共生菌OTU水平下降90%以上,14天后检测到肠道优势菌转变为埃希氏菌-志贺菌,该物种组成能够长期保持稳定。重塑后的肠道菌群丰度较低,且没有观察到对机体健康有有害的影响。根据呼吸道共生菌群测序结果,抗生素处理后恒河猴呼吸道共生菌群在属分类水平上的优势菌群组成和结构有所改变,但仍具有丰富的呼吸道菌群和菌群多样性。此外,肠道病毒组和代谢组的检测结果表明,随着肠道共生菌群的清除病毒组中噬菌体和DNA病毒丰富度显着下降,因此病毒组丰度与共生菌群多样性之间存在着正相关的关系;原有的肠道菌群代谢产物在抗生素处理之后色氨酸等代谢产物显着减少,而鸟氨酸、甘露醇、苏糖醇、糖胺聚糖等代谢产物水平显着增高。外周免疫细胞的检测结果表明抗生素处理后恒河猴外周血中T淋巴细胞比例显着升高,B淋巴细胞比例下降;对抗生素处理恒河猴的PBMCs进行表达谱分析结果则表明,IL13、VCAM1和IL1基因表达水平上调了5倍以上,其他固有免疫相关基因的表达水平也有着显着变化。在第二部分肠道共生菌与CA16感染之间的相互作用关系研究中,肠道共生菌群缺失的恒河猴与正常恒河猴一样均可以被CA16感染,并在感染后3～4天出现体温升高、手口部位疱疹等临床症状;肠道共生菌群缺失的恒河猴在感染后第3天检测出病毒血症,而正常恒河猴在感染后第5天检测出病毒血症,且肠道共生菌群缺失的恒河猴病毒血症持续时间更长、病毒载量峰值更高;肠道共生菌群缺失恒河猴各主要组织中病毒载量峰值出现的时间更晚、峰值更高且清除时间更久,病理变化也更严重。在CA16感染后,肠道共生菌群缺失恒河猴没有产生有效的中和抗体水平,且分泌IgG的B细胞水平也低于正常恒河猴。免疫荧光结果也验证了肠道共生菌群缺失恒河猴CD3+T淋巴细胞和感染后的病毒颗粒在小肠组织中的数量更多。CA16感染后外周免疫细胞和细胞因子的检测结果表明,在肠道共生菌群缺失恒河猴中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞比例高于正常水平,CD8+和CD20+淋巴细胞应答水平在CA16感染早期则低于正常恒河猴,CD3+CD4+IFNγ+淋巴细胞比例也明显下降;Th17/Treg细胞比例和IL17A细胞因子水平也有所改变;CD3+CD4+GATA3+淋巴细胞比例及其分泌的多种细胞因子水平在感染中后期大幅度升高。CA16感染后抗生素处理组恒河猴的组织局部免疫与正常恒河猴相比,小肠中CD3+CD4+IL17A+、CD3+CD4+GATA3+淋巴细胞比例增加,而CD3+CD4+IFNγ+淋巴细胞比例减少,CD4+CD25+淋巴细胞比例两组的差异不大。结论 本研究的结果表明在不影响机体健康状态的前提下,短期饲喂高剂量联合抗生素后即能有效清除恒河猴肠道共生菌,达到建立可用于肠道共生菌群研究的恒河猴动物模型的目的;同时,恒河猴肠道共生菌群的缺失会影响菌群代谢产物水平、机体肠道病毒组组成和外周血中淋巴细胞水平。应用CA16病毒感染动物模型,肠道共生菌群缺失的恒河猴与正常恒河猴一样均可以被感染并出现临床症状;但与正常恒河猴相比,肠道共生菌群缺失恒河猴在感染后的病毒血症和组织中病毒载量情况更严重且清除时间更久。与机体免疫系统变化进行比较分析,我们发现肠道共生菌群缺失恒河猴的全身和局部免疫系统中Th17/Treg细胞比例失衡、Th2细胞比例增多及其分泌的多种细胞因子水平上调,这些T细胞亚群比例的失衡和偏向性可能会加重机体炎性反应、影响CD8+T淋巴细胞应答和B细胞分化及抗体的产生,进而导致CA16持续性感染并加重病理损伤。总的来说,本研究证实了恒河猴肠道共生菌群的改变可能会通过调节机体Th2/Th1、Th17/Treg细胞比例的平衡来影响CA16感染的进程和病理变化。
李昊[7]（2019）在《Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究》文中研究指明肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一种生长因子,属于TGF-β超家族,主要在骨骼肌细胞中表达,对肌肉的生长具有负调控作用。MSTN基因的过表达可引起肌肉萎缩,而MSTN基因发生突变或被敲除时则会使动物的肌肉量增加,产生双肌现象。本研究利用克隆获得的绵羊MSTN基因构建真核表达载体,同时设计合成MSTN干涉序列并构建RNA干涉载体,共转染293GP细胞后经荧光定量PCR检测获得干涉效率最佳的载体;将其线性化后转染绵羊成纤维细胞后,经G418筛选获得MSTN敲低转基因细胞系;以MSTN敲低转基因细胞为核供体,利用细胞核移植的方法获得MSTN敲低转基因绵羊克隆胚和转基因绵羊,以期建立获得肌肉丰满绵羊新品系的方法。此外,本研究利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,为后续利用CRIISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。本研究的结果与结论如下:1、绵羊MSTN基因RNA干涉载体构建和活性分析（1）绵羊Myostatin基因的克隆:参照GenBank中绵羊MSTN基因序列（AF019622.1）,采用RT-PCR扩增技术,克隆绵羊肌肉生长抑制素基因,将其连接到pcDNA3.1（+）载体,获得肌肉抑制素基因真核表达载体;（2）RNA干涉表达载体的构建:参照绵羊MSTN基因的mRNA序列,设计合成RNA干涉序列并与pRNAT-U6载体连接,获得RNA干涉表达载体。与真核表达载体共转染293GP细胞后,通过实时定量PCR检测干涉效率,获得干涉效果最佳序列。（3）RNA干涉载体表达活性检测:将筛选获得的RNA干涉载体线性化,采用显微注射的方式,注射到小鼠原核时期的胚胎中,注射后的胚胎可以分裂为2细胞,经体外培养最终获得表达绿色荧光蛋白的囊胚,表明所构建的RNA干涉载体可以在胚胎中正常表达并支持胚胎的发育。2、绵羊MSTN敲低转基因成纤维细胞系的建立通过脂质体转染法将线性化的RNA干涉载体转染到绵羊成纤维细胞中,经G418筛选,获得转基因阳性细胞;PCR结果显示,构建的基因已整合到细胞基因组中;对获得的转基因阳性细胞的形态学特征、生长曲线以及冷冻复苏后特征的检测结果表明,转基因细胞具有正常细胞的生物学特征。3、绵羊MSTN敲低转基因胚胎的获得（1）供体细胞的修饰和处理:来源于成纤维细胞的核移植胚胎的卵裂率为44.6%,高于MSTN敲低转基因细胞的33.0%,且差异显着,但两者的桑/囊胚率差异不显着（分别为24.1%和15.6%）;供体细胞不需进行血清饥饿处理,使用接触抑制方法可以达到相同效果。（2）重构胚的融合、激活和培养:采用逐个融合（一次一个）的融合方式能显着提高融合效率,但融合后的胚胎发育能力和批量融合（一次多个）方法比差异不显着;采用A23187+6-DMAP激活卵母细胞与采用Ionomycin+6-DMAP激活方法之间的效果差异不大;重构胚融合后培养34 h后再进行激活可有效提高胚胎卵裂和囊胚发育率。KSOM和SOFaa都可以用来进行绵羊克隆胚的体外培养。4、转基因核移植胚胎的移植和胎儿鉴定（1）重构胚的移植:采用输卵管移植方法,将原核期或2-细胞期的核移植胚胎（242枚）移植到同步发情的受体绵羊（23只）体内,以检验其在体内的发育能力。（2）转基因胎儿鉴定:在23只受体中,最终只有1只受体妊娠,但妊娠期间发生流产,未能获得成活个体,获得流产胎儿1只;对流产胎儿进行PCR鉴定,结果显示,胎儿基因组中整合有目的基因。5、肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得（1）Rosa26基因sgRNA的设计和体外验证:根据小鼠Rosa26基因序列设计sgRNA,体外编辑试验表明,所设计的sgRNA可以对Rosa26位点发生编辑作用;（2）肌肉特异打靶载体的构建:通过PCR和同源重组连接,成功构建了肌肉特异表达Cas9蛋白的同源打靶载体Donor-SP-Cas9-DsRed;（3）Rosa26基因编辑胚胎和小鼠的获得:注射Rosa26 sgRNA和Cas9到小鼠胚胎,注射后的胚胎可以正常卵裂并支持囊胚发育,通过PCR和测序结果显示,获得的胚胎为基因编辑胚胎,注射的胚胎经胚胎移植后,获得了 Rosa26基因编辑小鼠;（4）通过将同源打靶载体与Rosa26 sgRNA和Cas9联合注射的方式,获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶胚胎;综上所述,通过构建MSTN基因RNA干涉载体、转染绵羊成纤维细胞建立MSTN敲低转基因细胞系和转基因细胞核移植等程序,可以获得MSTN敲低的绵羊转基因克隆胚,胚胎移植后获得流产胎儿且携带外源基因,表明获得的重构胚具有体内发育能力,可以通过该方法获得MSTN敲低的转基因绵羊。本研究结果为培育MSTN敲低的绵羊新品系提供了依据。此外,通过利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,初步在小鼠上建立了基因编辑和基因打靶体系,为后续利用CRISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。
余磊,李冬,姚文荣,王凤杰,崔艳芳,杨贵波[8]（2017）在《恒河猴XC趋化因子受体1（XCR1）基因的克隆和体外表达》文中研究说明目的了解恒河猴XC趋化因子受体1（XCR1）基因特征,并在HEK293T细胞上表达。方法采用反转录PCR和cDNA末端快速扩增法（RACE）克隆恒河猴XCR1基因、并与GenBank中其他物种XCR1的cDNA序列进行比对。构建真核表达载体3.1-XCR1并转染HEK293T细胞,采用流式细胞术、Western blot法和激光扫描共聚焦显微镜技术检测XCR1蛋白的表达。结果恒河猴XCR1 cDNA序列全长1665 bp,包含415 bp的5’非翻译区（5’UTR）、1003 bp的编码区和248 bp的3’UTR;恒河猴XCR1编码区氨基酸序列与人XCR1的相似性为96.8%,而且具有相似的结构特征:含有七次跨膜结构,酸性N端以及保守的G蛋白锚定功能性基序HRYLSVV。与基因组序列比对和跨外显子反转录PCR结果表明,在恒河猴多种组织中只存在缺失第二外显子的剪接变异体。恒河猴XCR1可在HEK293T细胞中表达Mr40 000左右的分子、主要分布于细胞质和细胞膜上。结论除mRNA剪接异构体以外,恒河猴XCR1分子与人高度相似,并且能在HEK293T细胞中有效表达。
姚文荣[9]（2016）在《恒河猴DNGR-1及其在免疫缺陷病毒感染后的变化》文中研究表明研究背景树突状细胞自然杀伤细胞凝集素家族受体1（DC NK lectin group receptor-1,DNGR-1）又称为C型凝集素结构域家族9成员A（C-type lectin domain family 9 member A,CLEC9A）,属于II型跨膜蛋白,为C-型凝集素受体家族成员之一。DNGR-1的表达具有高度的DC选择性,其配体是死亡和受损细胞暴露的纤维状肌动蛋白（Filament actin,F-actin）。DNGR-1参与DC的内吞功能,与交叉呈递死亡细胞和肿瘤相关抗原、启动细胞和体液免疫应答有关,在肿瘤疾病的预防和治疗,以及抗病毒感染中具有重要的作用。目前,DNGR-1的研究主要集中在人和小鼠DNGR-1结构、功能以及在诱导肿瘤和病毒特异免疫应答中的作用等方面。人DNGR-1分子主要表达在BDCA3+（CD141+）DC表面,小鼠DNGR-1主要表达在CD8α+DC表面,都与DC抗原交叉呈递功能有关。但人与小鼠的DNGR-1在胞质区的ITAM样结构、剪切异构体数目以及是否以二聚体或单体形式表达等方面不同,而且人DNGR-1和小鼠Dngr-1基因的核苷酸和氨基酸序列的相似性较低。恒河猴与人类亲缘关系较近,是疫苗和人类疾病研究的重要动物模型。为更好地利用恒河猴研究DNGR-1在艾滋病病理过程中的作用及其在艾滋病疫苗创制中的应用前景,本研究克隆表达了恒河猴DNGR-1基因,阐述了其分子特性、细胞和组织分布以及HIV/SIV感染对不同组织中DNGR-1表达的影响。为深入研究DNGR-1的相关人类疾病及探索艾滋病靶向治疗方法提供必要的科学基础。研究方法1、建立RT-PCR和RACE方法扩增恒河猴DNGR-1cDNA全长序列,用Bioedit（ClustalW）和MegAlign（ClustalW）软件对编码区核苷酸和氨基酸序列进行比对,并用MEGA6.0构建系统发生树。2、构建恒河猴DNGR-1分子胞外端C型凝集素样结构域（C-type lectin-like domain,CTLD）的原核表达质粒,在BL21（DE3）大肠杆菌中表达目的蛋白,纯化、复性后免疫新西兰大白兔制备抗恒河猴DNGR-1抗体。同时构建恒河猴DNGR-1真核表达质粒,转染HeLa细胞用于体外粘附实验。3、采用去除血清、自然凋亡和多聚甲醛固定并透化等方法诱导细胞凋亡及细胞膜损伤,PMA和LPS刺激THP-1细胞焦亡,流式细胞术和免疫荧光方法进行配体结合实验。4、利用巢氏PCR和实时荧光定量PCR检测组织中DNGR-1mRNA的表达水平;利用Western Blotting检测组织中DNGR-1蛋白水平;采用TSA信号放大系统进行免疫荧光染色,激光扫描共聚焦显微镜观察组织中DNGR-1+细胞的分布。5、利用实时荧光定量PCR检测SHIV/SIV感染的恒河猴血液（感染后不同时间点）、肠道、淋巴结等组织和HIV感染者血液中的DNGR-1mRNA水平。同时采集HIV/SIV感染后的血液进行DNGR-1配体结合实验。研究结果1、获得了长度为1270bp的恒河猴DNGR-1cDNA核苷酸序列。DNGR-1编码区、5’非编码区（5’-untranslated region,UTR）和 3’-UTR序列分别为 726bp,124bp 和 420bp。该基因位于第11号染色体,对应在中国恒河猴基因组中的序列为15739bp,编码区包含6个外显子。推测的DNGR-1分子包括胞质区、跨膜区、颈部区和CTLD。恒河猴DNGR-1基因编码区核苷酸和推测的氨基酸序列与GenBank中已有序列（截至2015年）的相似性分别为71.3%-99.3%和54.4%-99.2%,与灵长目动物的相似性最高,与啮齿类动物的相似性最低。构建的系统进化树中,恒河猴DNGR-1与猴科的关系最近,位于同一分支;与人科的关系比较近;与啮齿类等动物的关系比较远,位于不同的分支。2、成功表达了恒河猴DNGR-1的CTLD区,获得了重组DNGR-1CTLD蛋白。恒河猴DNGR-1 CTLD与人的抗原性相似,基于该蛋白制备的抗恒河猴DNGR-1抗体可以用于组织中DNGR-1+细胞的检测。重组CTLD蛋白具有生物学活性,能够识别原代细胞（血液及PBMC）和传代细胞系细胞（HeLa和293T等）中的凋亡和死亡细胞。此外,重组CTLD蛋白还可以结合焦亡的THP-1细胞。HeLa细胞表面表达重组恒河猴DNGR-1蛋白后可以粘附凋亡的MT-4和恒河猴PBMC。3、发现DNGR-1基因在恒河猴大部分组织中均有表达。淋巴结、脾脏和血液中的表达水平较高;胃肠道、肺脏、扁桃体等组织的表达水平较低;皮肤、肌肉、脑（大脑、小脑和脊髓）和心血管系统（心脏、动脉）、气管和骨髓中的表达水平最低。观察到表达DNGR-1（DNGR-1+）的细胞,它们存在于空回肠中段和结肠近端的固有层,腹股沟淋巴结的皮质区和髓质区的交界处,脾脏组织的白髓边界、红白髓交界及边缘区（数量极少）,尚未在胸腺和胃底组织中观察到DNGR-1+细胞。4、观察了DNGR-1mRN 水平在免疫缺陷病毒感染后的变化。恒河猴感染SHIV/SIV后,血液中DNGR-1mRNA水平随感染时间的变化而变化。第一次（SHIV-sf162p4直肠）攻毒后的第41d（P=0.0317）、第二次（SHIV-sf162p4静脉）攻毒后的第4d（P=0.0159）、第11d（P=0.0079）、第98d（P=0.0205）和第三次（SIVmac251静脉）攻毒后第4d（P=0.0483）、第 11d（P=0.0317）、第 182d（P=0.0125）,血液中 DNGR-1mRNA 水平均较攻毒前显着降低（Mann-Whitneytest）,感染后75周的转录水平与正常动物水平相近。整个感染过程中,第二次和第三次攻毒后的前期（约11d）,血液中DNGR-1mRNA水平最低,随后逐渐升高至正常动物水平后又降低,第三次感染后期（实验终止前）再次升高至正常动物水平。感染后75周,肠道、淋巴结、PBMC和血液中的DNGR-1转录水平出现升高趋势,其中结肠近端、肠系膜淋巴结和PBMC中的转录水平显着高于正常动物（P=0.0079,P=0.0317和P=0.0159）。人感染HIV（约3年）后,血液中DNGR-1mRNA水平较正常人明显降低,而且抗逆转录病毒治疗（Antiretroviral Therapy,ART）后DNGR-1mRNA水平显着降低（P<0.0001）,与病毒耐药与否无关。某些HIV感染者血液中DNGR-1mRNA水平可能与病毒载量和CD4+T细胞数量具有负相关性。5、观察了免疫缺陷病毒感染血液中DNGR-1识别细胞的变化。重组CTLD蛋白可以识别SIV/HIV感染血液中的凋亡和死亡细胞。恒河猴感染SIV后,重组CTLD蛋白结合细胞水平降低,而经过ART的HIV感染者的DNGR-1识别细胞水平升高,识别凋亡细胞的百分数和能力取决于血液中发生凋亡细胞的比例和病毒感染后血液中处于不同时期的凋亡细胞水平。结论本研究首次获得了恒河猴DNGR-1cDNA的核苷酸序列,发现与人的DNGR-1基因和结构高度相似,能够编码与人抗原性相似的蛋白质。恒河猴DNGR-1基因在大部分组织中均有表达,不同组织中的DNGR-1mRNA水平不同,肠道（空回肠中段和结肠近端）和淋巴结（腹股沟淋巴结）组织中存在表达DNGR-1的细胞。重组恒河猴DNGR-1胞外区CTLD蛋白具有生物活性,能够结合不同类型的凋亡和焦亡细胞。免疫缺陷病毒感染能够影响DNGR-1基因的转录水平。重组CTLD蛋白能够结合SIV/HIV感染血液中的凋亡细胞,DNGR-1识别细胞水平在SIV感染个体血液中降低,在经抗逆转录病毒治疗的HIV感染者的血液中升高,识别凋亡细胞的百分数和能力与凋亡细胞的比例及处于不同时期的凋亡细胞水平有关。本研究表明恒河猴DNGR-1与人的高度相似,恒河猴作为动物模型的研究成果更易于向AIDS和肿瘤等疾病的预防、治疗和临床应用转化,免疫缺陷病毒感染对DNGR-1基因的表达具有显着影响,抗逆转录病毒治疗未能使其恢复至正常水平,需要在AIDS治疗疫苗研究中得到重视。
淡新刚[10]（2015）在《GnIH对小鼠繁殖的调控及其分子机制和基因免疫技术研究》文中指出促性腺激素抑制激素（GnIH）是近期发现含12个氨基酸的激素,在哺乳动物上又称为RF酰胺相关肽（RFRP）。据推测GnIH与抑制素生理功能相似,能够抑制促性腺激素的合成和释放,并能以旁分泌或自分泌方式直接参与调控卵巢功能。本研究先用不同浓度的GnIH注射雄性小鼠,再用不同浓度的GnIH对小鼠卵泡颗粒细胞进行体外培养,从下丘脑、垂体、睾丸和卵泡颗粒细胞角度分析GnIH的作用及其机制。为了证明研究结果的可靠性,在本实验室现有抑制素基因疫苗基础上成功构建了三种新型基因疫苗,分析了这些疫苗在HeLa细胞中的表达情况。最后采用电穿孔肌肉注射方法将这些疫苗免疫小鼠,分析免疫反应及对小鼠产仔数的影响;同时用这些疫苗免疫滩羊,从免疫反应、血清激素浓度变化及产羔数等方面分析基因免疫对繁殖的影响,为进一步优化提高繁殖力的基因疫苗奠定基础。主要研究内容与结果如下:1.GnIH对雄鼠生殖与生殖内分泌的调控及分子机制研究挑选32只小鼠,依据年龄和体重在各组均衡的原则,分为4组,每组8只。试验组小鼠每天两次,分别皮下注射150μl含GnIH 0（对照）、1、3和6μg的生理盐水液,连续11天,然后收集血样,用ELISA方法检测LH、T和INH B的浓度;提取下丘脑、垂体、睾丸组织,提取组织中RNA及蛋白后,用qPCR分别检测GnRH I、Kiss-1、FSHβ、LHβ、GnRHR和HSF-2的mRNA表达;用western bolt检测P450scc、StAR、3β-HSD、LHR和AR蛋白表达;用H.E染色检测睾丸组织形态变化;用TUNEL方法检测生殖细胞凋亡。结果显示:GnIH处理能够明显降低血浆中LH浓度和下丘脑组织中GnRH I mRNA、Kiss-1 mRNA的表达;下调FSHβ、LHβ、GnRH受体、P450scc、StAR和3β-HSD基因的表达,进而降低血中睾酮水平。此外,GnIH处理还能下调精子发生相关基因（LHR、AR、HSF-2）的表达,降低血中INHB的浓度和睾丸组织中INHβb mRNA的表达量,导致睾丸生殖细胞形态异常,诱发凋亡。这些结果表明:GnIH抑制小鼠睾丸类固醇生成及精子发生的机制可以解释为（1）GnIH在下丘脑通过直接抑制GnRH I、Kiss-1mRNA的表达来抑制GnRH释放,或者在垂体抑制GnRHR mRNA的表达,从而减少腺垂体LH的分泌;（2）直接作用于睾丸组织,降低p450scc、star和β-hsd基因的表达来抑制睾酮生成;（3）通过直接下调睾丸中lhr、ar和hsf-2的表达来抑制精子发生。2.gnih对小鼠卵巢颗粒细胞类固醇生成的作用及分子机制首先分离pmsg注射后48h的小鼠卵巢颗粒细胞,体外培养24h、48h、72h、96h后,提取颗粒细胞总rna和蛋白,用qpcr和westernblot方法检测了gnih的受体（gpr147）在小鼠卵巢颗粒细胞上的表达情况。然后用不同浓度（10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml）的小鼠gnih（rfrp-3）培养原代颗粒细胞24h后,收集上清液,提取颗粒细胞总rna和蛋白。用elisa方法检测雌二醇（e2）、孕酮（p）的水平;用qpcr和westernblot方法检测颗粒细胞类固醇生成相关酶基因（p450scc、3β-hsd、star）、fshrmrna和p-erk1/2蛋白的表达;用流式细胞技术检测颗粒细胞的凋亡。结果显示:小鼠颗粒细胞上确有gpr147表达;中剂量（100ng/ml）gnih能够明显降低p450scc、3β-hsd和star、fshrmrna的表达,并能诱导颗粒细胞发生明显的凋亡（p<0.05）;低剂量和中剂量gnih能够显着降低颗粒细胞孕酮的合成（p<0.05）,还能下调p-erk1/2蛋白的表达。这些结果表明:小鼠颗粒细胞上确有gpr147的表达;gnih能够在体外直接作用于小鼠卵巢颗粒细胞,通过降低颗粒细胞中fhsrmrna和p-erk1/2蛋白的表达来降低颗粒细胞孕酮的合成及存活率,从而间接影响卵泡发育。3.gnih与抑制素共表达新型基因疫苗的构建、鉴定及其对小鼠繁殖力的影响先将猪源inhα（1-32）连接到乙肝表面抗原s基因c末端,合成sinh;将牛源gnih（rfrp-3）基因连接到乙肝表面抗原s基因c末端,合成srfrp。将sinh和srfrp基因片段分别插入到pires真核表达载体两个多克隆位点,构建抑制素和促性腺激素抑制激素共表达质粒,即p-sinh/srfrp（简称“共表达质粒”）。然后将组织纤溶酶原信号肽序列（tpa）信号肽序列分别插入到p-sinh/srfrp疫苗目的基因的n-端,构建带有信号肽的抑制素和促性腺激素抑制激素共表达疫苗,即p-tpa-sinh/tpa-sfrfp（简称“信号肽共表达质粒”）;将sinh插入到pires载体上游多克隆位点,构建成抑制素单表达质粒,即p-sinh（简称“单表达质粒,抑制素疫苗”）,用作阳性对照。应用双酶切和测序分析验证这些疫苗是否构建成功,同时将其转染真核细胞后检测在细胞中的表达情况。然后,选取6周龄体重相似的40只昆明小鼠,分为四组,应用电穿孔法将上述三种疫苗分别免疫小鼠,间隔2周加强免疫2次,并以生理盐水作为阴性对照。在初次免疫后第0 d、14d、28d和42d收集血样,用间接ELISA方法检测其中抗抑制素和抗RFRP水平。采血后母鼠与公鼠合笼,连续记录三个胎次的产仔数。双酶切和测序结果表明,三种质粒中目的基因的插入位点、方向和顺序完全正确,且都能在真核细胞中表达;免疫结果表明,在第三次免疫后2周,p-TPA-SINH/TPA-SFRFP疫苗免疫小鼠后血浆抗INH和抗RFRP-3抗体阳性值（P/N值）明显高于p-SINH和p-SINH/SRFRP疫苗产生的（p<0.05）,而且阳性小鼠比率分别是100%（抗INH抗体）和90%（抗RFRP抗体）;繁殖结果表明,三种质粒免疫小鼠后其产仔数显着高于对照组（生理盐水组）,并且p-TPA-SINH/TPA-SRFRP疫苗免疫后小鼠的产仔数明显高于p-SINH疫苗的（p<0.05）。这些结果表明,p-SINH、p-SINH/SRFRP和p-TPA-SINH/TPA-SRFRP质粒被成功构建;三种质粒免疫小鼠后,均能刺激机体产生抗INH和/或GnIH（RFRP-3）抗体,并可提高产仔数。其中,信号肽双表达质粒的免疫和提高产仔数效果最好。4.GnIH与抑制素共表达新型基因疫苗免疫绵羊对其生殖激素及繁殖力的影响挑选32只健康母滩羊,按照年龄和体重相似的原则分为四组,每组8只,分别肌肉注射信号肽共表达疫苗（A组）、共表达疫苗（B组）和抑制素苗（C组）各0.6mg及0.4 ml生理盐水（D组）。加强免疫2次,间隔20 d。在第3次免疫后当天所有绵羊进行同期发情处理。分别在初次免疫后20、30、40、60 d后颈静脉收集血清,并在最后一次采血之后引入公羊,直至所有绵羊妊娠,最后分别统计分娩之后各组绵羊的双羔率。用间接ELISA方法检测血清中抗INH和抗RFRP-3抗体水平;用RIA方法检测同情发情后绵羊外周血中FSH、LH、E2和P的水平。结果表明,在初次免疫后20 d,三种疫苗都能诱发明显的免疫反应,血中抗INH和抗RFRP-3抗体的阳性值（P/N值）显着高于对照组（p<0.05）;信号肽共表达疫苗能够诱发绵羊产生更高抗INH和抗RFRP-3抗体水平;在第3次免疫后20 d,A组绵羊外周血中FSH和LH水平显着高于C组（p<0.05）;双羔率在A、B、C和D组中分别是37.5%,37.5%,12.5%,0。这些结果表明,表达INH和RFRP-3双基因的新型基因疫苗能够诱发绵羊体液免疫反应,增加外周血中促性腺激素水平,并且在一定程度上能够提高母羊的双羔率。
二、恒河猴tPA基因的克隆、测序与真核表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、恒河猴tPA基因的克隆、测序与真核表达（论文提纲范文）
（1）SHIV感染恒河猴体内产生针对HIV-1广谱中和抗体机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 艾滋病 |
| 1.1.1 艾滋病简介 |
| 1.1.2 艾滋病治疗方案研究进展 |
| 1.1.3 艾滋病疫苗研究进展 |
| 1.1.4 艾滋病疫苗的研究模型 |
| 1.2 抗HIV-1 广谱中和抗体 |
| 1.2.1 广谱中和抗体功能及表位 |
| 1.2.2 抗HIV-1 广谱中和抗体产生及进化机制研究 |
| 1.2.3 广谱中和抗体在艾滋病预防和治疗中的应用 |
| 1.3 抗HIV-1 广谱中和抗体的分离与评价技术 |
| 1.3.1 单克隆广谱中和抗体的分离 |
| 1.3.2 单克隆广谱中和抗体评价体系 |
| 1.4 立题依据及实验设计 |
| 1.4.1 立题依据 |
| 1.4.2 实验设计 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 抗体 |
| 2.1.3 质粒与基因合成 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 恒河猴饲养及伦理审查 |
| 2.2.3 病毒载量检测 |
| 2.2.4 假病毒制备及TCID50 检测 |
| 2.2.5 免疫印迹法 |
| 2.2.6 中和实验 |
| 2.2.7 单点突变PCR |
| 2.2.8 单细胞流式分选 |
| 2.2.9 抗体可变区扩增 |
| 2.2.10 单克隆抗体表达 |
| 2.2.11 亲和层析纯化蛋白 |
| 2.2.12 酶联免疫吸附反应 |
| 2.2.13 生物膜干涉实验 |
| 2.2.14 单基因组扩增 |
| 2.2.15 抗体进化分析 |
| 2.2.16 抗原抗体结晶复合物结构分析 |
| 第三章 实验结果与讨论 |
| 3.1 SHIV长期感染恒河猴模型的建立 |
| 3.1.1 SHIV攻毒策略 |
| 3.1.2 恒河猴体内病毒载量检测 |
| 3.1.3 小结 |
| 3.2 SHIV感染恒河猴血浆中和抗体评价 |
| 3.2.1 血浆内抗体中和广谱度及强度评价 |
| 3.2.2 不同SHIVs感染恒河猴产生中和抗体广谱度对比 |
| 3.2.3 血浆内抗体中和表位评价 |
| 3.2.4 表位特异性中和抗体产生过程 |
| 3.2.5 小结 |
| 3.3 SHIV感染恒河猴体内广谱中和抗体基因分离 |
| 3.3.1 表位特异性记忆B细胞分选 |
| 3.3.2 抗体可变区基因扩增 |
| 3.3.3 抗体可变区基因谱系分析 |
| 3.3.4 小结 |
| 3.4 单克隆抗体表达与纯化 |
| 3.4.1 建立单克隆抗体线性表达体系 |
| 3.4.2 小量表达抗体检测抗原结合活性 |
| 3.4.3 完整抗体表达质粒构建及大量表达单克隆抗体 |
| 3.4.4 小结 |
| 3.5 单克隆抗体中和能力评价 |
| 3.5.1 Small global panel评价抗体中和能力 |
| 3.5.2 Large global panel评价抗体中和能力 |
| 3.5.3 小结 |
| 3.6 中和抗体谱系分析 |
| 3.6.1 抗体可变区谱系来源分析 |
| 3.6.2 抗体进化及脱靶抗体分析 |
| 3.6.3 小结 |
| 3.7 J038 谱系抗体中和表位分析 |
| 3.7.1 J038 谱系抗体表位内氨基酸依赖性分析 |
| 3.7.2 J038 谱系抗体结合抗原形式分析 |
| 3.7.3 小结 |
| 3.8 抗原-抗体复合物晶体结构分析 |
| 3.8.1 Cryo-EM揭示J038 结合Env的 V2 区域 |
| 3.8.2 Env-J038 结合V2 区氨基酸位点分析 |
| 3.8.3 Env-J038 结合V2 区糖基化位点分析 |
| 3.8.4 小结 |
| 3.9 J038 谱系抗体进化过程分析 |
| 3.9.1 推测抗体共同祖先及中间过渡体 |
| 3.9.2 共同祖先及中间过渡体抗原亲和力检测 |
| 3.9.3 共同祖先及中间过渡体中和能力检测 |
| 3.9.4 共同祖先及中间过渡体与Env相互作用界面分析 |
| 3.9.5 小结 |
| 3.10 中和抗体与病毒共进化分析 |
| 3.10.1 SHIV感染恒河猴体内病毒变异程度分析 |
| 3.10.2 病毒包膜蛋白突变对血浆中间抗体的影响 |
| 3.10.3 病毒包膜蛋白V2 区突变对单克隆中和抗体的影响 |
| 3.10.4 小结 |
| 3.11 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）裂谷热病毒中和抗体的筛选及保护机制的初步研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1. 抗裂谷热病毒药物研究概况 |
| 2. 研究的目的与意义 |
| 3. 研究内容 |
| 第一章 免疫原的制备 |
| 第一节 表达裂谷热病毒GnGc蛋白重组人4型腺病毒的构建 |
| 第二节 裂谷热病毒截短型Gn和Gc蛋白的真核表达 |
| 第二章 恒河猴的免疫与RVFV Gn和Gc蛋白结合抗体的筛选 |
| 第一节 恒河猴的免疫 |
| 第二节 裂谷热病毒Gn和Gc蛋白结合抗体的筛选 |
| 第三章 裂谷热病毒MP-12株感染性克隆的构建 |
| 第四章 裂谷热病毒中和抗体的筛选和中和表位的鉴定 |
| 第一节 裂谷热病毒中和抗体的筛选 |
| 第二节 裂谷热病毒中和抗体的中和表位鉴定 |
| 第五章 结论 |
| 第六章 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）猪MMP7和MMP9基因组织表达模式及其与哺乳仔猪腹泻的关联分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 研究背景与意义 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 仔猪病毒性腹泻抗性(或易感性)基因研究进展 |
| 1.2.2 仔猪细菌性腹泻抗性(或易感性)基因研究进展 |
| 1.2.3 猪干扰素通路基因研究进展 |
| 1.2.4 MMP7和MMP9 基因研究进展 |
| 1.3 研究目标及方案 |
| 1.3.1 研究目标 |
| 1.3.2 研究方案 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 细胞及菌株 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 常用缓冲液配制 |
| 2.1.6 主要生物学软件及网站 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 细胞复苏、传代及冻存 |
| 2.2.2 猪MMP7和MMP9 基因表达谱研究 |
| 2.2.3 猪MMP7和MMP9 基因亚细胞定位研究 |
| 2.2.4 猪MMP7和MMP9 基因与哺乳仔猪腹泻的性状关联分析 |
| 2.2.5 猪MMP7和MMP9 基因SNPs功能分析 |
| 2.2.6 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 猪MMP7和MMP9 基因表达谱 |
| 3.2 猪MMP7和MMP9 基因亚细胞定位研究分析 |
| 3.2.1 猪MMP7和MMP9 基因亚细胞定位预测 |
| 3.2.2 猪MMP7和MMP9 基因重组质粒构建 |
| 3.2.3 猪MMP7和MMP9 基因亚细胞定位结果 |
| 3.3 猪MMP7和MMP9 基因与哺乳仔猪腹泻的性状关联分析 |
| 3.3.1 猪MMP7基因与哺乳仔猪腹泻的性状关联分析 |
| 3.3.2 猪MMP9基因与哺乳仔猪腹泻的性状关联分析 |
| 3.4 猪MMP7和MMP9 基因SNPs功能分析 |
| 3.4.1 猪MMP7 基因SNPs功能预测 |
| 3.4.2 猪MMP9 基因SNP功能分析 |
| 3.4.3 猪MMP9-201转录本启动子区域鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 猪MMP7和MMP9 基因表达谱分析 |
| 4.2 猪MMP7和MMP9 基因亚细胞定位分析 |
| 4.3 猪MMP7和MMP9 基因与哺乳仔猪腹泻的性状关联分析 |
| 4.3.1 猪MMP7基因与哺乳仔猪腹泻的性状关联分析 |
| 4.3.2 猪MMP9基因与哺乳仔猪腹泻的性状关联分析 |
| 4.4 猪MMP7和MMP9 基因SNPs的功能鉴定分析 |
| 4.4.1 猪MMP7 基因SNPs的功能预测分析 |
| 4.4.2 猪MMP9 基因5’侧翼区SNP的功能鉴定分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（4）胞浆接头蛋白Dok5的表达纯化（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1. 细胞信号转导与酪氨酸激酶 |
| 2. Dok家族蛋白 |
| 3. Dok5与c-Ret受体 |
| 4. Dok5与TrkB/C受体 |
| 5. Dok5与NSR受体 |
| 第二章 实验材料 |
| 1. 菌株 |
| 2. 细胞株 |
| 3. 质粒载体 |
| 4. 细胞培养基及试剂 |
| 5. DNA引物 |
| 6. 常用试剂及耗材 |
| 7. 主要仪器和设备 |
| 8. 软件及网络资源 |
| 第三章 实验方法 |
| 1. 基因的基本信息分析 |
| 2. 基因的克隆与质粒构建 |
| 2.1 PCR扩增 |
| 2.2 PCR产物回收 |
| 2.3 双酶切载体和目的片段 |
| 2.4 目的片段与载体连接反应 |
| 2.5 目的片段与载体同源重组 |
| 2.6 转化 |
| 2.7 菌液PCR鉴定 |
| 2.8 质粒提取 |
| 2.9 酶切与测序鉴定 |
| 3. 昆虫细胞培养与传代 |
| 3.1 细胞复苏 |
| 3.2 细胞传代 |
| 3.3 细胞冻存 |
| 3.3.1 High5细胞冻存 |
| 3.3.2 SF21细胞冻存 |
| 4. 原核表达系统 |
| 4.1 原核表达质粒的构建与鉴定 |
| 4.2 最适诱导菌株的筛选 |
| 4.3 最适诱导温度的确定 |
| 4.4 最适IPTG诱导浓度的确定 |
| 4.5 重组蛋白的分离纯化 |
| 4.6 重组蛋白的鉴定 |
| 5. 昆虫细胞蛋白表达系统 |
| 5.1 重组pFastBac1质粒的构建 |
| 5.2 重组pFastBac1质粒转化DH10 Bac感受态细胞 |
| 5.3 重组Bacmid的提取 |
| 5.4 重组Bacmid的鉴定 |
| 5.5 转染SF21细胞 |
| 5.6 P1-P3病毒制备 |
| 5.7 目的蛋白表达检测 |
| 第四章 实验结果 |
| 1. Dok5基因和蛋白结构分析 |
| 1.1 Dok5基因结构分析 |
| 1.2 Dok5蛋白结构分析 |
| 2. Dok5蛋白的原核表达 |
| 2.1 Dok5原核表达质粒的构建与鉴定 |
| 2.2 Dok5重组蛋白在原核表达系统中的表达 |
| 2.3 Dok5重组蛋白在原核表达系统中的大量表达及纯化鉴定 |
| 3. Dok5蛋白的昆虫细胞表达 |
| 3.1 Dok5重组pFastBac1质粒的构建与鉴定 |
| 3.2 重组Bacmid的鉴定 |
| 3.3 Dok5重组蛋白在昆虫细胞表达系统中的检测 |
| 第五章 结果讨论 |
| 第六章 展望 |
| 第七章 小结 |
| 附件 |
| 个人简历 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）裂谷热病毒eGn蛋白重组狂犬病病毒及细菌样颗粒免疫原构建与实验免疫研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 课题背景 |
| 1.2 裂谷热病毒 |
| 1.2.1 病毒的结构蛋白与功能 |
| 1.2.2 病毒的生命周期 |
| 1.2.3 流行分布及其影响因素 |
| 1.2.4 临床症状 |
| 1.2.5 疫苗研究进展 |
| 1.3 重组狂犬病病毒载体疫苗 |
| 1.3.1 狂犬病病毒 |
| 1.3.2 狂犬病病毒载体的应用 |
| 1.4 基于GEM颗粒表面展示系统的细菌样颗粒疫苗 |
| 1.4.1 GEM颗粒 |
| 1.4.2 细胞壁结构域 |
| 1.4.3 GEM表面展示系统的应用 |
| 2 表达RVFV eGn蛋白重组狂犬病病毒rSRV9-eGn的构建与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞与菌种 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 溶液配制 |
| 2.1.6 实验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 重组质粒的构建与鉴定 |
| 2.2.2 重组病毒的拯救 |
| 2.2.3 重组病毒鉴定 |
| 2.2.4 重组病毒生长特性 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 重组病毒rSRV9-eGn感染性克隆的构建及鉴定 |
| 2.3.2 重组病毒rSRV9-eGn的拯救与鉴定 |
| 2.3.3 一步生长曲线 |
| 2.3.4 重组病毒rSRV9-eGn的稳定性鉴定 |
| 2.3.5 重组病毒rSRV9-eGn的安全性鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 表达RVFV eGn蛋白重组狂犬病病毒rSRV9-eGn免疫原性评价 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞与质粒 |
| 3.1.2 血清与病毒 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.1.5 溶液配制 |
| 3.1.6 实验动物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 293F真核细胞表达RVFV Gn head蛋白 |
| 3.2.2 免疫原的制备 |
| 3.2.3 小鼠分组及免疫 |
| 3.2.4 间接ELISA方法检测特异性IgG抗体及IgG抗体亚型 |
| 3.2.5 Western Blot方法检测特异性抗体 |
| 3.2.6 抗RVFV eGn中和抗体检测 |
| 3.2.7 抗RABV中和抗体检测 |
| 3.2.8 RABV攻毒实验 |
| 3.2.9 MSD方法检测血清中细胞因子 |
| 3.2.10 小鼠脾脏T淋巴细胞增殖试验 |
| 3.2.11 ELISpot方法检测小鼠脾细胞分泌IFN-γ、 IL-4水平 |
| 3.2.12 流式细胞术法检测CD4~+、CD8~+淋巴细胞及其亚型检测 |
| 3.2.13 记忆性淋巴细胞检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 293F真核细胞表达RVFV Gn head蛋白 |
| 3.3.2 间接ELISA方法检测RVFV eGn特异性IgG抗体 |
| 3.3.3 Western Blot方法检测特异性抗体 |
| 3.3.4 抗RVFV eGn中和抗体检测 |
| 3.3.5 抗RABV中和抗体检测 |
| 3.3.6 RABV攻毒实验 |
| 3.3.7 MSD方法检测血清中细胞因子 |
| 3.3.8 脾脏T淋巴细胞体外增殖能力检测 |
| 3.3.9 抗原刺激下脾T淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4的ELISpot检测结果 |
| 3.3.10 脾脏T淋巴细胞亚型分析 |
| 3.3.11 记忆性T淋巴细胞分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小节 |
| 4 GEM展示RVFV细菌样颗粒的构建与鉴定 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞与菌种 |
| 4.1.2 质粒 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.1.4 主要试剂 |
| 4.1.5 溶液配制 |
| 4.1.6 DH10 Bac感受态制备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 重组质粒构建与鉴定 |
| 4.2.2 重组杆粒的制备与鉴定 |
| 4.2.3 重组杆状病毒拯救 |
| 4.2.4 重组杆状病毒的鉴定 |
| 4.2.5 RVFV Gn head-PA融合蛋白的鉴定 |
| 4.2.6 GEM颗粒制备 |
| 4.2.7 RVFV Gn head-PA融合蛋白与GEM颗粒结合及鉴定 |
| 4.2.8 RVFV Gn head-PA融合蛋白锚定结合量测定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 目的基因扩增结果 |
| 4.3.2 重组质粒鉴定 |
| 4.3.3 重组杆粒鉴定 |
| 4.3.4 观察Sf9细胞病变 |
| 4.3.5 重组杆状病毒基因组的PCR鉴定 |
| 4.3.6 RVFV Gn head-PA融合蛋白的间接免疫荧光鉴定 |
| 4.3.7 RVFV Gn head-PA融合蛋白表达形式鉴定 |
| 4.3.8 重组杆状病毒传代次数的确定 |
| 4.3.9 负载RVFV Gn head-PA融合蛋白的GEM颗粒的鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小节 |
| 5 GEM展示RVFV细菌样颗粒免疫原性评价 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 主要仪器设备 |
| 5.1.3 溶液配制 |
| 5.1.4 实验动物 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 免疫原的制备 |
| 5.2.2 小鼠分组及免疫 |
| 5.2.3 间接ELISA方法检测特异性IgG抗体及IgG抗体亚型 |
| 5.2.4 MSD方法检测血清中细胞因子 |
| 5.2.5 抗RVFV Gn head中和抗体检测 |
| 5.2.6 小鼠脾脏T淋巴细胞增殖试验 |
| 5.2.7 ELISpot方法检测脾细胞分泌IFN-γ、IL-4水平 |
| 5.2.8 流式细胞术法检测CD4~+、CD8~+淋巴细胞及其亚型检测 |
| 5.2.9 记忆性淋巴细胞检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 间接ELISA方法检测RVFV Gn head特异性IgG抗体 |
| 5.3.2 MSD方法检测血清中细胞因子 |
| 5.3.3 抗RVFV Gn head中和抗体检测 |
| 5.3.4 脾脏T淋巴细胞体外增殖能力检测 |
| 5.3.5 抗原刺激下脾脏T淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4的ELISpot检测结果 |
| 5.3.6 脾脏T淋巴细胞亚型分析 |
| 5.3.7 记忆性T淋巴细胞分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小节 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（6）肠道共生菌群改变引起Th细胞的偏向对CA16感染恒河猴的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 一种用于共生菌群研究的恒河猴动物模型的建模方法及评价 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和材料 |
| 1.1.1 抗生素 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要耗材和仪器 |
| 1.1.5 主要试剂配制方法 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 动物实验 |
| 1.2.2 伦理 |
| 1.2.3 抗生素处理 |
| 1.2.4 样品采集和保存 |
| 1.2.5 粪便样品中基因组DNA的提取 |
| 1.2.6 病毒组测序粪便样品中核酸的提取 |
| 1.2.7 实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR)检测 |
| 1.2.8 16S扩增子测序 |
| 1.2.9 流式细胞术 |
| 1.2.10 血常规检测 |
| 1.2.11 PBMC分离 |
| 1.2.12 表达谱芯片 |
| 1.2.13 液相芯片 |
| 1.2.14 石蜡切片苏木素-伊红染色(HE)染色 |
| 1.2.15 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 恒河猴机体状态在抗生素处理9天后恢复稳定 |
| 2.2 抗生素饲喂前后肠道共生微生物组的改变 |
| 2.2.1 PCR检测抗生素饲喂前后肠道菌群的变化 |
| 2.2.2 选择性培养方法检测抗生素饲喂前后肠道菌群的变化 |
| 2.2.3 16S扩增子测序检测肠道共生菌群多样性和丰富度的改变 |
| 2.2.4 扩增子测序中菌群16S功能预测结果 |
| 2.2.5 抗生素饲喂后肠道中真核细胞DNA病毒的多样性下降 |
| 2.2.6 肠道共生菌群代谢产物的变化 |
| 2.3 抗生素饲喂前后恒河猴呼吸道共生菌群变化 |
| 2.3.1 扩增子测序检测呼吸道共生菌群多样性和丰富度的变化 |
| 2.4 肠道共生菌群的清除引起机体免疫系统中淋巴细胞比例改变 |
| 2.4.1 对机体外周免疫细胞的影响 |
| 2.4.2 对机体外周血血清中细胞因子的影响 |
| 2.4.3 对外周血单核细胞表达谱的影响 |
| 2.5 肠道菌群缺失导致小肠组织出现病理性变化 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 共生菌群缺失对柯萨奇病毒A组16型感染恒河猴的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 抗原 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要耗材和仪器 |
| 1.1.5 主要试剂配制方法 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 动物饲养 |
| 1.2.2 CA16病毒培养与收获 |
| 1.2.3 病毒滴度测定 |
| 1.2.4 感染实验动物方案 |
| 1.2.5 样品采集 |
| 1.2.6 样品RNA的提取 |
| 1.2.7 病毒载量检测 |
| 1.2.8 中和试验 |
| 1.2.9 流式细胞术 |
| 1.2.10 PBMC分离 |
| 1.2.11 表达谱芯片 |
| 1.2.12 液相芯片 |
| 1.2.13 冰冻切片 |
| 1.2.14 H&E染色 |
| 1.2.15 免疫荧光 |
| 1.2.16 固相酶联免疫斑点(Enzyme-linked immunospot,ELISpot) |
| 1.2.17 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 CA16感染后共生菌群多样性和丰富度的变化 |
| 2.1.1 肠道菌群多样性和丰富度的变化 |
| 2.1.2 呼吸道菌群多样性和丰富度的变化 |
| 2.2 肠道共生菌群缺失恒河猴仍可以感染CA16 |
| 2.2.1 肠道共生菌群缺失恒河猴感染CA16后出现发热症状 |
| 2.2.2 恒河猴感染CA16后手足口疱疹临床症状的观察 |
| 2.3 肠道共生菌群缺失恒河猴在CA16感染后病毒血症更明显 |
| 2.4 抗生素处理组恒河猴感染CA16后肠道组织中病毒载量更高 |
| 2.5 恒河猴感染CA16后主要组织器官的病理变化 |
| 2.6 肠道共生菌群缺失对机体抗病毒免疫反应的影响 |
| 2.6.1 恒河猴在CA16感染后外周血中T、B、NK淋巴细胞比例的变化 |
| 2.6.2 抗生素处理组恒河猴在感染中后期外周血中Th2、Th17淋巴细胞比例更高 |
| 2.6.3 恒河猴在感染后血清中细胞因子含量的变化 |
| 2.6.4 抗生素处理组恒河猴在感染后PBMCs中Th2相关基因表达显着上调 |
| 2.6.5 抗生素处理组恒河猴在感染早期和中期分泌IgG的B细胞水平更低 |
| 2.6.6 抗生素处理组恒河猴在感染后机体没有产生有效的中和抗体水平 |
| 2.7 肠道共生菌群缺失对感染后机体组织局部免疫的影响 |
| 2.7.1 抗生素处理组恒河猴组织中T淋巴细胞比例更高 |
| 2.7.2 抗生素处理组恒河猴在感染后肠道组织中Th1淋巴细胞比例较低 |
| 2.7.3 抗生素处理组恒河猴在感染后肠道组织中Th2淋巴细胞比例升高 |
| 2.7.4 抗生素处理组恒河猴在感染后呼吸道、肠道组织中Th17淋巴细胞比例升高 |
| 2.7.5 抗生素处理对感染后恒河猴组织中调节性T细胞的影响 |
| 2.7.6 抗生素处理恒河猴在感染后组织中固有淋巴细胞的变化 |
| 2.7.7 抗生素处理恒河猴在感染后组织中细胞因子的变化 |
| 2.8 抗生素处理和CA16感染过程中CD3~+T淋巴细胞在小肠中的变化 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录1 溶液配制 |
| 附录2 主要缩略语 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN) |
| 1.1.1 MSTN基因的发现 |
| 1.1.2 MSTN基因和蛋白结构 |
| 1.1.3 MSTN基因的表达 |
| 1.1.4 MSTN的作用机制 |
| 1.1.5 MSTN的表达调控机制 |
| 1.1.6 MSTN基因的应用前景 |
| 1.2 RNA干涉 |
| 1.2.1 RNA干涉现象的发现 |
| 1.2.2 RNA干涉的作用机制 |
| 1.2.3 RNA干涉的作用特点 |
| 1.2.4 siRNA和shRNA技术优缺点 |
| 1.2.5 哺乳动物的RNA干涉 |
| 1.2.6 RNA干涉的应用前景 |
| 1.3 卵母细胞的体外成熟 |
| 1.3.1 卵母细胞的成熟 |
| 1.3.2 卵母细胞的成熟调控机制 |
| 1.3.3 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.3.4 卵母细胞成熟的影响因素 |
| 1.4 哺乳动物细胞核移植 |
| 1.4.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.4.2 哺乳动物胚胎干细胞核移植研究进展 |
| 1.4.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.4.4 哺乳动物转基因细胞核移植研究进展 |
| 1.4.5 影响细胞核移植结果的因素 |
| 1.4.6 核移植存在的问题 |
| 1.5 CRISPR/Cas9 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9的发现 |
| 1.5.2 Cas9蛋白的结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9的作用机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9面临的问题和挑战 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体构建与活性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物、细胞和菌株 |
| 2.1.2 实验载体信息 |
| 2.1.3 药品和试剂 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 绵羊Myostatin基因克隆与序列分析 |
| 2.2.2 绵羊Myostatin真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的构建 |
| 2.2.4 293GP细胞的复苏和传代培养 |
| 2.2.5 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体效率检测 |
| 2.2.6 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的显微注射 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绵羊Myostatin基因的克隆与序列分析 |
| 2.3.2 绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建 |
| 2.3.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体测序 |
| 2.3.4 293GP细胞复苏传代与转染 |
| 2.3.5 RNA干涉效率结果与分析 |
| 2.3.6 RNA干涉载体表达活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 绵羊Myostatin基因敲低成纤维细胞系的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要药品和试剂 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA干涉载体的线性化 |
| 3.2.2 绵羊皮肤成纤维细胞的培养 |
| 3.2.3 G418浓度的筛选 |
| 3.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的转染及筛选 |
| 3.2.5 绵羊MSTN敲低转基因细胞系的鉴定 |
| 3.2.6 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻保存 |
| 3.2.7 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻复苏 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养 |
| 3.3.2 最适G418浓度的筛选 |
| 3.3.3 转基因细胞的生物学特征 |
| 3.3.4 转基因阳性细胞的PCR鉴定 |
| 3.3.5 冷冻复苏的转基因细胞的生物学特征 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 绵羊Myostatin基因敲低细胞核移植 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 药品试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 绵羊卵母细胞的获取 |
| 4.2.2 绵羊卵母细胞的体外成熟 |
| 4.2.3 绵羊成熟卵母细胞的孤雌激活 |
| 4.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的复苏 |
| 4.2.5 显微操作前的实验准备 |
| 4.2.6 核供体细胞的准备 |
| 4.2.7 核受体卵母细胞的准备 |
| 4.2.8 卵母细胞的去核和注核 |
| 4.2.9 重构胚的融合与激活 |
| 4.2.10 重构胚的体外培养 |
| 4.2.11 转基因胚胎的分子鉴定 |
| 4.2.12 转基因胚胎的移植 |
| 4.2.13 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 卵巢的保存和运输对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.2 绵羊卵母细胞的采集方法和分级对卵成熟的影响 |
| 4.3.3 卵密度和不同成熟液对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.4 绵羊卵母细胞成熟时间对成熟和去核的影响 |
| 4.3.5 不同的激活方法对绵羊卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 4.3.6 供体细胞修饰和处理对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.7 绵羊重构胚融合方式对核移植胚胎发育的影响 |
| 4.3.8 重构胚激活前培养时间对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.9 不同培养液对绵羊核移植重构胚发育的影响 |
| 4.3.10 转基因重构胚的获得和PCR鉴定 |
| 4.3.11 胚胎移植和流产胎儿鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 卵巢的保存和运输 |
| 4.4.2 卵母细胞的采集、分级和培养 |
| 4.4.3 供体细胞的遗传修饰和处理 |
| 4.4.4 重构胚的融合、激活和培养 |
| 4.4.5 转基因动物的生产 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物和菌株 |
| 5.1.2 实验载体信息 |
| 5.1.3 药品和试剂 |
| 5.1.4 溶液的配制 |
| 5.1.5 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠Rosa26基因sgRNA的设计与获得 |
| 5.2.2 Rosa26基因sgRNA体外编辑效率检测 |
| 5.2.3 肌肉特异性小鼠Rosa26同源打靶载体的构建 |
| 5.2.4 小鼠胚胎的显微注射 |
| 5.2.5 注射后囊胚的基因分型和检测 |
| 5.2.6 胚胎移植和基因分型检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 sgRNA获得与体外编辑效率检测 |
| 5.3.2 肌肉特异表达同源打靶载体的构建 |
| 5.3.3 小鼠Rosa26基因编辑胚胎的获得 |
| 5.3.4 Rosa26基因编辑小鼠的获得 |
| 5.3.5 肌肉特异表达Cas9蛋白小鼠胚胎的获得 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）恒河猴XC趋化因子受体1（XCR1）基因的克隆和体外表达（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 组织总RNA提取 |
| 1.2.2 反转录PCR和RACE扩增恒河猴XCR1 m RNA |
| 1.2.3 外显子检测 |
| 1.2.4 真核表达质粒的构建及细胞转染 |
| 1.2.5 Western blot法检测转染HEK293T细胞表达XCR1水平 |
| 1.2.6 流式细胞术检测HEK293 T细胞XCR1的表达 |
| 1.2.7 激光扫描共聚焦显微镜技术观察HEK293T细胞XCR1的表达 |
| 2 结果 |
| 2.1 XCR1 c DNA核苷酸序列测定 |
| 2.2 恒河猴XCR1缺失第二外显子 |
| 2.3 恒河猴XCR1与其他动物XCR1的相似性 |
| 2.4 XCR1在HEK293T细胞中的表达 |
| 2.5 XCR1在HEK293T细胞表达后的定位 |
| 3 讨论 |
（9）恒河猴DNGR-1及其在免疫缺陷病毒感染后的变化（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 恒河猴DNGR-1分子的基本特性研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 实验结果 |
| 1. 恒河猴DNGR-1cDNA的核苷酸序列和推测氨基酸序列与人DNGR-1的相似性 |
| 2. 胞质区氨基酸突变对DNGR-1表达的影响 |
| 3. 重组恒河猴DNGR-1 CTLD蛋白及其多克隆抗体的一般特性 |
| 4. 恒河猴DNGR-1结合凋亡细胞的能力 |
| 5. DNGR-1识别焦亡细胞的能力 |
| 6. 体外表达恒河猴DNGR-1的细胞对凋亡/破损细胞的粘附能力 |
| 7. DNGR-1在正常恒河猴体内的分布 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 免疫缺陷病毒感染对DNGR-1表达的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 实验结果 |
| 1. 恒河猴血液中DNGR-1mRNA水平在SIVmac251感染后的变化 |
| 2. 恒河猴血液中DNGR-1mRNA水平在SHIV/SIV感染后随时间的变化 |
| 3. SHIV/SIV感染恒河猴不同组织中DNGR-1mRNA水平与正常动物的差异 |
| 4. HIV感染者血液中DNGR-1mRNA水平的变化 |
| 5. DNGR-1识别细胞的水平在SIV/HIV感染后的变化 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 发表文章 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（10）GnIH对小鼠繁殖的调控及其分子机制和基因免疫技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表（Abbreviation） |
| 第一章 促性腺激素抑制激素及基因免疫研究进展 |
| 1 促性腺抑制激素研究进展 |
| 1.1 GnIH的结构及命名 |
| 1.2 GnIH神经元的分布 |
| 1.3 GnIH受体的特性及分布 |
| 1.3.1 GnIH受体的特性 |
| 1.3.2 GnIH受体的分布 |
| 1.4 GnIH的生理功能 |
| 1.4.1 GnIH对下丘脑的生理作用 |
| 1.4.2 GnIH对垂体的生理作用 |
| 1.4.3 GnIH对性腺的生理作用 |
| 1.5 GnIH的作用机制 |
| 1.6 GnIH对生殖激素以外激素的影响 |
| 1.7 GnIH对季节性繁殖及采食量的调控 |
| 1.7.1 GnIH对季节性繁殖的影响 |
| 1.7.2 GnIH对采食量的调控 |
| 1.8 GnIH的表达调控 |
| 1.8.1 褪黑素对GnIH的调控 |
| 1.8.2 应激对GnIH的调控 |
| 2 提高动物繁殖力的基因免疫研究进展 |
| 2.1 抑制素基因免疫 |
| 2.2 提高抑制素基因免疫效果的方法 |
| 3 研究的目的与意义 |
| 第二章 GnIH对雄鼠生殖与生殖内分泌的分子调控机制研究 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 药品 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要试剂盒 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 实验动物处理 |
| 1.2.2 组织Trizol法提取RNA |
| 1.2.3 第一链cDNA的合成 |
| 1.2.4 基因相对表达量分析 |
| 1.2.5 睾丸组织的石蜡包埋、切片 |
| 1.2.6 睾丸组织的HE染色 |
| 1.2.7 睾丸组织的TUNEL检测 |
| 1.2.8 Western blot检测目的蛋白的表达 |
| 1.2.9 INHB、T、LH激素的ELISA测定 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同浓度的GnIH处理对血浆INHB、T及LH浓度的影响 |
| 2.2 GnIH对下丘脑GnRH-I mRNA、Kiss-1mRNA及NPY mRNA表达的影响 |
| 2.3 GnIH对小鼠腺垂体FSH β mRNA、LH β mRNA及GnRHR mRNA表达的影响 |
| 2.4 GnIH对类固醇生成相关酶基因表达的影响 |
| 2.5 GnIH处理对调控精子生成主要因子表达的影响 |
| 2.6 GnIH能够引起小鼠睾丸曲细精管异常组织学变化，诱导生殖细胞凋亡 |
| 3 讨论 |
| 第三章 GnIH对雌性小鼠颗粒细胞类固醇生成的影响及其调控机制研究 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 药品及实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要的试剂盒 |
| 1.1.4 Western blot所用抗体 |
| 1.1.5 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 小鼠卵巢颗粒细胞分离培养 |
| 1.2.2 小鼠粒细胞上GPR147蛋白的检测 |
| 1.2.3 GnIH处理颗粒细胞 |
| 1.2.4 小鼠颗粒细胞总RNA的提取 |
| 1.2.5 第一链的合成、实时定量分析基因相对表达量及Western blot检测细胞目的蛋白的表达 |
| 1.2.6 PCR检测颗粒细胞上GPR147受体的表达 |
| 1.2.7 流式检测细胞凋亡 |
| 1.2.8 激素测定 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠卵巢颗粒细胞上GPR147的表达检测 |
| 2.2 不同剂量小鼠GnIH处理对类固醇合成酶相关基因及FSHR基因表达的影响 |
| 2.3 Gn IH 处理对 E2，P 分泌量的影响 |
| 2.4 GnIH处理对颗粒细胞凋亡的影响 |
| 2.5 不同剂量的GnIH处理对颗粒细胞中p-ERK1/2 蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 第四章 RFRP-3 和INH α（1-32）共表达基因疫苗的构建、鉴定及其对小鼠繁殖力的影响 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒、菌种与细胞 |
| 1.1.2 酶和试剂 |
| 1.1.3 实验动物 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组质粒的构建 |
| 1.2.3 目的基因片段的胶回收 |
| 1.2.4 小提质粒DNA |
| 1.2.5 重组质粒表达的鉴定 |
| 1.2.6 质粒大提 |
| 1.2.7 免疫小鼠 |
| 1.2.8 疫苗免疫对小鼠产仔数的评估 |
| 1.2.9 ELISA检测抗体 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 质粒的酶切鉴定 |
| 2.2 RT-PCR鉴定目的基因的表达 |
| 2.3 质粒转染HeLa细胞后的蛋白表达 |
| 2.4 疫苗免疫后对小鼠血浆抗INH抗体阳性值（P/N值）的影响 |
| 2.5 免疫后对小鼠抗RFRP-3 抗体阳性值（P/N值）的影响 |
| 2.6 免疫对小鼠产仔数的影响 |
| 3 讨论 |
| 第五章 RFRP-3 和INHα（1-32）共表达基因疫苗对绵羊生殖激素及繁殖力的影响 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒疫苗 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 ELISA相关溶液的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 疫苗完整性的鉴定 |
| 1.2.2 疫苗的大量制备 |
| 1.2.3 免疫母羊 |
| 1.2.4 母羊的同情发情及配种 |
| 1.2.5 间接ELISA检测抗体 |
| 1.2.6 放免法检测繁殖激素水平 |
| 1.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 疫苗的鉴定 |
| 2.2 疫苗免疫对小鼠血清抗INH和抗RFRP-3 抗体阳性值（P/N值）的影响 |
| 2.3 疫苗免疫之后对母羊血清FSH、LH、E2和P水平的影响 |
| 2.4 疫苗免疫母羊后对其双羔率的影响 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 创新与不足 |
| 参考文献 |
| 发表的论文 |
| 致谢 |
四、恒河猴tPA基因的克隆、测序与真核表达（论文参考文献）
- [1]SHIV感染恒河猴体内产生针对HIV-1广谱中和抗体机制的研究[D]. 高楠. 吉林大学, 2021(01)
- [2]裂谷热病毒中和抗体的筛选及保护机制的初步研究[D]. 郝勐. 北京协和医学院, 2020(05)
- [3]猪MMP7和MMP9基因组织表达模式及其与哺乳仔猪腹泻的关联分析[D]. 寇明星. 东北农业大学, 2020(04)
- [4]胞浆接头蛋白Dok5的表达纯化[D]. 庞云丽. 北京协和医学院, 2020(05)
- [5]裂谷热病毒eGn蛋白重组狂犬病病毒及细菌样颗粒免疫原构建与实验免疫研究[D]. 张胜男. 东北林业大学, 2020(01)
- [6]肠道共生菌群改变引起Th细胞的偏向对CA16感染恒河猴的影响[D]. 李洪哲. 北京协和医学院, 2019(02)
- [7]Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究[D]. 李昊. 东北林业大学, 2019(01)
- [8]恒河猴XC趋化因子受体1（XCR1）基因的克隆和体外表达[J]. 余磊,李冬,姚文荣,王凤杰,崔艳芳,杨贵波. 细胞与分子免疫学杂志, 2017(04)
- [9]恒河猴DNGR-1及其在免疫缺陷病毒感染后的变化[D]. 姚文荣. 中国疾病预防控制中心, 2016(11)
- [10]GnIH对小鼠繁殖的调控及其分子机制和基因免疫技术研究[D]. 淡新刚. 华中农业大学, 2015(02)