一、猪繁殖与呼吸综合征的诊疗（论文文献综述）
李志民,徐秀,刘荣[1]（2021）在《猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病毒病混染的诊治》文中研究说明在养猪生产中,猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病混合感染所带来的危害极大,不仅会降低种猪的繁殖性能,也会对仔猪的生长产生抑制,此病具有地方性流行特征,属于持续性感染性疾病,并且此病是其他猪病的诱发原因之一。混合感染发病后,妊娠母猪、育肥猪、仔猪会出现不同的症状表现,且存在一定的致死率。通过临床症状、病理剖检、实验室检测可判定猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病混合感染,需采取有效的方式预防并科学用药治疗,从而控制此病的扩散与蔓延。
乌吉斯古楞,刘亭岐,韩宇,宋前进,刘建奇,关平原,宋庆庆[2]（2021）在《猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5重组蛋白对外周血单个核细胞功能的影响》文中进行了进一步梳理为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5重组蛋白（rGP5）对猪外周血单个核细胞（PBMC）功能的影响,本研究选取PRRSV-PC疫苗株中的ORF5基因片段,对其进行原核表达并纯化,结果显示rGP5以可溶性和包涵体两种形式表达,分子质量约为30 ku;将该纯化蛋白免疫大耳白兔,按常规方法制备抗血清并进行酶联免疫吸附试验（ELISA）,结果显示,纯化后的rGP5可以与PRRSV阳性血清特异性结合;制备的兔抗rGP5多克隆抗体效价高达1.64 000,可用于后续试验。无菌采集PRRSV阴性猪外周血并分离PBMC,加入终浓度为10μg/mL的rGP5体外培养后,采用间接免疫荧光试验（IFA）检测重组蛋白与PBMC的结合,结果显示rGP5与PBMC共培养1 h后,PBMC出现红色荧光,表明r GP5可以结合PBMC。进一步采用不同浓度的rGP5体外刺激猪PBMC,利用ELISA方法检测淋巴细胞中IL-10、IFN-γ、TGF-β1及TNF-α的分泌水平,同时采用CCK-8细胞增殖检测试剂盒测定rGP5对PBMC增殖的影响,以及不同浓度的rGP5刺激PBMC分泌NO的情况,结果显示,不同浓度的rGP5均显着促进PBMC细胞因子IL-10、IFN-γ和TNF-α的分泌（p<0.05）;同时rGP5能够促进PBMC增殖（p<0.05）,也能增加NO分泌（p<0.05）,上述结果表明GP5是PRRSV重要的抗原,发挥着重要的免疫作用。本实验首次研究了rGP5对猪PBMC免疫功能的影响,揭示PRRSV影响宿主免疫反应的具体机制,有助于阐明PRRSV与宿主细胞相互作用的分子基础,为进一步研究其免疫保护性提供了实验依据。
丁耀忠[3]（2021）在《QH-08PRRS分离株Caspase-8介导的凋亡途径及实时定量PCR方法的建立》文中进行了进一步梳理猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）的病原,猪是其唯一宿主。PRRSV属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属,不分节段的一种有囊膜的单股正链RNA病毒,根据抗原特性和基因组特征分为两个基因型:欧洲型（European,Eu）,即1型PRRSV;北美型（North American,NA）,即2型PRRSV。该病毒的基因组长度约为15 kb,具有九个或十个重叠的开放阅读框（ORF）:ORF 1a-1b,ORF 2-7（病毒结构蛋白GP2,E,GP3,GP4,ORF5a,ORF5,M和N）。与马动脉炎病毒（equine arteritis virus,EAV）,乳酸脱氢酶升高病毒（lactate dehydrogenase-elevating virus,LDV）和猴出血热病毒（simian hemorrhagic fever virus）为同一属病毒。我们分离了一株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV）,将其命名为QH-08（Gen Bank:KU201579）。对其进行溯源后发现,其与HUN4和JXA1的进化变异几乎没有差异,全序列同源性分别为97.2%和97%,同时与HP/Thailand19500LL/2010（泰国,KF735060）、PRRSV/MZ/IND/1A/18（印度,MK287894）和BH58/10（老挝,JN626287）的全序列同源性为95.7%、93.8%和95.9%;遗传进化表明,这5株2型PRRSV分离株处在同一个进化分支上,而且QH-08分离株在进化谱系上与HUN4分离株具有更高的亲源性;同时在分子水平上比较34株分离株的同源性后得到了一种假想,即PRRSV-2型ORF1α1b的同源性差异是导致PRRS疫苗对于同源毒株攻毒保护力差异的重要原因,从而为疫苗选择和实时real-time RT-PCR的建立提供分子理论基础。对于天然抗病毒通路,如TLR 3凋亡途径,能否被有关刺激因子激活从而抑制PRRSV的感染能力;另外,选择一种可以防控QH-08 PRRSV的感染的疫苗对于将来促进PRRSV的防控可以提供一种参考依据;同时,由于PRRSV-2存在大量重组现象,建立能够覆盖经典毒株和变异毒株的、特异性检测PRRSV-2型的实时定量PCR技术,对于PRRSV-2型的防控具有积极意义。因此,在基于对不同的PRRSV-2型分子分析的基础上,进行了一些系列的研究。首先,通过病毒噬斑、qPCR和IFA等检测方法评估了刺激因子—盐酸吗啉胍对QH-08在Marc-145细胞上的复制有一定的抑制作用,其抑制机理是盐酸吗啉胍诱导在细胞水平上诱导TLR 3依赖的凋亡途径,进一步激活了caspas-8和caspas-3凋亡途径进而抑制了PRRSV复制,而且,这种抑制作用与caspase-3激活后Mcl-1表达量下调有关。这种通过激活caspase-8和caspase-3天然抗病毒信号通路或负调控Mcl-1表达来发挥其抗PRRSV的复制的机制,能够为天然抗病毒途径的研发提供启发作用。其次,选用了四种疫苗,分别为Ingelvac PRRS MLV、CH-1a、JXA1和JXA1-RMLV疫苗,其疫苗毒株的特性为ORF1α1b序列同源性为25.3-96.3%,而ORF2-ORF7同源性为85.8-99.6%。其中,第1组和第4组（n=5）的仔猪分别使用上述四种疫苗按照一一对应的方式分别进行免疫,第5组和第6组（n=3）仅仅注射PBS作为阳性和阴性对照。免疫28 d后,除阴性对照组外,第1组-第5组分别使用等量QH-08 PRRSV进行攻毒;与攻毒后14 d,将所有仔猪处死后进行尸检。研究表明,与第5组猪（阳性对照）相比,接种疫苗的猪的体温、肺损伤程度、血清和肺组织中的病毒含量水平显着降低（p<0.05）;在攻毒期内,JXA1和JXA1-R MLV疫苗对QH-08 PRRSV攻击提供了100%的保护,保护率显着的高于Ingelvac PRRS MLV和CH-1a疫苗的保护率。最后,基于QH-08分离株与其余毒株序列特性建立了一种检测2型PRRSV的实时定量PCR技术,研究表明,其检测最低核酸检测限为10拷贝/μL,敏感性是多重RT-PCR的10倍;特异性良好,不与1型PRRSV、PCV2、PRV和CSF发生交叉反应性。对临床样品的阳性检出率和阴性检出率均为100%;研制的3批试剂盒在一定保存期内,其重复性、特异性和敏感性良好,可以满足2型PRRSV的临床检测和防控的需求。
傅欣玲[4]（2021）在《伪狂犬病病毒gB蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA方法的建立》文中认为猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）的病原为伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）,是一种急性传染病,能引起新生仔猪的突发死亡与成年猪的繁殖障碍。2011年以来,伪狂犬病病毒变异株在我国开始流行,传统疫苗如Bartha-K61等不能为免疫猪提供完全的保护。伪狂犬病病毒变异株的出现给我国养猪业疫病净化及防控带来的巨大的挑战。囊膜糖蛋白gB在疱疹病毒中序列保守,促进病毒囊膜与细胞膜的融合以利于病毒的感染入侵和传播。gB是PRV主要的免疫原性蛋白,且对变异毒株毒力的改变具有很大影响。因此,gB也作为PRV基因工程疫苗和临床抗体检测的靶蛋白被广泛研究和应用。为了建立检测PRV-gB蛋白抗体的检测方法,本研究使用各种不同形式的抗原免疫小鼠,比较了不同抗原诱导抗体的效果,制备了伪狂犬病病毒gB蛋白单克隆抗体,并证实该单克隆抗体具有一定特异性,可用于竞争ELISA方法的建立,为后续研究奠定了良好的基础。本研究分别采用昆虫细胞-杆状病毒表达系统和原核表达系统表达了gB蛋白,并构建了携带gB基因的重组质粒DNA,用gB蛋白和质粒DNA分别免疫小鼠。用蛋白质印迹法（Western-blotting）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和间接免疫荧光（IFA）等方法评价了不同抗原诱导的抗体水平。其中,质粒DNA免疫诱导的抗体能与病毒发生良好反应,IFA检测抗体效价较高。随后,选择质粒DNA作为免疫原免疫小鼠,并筛选到了一株单克隆抗体2E10。IFA和Western blotting实验证实2E10与PRV具有良好的反应性和特异性。用2E10初步建立了检测gB抗体的竞争ELISA方法。在建立该方法优化各种反应条件时发现:包被缓冲液最佳浓度为0.01M;每孔最佳包被蛋白量为200ng;最佳封闭条件为37℃、2h;血清最佳稀释倍数设定为4倍;一抗最佳稀释倍数设定为104倍;二抗最佳稀释倍数为5000倍;最佳孵育时间都为1h;TMB最佳显色条件为避光、37℃、0.5h。判定标准为:抑制率大于等于24.2%判定为阳性;抑制率小于等于22.8%判定为阴性;两者之间判定为可疑。特异性试验结果显示只有PRV阳性血清具有较高抑制率,猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）阳性血清、猪圆环病毒2型（PCV-2）阳性血清抑制率很低,证实了该方法具有一定的特异性。敏感性试验结果为1:128,证实了该方法较好的敏感性。该法的符合率试验结果显示,阴性符合率为100%,阳性符合率为91%,总符合率为94.6%,具有一定使用价值。总之,本研究选择了质粒DNA作为免疫原,制备单克隆抗体。单克隆抗体2E10与PRV具有良好反应性,可用于建立竞争性ELISA方法。这些都为PRV抗体的制备和抗体检测方法的建立提供了有价值的信息和材料。
冯会利,王海棚,王汝都,程征[5]（2021）在《猪繁殖与呼吸障碍综合征诊疗技术探析》文中研究说明猪繁殖与呼吸障碍综合征是一种传染性非常高的病毒性传染病,一旦发病,极易造成大面积传播,造成猪只大量死亡,严重影响猪场经济效益。因此,就猪繁殖与呼吸障碍综合征的病原特点、流行病学、临床症状进行详细分析,并对其诊断与防控进行了相关阐述,以求降低猪繁殖与呼吸障碍综合征的发病率,为该病的防控提供一定的参考。
叶超[6]（2021）在《陕西省2017-2019年猪常见四种病毒性传染病病原学及血清学监测与分析》文中研究指明猪瘟（Classical swine fever,CSF）、猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）、猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）、猪圆环病毒病（Porcine circovirus disease,PCVD）是当前威胁养猪业的主要病毒性传染病,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。随着“一带一路”政策的执行和一系列环保机制的运行,我国养殖产业正逐渐向西部地区转移。作为西部地区重要省份的陕西省,无论是在国家政策扶持还是地理位置等方面,对发展养猪业都具有很多有利条件,但养殖技术相对落后、生猪跨区域调运频繁、中小养猪企业和农户养殖者相对薄弱的生物安全意识,导致其疫病防控能力不足,增加了地区生猪养殖疫病传播的风险。监测猪群疫苗免疫抗体水平及病原流行趋势是疫病防控的前提和基础,对有效防范重大疫情以及推动本地区畜牧业高质量发展具有重大指导意义。因此,为了调查CSF、PRRS、PR、PCVD在陕西省的流行状况及疫苗免疫效果,本研究对2017～2019年该省10个县市的不同规模猪场进行取样,共采集到752份血清样品和143份组织病料样品,采用酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）和聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）技术对其疫苗免疫抗体和病原进行了监测与分析,以期为上述四种疫病制定切实有效的防控策略提供指导。研究结果如下。1.2017年陕西省CSF、PR疫苗抗体阳性率分别为65.3%、64.5%,未达国家免疫抗体合格率70%的要求,病原核酸阳性率分别为18.5%、16.7%。通过及时为养殖场改善免疫程序,提高猪群疫苗免疫覆盖率等措施,有效提高了疫苗抗体阳性率,降低了病原核酸阳性率。2018年陕西省以上两种疫病疫苗抗体阳性率分别升高至84.2%、80.5%,同时核酸阳性率均下降至7.5%,到2019年,抗体阳性率显着提高到94.3%、94.8%,核酸阳性率全下降至0%,陕西省CSF、PR两种疫病防控效果显着。2.2017-2019年陕西省PRRS疫苗抗体阳性率分别为88.7%、68.2%、58.5%,逐年呈下降趋势,2017年病原核酸阳性率为7.4%,2018～2019年（28.3%、19.4%）较2017年呈现上升趋势。由于PRRS疫苗覆盖率不高,导致疫苗抗体逐年下降,病原核酸阳性率上升,说明PRRS疫苗对疫病的防控起着至关重要的作用。3.通过提高疫苗覆盖率等措施,2018～2019年PCVD疫苗抗体阳性率（93.2%、95.2%）较2017年（78.6%）显着上升,病原核酸阳性率（18.9%、27.9%）较2017年（38.9%）有所下降,表明该病的防控效果不太理想,需要制定更加科学的综合防控方案。上述研究结果表明,2017～2019年,陕西省CSF、PR疫苗抗体阳性率逐年上升,病原阳性率逐年下降,说明在该地区这两种疫病流行呈下降趋势;但PRRS、PCVD病原阳性率逐年上升,说明PRRS、PCVD在该地区流行呈上升趋势。因此,PRRS、PCVD在陕西省具有地方流行性风险,需要进一步制定更加科学合理的疫苗免疫策略及综合防控方案。
乌吉斯古楞,刘亭岐,巨敏莹,张斌,韩宇,刘建奇,宋庆庆,关平原[7]（2020）在《猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的原核表达及多克隆抗体制备》文中提出为体外表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）糖基化囊膜蛋白GP5,以及制备其多克隆抗体,以PRRSV PC疫苗株RNA为模板,应用RT-PCR扩增GP5基因,并克隆至原核表达载体pET-32a（+）,构建重组表达载体pET-32a-GP5。经过酶切和测序鉴定后,将阳性重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,加入IPTG低温诱导表达。使用亲和层析法纯化PRRSV GP5蛋白。然后将纯化的蛋白免疫北京大耳白兔制备多克隆抗体,并进行酶联免疫吸附试验（ELISA）和间接免疫荧光分析（IFA）。结果显示,表达的PRRSV GP5原核蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在,相对分子质量大约30 kDa;制备的GP5蛋白多克隆抗体ELISA效价可达1:64 000;IFA检测显示,制备的多克隆抗体能够识别PRRSV。重组PRRSV GP5蛋白及其多克隆抗体的成功制备为PRRSV血清学检测方法的建立提供了良好的生物学材料。
刘雨琦[8]（2020）在《猪圆环病毒2型和3型双重微滴式数字PCR检测方法的建立》文中进行了进一步梳理猪圆环病毒2型是世界上公认的对养猪业造成严重危害的致病菌之一,可与多种其他病原体混合感染,引起仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎与肾病综合征和增生和坏死性肺炎等多种疾病,对各国养猪业造成巨大的影响。猪圆环病毒3型是一种2016年在美国发现的新型病毒,之后在世界各养猪国均有PCV3感染的报道,对未来养猪业会造成不容小觑的影响。猪圆环病毒2型和3型同属于猪圆环病毒,引起的疾病临床表现类似,在我国7个省市均有混合感染的报道,在湖南、湖北和江苏等地,二者混合感染率可达42.9%。目前已建立PCV2和PC V3的免疫学诊断方法和分子生物学诊断方法,其中包括常见的酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）、聚合酶链式反应（Polym erase Chain Reaction,PCR）和实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PC R,q PCR）等检测方法。这些检测方法大多存在耗时长、灵敏度低、易污染等缺点。本实验旨在利用微滴式数字PCR技术（Droplet Digital PCR,dd PCR）建立一种快速、高效、可同时对PCV2和PCV3定量的检测的方法,可对猪的病料组织或者血清等低浓度样本进行特异性定量检测。具体研究内容如下。1.单重PCV2微滴式数字PCR检测方法的建立,单重PCV3微滴式数字PCR检测方法的建立。选择PCV2和PCV3中目的基因的保守序列片段（Gen Bank No.KC823059.1和KY778776）与载体p UC59合成质粒,并利用Primer Premier 5软件设计引物。通过引物筛选、优化退火温度和引物探针浓度比建立PCV2和PCV3微滴式数字PCR检测方法,通过特异性实验探究建立的反应体系的特异性,并比较了所建立的PCV2和PCV3微滴式数字PCR检测方法与PCV2和PCV3实时荧光定量PCR检测方法的灵敏度和重复性。实验结果表明,当引物探针浓度比为400 n Mv:200 n M和退火温度为56℃时,阳性液滴集中,扩增效果最好,对其他核酸样本无特异性扩增,灵敏度均能达到0.1 fg/μL,dd PCR最低可检出1.1 copies/μL的p UC59-PCV2和1.03 copies/μL的p UC59-PCV3。其中PCV2的q PCR和dd PCR标准曲线相关系数（R2）分别为0.9941和0.9762,dd PCR的扩增效率为83.41%;PCV3的q PCR和dd PCR标准曲线相关系数（R2）分别为0.965和0.9575,dd PCR的扩增效率为80.75%。PCV2微滴式数字PCR检测方法与PCV2实时荧光定量PCR检测方法的组内组间实验CV（%）值均小于5,PCV3微滴式数字PCR检测方法与PCV3实时荧光定量PCR检测方法的组内组间CV（%）值均小于6.06,说明本实验所建立的四种检测方法其可重复性好,稳定性强。2.双重PCV2和PCV3微滴式数字PCR检测方法的建立。让每个微反应体系都含有两套引物探针,分别用含有FAM和VIC两种不同的报告基团探针进行检测,实现PCV2和PCV3能同时高效的准确定量,提高检测效率,降低检测成本。本实验建立的双重PCV2和PCV3微滴式数字PCR检测方法和的双重PCV2和PCV3实时荧光定量PCR检测方法灵敏度均能达到0.1 fg/μL,其中双重dd PCR检测检出0.1 fg/μL的p UC59-PCV2和p UC59-PCV3的拷贝数为1.1 copies/μL和1.32 copies/μL,双重q PCR检测PCV2和PCV3标准曲线相关系数（R2）分别为0.9907和0.9682,双重dd PCR检测PCV2和PCV3标准曲线相关系数（R2）分别为0.9651和0.9638,扩增效率分别为83.9%和78.8%。方差分析结果表明四个F值均小于其F crit值,则F值在a=0.05的水平上不显着差异。说明本实验建立的双重微滴式数字PCR和双重实时荧光定量PCR与单重检测之间结果无显着差异,且均呈现良好的线性关系。3.实际样本检测和试剂盒研发。利用已建立的q PCR和dd PCR两种检测方法对95份疑似感染PCV2的病猪样本进行检测,其中q PCR的阳性检出率为60%（57/95）,dd PCR的检出率为62.10%（59/95）,两种方法检测结果的kappa系数为0.9766,说明两种方法具有很好的一致性。其中dd PCR对q PCR检测出的疑似结果,能够通过具体拷贝数做出阳性或阴性的判断,在低浓度的检测样本中发挥出独特优势。本章实验也研发了两种双重检测试剂盒,其中试剂盒具有良好的特异性和灵敏度,能满足各种环境和条件下的检测要求,且节约了成本,缩短了检测时间,在一次反应过程种能对PCV2和PCV3同时检出,将会有广阔的市场前景。
常艳燕[9]（2020）在《猪源唾液酸黏附素介导PRRS病毒感染Marc145细胞的适应性研究》文中研究指明猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS,俗称蓝耳病）是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）引起的一种严重危害养猪业的免疫抑制性疾病。疫苗接种是预防本病的重要手段之一。但是,由于PRRSV具有严格的细胞嗜性,原代易感细胞如猪肺泡巨噬细胞（PAM）等难以满足大规模生产的需求,而继代细胞如非洲绿猴肾上皮细胞（Marc145）等因缺乏唾液酸黏附素（Sn）受体限制了某些PRRSV田间流行株的体外增殖,这十分不利于现有PRRS疫苗免疫效果的持续性评价及其疫苗种子库的建立,阻碍了PRRS疫情的防控实践。故此,迫切需要构建PRRSV易感的重组细胞系来解决这一瓶颈性问题。【目的】本论文拟借助CRISPR/Cas9技术对Marc145细胞的基因组进行修饰和改造,构建稳定表达猪源Sn（p Sn）的Marc145细胞株（p Sn-Marc145）,以期提高PRRSV的细胞吸附能力及其适应性和感染性,为PRRSV的基础与应用研究提供可靠的细胞平台支撑。【方法】本论文选择Marc145细胞第11号染色体RACGAP1和ASIC1基因之间的内含子序列作为打靶区域。首先,利用生物学软件设计单向导RNA（sg RNA）并构建Cas9打靶质粒,通过软件分析和Surveyor检测试剂盒筛选脱靶效率较低的sg RNA;并利用编码增强型绿色荧光蛋白（e GFP）的供体质粒进行同源重组修复,借助荧光显微镜观察、Junction PCR、Southern Blotting等方法来确定外源基因是否可以特异性重组至靶向区域并有效表达。随后,根据所选sg RNA,构建并比较不同Cas9突变体打靶质粒的切割效率;选择脱靶效率低、切割效率和同源重组较高的Cas9打靶质粒用于p Sn-Marc145细胞的构建:在CRISPR/Cas9系统的介导下,将p Sn基因序列经供体质粒整合至Marc145细胞基因组中。嘌呤霉素加压条件下,挑取单克隆细胞并扩大培养;对经Junction PCR、Southern Blotting、Western Blotting、间接免疫荧光试验鉴定为阳性的克隆进行核型分析、细胞形态观察以及生长周期活性评估。最终,在正常的Marc145和p Sn-Marc145细胞上,比对研究制苗用PRRSV（VR2332、CH1R、R98、JXA1）和野生型PRRSV（GSWW2018和GSKL）的生物学特性。【结果】本论文共设计合成了5种sg RNA（sg RNA-3、-17、-23、-24、-33）,其中sg RNA-24的脱靶效率最低;该打靶质粒能够将供体质粒携载的e GFP定点整合于RACGAP1和ASIC1基因之间的内含子中并检测到特异性绿色荧光。3种Cas9突变体（p Sp Cas9、Cas9n、e Cas9）中,Cas9n（含双sg RNA）打靶质粒的切割效率最高;将Cas9n（含双sg RNA）打靶质粒和p Sn供体质粒转染正常的Marc145细胞后,获得了2株靶向单一整合的p Sn-Marc145重组细胞（24-15-7、24-15-9）,单细胞阳性克隆在保持正常Marc145细胞遗传特征和细胞形态的同时,表现出更优的生长活性。通过蚀斑形成试验、间接免疫荧光试验、病毒生长曲线的绘制、Western Blotting和实时荧光定量PCR检测发现,尽管p Sn的表达对PRRSV疫苗生产用毒种在Marc145细胞中的毒力和复制能力影响不大,但显着提高高致病性PRRSV（HR-PRRSV,JXA1）的吸附能力;通过传代培养、遗传变异分析、实时荧光定量PCR、蚀斑形成试验和病毒生长曲线的绘制发现,2株野生型PRRSV在p Sn-Marc145细胞上具有明显强于其在正常Marc145细胞上的适应性和感染性。【结论】综上所述,本论文研究结果表明:一、Marc145细胞基因组中第11号染色体RACGAP1和ASIC1基因之间的内含子区域可作为外源基因定点打靶的有效位点。二、利用CRISPR/Cas9系统构建的p Sn-Marc145细胞株在HP-PRRSV疫苗生产和野生型PRRSV分离过程中具有良好的应用潜力。
杨宝云[10]（2019）在《一起猪繁殖与呼吸综合征与伪狂犬病混合感染的诊治报告》文中指出连城县陈某养猪场内一栋保育猪发病,主要表现为精神萎靡、食欲不振、被毛粗乱、站立不稳、呼吸急促,个别猪呈腹式呼吸现象。对患猪进行解剖及实验室PCR检测,确诊为猪繁殖与呼吸综合征与伪狂犬病混合感染。对患猪采取隔离分群饲养、疫苗紧急免疫、饮水和饲料中添加药物及加强饲养管理等综合防控措施,最终实现对该疫情的有效控制。
二、猪繁殖与呼吸综合征的诊疗（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪繁殖与呼吸综合征的诊疗（论文提纲范文）
（1）猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病毒病混染的诊治（论文提纲范文）
| 1 发病原因 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征 |
| 1.2 猪圆环病毒病 |
| 2 混合感染的临床症状 |
| 2.1 母猪 |
| 2.2 哺乳仔猪 |
| 2.3 育肥猪 |
| 3 部检与诊断 |
| 3.1 病理剖检 |
| 3.2 实验室诊断 |
| 4 混合感染的防控措施 |
| 4.1 混合感染防范措施 |
| 4.1.1 加强免疫接种 |
| 4.1.2 强化饲养管理 |
| 4.1.3 做好药物预防 |
| 4.2 混合感染治疗措施 |
| 5 结语 |
（2）猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5重组蛋白对外周血单个核细胞功能的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要实验材料 |
| 1.2 重组蛋白的诱导表达、纯化及鉴定 |
| 1.3 抗血清的制备 |
| 1.4 IFA鉴定r GP5与PBMC的结合试验 |
| 1.5 r GP5对猪PBMC细胞因子表达的影响 |
| 1.6 r GP5对猪PBMC增殖效应的检测 |
| 1.7 r GP5对PBMC分泌NO的影响 |
| 2 结果 |
| 2.1 r GP5的诱导表达、纯化及鉴定 |
| 2.2 抗血清的制备 |
| 2.3 IFA鉴定r GP5与PBMC的结合试验 |
| 2.4 r GP5对猪PBMC细胞因子表达影响的结果 |
| 2.5 r GP5对猪PBMC增殖效应的检测结果 |
| 2.6 r GP5对PBMC分泌NO的影响的检测结果 |
| 3 讨论 |
（3）QH-08PRRS分离株Caspase-8介导的凋亡途径及实时定量PCR方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| summary |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 PRRS病原特征及防控技术研究 |
| 1 PRRSV非结构蛋白及结构蛋白的基本功能 |
| 1.1 PRRSV非结构蛋白的基本功能 |
| 1.1.1 PRRSV 的 5' UTR 和 3' UTR 的分子特性 |
| 1.1.2 PRRSV ORF1a 和 ORF1b 的特征 |
| 1.2 PRRSV结构蛋白的基本特征 |
| 2 PRRSV致病过程中的天然免疫通路 |
| 2.1 细胞凋亡 |
| 2.2 NF-κB通路 |
| 2.3 干扰素反应 |
| 2.4 Toll样受体信号通路 |
| 3 PRRSV在中国的流行趋势 |
| 3.1 PRRSV-1 型在中国的流行趋势 |
| 3.2 PRRSV-2 型在国内的流行趋势 |
| 4 PRRSV的防控 |
| 4.1 PRRS的检测技术 |
| 4.1.1 PRRS病毒分离 |
| 4.1.2 PRRSV血清学检测方法 |
| 4.1.2.1 间接荧光抗体试验 |
| 4.1.2.2 免疫过氧化物酶单层试验 |
| 4.1.2.3 酶联免疫吸附测定 |
| 4.1.3 PRRSV核酸检测方法 |
| 4.2 PRRS 的疫苗 |
| 4.2.1 现有疫苗 |
| 4.2.2 新型疫苗研发 |
| 4.2.2.1 DNA疫苗 |
| 4.2.2.2 植物疫苗 |
| 4.2.2.3 病毒样颗粒的疫苗 |
| 4.3 疫苗佐剂 |
| 5 抗病毒因子 |
| 5.1 二氧化氯抑制PRRSV的复制 |
| 5.2 化学抗病毒因子对 PRRSV 的抑制作用 |
| 5.3 蛋白质因子对 PRRSV 的抑制作用 |
| 6 本课题研究目标和任务 |
| 第二章 QH-08 PRRSV分离株全序列特征 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 样品 |
| 1.3 序列比对及分析 |
| 1.4 ORF2-ORF7 序列的变异分析 |
| 1.5 ORF2-ORF7 序列二级结构 |
| 2 结果 |
| 2.1 QH-08 的基因组基本特征 |
| 2.2 34株PRRSV-2型的ORF2-7序列的进化变异 |
| 2.2.1 ORF 2 进化和变异 |
| 2.2.2 ORF3 分子进化和变异 |
| 2.2.3 ORF4 分子进化和变异 |
| 2.2.4 ORF5 分子进化和变异 |
| 2.2.5 ORF6 分子进化和变异 |
| 2.2.6 ORF7 分子进化和变异 |
| 2.3 ORF1α1b分子进化和变异 |
| 2.4 二级结构分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 盐酸吗啉胍激活caspase-8 凋亡途径抑制QH-08PRRSV的复制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞、病毒和试剂 |
| 1.2 Quantitative real-time RT-PCR(q PCR)检测 |
| 1.3 病毒感染试验 |
| 1.4 Annexin V和 PI双重染色检测细胞死亡 |
| 1.5 siRNA实验 |
| 1.6 Westernblot检测 |
| 1.7 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 盐酸吗啉胍对 PRRSV 复制和细胞死亡的抑制作用 |
| 2.2 盐酸吗啉胍诱导TLR3 凋亡信号通路 |
| 2.3 盐酸吗啉胍激活 caspase-8 和 caspase-3 途径 |
| 2.4 Mcl-1 蛋白是抑制 PRRSV 复制的主要因子 |
| 3 讨论 |
| 第四章 不同PRRSV疫苗对QH-08 毒株的保护性研究 |
| 1 病毒和疫苗 |
| 2 方法 |
| 2.1 动物实验 |
| 2.2 临床检查 |
| 2.3 血清学检测 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 临床观察 |
| 3.2 病毒 RNA 的检测 |
| 3.3 检测 PRRSV 的抗体 |
| 4 讨论 |
| 第五章 基于QH-08 分离株的一步法real-time RT-PCR检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株与质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 试剂盒 |
| 1.4 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 real-time RT-PCR方法 |
| 2.1.1 引物 |
| 2.1.2 反应体系 |
| 2.2 多重RT-PCR检测方法 |
| 2.2.1 多重RT-PCR检测方法反应所用引物 |
| 2.2.2 RT-PCR反应体系和反应流程 |
| 2.3 检测结果判定 |
| 2.4 敏感性试验 |
| 2.5 特异性试验 |
| 2.6 临床样品 |
| 2.7 保存期试验 |
| 2.7.1 试剂盒性状检测 |
| 2.7.2 重复性试验 |
| 2.7.3 敏感性试验 |
| 2.7.4 特异性性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 方法建立及标准曲线 |
| 3.2 敏感性试验 |
| 3.3 特异性试验 |
| 3.4 临床样品检测 |
| 3.5 保存期试验 |
| 3.5.1 重复性试验 |
| 3.5.2 试剂盒性状试验 |
| 3.5.3 敏感性试验 |
| 3.5.4 保存期特异性检测 |
| 4 讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 导师简介 |
（4）伪狂犬病病毒gB蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 伪狂犬病概述 |
| 1.2 形态与结构 |
| 1.3 基因组与基因型 |
| 1.4 蛋白及其功能 |
| 1.5 理化特性 |
| 1.6 病毒入侵与体内免疫 |
| 1.7 2011年后猪伪狂犬病的流行概况 |
| 1.8 毒株的序列比较 |
| 1.9 gB蛋白及其抗体检测方法 |
| 第二章 gB抗原的不同表达形式与多抗制备 |
| 第一节 昆虫细胞杆状病毒系统表达gB蛋白与多抗制备 |
| 2.1.1 材料与方法 |
| 2.1.2 结果 |
| 2.1.3 讨论 |
| 第二节 gB蛋白的原核表达与多抗制备 |
| 2.2.1 材料与方法 |
| 2.2.2 结果 |
| 2.2.3 讨论 |
| 第三节 gB基因的质粒免疫与多抗制备 |
| 2.3.1 材料与方法 |
| 2.3.2 结果 |
| 2.3.3 讨论 |
| 第三章 gB蛋白的单抗制备与竞争ELISA的初步建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试剂与溶液 |
| 3.1.2 免疫程序 |
| 3.1.3 单克隆抗体的制备 |
| 3.1.4 腹水的制备与鉴定 |
| 3.1.5 竞争ELISA检测方法的建立与优化 |
| 3.1.6 竞争ELISA检测方法临界值的测定 |
| 3.1.7 敏感性试验 |
| 3.1.8 特异性试验 |
| 3.1.9 符合率试验 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）猪繁殖与呼吸障碍综合征诊疗技术探析（论文提纲范文）
| 一、猪繁殖与呼吸障碍综合征的病原特点及流行病学 |
| 二、猪繁殖与呼吸障碍综合征的临床症状 |
| （一）育肥猪的临床症状 |
| （二）公猪的临床症状 |
| （三）母猪的临床症状 |
| （四）仔猪的临床症状 |
| 三、猪繁殖与呼吸障碍综合征诊断技术 |
| （一）抗原检测诊疗技术 |
| （二）病毒分离诊疗技术 |
| （三）酶联免疫吸附实验诊疗技术 |
| 四、猪繁殖与呼吸障碍综合征的防治对策 |
| （一）严控饲养人员出入，严格全面消毒 |
| （二）做好疫苗接种工作 |
| （三）提倡自繁自养，严格检疫 |
| （四）及时扩建养猪场地，健全养殖环境 |
（6）陕西省2017-2019年猪常见四种病毒性传染病病原学及血清学监测与分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪瘟的研究进展 |
| 1.1.1 猪瘟病毒概述 |
| 1.1.2 流行病学特征 |
| 1.1.3 临床症状与病理变化 |
| 1.1.4 CSFV的诊断方法 |
| 1.1.5 CSF的防控 |
| 1.2 猪繁殖与呼吸综合征的研究进展 |
| 1.2.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒概述 |
| 1.2.2 流行病学特征 |
| 1.2.3 临床症状与病理变化 |
| 1.2.4 猪繁殖与呼吸综合征的诊断方法 |
| 1.2.5 PRRS的防控 |
| 1.3 猪PR的研究进展 |
| 1.3.1 猪PRV概述 |
| 1.3.2 流行病学特征 |
| 1.3.3 临床症状与病理变化 |
| 1.3.4 PR的诊断方法 |
| 1.3.5 PR的防控 |
| 1.4 猪圆环病的研究进展 |
| 1.4.1 猪圆环病毒概述 |
| 1.4.2 流行病学特征 |
| 1.4.3 临床症状与病理变化 |
| 1.4.4 PCVD的诊断方法 |
| 1.4.5 PCVD的防控 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 第二章 2017-2019 年陕西省CSFV、PRRSV、PRV和 PCV抗体监测及分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 血清样品来源与分布 |
| 2.2.2 样品处理 |
| 2.2.3 ELISA抗体检测方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 2017~2019 年陕西省猪群CSFV抗体ELISA监测结果 |
| 2.3.2 2017~2019 年陕西省猪群PRRSV抗体ELISA监测结果 |
| 2.3.3 2017~2019 年陕西省猪群PRV g B抗体ELISA监测结果 |
| 2.3.4 2017~2019 年陕西省猪群PCV2 抗体ELISA监测结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 2017-2019 年陕西省CSFV、PRRSV、PRV和 PCV PCR检测及分析 |
| 3.1 实验材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 样品采集与处理 |
| 3.2.2 主要试剂配制 |
| 3.2.3 病原PCR检测方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 2017~2019 年陕西省猪群CSFV PCR监测结果 |
| 3.3.2 2017~2019 年陕西省猪群PRRSV RT-PCR监测结果 |
| 3.3.3 2017~2019 年陕西省猪群RPV g E PCR监测结果 |
| 3.3.4 2017~2019 年陕西省猪群PCV2 PCR监测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 2017~2019 年陕西省猪群CSF监测结果分析 |
| 3.4.2 2017~2019 年陕西省猪群PRRS监测结果分析 |
| 3.4.3 2017~2019 年陕西省猪群PR监测结果分析 |
| 3.4.4 2017~2019 年陕西省猪群PCVD监测结果分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的原核表达及多克隆抗体制备（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 毒株与细胞 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 实验动物 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 PRRSV GP5蛋白生物信息学分析 |
| 1.2.2 目的基因扩增及表达载体构建 |
| 1.2.3 GP5蛋白的诱导表达 |
| 1.2.4 GP5蛋白纯化及免疫印迹检测（Western Blot) |
| 1.2.5 GP5蛋白兔源多克隆血清制备 |
| 1.2.6 GP5蛋白多抗血清ELISA效价测定 |
| 1.2.7 Western Blot检测GP5多克隆血清反应性 |
| 1.2.8 间接免疫荧光法（IFA）检测GP5多抗血清免疫反应性 |
| 2 结果 |
| 2.1 目的片段扩增及原核质粒构建 |
| 2.2 GP5蛋白纯化 |
| 2.3 GP5蛋白Western Blot检测 |
| 2.4 GP5蛋白多抗血清Western Blot检测 |
| 2.5 GP5蛋白多克隆抗体ELISA效价测定 |
| 2.6 GP5蛋白多克隆抗体IFA检测 |
| 3 讨论 |
（8）猪圆环病毒2型和3型双重微滴式数字PCR检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 PCV的病原学特征 |
| 1.1.1 形态及理化性质 |
| 1.1.2 PCV基因结构特征 |
| 1.2 PCV的复制方式 |
| 1.3 PCV的分类 |
| 1.3.1 PCV1的基因结构 |
| 1.3.2 PCV2的基因结构与分型 |
| 1.3.3 PCV3的基因结构 |
| 1.4 PCV2和PCV3引起的相关综合征和疾病 |
| 1.4.1 PCV2引起的相关综合征和疾病 |
| 1.4.2 PCV3引起的相关综合征和疾病 |
| 1.5 PCV2和PCV3与其他病原体引起的混合感染 |
| 1.5.1 PCV2与其他病原体引起的混合感染 |
| 1.5.2 PCV3与其他病原体引起的混合感染 |
| 1.5.3 PCV2与PCV3的混合感染 |
| 1.6 研究进展 |
| 1.6.1 免疫学诊断方法 |
| 1.6.2 分子生物学诊断方法 |
| 1.6.3 PCV2和PCV3的双重检测 |
| 1.7 微滴式数字PCR |
| 1.7.1 数字PCR的简介 |
| 1.7.2 数字PCR的分类 |
| 1.7.3 ddPCR的优点 |
| 1.7.4 ddPCR的应用 |
| 1.8 论文研究内容、目的和意义 |
| 1.8.1 研究内容和方法 |
| 1.8.2 研究目的和意义 |
| 第二章 猪圆环病毒2型微滴式数字PCR定量检测方法的建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验样品 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细菌的培养 |
| 2.2.2 核酸的提取与反转录 |
| 2.2.3 标准品的制备 |
| 2.2.4 标准品的制备 |
| 2.2.5 PCV2的qPCR和ddPCR反应体系的建立和优化 |
| 2.2.6 qPCR和ddPCR检测PCV2的特异性实验 |
| 2.2.7 qPCR和ddPCR检测PCV2的灵敏度实验及标准曲线绘制 |
| 2.2.8 qPCR和ddPCR检测PCV2的最低检测限实验和重复性实验 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 引物的筛选和体系的优化 |
| 2.3.2 qPCR和ddPCR检测PCV2的特异性实验 |
| 2.3.3 qPCR和ddPCR检测PCV2的灵敏度实验及标准曲线绘制 |
| 2.3.4 qPCR和ddPCR检测PCV2的最低检测限实验和重复性实验 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第三章 微滴式数字PCR检测猪圆环病毒3型方法的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验仪器 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验样品 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 引物的筛选和体系的优化 |
| 3.3.2 qPCR和ddPCR检测PCV3的特异性实验 |
| 3.3.3 qPCR和ddPCR检测PCV3的灵敏度实验及标准曲线绘制 |
| 3.3.4 qPCR和ddPCR检测PCV3的最低检测限实验和重复性实验 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 双重微滴式数字PCR检测猪圆环病毒2型和3型方法的建立 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验仪器 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验样品 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 标准品的制备 |
| 4.2.2 引物与探针的设计合成 |
| 4.2.3 双重qPCR检测PCV2和PCV3反应体系的建立 |
| 4.2.4 双重dd PCR检测PCV2和PCV3反应体系的建立 |
| 4.2.5 双重qPCR检测PCV2和PCV3的灵敏度实验及标准曲线绘制 |
| 4.2.6 双重dd PCR检测PCV2和PCV3的灵敏度实验及标准曲线绘制 |
| 4.2.7 方差分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 双重qPCR和双重dd PCR检测PCV2和PCV3反应体系的建立 |
| 4.3.2 双重qPCR和双重dd PCR检测PCV2和PCV3灵敏度实验 |
| 4.3.3 方差分析 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 实际样本检测和实际应用 |
| 5.1 实际样本检测 |
| 5.1.1 实验样本 |
| 5.1.2 提取方法 |
| 5.1.3 实际样本检测结果 |
| 5.2 猪圆环病毒2型和3型双重微滴式数字PCR检测试剂盒的研发 |
| 5.2.1 简介 |
| 5.2.2 试剂盒组成 |
| 5.2.3 具体操作步骤 |
| 5.2.4 结果判读 |
| 5.2.5 注意事项 |
| 5.3 猪圆环病毒2型和3型实时荧光PCR检测试剂盒的研发 |
| 5.3.1 简介 |
| 5.3.2 试剂盒组成 |
| 5.3.3 具体操作步骤 |
| 5.3.4 结果判读 |
| 5.3.5 注意事项 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点和应用前景 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 中英文缩略表 |
| 攻读硕士学位期间的科研情况 |
| 致谢 |
（9）猪源唾液酸黏附素介导PRRS病毒感染Marc145细胞的适应性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩略词表 |
| 第一章 CRISPR/ Cas9 技术在哺乳动物细胞中的应用 |
| 1.1 CRISPR/ Cas9技术的研究进展 |
| 1.1.1 CRISPR/ Cas9技术的发展历程 |
| 1.1.2 CRISPR/ Cas分类 |
| 1.1.3 CRISPR/ Cas9 技术及其作用的基本原理 |
| 1.1.4 CRISPR/ Cas9 的基因修复路径 |
| 1.2 CRISPR/ Cas9技术在生产病毒性疫苗哺乳动物细胞株的应用 |
| 1.2.1 病毒性疫苗用哺乳动物细胞系的简介 |
| 1.2.2 CRISPR/ Cas9技术在病毒性疫苗哺乳动物细胞的应用 |
| 第二章 猪源唾液黏附素受体研究进展 |
| 1.1 Sn受体结构 |
| 1.2 PRRSV与 Sn受体作用机理 |
| 1.2.1 PRRSV流行现状 |
| 1.2.2 PRRSV与 Sn受体的相互作用 |
| 1.2.3 Sn受体与PRRSV的免疫作用机理 |
| 第三章 Marc145细胞基因组打靶位点的筛选及验证 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和载体 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 打靶质粒构建 |
| 1.2.2 eGFP供体质粒构建 |
| 1.2.3 转染 |
| 1.2.4 Surveyor核酸酶检测 |
| 1.2.5 Junction PCR检测 |
| 1.2.6 Southern Blotting检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 Marc145 细胞基因组打靶位点的选择和sgRNA的设计及筛选 |
| 2.2 打靶质粒和供体质粒的构建 |
| 2.3 Cas9切割效率检测 |
| 2.4 阳性细胞克隆鉴定 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 不同Cas9在Marc145 细胞的切割效率及重组效率分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 打靶载体 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 eSpCas9 打靶质粒构建 |
| 1.2.2 Cas9n双打靶质粒构建 |
| 1.2.3 pSpCas9、Cas9n(双打靶)和e Cas9 打靶质粒的转染 |
| 1.2.4 Surveyor核酸酶检测三种打靶质粒的切割效率 |
| 1.2.5 Junction PCR检测同源重组效率 |
| 2 结果 |
| 2.1 三种打靶质粒的构建 |
| 2.2 三种打靶质粒的切割效率 |
| 2.3 Junction PCR检测同源重组效率 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第五章 稳定表达猪源唾液酸黏附素Marc145细胞系的建立 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 载体 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 嘌呤霉素浓度滴定 |
| 1.2.2 猪源Sn供体质粒构建 |
| 1.2.3 猪源Sn供体质粒与Cas9n(双sgRNA)质粒共转染 |
| 1.2.4 压力筛选阳性克隆 |
| 1.2.5 阳性细胞克隆鉴定 |
| 1.2.6 pSn-Marc145 单克隆细胞的生物学特性分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪源Sn供体质粒构建 |
| 2.2 阳性细胞克隆鉴定 |
| 2.2.1 Junction PCR结果 |
| 2.2.2 Western Blotting结果 |
| 2.2.3 间接免疫荧光检测结果 |
| 2.2.4 Southern Blotting结果 |
| 2.3 单克隆Marc145细胞生物学特性鉴定 |
| 2.3.1 阳性克隆核型分析结果 |
| 2.3.2 细胞形态观察及生长特性分析结果 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第六章 pSn-Marc145 细胞对PRRS疫苗毒株生物学特性的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞及PRRSV毒株 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病毒传代 |
| 1.2.2 蚀斑形成试验 |
| 1.2.3 间接免疫荧光 |
| 1.2.4 病毒生长曲线 |
| 1.2.5 Western Blotting |
| 2 结果 |
| 2.1 不同PRRSV在 Marc145和pSn-Marc145 细胞的蚀斑表型 |
| 2.2 间接免疫荧光检测结果 |
| 2.2.1 VR2332 |
| 2.2.2 CHIR |
| 2.2.3 JXA1 |
| 2.2.4 R98 |
| 2.3 病毒生长曲线的绘制结果 |
| 2.3.1 VR2332 |
| 2.3.2 CHIR |
| 2.3.3 JXA1 |
| 2.3.4 R98 |
| 2.4 Western Blotting结果 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第七章 PRRSV对 pSn-Marc145 细胞的感染性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞及PRRSV毒株 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病毒的传代培养 |
| 1.2.2 PRRSV遗传变异分析 |
| 1.2.3 实时荧光定量PCR |
| 1.2.4 蚀斑形成试验 |
| 1.2.5 病毒生长曲线 |
| 2 结果 |
| 2.1 PRRSV传代培养 |
| 2.2 PRRSV遗传变异分析结果 |
| 2.3 实时荧光定量qPCR检测结果 |
| 2.4 蚀斑形成试验结果 |
| 2.5 病毒生长曲线检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
| 导师简介 |
（10）一起猪繁殖与呼吸综合征与伪狂犬病混合感染的诊治报告（论文提纲范文）
| 1 发病情况 |
| 2 临床表现 |
| 3 剖检病变 |
| 4 诊断 |
| 5 防控 |
| 5.1 患猪隔离、分群饲养 |
| 5.2 紧急接种 |
| 5.3 防止继发感染 |
| 5.4 加强饲养管理 |
| 5.5 免疫程序调整 |
| 6 小结 |
四、猪繁殖与呼吸综合征的诊疗（论文参考文献）
- [1]猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病毒病混染的诊治[J]. 李志民,徐秀,刘荣. 饲料博览, 2021(12)
- [2]猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5重组蛋白对外周血单个核细胞功能的影响[J]. 乌吉斯古楞,刘亭岐,韩宇,宋前进,刘建奇,关平原,宋庆庆. 中国预防兽医学报, 2021(08)
- [3]QH-08PRRS分离株Caspase-8介导的凋亡途径及实时定量PCR方法的建立[D]. 丁耀忠. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [4]伪狂犬病病毒gB蛋白单克隆抗体的制备及竞争ELISA方法的建立[D]. 傅欣玲. 中国农业科学院, 2021(09)
- [5]猪繁殖与呼吸障碍综合征诊疗技术探析[J]. 冯会利,王海棚,王汝都,程征. 河南农业, 2021(12)
- [6]陕西省2017-2019年猪常见四种病毒性传染病病原学及血清学监测与分析[D]. 叶超. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [7]猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的原核表达及多克隆抗体制备[J]. 乌吉斯古楞,刘亭岐,巨敏莹,张斌,韩宇,刘建奇,宋庆庆,关平原. 中国动物检疫, 2020(10)
- [8]猪圆环病毒2型和3型双重微滴式数字PCR检测方法的建立[D]. 刘雨琦. 暨南大学, 2020(03)
- [9]猪源唾液酸黏附素介导PRRS病毒感染Marc145细胞的适应性研究[D]. 常艳燕. 甘肃农业大学, 2020(01)
- [10]一起猪繁殖与呼吸综合征与伪狂犬病混合感染的诊治报告[J]. 杨宝云. 福建畜牧兽医, 2019(04)