一、凋亡抑制蛋白研究进展（论文文献综述）
李姣[1]（2021）在《BRD4天然抑制剂3’，4’，7, 8-Tetrahydroxyflavone的发现及其抑制急性髓系白血病的机制研究》文中研究指明近年来,随着基因测序与蛋白结构解析技术的不断提高,针对恶性肿瘤的相关研究取得了不少进展。大量研究表明恶性肿瘤发病过程中极其复杂的生物学行为运用单纯的中心法则已经无法解释清楚,而表观遗传学的发展使得对恶性肿瘤发病机制的认识更加深刻。表观遗传（epigenetic inheritance）是指在不改变遗传物质DNA序列的情况下改变遗传性状的可遗传变化。目前表观遗传主要是通过对组蛋白翻译后修饰、DNA修饰和非编码RNA的调控等方式进行。近年来随着对癌症发展过程中关键表观事件的研究不断深入,新的表观遗传学关键靶点不断被发现,设计研发针对这些靶点的新一代药物是表观靶向治疗学的主要策略和方向。溴结构域识别蛋白4（Bromodomain-containing protein 4,BRD4）是溴结构域超末端蛋白（Bromodomain and extra terminal protein,BET）众家族成员中研究最为广泛的一员,它可以通过两个结构域（BD1和BD2）识别并结合组蛋白氮端尾部的乙酰化赖氨酸残基,参与表观遗传组蛋白翻译后修饰乙酰化信号的传递,调控下游基因转录。当BD1和/或BD2被抑制时会导致不同的表型,说明两个结构域具有不同的生物学功能。目前为止,虽然已有部分BRD4抑制剂进入了临床研究阶段,但相似的结构骨架可能为该类靶向抑制剂将来的临床应用带来潜在的耐药性风险,因此发现全新结构骨架的BRD4抑制剂仍具有重大意义。而天然化合物作为大自然进化产生的“天然分子库”,具有多样的化学骨架、广泛的生物活性、丰富的资源等优点,长期以来都是人类药物的重要来源。因此,本文基于BRD4蛋白重要的生物学功能带来的科学问题,充分发挥天然化合物自身优势,从筛选结构新颖的天然抑制剂、探索苗头化合物的生物活性及作用机制等角度着手,进行BRD4天然抑制剂的研究。本论文主要包含了以下几个方面的工作:1.利用AlpHaScreen assay从天然黄酮类化合物中筛选了 一个全新结构骨架的BRD4天然抑制剂-3’,4’,7,8-Tetrahydroxyflavone（以下简写 3478）,并结合 Counter assay 分析3478分别对BD1及BD2的亲和作用。结果表明3478对BRD4具有较好亲和活性,而其他结构相似的天然黄酮类化合物及衍生物无明显活性,这说明3478自身特异的结构骨架对BRD4的亲和作用具有非常重要的意义,这种亲和作用并非黄酮类化合物普遍存在的性能。同时,3478对BD2的亲和活性（IC50=204nM）约是对BD1（IC50=17.9μM）的100倍,具有BRD4-BD2选择性;2.选用急性骨髓性白血病细胞MV4-11作为研究对象,观察3478在体外对MV4-11细胞增殖、凋亡、原癌基因c-Myc及BRD4表达等的影响,探索3478的生物活性及可能的分子调控机制。结果显示3478可以抑制MV4-11细胞增殖、促进MV4-11细胞凋亡,同时可以下调原癌基因c-Myc mRNA水平以及c-Myc表达;3.构建急性骨髓性白血病小鼠模型,研究3478在体内对干预白血病细胞皮下移植瘤组织生长的作用及潜在的分子调控机制,为天然化合物3478可能干预急性骨髓性白血病提供客观的实验依据。结果发现3478在不影响小鼠体重及脏器指数的情况下可以减缓皮下移植瘤组织体积及重量的增长,同时也可以下调原癌基因c-Myc mRNA水平,降低细胞核和细胞质中c-Myc的表达;4.利用蛋白质晶体学的技术手段,通过解析3478分别与BD1及BD2的复合物结构、分析他们在结合模式、结合特点等方面的差异,解释3478对BRD4亲和活性及潜在选择性背后的分子机制。本研究中解析了 3478分别与BD1和BD2 1.3 A和1.73 A的高分辨率复合物晶体结构,发现3478与BD1和BD2的结合方式非常相似,与BD1 N140及BD2的N433均形成氢键,且通过水分子与BD1 Y97位及BD2的Y390均形成氢键,同时化合物的7-羟基与BD1 P82及BD2 P375均形成氢键,这3个氢键分别将化合物骨架环紧紧固定在 BD1 及 BD2 口袋内。另外,BD1 的 V87、1146、194 及 BD2 的 V380、V439、L387 与3478均形成较强的疏水相互作用。这些结合特点从分子水平阐明了 3478对BD1及BD2均具有亲和活性的机理。此外,在BD1-3478复合物晶体中,化合物的苯基电子密度较弱,表明该苯基与BD1相互作用较弱,相比之下,其密度在BD2中明显较好,表明3478在BD2中具有更稳定的构象且相互作用更强。并且BD2 N433附近的水分子与3478形成一个额外的氢键,同时H437的NH指向化合物苯环上的两个碳原子,可能会形成疏水作用,而在BD1中的对应位置为D144,其侧链距离化合物太远,无法建立有效的相互作用。近来研究也发现BD2 H437是设计BD2选择性抑制剂的重要氨基酸位点,这些结构特点揭示了 3478对BRD4-BD2的活性明显高于BRD4-BD1的分子机理。3478的化学骨架及其与BRD4溴域的结合模式,与迄今为止报道过的BRD4抑制剂截然不同。鉴于3478对BRD4不同结构域均具有较好的亲和活性,化学骨架及与BRD4活性口袋的的结合模式均较新颖,对BD2具有一定的选择性,且分子量也较小（MW:286.24）,还有较大的结构改造和结构优化的空间等优点,该化合物值得作为BRD4先导化合物进行进一步探索,以启发癌症及其他BRD4相关疾病的药物研发。
王生淋[2]（2021）在《Stattic对表皮生长因子受体抑制介导的骨肉瘤生物学活性的影响》文中提出第一部分EGFR酪氨酸激酶抑制剂对骨肉瘤生物学活性的影响目的:骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）是最常见的来源于骨组织的恶性肿瘤,常发生于儿童和青少年,具有很高的转移潜能。表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor,EGFR）是多种肿瘤发生的驱动因素,针对EGFR的酪氨酸激酶抑制剂对多种类型的实体肿瘤患者表现出令人鼓舞的抗肿瘤活性,然而其对OS作用的研究仍存在较大争议。本部分研究旨在明确EGFR的酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼（Gefitinib）对OS的抗肿瘤活性,并探讨其作用机制。方法:首先使用免疫印迹实验（Western blot）和实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-q PCR）检测人OS细胞与正常成骨细胞EGFR表达。通过CCK-8法、克隆形成实验、裸鼠皮下移植瘤模型检测吉非替尼对OS细胞增殖和肿瘤生长的影响。使用Transwell法和Western blot检测吉非替尼对OS细胞的迁移、侵袭的影响及其机制。使用流式细胞计数法和Western blot探讨吉非替尼对OS细胞凋亡和周期的影响及相关机制。为了研究吉非替尼影响OS细胞的机制,我们使用Western blot检测EGFR、蛋白激酶B（Akt）,细胞外信号调节激酶（ERK）和信号转导和转录激活因子3（STAT3）蛋白的表达。结果:Western blot和RT-q PCR结果表明,具有成纤维细胞或混合特性的MG63、143B和MNNG-HOS细胞中EGFR蛋白和基因表达升高,与成骨细胞比,基因表达差异具有统计学意义（P<0.01）;而具有上皮特征的U2OS和Saos-2细胞EGFR蛋白和基因呈现为低表达状态。吉非替尼以剂量依赖的方式抑制了OS细胞增殖和移植瘤生长。Transwell实验结果表明吉非替尼通过升高E-cad和降低N-cad表达抑制了OS细胞的迁移和侵袭。此外,吉非替尼处理后,OS细胞凋亡增加,G1期细胞比例增多,与对照组相比差异均具有统计学意义（P<0.05）。Western blot结果表现为Bax/Bcl-2比值和P27的增加,以及细胞周期蛋白D1（cyclin D1）和细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）的减少。进一步的机制研究表明,吉非替尼抑制EGFR、Akt和ERK的磷酸化,然而提高了STAT3的磷酸化水平。吉非替尼对EGFR、Akt、ERK和STAT3总蛋白的水平无显着影响。结论:吉非替尼通过阻断EGFR及Akt、ERK信号通路激活从而抑制OS的发生和转移,并促进OS细胞G1期阻滞和细胞凋亡。吉非替尼介导的STAT3蛋白负反馈激活可能参与了OS细胞对EGFR抑制剂的抵抗机制。第二部分EGFR沉默表达对骨肉瘤生物学活性的影响目的:第一部分的研究结果表明,EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼能够抑制OS细胞的生物学活性。然而,EGFR活性抑制对OS发生和进展的影响还需要进一步探究。本部分研究旨在明确OS中EGFR蛋白表达抑制的抗肿瘤活性。方法:使用EGFR沉默（sh-EGFR）和对照（sh-NC）慢病毒转染OS细胞,并通过RT-q PCR和Western blot检测慢病毒转染后EGFR的m RNA和蛋白表达变化。通过CCK-8法、克隆形成实验和构建裸鼠皮下移植瘤模型观察EGFR沉默对OS细胞增殖和肿瘤生长的影响。通过Transwell法观察EGFR沉默对OS细胞迁移和侵袭能力的影响。通过流式细胞计数法观察EGFR沉默对OS细胞凋亡和周期分布的影响。结果:RT-q PCR和Western blot结果显示sh-EGFR组143B和U2OS细胞EGFR的m RNA和蛋白表达均明显低于各自的sh-NC组,差异具有统计学意义（P<0.01）。sh-EGFR组143B和U2OS细胞的增殖、集落形成数量和裸鼠移植瘤生长明显低于各自的sh-NC组,差异具有统计学意义（P<0.01）。Transwell实验结果表明sh-EGFR组143B和U2OS细胞发生迁移和侵袭的数量显着少于各自的sh-NC组（P<0.01）。流式细胞计数结果表明,EGFR沉默后,143B和U2OS细胞凋亡比例增加,并且G1期细胞增多,S期期细胞减少,与对照组相比差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论:慢病毒沉默EGFR表达能够抑制OS细胞的增殖、肿瘤生长、细胞迁移和侵袭,并促进OS细胞G1期阻滞和细胞凋亡。第三部分Stattic对吉非替尼介导的骨肉瘤生物学活性的影响目的:第一部分的研究中观察到,吉非替尼介导的EGFR磷酸化抑制能负反馈激活STAT3蛋白发生磷酸化。有研究表明,软组织肉瘤中STAT3磷酸化与肿瘤对吉非替尼的耐药性相关。然而,OS中EGFR与STAT3的相互作用尚未见相关报道。本部分研究旨在探讨OS中STAT3在吉非替尼介导的抗肿瘤活性中的作用及其相关机制。方法:首先使用Western blot检测STAT3酪氨酸激酶抑制剂Stattic处理OS细胞后EGFR蛋白的变化。通过CCK-8实验、克隆形成实验和构建裸鼠皮下移植瘤模型比较吉非替尼（G）、Stattic（S）及两者联用（G+S）对OS细胞增殖和肿瘤生长的影响。使用Transwell法和Western blot比较G、S及G+S处理对OS细胞迁移和侵袭的影响及E-cad和N-cad的变化。使用流式细胞计数法比较G、S及G+S处理对OS细胞凋亡和细胞周期分布的影响,并使用Western blot检测周期和凋亡相关蛋白表达的变化。最后,通过Western blot检测G、S及G+S处理后OS细胞EGFR、Akt,ERK和STAT3蛋白的表达变化。结果:Western blot结果表明,S使p-STAT3表达水平降低,然而却升高了p-EGFR水平。CCK-8实验结果表明,G+S组对143B和U2OS细胞的半抑制浓度低于G组或者S组。并且,G+S组143B和U2OS细胞的集落形成数量、裸鼠移植瘤体积和重量均显着小于各自的G组和S组,差异具有统计学意义（P<0.05）。G+S组143B和U2OS细胞发生迁移和穿过基质胶的细胞数量显着少于各自的G组和S组,差异具有统计学意义（P<0.001）。Western blot结果表明,与G组和S组相比,G+S组OS细胞E-cad表达最高,而N-cad表达最低。此外,G+S组OS细胞发生凋亡的比例和G1期细胞比例显着多于各自的G组和S组OS细胞,差异均具有统计学意义（P<0.01）。Western blot结果表现为G+S组OS细胞Bax/Bcl-2比值和P27增加最明显,而cyclin D1和CDK4减少最明显。进一步的机制研究表明,G+S组同时抑制了EGFR和STAT3的磷酸化水平,并且p-Akt和p-ERK水平也低于G组和S组。G、S及G+S对EGFR、Akt、ERK和STAT3总蛋白的水平均无显着影响。结论:Stattic通过抑制STAT3磷酸化阻断STAT3与EGFR之间的负反馈激活通路,从而增加吉非替尼对OS细胞增殖和转移的抑制,以及对肿瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞的促进。EGFR和STAT3的联合靶向治疗有望成为OS治疗的潜在方案。第四部分Stattic对EGFR沉默表达介导的骨肉瘤生物学活性的影响目的:第三部分的研究中观察到,Stattic能够增加吉非替尼介导的抗OS细胞增殖、肿瘤生长、细胞迁移和侵袭,以及增加吉非替尼对细胞周期进展阻断和细胞凋亡的促进。然而,Stattic对OS细胞中EGFR沉默产生的生物学活性影响的协同作用还需要进一步验证。本部分研究旨在探究Stattic在EGFR沉默介导的抗OS活性中的协同作用。方法:通过CCK-8实验和克隆形成实验分别比较Stattic（S）处理的EGFR沉默（sh-EGFR）和对照（sh-NC）组143B和U2OS细胞的增殖和集落形成数量差异。通过Transwell法比较S处理的sh-EGFR和sh-NC组OS细胞的迁移和侵袭数量差异。使用流式细胞计数法比较S处理的sh-EGFR和sh-NC组OS细胞凋亡比例和细胞周期分布变化。结果:在相同S浓度作用下,sh-EGFR组143B和U2OS细胞的半抑制浓度均低于各自的sh-NC组细胞。sh-EGFR+S组143B和U2OS细胞的集落形成数量显着少于各自的sh-EGFR组和S组,差异具有统计学意义（P<0.001）。sh-EGFR+S组143B和U2OS细胞发生迁移和穿过基质胶的数量显着少于各自的sh-EGFR组和S组,差异具有统计学意义（P<0.01）。此外,sh-EGFR+S组OS细胞发生凋亡的比例和G1期比例显着多于sh-EGFR组和S组OS细胞,差异具有统计学意义（P<0.001）。结论:Stattic增加EGFR沉默对OS细胞增殖、迁移和侵袭的抑制,以及对OS细胞凋亡和细胞G1期阻滞的促进。未来的OS治疗中应考虑EGFR和STAT3的联合靶向治疗方案。
徐奡澍[3]（2021）在《极低频交变磁场细胞培养系统及其生物效应研究》文中研究说明癌症严重威胁人类的健康,是全世界最常见的死亡原因之一。尽管现有的抗肿瘤疗法取得了一定的成效,但基于化疗药物和放射治疗的标准抗肿瘤疗法仍存在潜在的副作用。近年来,一些研究表明极低频、低强度的磁场对正常的细胞无害,甚至可能是有益的,而这类磁场会对某些恶性肿瘤产生一定影响。极低频磁场（<300Hz）已被证实能够参与调控肿瘤细胞周期分布、凋亡、自噬、分化、系统免疫等过程,且能通过多种信号通路抑制血管生成和转移,并且具有副作用小、成本低、应用广泛、无创等优势。此外,在与化疗药物的联合治疗中,极低频磁场不仅能通过刺激肿瘤细胞表面产生小孔而促进药物的吸收,还能通过调节细胞周期和凋亡相关蛋白增强化疗药物的作用、降低化疗药物剂量。然而,尽管关于极低频磁场对肿瘤细胞生物效应的研究众多,但应用的磁场类型、磁场参数、测试的肿瘤细胞类型差异较大,因此该研究领域的研究成果一致性、重复性较差。针对上述问题,为了探究极低频磁场在肿瘤治疗领域的潜在应用价值,本文开展了极低频交变磁场细胞培养系统及其生物效应研究,主要研究内容如下:（1）研制极低频交变磁场细胞培养系统。为了探究极低频交变磁场对肿瘤细胞的影响,既要满足基本的细胞培养条件,又要在足以覆盖细胞培养器皿的空间内产生均匀的磁场照射环境。提出基于现有商业型细胞培养箱的磁场内置型细胞培养系统,将改进型亥姆霍兹线圈内置于细胞培养箱,采用基于H桥的串联谐振电路驱动线圈产生强度、频率可控的极低频交变磁场;为了将磁场照射方向纳入实验设计,提出将大尺寸三维亥姆霍兹线圈外置于细胞培养箱的磁场外置型细胞培养系统,选用亚克力作为细胞培养箱的制作材料以避免常规金属材质细胞培养箱对磁场分布的影响,结合线圈产生的均匀区大小定制了细胞培养箱内嵌于三维亥姆霍兹线圈中,以实现细胞培养的同时施加强度、频率、方向可控的极低频交变磁场。（2）针对磁场类型、强度、频率、处理时长以及检测样品等实验设置的差异引起的极低频磁场对肿瘤细胞效应重复性、一致性较差的问题,本文从磁场照射方向、磁场强度、频率、细胞种类四个方面分析了极低频交变磁场对细胞增殖的影响。利用磁场外置型细胞培养系统设计了细胞存活率检测对照实验,结果表明垂直于细胞培养平面照射的磁场比平行照射的磁场抑制细胞增殖的效果更显着;采用磁场内置型细胞培养系统验证了极低频交变磁场强度、频率对细胞增殖能力的影响,结果显示肿瘤细胞存活率随磁场强度的增加而降低,不同频率磁场对不同种类肿瘤细胞的抑制效果存在差异,极低频交变磁场对普通上皮细胞的抑制作用有限。（3）针对极低频交变磁场细胞生物效应机制尚不明确的现状,采用TMT标记蛋白质组学法与质谱法对未照射/照射磁场（200Hz,1m T）环境中生长24小时的乳腺癌细胞MCF-7进行了图谱分析,结合生物信息学分析方法筛选出了差异表达蛋白,利用基因本体数据库、京都基因与基因组百科全书数据库对差异表达蛋白进行分析、注释、定位、通路富集以探索其涉及的机制,结合免疫印迹法与流式细胞术进行初步的实验验证,为后续基于蛋白质组的极低频交变磁场抑制肿瘤细胞增殖机制研究提供指引。（4）为了探究极低频交变磁场诱导乳腺癌细胞凋亡的机制,从机理上解释极低频交变磁场如何抑制肿瘤细胞增殖,设计免疫印迹法、流式细胞术、荧光检测法等实验,研究了极低频交变磁场引起的乳腺癌细胞凋亡和周期阻滞的机制。结果表明细胞周期阻滞与凋亡现象随着照射时长的增加而增强,G2-M期细胞数量的增多与极低频交变磁场引起的细胞周期蛋白Cyclin B1下调有关,而细胞凋亡的发生与极低频交变磁场诱导的活性氧生成、PI3K/AKT信号通路抑制、GSK-3β激活相关,通过加入GSK-3β抑制剂进行重复性实验证实了GSK-3β在极低频交变磁场诱导细胞凋亡中的关键作用,为极低频磁场抑制肿瘤细胞增殖的现象提供理论基础。通过对上述内容的研究,本文的创新点如下:（1）针对极低频交变磁场生物效应研究中的装置研发及机理研究问题,研制了极低频交变磁场细胞培养系统,较为系统地研究了极低频交变磁场照射方向、磁场强度、频率对不同细胞系增殖的影响,设计细胞存活率检测对照实验,得出垂直照射的磁场对肿瘤细胞增殖抑制作用较为明显且细胞响应随磁场强度的增加而增强、不同类型的肿瘤细胞对频率的响应差异较大、磁场的照射对普通上皮细胞增殖无显着影响的结论。（2）针对极低频磁场引起的生物效应机制尚不明确的研究现状,对极低频交变磁场照射后的乳腺癌细胞进行了TMT标记蛋白组学分析。采用质谱法和生物信息学分析方法对比经极低频交变磁场照射24小时的乳腺癌细胞MCF-7细胞系与未经处理的MCF-7细胞系的谱图,筛选出差异表达蛋白并进行定位、注释与富集分析,揭示了极低频交变磁场对乳腺癌细胞生物效应的潜在机制,为深入研究极低频磁场引起的肿瘤细胞生物效应提供思路。（3）研究了极低频交变磁场诱导乳腺癌细胞凋亡和调控细胞周期分布的机制,设计免疫印迹法、流式细胞术、荧光检测法、活性氧检测等实验,探究极低频交变磁场引起细胞周期阻滞、细胞凋亡的机制。提出乳腺癌细胞周期阻滞于G2-M期主要与极低频交变磁场引起的细胞周期蛋白Cyclin B1降低相关,而细胞凋亡与极低频交变磁场诱导的活性氧生成、GSK-3β激活有关,为特定频率极低频磁场抑制细胞增殖的现象提供理论基础。
李振旺[4]（2021）在《1-（4-取代苯基）-2-乙基咪唑衍生物的合成及抗肿瘤活性、作用机制的研究》文中指出研究背景:咪唑是生物体内组氨酸和组胺的重要组成部分,在生理功能中发挥主要作用。由于咪唑环的这种特殊结构,含有咪唑结构的衍生物具有很大的药物研究价值,如抗癌、抗炎、抗菌及抗氧化等多种生物学活性。本实验室前期研究发现含咪唑结构的化合物I在体外对肺癌和肝癌具有弱的抗肿瘤活性(IC50=300-500μM),而开环得到的化合物II对肺癌和肝癌细胞的活性增强(IC50=100-300μM)。我们推测,其柔性结构提高了抗肿瘤活性。所以,本论文以化合物II为先导结构,进行了深入的结构修饰和药理活性研究。目的与意义:本研究以化合物II为先导化合物,在骨架结构的基础上,引入了两个酰胺基团,设计并合成了几种结构修饰的咪唑衍生物,以期筛选出能够抑制肿瘤细胞增值,毒副作用低的化合物,并探索目标结构对肿瘤细胞增殖抑制作用、诱导凋亡作用,期待寻找到抗肿瘤替代药物,造福于癌症患者。方法:以2-乙基咪唑、对氟硝基苯为原料,经过取代反应、还原反应和缩合反应合成了19个1-（4-取代苯基）-2-乙基咪唑类衍生物。通过MTT法、Hoechst/PI细胞凋亡染色法、蛋白免疫印迹法,研究其抗肿瘤活性及作用机制。结果:通过合成得到19个目标化合物,并通过1H-NMR,13C-NMR和HRMS进行了结构鉴定。大多数化合物显示出明显的抗肿瘤活性。其中化合物4e-4i,4l,4m和4q的抑制活性优于阳性对照的5-FU和MTX,以化合物4f的抑制活性最佳,对A549、He La和SGC-7901的IC50值分别为6.60、3.24和5.37μM,且对正常肝细胞L-02的毒性较低(IC50=152μM)。荧光显微镜下观察,细胞随着药物作用时间增加,由原来的饱满、透亮且贴壁生长状态变得皱缩、模糊悬浮生长,化合物4f诱导细胞凋亡率优于5-FU。Western blot结果显示,化合物4f使促凋亡蛋白Bax、Caspase-3、PARP的表达量上调,抑凋亡蛋白Bcl-2的表达量下调。结论:1.以2-乙基咪唑为原料,通过取代、还原和缩合反应合成了19个新型1-（4-取代苯基）-2-乙基咪唑衍生物4a-4s。2.化合物4c,4e-4i,4l,4m和4q对三种癌细胞系（A549,SGC-7901和He La）具有良好的抑制活性,其中化合物4f的抑制活性最佳,对A549、He La和SGC-7901的IC50值分别为6.60、3.24和5.37μM。3.化合物4f通过上调促凋亡蛋白Bax,Caspase-3,PARP的表达,下调抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达,诱导肿瘤细胞（A549,SGC-7901和He La）发生细胞凋亡。
王勇生[5]（2021）在《高压氧对化学性缺氧肺腺癌A549细胞生物学行为的影响及其机制的研究》文中指出研究背景:肺癌（lung cancer）是最常见的恶性肿瘤之一,鳞癌、腺癌等非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占肺恶性肿瘤总病例数近85%。近年来随着抗血管生成、靶向和免疫等治疗在肺癌上的治疗方面逐渐取得的进展,肺癌的预后有了显着的改善。但对于晚期肺癌,尤其无驱动基因突变患者,放、化疗仍是主要治疗手段,死亡率仍居高不下,仍需要不断寻求更有效的、新的治疗手段,在原有治疗的基础上增加一些有效辅助治疗,使肺癌的预后得到改善,提升患者生活质量和总生存期,是近年来研究肿瘤的热点。有研究发现,肿瘤缺氧微环境,是促使肿瘤的发生和转移、恶性程度增高转化的始发因素,并可导致肿瘤细胞对化、放疗产生耐受,疗效下降。通过改善肿瘤组织中氧含量来改变肿瘤的缺氧状况,去除或逆转肿瘤组织适应损害的防御功能,以及诱导产生氧化应激,引起肿瘤组织破坏,来达到治疗肿瘤,从而提供了一种新的治疗思路。而改善肿瘤细胞氧合的一种有效方法就是给予高压氧治疗。高压氧疗法（hyperbaric oxygen therapy,HBOT）是指高压下间断使用100%的氧气,促进溶解血浆中氧的含量升高,从而增加O2向组织的输送,用于治疗缺氧性疾病,如吸入一氧化碳中毒、放射损伤、非愈合性创伤、缺血性疾病、静脉或动脉溃疡、烧伤、压疮等。近年来,关于HBOT和癌症的研究焦点都集中在增强肿瘤组织氧含量是否促进癌症细胞生长,从而加速肿瘤进展的问题上。有学者研究发现,高压氧提高氧合改变肿瘤细胞所处的缺氧状态或抑制HIF-1α水平和活性从而降低肿瘤细胞对低氧的适应性应答和对药物治疗的抵抗,提高肿瘤细胞对放、化疗的敏感性,可能是一种强有效的抗肿瘤策略。本课题采取氯化钴（CoCl2）诱导肺腺癌A549细胞产生缺氧,同时给予高压氧治疗,检测在缺氧微环境下肿瘤细胞生长、代谢、转移、侵袭等生物学行为的变化以及高压氧治疗对其影响,明确高压氧在肿瘤辅助治疗中应用的可能性并探讨其分子机制。研究结果将为高压氧治疗可否通过改善肿瘤缺氧微环境发挥抗肿瘤作用、可否作为肿瘤综合治疗的辅助治疗方式提供可靠的理论依据,为临床肿瘤患者治疗开拓新的治疗模式。目的:探讨高压氧干预对CoCl2诱导的缺氧状态下肺腺癌A549细胞的增殖、分化、凋亡、迁移和侵袭能力的影响,并研究其作用机制。方法:采用MTT和CCK-8方法分别检测CoCl2对肺腺癌细胞A549活力和增殖的影响,并检测HIF-1α表达情况,筛选能有效诱导低氧并且不对细胞产生毒性的合适的CoCl2浓度。采用筛选的合适浓度的CoCl2诱导肺腺癌细胞A549发生化学性低氧,并给予高压氧处理。乳酸脱氢酶活性测定、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验、Hoechst染色等方法分别检测细胞分化水平、细胞迁移能力、细胞侵袭能力、细胞附着和分离能力以及凋亡水平等。Western-blot检测MLCK、MMP-9、Bcl-2/Bax、EMT标记物E-cad和N-cad、GRP78和CHOP、p53蛋白等与迁移、侵袭和凋亡相关的蛋白的表达变化,以初步探讨高压氧作用的分子机制;同时检测磷酸化ERK、JNK和p38的水平,明确高压氧是否通过影响MAPK信号通路活性而发挥上述作用。结果:与对照组相比,100μM和200μM CoCl2均可明显上调HIF-1α的表达而诱导细胞低氧状态,而100μM浓度对细胞增殖和细胞活力无明显抑制,对细胞不产生毒性,所以选择100μM的CoCl2浓度用于诱导细胞低氧。CoCl2处理的细胞LDH活性明显上升,提示细胞分化水平下降,HBO联合CoCl2治疗的细胞中LDH活性明显低于单独CoCl2处理组。CoCl2处理使肺腺癌A549细胞迁移、侵袭能力增强、细胞脱离和附着率增加、凋亡细胞减少,高压氧联合作用抑制化学低氧所致的迁移、侵袭能力增强、细胞脱离和附着率增加以及凋亡抑制。CoCl2处理的A549细胞中,E-cad显着下降,N-cad蛋白水平升高,E-cad/N-cad比例明显下降,MLCK和MMP-9表达增加,高压氧治疗逆转CoCl2引起的E-cad/N-cad比例下降以及升高的MLCK和MMP-9水平;CoCl2可降低A549细胞中Bax和p53水平而提高Bcl-2、GRP78和CHOP表达水平,Bcl-2/Bax比值显着升高,高压氧治疗显着降低CoCl2处理所致的Bcl-2/Bax比值升高以及GRP78和CHOP表达水平,上调CoCl2处理的细胞中p53表达水平;同时,CoCl2处理的细胞中p ERK和pp38水平明显升高,pJNK水平明显降低,高压氧处理可逆转CoCl2处理引起的p ERK和pp38水平升高和pJNK水平降低。结论:CoCl2诱导的化学缺氧环境下的肺腺癌A549细胞分化程度降低、迁移和侵袭能力增加、脱离和附着能力增强、凋亡细胞比例下降,恶性程度增高。高压氧治疗（HBOT）部分抑制或完全逆转化学缺氧所致的上述恶性表型。机制探讨发现,高压氧可能通过调节MAPK信号通路活性而调节MMP-9、MCLK、上皮间充质转化蛋白E-cad和N-cad、Bcl-2、Bax、GRP78、CHOP、p53等迁移、侵袭、粘附、凋亡等相关蛋白的表达发挥作用,采用高压氧干预治疗可以抑制或逆转肿瘤缺氧微环境所致的肿瘤细胞恶性程度增加,可作为一种潜在辅助肿瘤辅助治疗手段。
张圆圆[6]（2021）在《山核桃萜类醌的生物合成途径及其成分胡桃醌抑制Ishikawa癌细胞增殖的分子机理》文中进行了进一步梳理山核桃,胡桃科,是一种广泛栽培的木本油料树种。山核桃仁因富含油脂、蛋白质、纤维、酚酸和萜类等生物活性成分而受到人们亲睐。子宫内膜癌是女性生殖道最常见的恶性肿瘤之一,膳食干预是预防疾病的重要措施。本论文首先调查了山核桃授粉后萜类醌的合成,联合转录组学与代谢组学方法明确了山核桃发育期萜类合成与代谢的机制;接着考察了山核桃青皮中胡桃醌对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖抑制效果,利用mRNA-miRNA组学从整体水平明确了胡桃醌对子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖抑制的机制;最后,明确了胡桃醌抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖和迁袭的机制。本学位论文的研究结果为山核桃萜类化合物胡桃醌开发成特殊医学用途的功能性食品提供了理论的支持。（1）山核桃授粉后发育期萜类物质代谢机制。山核桃授粉后90-105天（P1-P2）是次级代谢物形成的关键时期。从P1至P2阶段,山核桃中的萜类化合物大量累积,而山核桃授粉后120-165天（P2-P6）萜类化合物含量急剧下降,此外,MENB和C4H基因在山核桃胚胎中高表达,最高的转录组表达量分别为671和1469,其中MENB的高表达水平可能是山核桃胚胎中萜类醌（萘醌）含量高的重要原因。通过网络共表达分析,6种萜烯醌代谢物与86个差异表达基因之间存在显着的正负相关性（r>0.8或<0.8,p<0.05）,且次级代谢产物的表达水平在早期是最高的,这与调控其差异表达基因水平基本一致。（2）山核桃青皮提取物胡桃醌抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖作用。利用超声波辅助提取山核桃青皮提取物的工艺条件为:85%乙醇浸泡8 h、料液比为1:8、超声提取30 min,40℃减压浓缩,在此条件下得到的山核桃青皮粗提取物经大孔树脂与硅胶柱联合纯化后,化合物含量为3.31 mg/kg,纯度为98%,经二次质谱和离子碎片数据数据库比对后该组分鉴定为胡桃醌。胡桃醌处理Ishikawa细胞24 h的半增殖抑制率(IC50)为20.81μmol/L。用不同浓度的胡桃醌（0、10、15、20μM）处理24 h后,Ishikawa细胞的形态变化呈剂量依赖性。（3）转录组学和miRNA组学联合分析胡桃醌抑制Ishikawa细胞增殖。子宫内膜癌Ishikawa细胞经胡桃醌（20μM）处理24 h后,942个mRNA的表达量差异显着。差异表达的mRNA中,789个上调、153个下调,其富集分析在与细胞周期和凋亡相关的通路上。通过Cytoscape的Cytohubba插件分析String数据库构建的差异表达mRNA间蛋白质-蛋白质互作关系（PPI）,发现筛选出的16个特征（Hub）基因主要参与细胞周期G1/S期和铁死亡相关HIF-1信号通路。胡桃醌处理Ishikawa细胞后50个miRNA的表达量显着变化,其中24个上调、26个下调。通过构建miRNA共表达网络,鉴定出4个关键的miRNA（hsa-let-7i-5p,hsa-let-7g-5p,hsa-mir-148b-3p和hsa-mir-148a-3p）,其靶基因富集分析在与凋亡相关通路中。miRNA-mRNA调控网络分析表明,胡桃醌诱导子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖抑制与铁死亡和细胞凋亡、周期机制密切相关,且为进一步探究成为功能性食品成分提供线索。（4）胡桃醌诱导Ishikawa细胞凋亡及其机理。胡桃醌通过Cdc25A/CDK2/Cyclin A信号途径将Ishikawa细胞阻滞在S期,显着促进子宫内膜癌Ishikawa细胞的晚期凋亡的发生。胡桃醌诱导Ishikawa细胞凋亡,线粒体途径和死亡受体途径都参与其中。在线粒体途径中,抑凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-x L的表达显着下调,而促凋亡蛋白Bad和Bak表达上调。Caspase 3抑制剂与胡桃醌的联合作用在一定程度上减弱了这种抑制作用,表明线粒体途径中的Caspase3在胡桃醌诱导的Ishikawa细胞凋亡中起关键作用,进一步证实了线粒体途径参与胡桃醌诱导的细胞凋亡。同时在死亡受体途径中,TNF-α、TNF-R1、TRADD、FAS、FADD、Caspase 8、Caspase 10和DR3/5的mRNA和蛋白表达显着上调。当用Caspase-8抑制剂（Z-IETD-FMK）处理时,Caspase 8的表达水平显着降低;而胡桃醌的添加在一定程度上减弱了这种抑制作用,进一步说明了死亡受体通路参与了胡桃醌诱导的Ishikawa细胞凋亡。（5）胡桃醌诱导的子宫内膜癌Ishikawa细胞铁死亡及其机理。胡桃醌处理子宫内膜癌Ishikawa细胞24 h后,出现了Fe2+的积累、脂质过氧化、GSH消耗、HMOX1上调等现象,说明铁死亡可能参与了胡桃醌诱导的细胞死亡。在胡桃醌处理的Ishikawa细胞中,Beclin 1呈剂量依赖性下调。此外,胡桃醌和铁死亡抑制剂Fer-1联合处理24 h后,Ishikawa细胞中Beclin 1的表达增加,表明胡桃醌诱导细胞发生铁自噬。在胡桃醌处理的Ishikawa细胞中,E-cadherin、MMP 9和MMP 2蛋白发生显着变化。结果表明胡桃醌可能通过抑制上皮-间充质转化（EMT）来抑制Ishikawa细胞的迁移。同时,通过用Fer-1抑制剂和胡桃醌处理,进一步说明了胡桃醌诱导的Ishikawa细胞死亡与铁死亡有关。此外,胡桃醌诱导子宫内膜癌Ishikawa细胞发生内质网应激。
陶鹏先[7]（2021）在《PAI-1通过PTEN/PI3K/AKT信号通路引起肝癌失巢凋亡抵抗的相关研究》文中研究表明肝癌是世界排名第5的高致死性恶性肿瘤,因高侵袭性、高复发性而着称,其中肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）占约90%以上。而作为与肿瘤浸润、转移密切相关的失巢凋亡（anoikis resistance,AR）抵抗在肝癌中的研究一直处于边缘领域。作为HCC发生发展中的重要凝血相关纤溶因子PAI-1既往证实与HCC的浸润转移密切相关,但其临床预后意义及与基础研究往往相左。是否PAI-1因子在HCC中发挥其浸润转移重要调控作用是通过引起肿瘤细胞AR表型引起,既往并无相关报道。目的 探索PAI-1在肝癌中的生物学意义及其是否调控肝癌细胞失巢凋亡抵抗表型和具体调控机制。方法 1、使用免疫组化（IHC）分析PAI-1在肝癌组织中表达情况,并结合临床基线资料统计其与肝癌患者临床预后（总体生存率,OS）结局;2、使用Western-blot,RT-PCR技术验证PAI-1在HCC细胞中的相对mRNA及蛋白表达水平;验证PAI-1调控HCC细胞中的凋亡蛋白表达水平（cleaved caspase-3）,EMT蛋白表达水平（E-cahdarin,N-cahdarin,Vimentin）;以及验证PAI-1调控HCC细胞AR的信号通路蛋白表达（PTEN,PI3K,p-85α,AKT及p-AKT）;3、使用慢病毒载体工具构建PAI-1 RNAi及Ovexpression HCC稳转细胞株进一步验证PAI-1调控HCC细胞mRNA及蛋白表达水平;4、使用流式Annexin V-FITC/PI法检测HCC细胞的anoikis表型以及PAI-1调控HCC anoikis表型;5、使用细胞划痕愈合实验、Transwell实验以及CCK-8实验验证PAI-1调控HCC细胞的增殖、浸润、转移表型;6、使用生物信息学技术分析在HCC中PAI-1调控PTEN/PI3K/AKT信号通路的下游蛋白分子及临床意义;7、通过构建体内HCC肝内转移模型,验证PAI-1在体内调控HCC浸润转移表型及相关调控机制。结果 1、通过本课题组分析统计174例肝癌患者临床资料及IHC结果,发现PAI-1表达与HCC患者生存预后呈正相关,PAI-表达越低,肝癌患者预后越差（Log-rank,p=0.027）;测量肝癌患者IHC切片Mean-IOD值,验证癌旁vs癌组织（p<0.000）,并且随着临床分期的升级,PAI-1表达呈明显下降趋势;使用COX单因素回归分析PAI-1表达（HR=1.662,95%CL=1.380-2.546,p=0.000）,多因素COX回归分析PAI-1表达（HR=2.303,95%CL=1.852-2.654,p=0.000）,提示相较其他因素,PAI-1可以作为独立的预后因子,低表达是高表达预测风险的1.662倍/2.303倍。2、PAI-1基因在蛋白及mRNA表达水平上基本一致（VS L02）在PLC/PRF/5、SMMC 7721以及MHCC-97H表达均为低表达;慢病毒构建稳转株:PAI-1高表达细胞组（Hep G2、Huh 7）共设三个敲减靶点,敲减效率最低达到80%以上（Hep G2 sh-PAI-1#53.3%,sh-PAI-2#84%,sh-PAI-3#23%;Huh sh-PAI-1#71%,sh-PAI-2#83.3%,sh-PAI-3#66.1%）,低表达组（SMMC 7721以及MHCC-97H）过表达效率达到70%以上（MHCC-97H 84%,SMMC 7721 76.2%）。高表达细胞系悬浮48h后PAI-1表达明显下降,而低表达组sus 48h却呈明显上升趋势（p<0.001,VS贴壁48h组）,对高表达细胞系敲减PAI-1基因后,细胞悬浮48h PAI-1表达明显下降（p<0.001,VS sh-NC sus 48h,悬浮sus（suspension））。而对低表达组过表达PAI-1基因后,细胞悬浮48h PAI-1表达明显上升（p<0.001,VS OV-NC sus 48h）;验证cleaved-caspase 3表达,在高表达细胞系中,敲减PAI-1细胞系sus 48h凋亡率明显下降（VS sus 48h sh-NC,p<0.001）,而在低表达细胞系中缺恰恰相反（VS sus 48h OV-NC,p<0.001）;探索EMT表型蛋白（N-cadherin,E-cadherin,Vimentin）表型蛋白变化,细胞悬浮48h后EMT,发现PAI-1表达越高,悬浮细胞浸润及转移能力越差,反之越强（VS sh-NC sus 48h/OV-NC sus48h,p<0.001）;分别对PTEN,PI3K,PI3K磷酸化蛋白p85α,AKT,AKT磷酸化蛋白p-akt表达水平分析,sh组细胞悬浮48h后,PTEN表达明显降低（VS sh-NC sus 48h,p<0.001,***）,而p85α和p-akt表达升高（VS sh-NC sus 48h,p<0.001,***）。相较sh-NC组,sh组细胞贴壁48h后,PTEN表达明显降低,p85α和p-akt表达升高,但相较悬浮组,细胞悬浮后信号通路下游蛋白激活更为明显;与之相反,相较OV-NC组,OV组细胞悬浮48h后,PTEN表达增高,p85α和p-akt表达降低（VS OV-NC sus 48h,p<0.001,***）,而贴壁48h PTEN表达虽然也有增高,p85α和p-akt表达降低趋势,变化趋势并不太明显（VS OV-NC sus 48h,p>0.05）,未磷酸化蛋白PI3K,AKT相较NC组却未发生明显改变。3、使用流式Annexin V-FITC/PI凋亡检测高表达细胞经过PAI-1基因敲除后,sus 48h凋亡率明显下降（sus 48h sh-NC-Hep G2 43.32%±4.23%VS sus 48h shPAI-1-Hep G2 15.38±1.68%、sus 48h sh-NC-Huh 7 53.7%±7.23%VS sus 48h sh-PAI-1-Huh 7 15.35.7%±3.33%,p<0.001）,而对于低表达细胞系,则恰恰相反（sus48h OV-NC-SMMC 7721 21.41%±3.36%VS sus 48h OV-PAI-1-SMMC 772144.41±4.35%、sus 48h OV-NC-MHCC-97H 17.21%±3.63%VS sus 48h OV-PAI-1-MHCC-97H 32.16%±3.88%,p<0.001）。4、划痕实验可见PAI-1高表达细胞,当PAI-1基因敲除后,相较sh-NC组,Hep G2划痕相对面积愈合速度明显加快（0.86 cm2±0.21 cm2 VS 0.14 cm2±0.06cm2,p<0.001）,Huh 7趋势同前（0.98 cm2±0.16 cm2 VS 0.57 cm2±0.21 cm2,p<0.001）;而对于PAI-1低表达细胞,相较OV-NC组,趋势则恰恰相反,MHCC-97H划痕相对面积愈合速度明显降低（0.12 cm2±0.02 cm2 VS 0.38 cm2±0.11 cm2,p<0.001）,SMMC 7721趋势同前（0.29 cm2±0.17 cm2 VS 0.74 cm2±0.18 cm2,p<0.001）。Transwell实验可见,PAI-1高表达细胞,当PAI-1基因敲除后,相较sh-NC组,Hep G2浸润及转移能力明显增强（invasion:32±4 VS 8±3,p<0.001;migration:22±2 VS 6±3,p<0.001）,Huh 7趋势同前（invasion:298±14 VS 78±13,p<0.001;migration:324±22 VS 85±16,p<0.001）;PAI-1低表达细胞,当过表达PAI-1基因后,相较OV-NC组,趋势则恰恰相反,MHCC-97H浸润及转移能力明显降低（invasion:23±5 VS 107±21,p<0.001;migration:21±4 VS 94±15,p<0.001）,SMMC 7721趋势同前（invasion:112±22 VS 198±13,p<0.001;migration:124±18VS 237±26,p<0.001）。使用cck-8检测HCC增殖率,细胞增殖表型基本相同NC组（OV-MHCC 97H VS OV-NC组,p=0.017;OV-SMMC 7721 VS OV-NC组,p=0.024）。5、根据各种在线生物信息学预测网站,我们预测AKT1作为PTEN及PAI-1主要调控蛋白,可能参与PAI-1激活/失活PTEN,调控PI3K/AKT信号通路。6、为构建PAI-1调控体内肝癌细胞转移瘤模型,我们对OV-NC及OV-PAI-1 MHCC-97H荷瘤NOD/SCID小鼠肝脏标本进行HE染色并对两组肝癌转移灶拍照比对。相较OV-PAI-1组,OV-NC组小鼠肝脏肝癌细胞转移灶明显增多,并且质地明显较硬。使用小动物成像技术显影小鼠CDX成瘤强度及分析其肿瘤平均ROIs值。可见OV-NC组显影强度明显高于OV-PAI-1组,相较OV-NC组,OV-PAI-1组ROIs显着降低（3648±457 VS 9874±688,p<0.001）。为验证体内PAI-1调控HCC预后,绘制Kaplan-Meier生存曲线,相较OV-NC组,OV-PAI-1组小鼠生存周期明显延长（VS OV-NC,p=0.0037）。使用western-blot验证OVNC及OV-PAI-1两组小鼠荷瘤组织蛋白中PAI-1,PTEN,PI3K,p-85α,AKT及p-AKT蛋白表达水平。相较OV-NC组,OV-PAI-1组PAI-1表达明显升高,PTEN蛋白表达升高,而p-85α及p-AKT蛋白表达降低（p<0.001）,而PI3K及AKT表达水平无明显变化。结论 本课题组通过临床、体内、体外三个层面对PAI-1在肝癌中调控作用做了系统的分析、验证,证实:1、PAI-1在HCC中普遍低表达,与患者预后呈正相关;2、PAI-1参与HCC的浸润、转移、增殖表型,从而与HCC的AR表型密切相关;3、PAI-1通过调控PTEN/PI3K/AKT信号通路介导了肝癌细胞AR表型发生,从而促进肝癌的浸润转移能力。
马晓丽[8]（2021）在《ILK对食管鳞癌恶性表型的影响及其功能研究》文中研究说明目的:本研究目的是探讨整合素连接激酶（ILK）基因对食管癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响,研究其在食管癌中功能,为食管癌的精准诊疗奠定理论基础和临床参考。方法:1)采用meta分析评价ILK在消化系统肿瘤组织中的表达,及与消化系统肿瘤临床表型及预后间的相关性;2)筛选ILK高表达的人食管鳞癌细胞系,建立ILK慢病毒干扰序列。将ILK慢病毒干扰序列转染食管鳞癌细胞系TE-1和KYSE-150,用q RT-PCR检测干扰载体转染后ILK的表达。在细胞水平上,利用MTT增殖、克隆检测、流式细胞仪凋亡检测、Transwell小室侵袭及划痕愈合等技术,研究ILK基因消减对食管鳞癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响;3)建立ILK慢病毒干扰载体,转染KYSE-150细胞。在裸鼠皮下分别接种sh ILK及对照细胞株,建立KYSE-150细胞裸鼠皮下移植瘤模型,通过观察肿瘤生长,测量肿瘤大小和体积。在动物水平上,研究ILK基因消减对食管鳞癌细胞生长的影响。基于RNA-seq技术筛选食管癌的差异表达基因,通过GO功能富集和KEGG通路分析预测其可能的发病机制,筛选可能参与食管癌发生发展的关键调控基因及相关信号通路。结果:第一部分:meta分析结果显示ILK在消化系统肿瘤组中高表达,ILK表达与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移、肿瘤浸润程度及生存预后呈相关性,与年龄及性别无明显相关性。第二部分:在体外ESCC细胞水平,沉默ILK基因后,可显着抑制TE-1、KYSE-150细胞增殖和集落形成,促进TE-1、KYSE-150细胞凋亡。ILK基因消减后,TE-1、KYSE-150细胞侵袭及迁移能力明显减弱。第三部分:裸鼠移植瘤动物模型结果发现,ILK干扰组裸鼠肿瘤生长缓慢,相比较于对照组,肿瘤的重量及体积均偏小,ILK基因消减后影响了裸鼠成瘤的能力。基于RNA-seq技术,ILK基因干扰后挖掘到5540个食管癌差异表达基因,其中上调基因为2839个,下调基因为2601个。上调的基因有SOD2、IRF6、PER1、PHLDB2、TNFAIP3等,下调的基因有RPL21、HYOU1、WARS、SUPT16H、DHCR24等。可能参与TNF信号通路、AMPK信号通路、Fox O信号通路、P53信号通路、NF-k B信号通路等。结论:ILK在消化系统肿瘤中高表达,与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移、肿瘤浸润程度及生存预后呈相关性,与年龄及性别无明显相关性。ILK基因消减抑制ESCC细胞增殖、克隆形成、侵袭及转移,促进细胞凋亡。体内致瘤研究证实,ILK基因消减会阻碍KYSE-150移植瘤的生长。基于RNA-seq技术筛选出食管癌的差异表达基因,通过GO功能富集和KEGG通路分析预测差异表达基因,可能相关的信号传导通路。
曾琼瑶[9]（2020）在《百里酚通过Wnt/β-catenin信号通路抗结直肠癌作用研究》文中进行了进一步梳理目的:结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是最常见的恶性肿瘤之一。过去5-10年中由于饮食结构的改变、老龄化及环境污染等因素,我国结直肠癌的发病率和死亡率迅速上升。对于早期结直肠癌患者手术切除是首选的治疗方案。但在我国约20-25%的结直肠癌患者被诊断时即为IV期出现了转移,另有25%左右的患者在治疗期间出现转移,失去根治性手术治疗的机会,该类型的患者如果不给予任何治疗,其平均生存期仅为6-9个月。除外科手术外,药物治疗在结直肠癌的生长和转移抑制中具有重要的地位。目前化疗联合西妥昔单抗或者贝伐珠单抗在一定程度上能够阻止结直肠癌的进展,但由于肿瘤细胞耐药性的出现及药物本身的毒副作用,导致长期效果差,结直肠癌的术后复发率和死亡率仍较高。因此,寻找一种新的、安全有效的药物显得尤为重要。百里酚（Thymol）是一种天然酚类化合物,在食品、医疗和化妆品领域被认为是安全无毒的。既往研究表明,百里酚在肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多种肿瘤中具有明显的抑制作用,但其作用机制尚不明确。而且,百里酚对结直肠癌是否具有抑制作用、潜在作用机制如何,目前研究甚少。方法:首先利用甲醇对百里香全株进行提取,然后经柱层析及半制备型HPLC纯化后获得活性成分百里酚。利用CCK-8检测百里酚对HCT116和Lovo细胞的增殖抑制及对FHC的细胞毒性作用;平板克隆形成实验检测百里酚对HCT116和Lovo细胞克隆形成能力的影响;流式细胞术检测百里酚对HCT116和Lovo细胞周期分布和凋亡的影响;Transwell迁移和侵袭实验检测百里酚对HCT116和Lovo细胞迁移和侵袭能力的抑制作用。利用针对β-catenin的过表达质粒和小干扰RNA（small interference RNA,si RNA）将HCT116和Lovo细胞中的β-catenin基因分别进行过表达和沉默,进一步分析改变β-catenin的表达对百里酚CRC细胞增殖、迁移和侵袭抑制作用的影响。另外通过皮下注射和尾静脉注射HCT116细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型和结直肠癌转移模型,分析百里酚对裸鼠移植瘤生长和结直肠癌血行播散转移的抑制作用。进一步我们采用实时荧光定量PCR、免疫印迹以及免疫组化的方法,从m RNA水平和蛋白水平上检测百里酚对CRC细胞内、瘤体组织及肺转移组织中增殖、凋亡及转移相关基因表达的影响。结果:百里香中主要活性成分-百里酚对HCT116和Lovo细胞的增殖具有明显的抑制作用,且这种抑制作用呈现出一定的时间和浓度依耐性。百里酚（0-120mg/ml）对正常结直肠粘膜FHC细胞无明显的细胞毒作用。与对照组相比较,百里酚各组中细胞克隆形成数明显降低,有显着统计学差异（P<0.001）。细胞周期实验结果显示,百里酚能够有效地将HCT116和Lovo细胞阻滞于G0/G1期。Hoechst33258染色和流式细胞技术分析结果显示百里酚能够诱导CRC细胞的凋亡。Transwell小室迁移和侵袭实验结果显示百里酚能够降低HCT116和Lovo细胞的迁移和侵袭能力,且具有剂量依耐性。百里酚能够通过激活Bax/Bcl-2信号通路诱导CRC细胞凋亡。此外,百里酚能够通过抑制Wnt/β-catenin通路的激活,抑制CRC细胞上皮-间质转化（EMT）、侵袭和转移;β-catenin的过表达能够部分阻遏百里酚对结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT抑制作用,反之,β-catenin的沉默能够增加百里酚对结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT抑制作用。另外,在体内百里酚能够剂量依耐性的抑制裸鼠移植瘤的生长,同时抑制结直肠癌HCT116细胞的肺转移,其机制可能与百里酚抑制Wnt/β-catenin通路的激活,从而抑制CRC细胞增殖、迁移、侵袭和EMT有关。结论:本研究以百里酚为研究对象,采用多种研究方法证实了百里酚体内外对结直肠癌细胞生长和转移的抑制作用及机制。百里酚能有效的将HCT116和Lovo细胞周期阻滞于G0/G1期,从而抑制增殖。百里酚能够通过下调CRC细胞内Bcl-2/Bax比值,诱导HCT116和Lovo细胞凋亡。百里酚能够降低HCT116和Lovo的迁移和侵袭能力,阻碍EMT进程。在体内百里酚能够抑制裸鼠移植瘤的生长及结直肠癌的肺转移。百里酚抑制CRC细胞的增殖、转移和EMT,其机制可能与百里酚抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性有关,β-catenin介导了百里酚的抗结直肠癌作用。综上所述,百里酚能够显着抑制结直肠癌的细胞增殖、侵袭、转移和EMT,其机制可能是通过抑制Wnt/β-catenin通路来实现的;百里酚有望能够作为单一药物或与其他抗癌药物联合用于CRC的治疗。
徐珩[10]（2020）在《靶向肿瘤凋亡相关靶标的先导化合物发现及作用机制研究》文中研究说明细胞凋亡逃逸是肿瘤的六大特征之一,靶向肿瘤细胞凋亡治疗癌症一直是抗肿瘤药物研发的主要方式之一。肿瘤细胞凋亡受多种信号转导通路、蛋白和内源小分子调控,是一个非常复杂的网络。其中,较早开始研究的是凋亡信号通路相关蛋白,如IAP家族蛋白,目前已有多个IAP小分子在进行临床I期和II期的研究。核受体是细胞凋亡调控中非常重要的一环,在结合其内源性配体后,核受体被激活进而调控众多的细胞凋亡相关的基因转录。其中比较特别的是,孤儿核受体Nur77。Nur77接受凋亡信号后从细胞核向线粒体转位,并通过直接的相互作用将抗凋亡蛋白BCL-2转变成促凋亡蛋白。研究发现活性氧（ROS）在细胞中的作用类似于第二信使,能调控众多蛋白和信号通路。靶向直接调控ROS的蛋白是肿瘤细胞凋亡调控的新思路。来源于中草药的天然产物种类繁多,化学空间巨大,生物学活性广泛,其中很多都有诱导肿瘤细胞凋亡的表型。本文结合上述因素进行三方面的课题研究。第一个方面,是从小分子诱导cIAP1蛋白发生二聚化进而降解的现象入手,结合文献中cIAP1的氨基酸残基突变实验,采用分子动力学模拟的方法,解释了在小分子诱导cIAP1二聚化降解过程中,关键残基E447与周围氨基酸残基的氢键网络、静电相互作用发挥的重要作用。动力学模拟结果显示cIAP1的氨基酸残基D303与自发泛素化关键残基T612存在氢键作用,据此结果设计并表达纯化了cIAP1新突变体蛋白D303A,通过实验观察到D303A的自发二聚化。结果证明了在溶液状态下,关键残基的氢键相互作用对cIAP1二聚化降解的影响。为挖掘天然产物靶向cIAP1蛋白的潜力,我们针对天然产物小分子库,采用基于蛋白热稳定性筛选的方法,得到分子水平亲和力为163.5 nM的土木香内酯,亲和力为359.8 nM的6-姜烯酚,比阳性对照小分子BV6靶向cIAP1的亲和力（1.63μM）更强。cIAP1是这两个天然产物目前已有报导的结合活性最强的靶标,并且它们也是为数不多的靶向cIAP1的天然产物抑制剂。通过细胞水平相关实验,我们进一步证明了土木香内酯和6-姜烯酚靶向cIAP1的在靶效应。综上,分子水平和细胞水平实验结果都表明土木香内酯和6-姜烯酚是具有改造前景的靶向cIAP1的天然产物抑制剂。第二个方面,是通过分子动力学模拟分析比较Nur77已报道的炎症调控位点和凋亡调控位点。比较分析小分子结合在不同口袋对蛋白构象影响的差别。与此同时,我们靶向Nur77开展了基于蛋白热稳定性的天然产物筛选,发现了结合强度为1.81μM的去甲氧基姜黄素和3.07μM的宝霍苷I,而Nur77蛋白也是去甲氧基姜黄素和宝霍苷I目前已报道的亲和力最强的分子靶标。细胞水平实验也证明这两个小分子是活性较好的靶向Nur77的诱导肿瘤细胞凋亡的小分子。第三个方面,是利用共价对接结合酶活实验的策略,获得了靶向细胞氧化还原调控关键蛋白过氧化物氧化还原酶1（PRDX1）的活性、选择性较好的抗肿瘤先导化合物P1-L02。P1-L02靶向PRDX1的酶活性抑制IC50为89.3 nM,在PRDX家族中也有较好的选择性。通过分子动力学模拟结合结晶条件筛选的方式,我们解决了PRDX1晶体稳定性差的问题,获得了高分辨率的PRDX1蛋白晶体,进而成功解析了PRDX1和P1-L02的复合物晶体结构。细胞水平实验证实了P1-L02的表型符合PRDX1的生物学功能,深入的解析具体分子机制发现P1-L02是通过靶向PRDX1-ASK1蛋白相互作用来实现促凋亡活性。P1-L02是目前报导的活性最强的PRDX1抑制剂,有望作为工具化合物,用于对PRDX1相关的进一步机制研究。P1-L02也为靶向PRDX1的抗肿瘤先导化合物开发奠定了坚实的基础。
二、凋亡抑制蛋白研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、凋亡抑制蛋白研究进展（论文提纲范文）
（1）BRD4天然抑制剂3’，4’，7, 8-Tetrahydroxyflavone的发现及其抑制急性髓系白血病的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 表观遗传概述 |
| 1.3 组蛋白翻译后修饰 |
| 1.3.1 组蛋白乙酰化 |
| 1.3.2 组蛋白磷酸化 |
| 1.3.3 组蛋白甲基化 |
| 1.4 Bromodomains家族蛋白概述 |
| 1.5 研究BET亚家族及BRD4的意义 |
| 1.6 BET亚家族蛋白抑制剂研究进展 |
| 1.7 天然化合物的优势及开发 |
| 1.8 台湾相思及其活性成分3',4',7,8-Tetrahydroxyflavone的相关研究 |
| 1.9 急性髓系白血病在表观遗传方面的进展 |
| 1.10 本论文选题依据及研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 BRD4天然抑制剂3478的发现 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验药物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 AlphaScreen Assay |
| 2.3.2 AlphaScreen Counter Assay |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 筛选出对BRD4-BD1具有较好活性的天然化合物3478 |
| 2.4.2 3478对BRD4-BD2具有一定的选择性 |
| 2.4.3 AlphaScreen Counter Assay验证筛选结果是可信的 |
| 2.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 3478体外对MV4-11细胞生长的作用及机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验药物及细胞株 |
| 3.2.2 实验耗材 |
| 3.2.3 实验试剂 |
| 3.2.4 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞的培养 |
| 3.3.2 细胞增殖试验 |
| 3.3.3 细胞凋亡试验 |
| 3.3.4 Western blot检测MV4-11细胞中BRD4以及c-Myc的表达水平 |
| 3.3.5 数据处理分析 |
| 3.4 实验结果与分析 |
| 3.4.1 BRD4在MV4-11细胞中显着高表达 |
| 3.4.2 3478对MV4-11细胞生长的影响 |
| 3.4.3 3478对MV4-11细胞生长影响的分子机制研究 |
| 3.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 3478体内抑制MV4-11皮下移植瘤的作用及其机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验药物 |
| 4.2.2 实验细胞 |
| 4.2.3 实验动物 |
| 4.2.4 实验耗材、试剂及仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞的培养 |
| 4.3.2 人髓性单核细胞白血病细胞MV4-11裸小鼠移植瘤模型的建立 |
| 4.3.3 各实验组给药处理 |
| 4.3.4 Western blot检测瘤组织中BRD4蛋白以及肿瘤因子c-Myc的水平 |
| 4.3.5 免疫荧光检测瘤组织中c-Myc的表达 |
| 4.3.6 qRT-PCR检测瘤组织中c-Myc的mRNA水平 |
| 4.3.7 数据处理分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 各组小鼠生长状况观察 |
| 4.4.2 各组小鼠瘤组织生长状况观察 |
| 4.4.3 瘤组织取材及观察 |
| 4.4.4 3478对小鼠脏器指数的影响 |
| 4.4.5 实时荧光定量PCR法检测3478对瘤组织中c-Myc mRNA的影响 |
| 4.4.6 免疫荧光法检测3478对瘤组织中肿瘤标志物c-Myc的影响 |
| 4.4.7 Western Blot检测瘤组织中BRD4、c-Myc蛋白表达水平 |
| 4.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 3478与BRD4蛋白共晶结构的解析及其抑制机理研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与仪器 |
| 5.2.1 质粒及菌株 |
| 5.2.2 化学试剂及耗材 |
| 5.2.3 试剂盒 |
| 5.2.4 实验仪器 |
| 5.2.5 常用溶液及配制方法 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 感受态细胞制备方法 |
| 5.3.2 质粒转化 |
| 5.3.3 蛋白表达 |
| 5.3.4 蛋白纯化及检测 |
| 5.3.5 蛋白质结晶 |
| 5.3.6 数据收集及结构解析与建模 |
| 5.4 实验结果与分析 |
| 5.4.1 蛋白质纯化结果 |
| 5.4.2 3478与BRD4-BD1及BD2复合物晶体 |
| 5.4.3 X-射线衍射复合物晶体结果 |
| 5.5 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 附: 缩略语中英文对照表 |
| 附: 综述 中医药治疗白血病的研究进展 |
| 1 中医学对AML的认识 |
| 1.1 病因病机 |
| 1.2 治疗原则 |
| 1.3 辨证论治 |
| 2 中医药治疗AML |
| 2.1 自拟方治疗 |
| 2.2 中成药治疗 |
| 2.3 协定处方治疗 |
| 3 中医药治疗AML的机制研究 |
| 3.1 抑制白血病细胞增殖 |
| 3.2 诱导白血病细胞分化 |
| 3.3 诱导白血病细胞凋亡 |
| 3.4 提高机体免疫力、增效减毒 |
| 3.5 逆转白血病多药耐药 |
| 4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 博士期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）Stattic对表皮生长因子受体抑制介导的骨肉瘤生物学活性的影响（论文提纲范文）
| 附录:缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 EGFR酪氨酸激酶抑制剂对骨肉瘤生物学活性的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 结果 |
| 1 EGFR在不同OS细胞和成骨细胞中表达 |
| 2 吉非替尼对OS细胞增殖的影响 |
| 3 吉非替尼对OS细胞移植瘤生长的影响 |
| 4 吉非替尼对OS细胞迁移和侵袭的影响 |
| 5 吉非替尼对OS细胞凋亡的影响 |
| 6 吉非替尼对OS细胞周期的影响 |
| 7 吉非替尼对OS细胞生物学特性影响的相关机制 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 EGFR沉默表达对骨肉瘤生物学活性的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 结果 |
| 1 EGFR慢病毒干扰对OS细胞EGFR表达的影响 |
| 2 EGFR沉默表达对OS细胞增殖的影响 |
| 3 EGFR沉默表达对OS细胞移植瘤生长的影响 |
| 4 EGFR沉默表达对OS细胞迁移和侵袭的影响 |
| 5 EGFR沉默表达对OS细胞凋亡的影响 |
| 6 EGFR沉默表达对OS细胞周期的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 Stattic对吉非替尼介导的骨肉瘤生物学活性的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 结果 |
| 1 EGFR蛋白与STAT3 蛋白之间的相互作用 |
| 2 Stattic对吉非替尼介导的OS细胞增殖抑制的影响 |
| 3 Stattic对吉非替尼介导的OS细胞移植瘤生长抑制的影响 |
| 4 Stattic对吉非替尼介导的OS细胞迁移和侵袭抑制的影响 |
| 5 Stattic对吉非替尼介导的OS细胞凋亡促进的影响 |
| 6 Stattic对吉非替尼介导的OS细胞周期变化的影响 |
| 7 Stattic对吉非替尼介导的OS细胞活性变化影响的相关机制 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 Stattic对 EGFR沉默表达介导的骨肉瘤生物学活性的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 结果 |
| 1 Stattic对 EGFR沉默表达介导的OS细胞增殖抑制的影响 |
| 2 Stattic对 EGFR沉默表达介导的OS细胞迁移和侵袭抑制的影响 |
| 3 Stattic对 EGFR沉默表达介导的OS细胞凋亡促进的影响 |
| 4 Stattic对 EGFR沉默表达介导的OS细胞周期变化的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 肝细胞生长因子受体在骨肉瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）极低频交变磁场细胞培养系统及其生物效应研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 生物医学研究中的常用磁场装置 |
| 1.2.2 磁场对肿瘤细胞的非热生物学效应综述 |
| 1.3 本文的研究目的和研究内容 |
| 1.4 论文结构安排 |
| 第2章 极低频交变磁场细胞培养系统研制 |
| 2.1 极低频交变磁场细胞培养系统总体方案设计 |
| 2.1.1 系统功能与指标 |
| 2.1.2 总体设计方案 |
| 2.1.3 线圈的选型 |
| 2.2 磁场内置型细胞培养系统设计 |
| 2.2.1 改进型亥姆霍兹线圈设计 |
| 2.2.2 线圈驱动单元设计 |
| 2.2.3 磁场采集单元设计 |
| 2.3 磁场外置型细胞培养系统设计 |
| 2.3.1 三维亥姆霍兹线圈设计 |
| 2.3.2 细胞培养环境的构建 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 极低频交变磁场细胞培养系统性能测试及其生物效应分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 极低频交变磁场细胞培养系统性能测试 |
| 3.2.1 改进型亥姆霍兹线圈测试 |
| 3.2.2 三维亥姆霍兹线圈测试 |
| 3.3 实验材料及方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 实验材料与试剂 |
| 3.3.3 MTT细胞存活率检测法 |
| 3.3.4 细胞克隆形成实验 |
| 3.4 极低频交变磁场抑制肿瘤细胞增殖的影响因素分析 |
| 3.4.1 照射方向对细胞增殖的影响 |
| 3.4.2 磁场强度对细胞增殖的影响 |
| 3.4.3 磁场频率对细胞增殖的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 极低频交变磁场对乳腺癌细胞生物效应的蛋白组学分析 |
| 4.1 蛋白组学技术 |
| 4.1.1 蛋白质、蛋白质组和蛋白质组学 |
| 4.1.2 基于质谱法的蛋白质组学 |
| 4.1.3 定量蛋白组学 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 液相色谱-质谱联用法 |
| 4.2.2 生物信息学分析方法 |
| 4.2.3 免疫印迹法 |
| 4.2.4 流式细胞术检测细胞的凋亡率与细胞周期 |
| 4.3 磁场照射对乳腺癌细胞蛋白质组的影响 |
| 4.3.1 基于质谱法的蛋白样品鉴定总览 |
| 4.3.2 差异表达蛋白(DEPs)的筛选 |
| 4.3.3 差异表达蛋白的功能分类 |
| 4.3.4 差异表达蛋白功能富集分析 |
| 4.3.5 差异表达蛋白的免疫印迹及实验验证 |
| 4.4 结果分析与讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 极低频交变磁场诱导乳腺癌细胞凋亡的机制研究 |
| 5.1 细胞凋亡 |
| 5.1.1 凋亡的主要信号通路 |
| 5.1.2 凋亡的负调控因子 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料与试剂 |
| 5.2.2 细胞培养 |
| 5.2.3 DAPI细胞核染色 |
| 5.2.4 细胞内活性氧(ROS)测定 |
| 5.2.5 统计学分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 极低频交变磁场诱导乳腺癌细胞凋亡 |
| 5.3.2 极低频交变磁场引起乳腺癌细胞G2-M期周期阻滞 |
| 5.3.3 极低频交变磁场诱导细胞凋亡与活性氧的关系 |
| 5.3.4 GSK-3β在乳腺癌细胞凋亡中的作用 |
| 5.4 结果分析与讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 本文创新点 |
| 6.3 后续工作进展 |
| 参考文献 |
| 作者简介及攻读博士期间科研成果 |
| 致谢 |
（4）1-（4-取代苯基）-2-乙基咪唑衍生物的合成及抗肿瘤活性、作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 肿瘤 |
| 1.1.1 致癌因素 |
| 1.1.2 肿瘤的治疗方法 |
| 1.2 肿瘤细胞凋亡 |
| 1.2.1 肿瘤细胞凋亡机制 |
| 1.2.2 与肿瘤细胞凋亡相关的主要基因蛋白 |
| 1.3 咪唑类化合物的研究进展 |
| 1.3.1 咪唑类化合物的抗肿瘤活性研究进展 |
| 1.3.2 咪唑类化合物的其他生物活性研究进展 |
| 1.4 目的与意义 |
| 2 1-(4-取代苯基)-2-乙基咪唑衍生物的设计 |
| 2.1 先导化合物的发现 |
| 2.2 1-(4-取代苯基)-2-乙基咪唑衍生物的设计 |
| 2.3 先导化合物分子对接模拟 |
| 2.4 技术路线 |
| 3 药物合成与鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 仪器设备 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 中间体2-乙基-1-(4-硝基苯)-1H-咪唑(1)的合成 |
| 3.3.2 中间体2-乙基-1-(4-苯胺)-1H-咪唑(2)的合成 |
| 3.3.3 中间体3-(4-(2-乙基-1H-咪唑-1-基)苯基氨基甲酰基)丙酸(3)的合成 |
| 3.3.4 目标化合物(4a-4s)合成的一般程序 |
| 3.3.5 单晶的制备 |
| 3.4 结果讨论与分析 |
| 3.4.1 缩合反应条件筛选 |
| 3.4.2 单晶结果分析 |
| 3.4.3 波谱分析 |
| 4 抗肿瘤活性筛选 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞株的来源 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 试剂配制 |
| 4.2 仪器设备 |
| 4.3 实验内容 |
| 4.3.1 MTT细胞毒性检测 |
| 4.3.2 细胞核红蓝双染实验 |
| 4.3.3 蛋白免疫印迹实验 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 MTT细胞毒性结果分析 |
| 4.4.2 细胞核红蓝双染结果分析 |
| 4.4.3 蛋白免疫印记结果分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 个人情况 |
| 教育背景 |
| 科研经历 |
| 在学期间发表论文 |
（5）高压氧对化学性缺氧肺腺癌A549细胞生物学行为的影响及其机制的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要设备与仪器 |
| 2.2 药物 |
| 2.3 细胞株及其培养 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 高压氧处理 |
| 2.6 检测高压氧处理后培养基氧分压 |
| 2.7 MTT法检测A549细胞活力 |
| 2.8 CCK-8检测A549细胞增殖情况 |
| 2.9 蛋白印迹实验(Western blot)法检测CoCl2对A549细胞中HIF-1α蛋白表达的影响 |
| 2.10 LDH活性检测 |
| 2.11 细胞划痕实验 |
| 2.12 细胞侵袭分析 |
| 2.13 附着与分离实验 |
| 2.14 Hoechst33258染色检测肺腺癌A549细胞凋亡 |
| 2.15 蛋白印迹实验(Western blot)法检测凋亡相关蛋白表达水平、EMT标记蛋白、MLCK、MMP-9、GRP78、CHOP、P53的表达以及JNK、ERK和P38磷酸化水平的改变 |
| 2.16 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 CoCl_2对肺腺癌A549细胞活力的影响 |
| 3.2 CoCl_2对肺腺癌A549细胞增殖的影响 |
| 3.3 CoCl_2对肺腺癌A549细胞HIF-1α表达的影响 |
| 3.4 高压氧治疗干预后,对肺腺癌A549细胞氧含量影响 |
| 3.5 HBO治疗可降低缺氧所致肺腺癌A549细胞LDH活性的增加 |
| 3.6 CoCl_2处理及高压氧联合治疗后,肺腺癌A549细胞迁移能力的变化 |
| 3.7 CoCl_2处理及高压氧联合治疗后,对肺癌A549细胞侵袭能力的变化 |
| 3.8 CoCl_2处理及高压氧治疗后,对肺腺癌A549细胞附着和分离能力的变化情况 |
| 3.9 高压氧诱导肺腺癌A549细胞的细胞凋亡 |
| 3.10 CoCl_2处理及高压氧联合治疗后,肺腺癌A549细胞凋亡相关蛋白的变化 |
| 3.11 CoCl_2处理及高压氧治疗后,对于肺腺癌A549细胞上皮间充质转换相关蛋白的变化 |
| 3.12 CoCl_2处理及高压氧联合治疗后,肺腺癌A549细胞MLCK的变化 |
| 3.13 CoCl_2处理及高压氧联合治疗后,对肺腺癌A549迁移相关蛋白MMP-9表达的影响 |
| 3.14 CoCl_2处理及高压氧联合治疗后,对肺腺癌A549细胞GRP78、CHOP表达的的影响 |
| 3.15 CoCl_2处理及高压氧联合治疗,肺癌A549中p53蛋白表达的变化 |
| 3.16 CoCl_2处理及高压氧联合治疗后,对肺腺癌A549 MAPK相关蛋白ERK、p38、JNK的磷酸化水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 氯化钴(CoCl_2)成功诱导建立肺腺癌A549细胞缺氧模型、缺氧细胞HIF-1α的表达显着增加、过度缺氧可致细胞活力及增殖能力下降 |
| 4.2 高压氧治疗可降低缺氧所致肺腺癌A549细胞LDH活性的增加 |
| 4.3 CoCl_2引起缺氧增加肺腺癌A549细胞的迁移、侵袭强度,高压氧治疗可以抑制 |
| 4.4 CoCl_2诱导缺氧及高压氧联合CoCl_2对肺癌A549上皮间充质转换相关蛋白的影响 |
| 4.5 CoCl_2诱导缺氧以及同时高压氧干预,对肺腺癌A549凋亡及相关蛋白的影响 |
| 4.6 .CoCl_2诱导缺氧及高压氧干预对肺癌A549细胞GRP78、CHOP的影响 |
| 4.7 高压氧治疗增加CoCl_2诱导肺腺癌A549细胞p53蛋白 |
| 4.8 .高压氧可以降低缺氧诱导A549 细胞中ERK、p38的磷酸化,提高JNK的磷酸化水平 |
| 5 结论 |
| 5.1 氯化钴(CoCl_2)诱导肺腺癌A549细胞低氧 |
| 5.2 缺氧肺腺癌A549细胞的生物学行为,可以被高压氧治疗抑制,从而发挥高压氧抗肿瘤作用 |
| 6 论文的创新点及不足 |
| 7 对本课题的进一步设想 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 缺氧、缺氧诱导因子与癌症关系研究进展 |
| 参考文献 |
（6）山核桃萜类醌的生物合成途径及其成分胡桃醌抑制Ishikawa癌细胞增殖的分子机理（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 山核桃 |
| 1.1.1 山核桃概述 |
| 1.1.2 山核桃主要成分及功能 |
| 1.1.3 山核桃青皮中主要活性成分的抗癌机制 |
| 1.2 多组学探究植物生长机制 |
| 1.2.1 转录组学与植物生长 |
| 1.2.2 代谢组学与植物生长 |
| 1.3 子宫内膜癌 |
| 1.3.1 子宫内膜癌的现状 |
| 1.3.2 子宫内膜癌的发展机制 |
| 1.3.3 子宫内膜癌的治疗措施 |
| 1.3.4 子宫内膜癌细胞系研究的选择 |
| 1.4 多组学探究癌症机制 |
| 1.4.1 miRNA组学探究癌症机制 |
| 1.4.2 mRNA组学探究癌症机制 |
| 1.5 课题研究背景、意义及主要内容 |
| 1.5.1 课题研究背景、意义 |
| 1.5.2 课题研究主要内容 |
| 1.5.3 研究技术路线 |
| 第二章 不同发育期山核桃的转录组与代谢组分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 样本采集 |
| 2.1.2 实验试剂和仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 不同发育期山核桃仁总RNA的提取 |
| 2.2.2 RNA纯度及浓度检测 |
| 2.2.3 山核桃仁文库的制备和测序建立 |
| 2.2.4 生物信息学分析 |
| 2.2.5 基因功能注释和分类 |
| 2.2.6 基因总体表达水平分析 |
| 2.2.7 差异基因表达分析 |
| 2.2.8 代谢组学实验流程分析 |
| 2.2.9 代谢物提取 |
| 2.2.10 液相参数 |
| 2.2.11 质谱参数 |
| 2.2.12 代谢组学信息分析流程 |
| 2.2.13 代谢组学信息分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 山核桃仁转录组测序质控分析 |
| 2.3.2 不同发育期山核桃仁基因组装结果分析 |
| 2.3.3 基因功能注释和分类 |
| 2.3.4 基因总体表达水平分析 |
| 2.3.5 不同发育期差异基因表达分析 |
| 2.3.6 代谢物检测 |
| 2.3.7 代谢物检测质控 |
| 2.3.8 代谢物鉴定 |
| 2.3.9 不同发育期山核桃仁代谢物定量分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于转录组学与代谢组联合分析山核桃萜类化合物合成规律 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 萜类化合物的提取 |
| 3.2.2 RNA提取和Illumine测序 |
| 3.2.3 山核桃基因组装,基因注释以及功能分析 |
| 3.2.4 脂质代谢差异表达基因的KEGG和GO分析 |
| 3.2.5 RNA提取 |
| 3.2.6 反转录 |
| 3.2.7 定量PCR实验 |
| 3.2.8 代谢物提取与分析 |
| 3.2.9 关键萜类代谢组学的靶向测定 |
| 3.2.10 代谢物和转录物的综合分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 萜类化合物含量的动态变化 |
| 3.3.2 萜类化合物代谢差异表达基因的KEGG和GO分析 |
| 3.3.3 萜类化合物生成 |
| 3.3.4 山核桃发育过程中的关键萜类代谢产物 |
| 3.3.5 代谢组与转录组共表达网络分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 山核桃青皮胡桃醌的制备及其Ishikawa细胞增殖的抑制作用 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞株 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 山核桃青皮提取 |
| 4.2.2 纯化样品检测鉴定 |
| 4.2.3 细胞培养 |
| 4.2.4 MTT细胞实验 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 胡桃醌的提取 |
| 4.3.2 胡桃醌纯化及检测 |
| 4.3.3 胡桃醌对Ishikawa细胞增殖的抑制作用 |
| 4.3.4 胡桃醌对Ishikawa细胞形态的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 转录组学与miRNA联合分析胡桃醌对Ishikawa细胞抑制作用的机制 |
| 5.1 实验材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料与试剂 |
| 5.1.2 细胞处理 |
| 5.1.3 制备文库和测序 |
| 5.1.4 测序信息分析 |
| 5.1.5 mRNA和 miRNA的提取 |
| 5.1.6 mRNA和 miRNA的反转录 |
| 5.1.7 mRNA和 miRNA的荧光定量PCR检测 |
| 5.1.8 功能和途径富集分析 |
| 5.1.9 PPI网络建立及模块分析 |
| 5.1.10 差异表达miRNA靶基因预测 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 总RNA质检分析 |
| 5.2.2 差异表达miRNA和mRNA分析 |
| 5.2.3 qRT-PCR检测差异表达miRNAs和差异表达基因的表达 |
| 5.2.4 差异表达基因的GO与 KEGG富集分析 |
| 5.2.5 PPI网络构建及模块分析 |
| 5.2.6 差异表达miRNA的靶基因预测 |
| 5.3 本章小结 |
| 第六章 胡桃醌诱导Ishikawa细胞凋亡及其机制 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 实验试剂 |
| 6.1.2 实验仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 细胞培养 |
| 6.2.2 胡桃醌处理Ishikawa细胞 |
| 6.2.3 细胞周期检测 |
| 6.2.4 细胞凋亡荧光 Hoechst 33342/PI 双染 |
| 6.2.5 Annexin V-Alexa Fluor 488/PI 凋亡检测 |
| 6.2.6 活性氧检测 |
| 6.2.7 mRNA提取和定量PCR |
| 6.2.8 蛋白提取和 Western blot |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 胡桃醌对Ishikawa细胞周期的影响 |
| 6.3.2 胡桃醌对细胞凋亡形态学的影响 |
| 6.3.3 胡桃醌对Ishikawa细胞凋亡的影响 |
| 6.3.4 胡桃醌对线粒体途径影响 |
| 6.3.5 胡桃醌对死亡受体通路相关基因表达的影响 |
| 6.3.6 胡桃醌对细胞凋亡相关基因表达的影响 |
| 6.3.7 胡桃醌诱导ROS介导的Ishikawa细胞凋亡 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 胡桃醌作为诱导剂诱导Ishikawa细胞铁自噬 |
| 7.1 实验材料 |
| 7.1.1 实验试剂 |
| 7.1.2 实验仪器 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 细胞培养 |
| 7.2.2 细胞死亡检测 |
| 7.2.3 铁含量测定 |
| 7.2.4 丙二醛(MDA)测定 |
| 7.2.5 谷胱甘肽的测定 |
| 7.2.6 透射电镜观察 |
| 7.2.7 免疫荧光检测 |
| 7.2.8 细胞集落形成实验 |
| 7.2.9 细胞迁袭 |
| 7.2.10 转录组学分析 |
| 7.2.11 RNA提取和定量PCR实验 |
| 7.2.12 Western Blot实验 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 胡桃醌诱导Ishikawa细胞死亡 |
| 7.3.2 胡桃醌诱导Ishikawa细胞铁死亡 |
| 7.3.3 透射电镜显示胡桃醌诱导的铁自噬 |
| 7.3.4 胡桃醌诱导Ishikawa细胞铁自噬机制 |
| 7.3.5 胡桃醌抑制Ishikawa细胞的迁移和侵袭 |
| 7.3.6 胡桃醌诱导Ishikawa细胞内质网应激 |
| 7.4 本章小结 |
| 第八章 结论与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 创新点 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的学术活动及成果情况 |
（7）PAI-1通过PTEN/PI3K/AKT信号通路引起肝癌失巢凋亡抵抗的相关研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 PAI-1在肝癌中的临床意义 |
| 1.实验材料及方法 |
| 1.1 临床资料 |
| 1.2 实验仪器及试剂 |
| 1.3 S-P(streptavidin-perosidase)法免疫组织化学技术 |
| 1.4 IHC切片定性及定量方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 生物信息学分析PAI-1在肝癌组织中m RNA水平表达 |
| 2.2 生物信息学分析PAI-1在肝癌患者预后 |
| 2.3 IHC检测PAI-1在临床HCC患者中的表达情况及生存预后 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第三章 PAI-1在肝癌细胞系中的作用及介导anoikis现象的研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 1.4 主要试剂溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 构建悬浮细胞模型 |
| 2.2 细胞培养、传代、冻存 |
| 2.3 RT-PCR(适时定量聚合酶链扩增反应) |
| 2.4 Western Blot(蛋白印迹)检测 |
| 2.5 RNAi慢病毒构建与过表达慢病毒构建 |
| 2.6 流式Annexin V-FITC/PI法检测HCC细胞系anoikis表型 |
| 2.7 划痕实验验证PAI-1在HCC细胞系中的增殖、迁移表型 |
| 2.8 Transwell实验验证PAI-1在HCC细胞系中的浸润、转移表型 |
| 2.9 CCK8测定PAI-1在HCC细胞中增殖表型以及筛选PAI-1抑制剂IC50 |
| 2.10 统计学方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 PAI-1在肝癌细胞系中表达水平 |
| 3.2 验证待遴选肝癌细胞系悬浮表型 |
| 3.3 PAI-1在遴选细胞系中敲减/过表达细胞悬浮后蛋白表达水平 |
| 3.4 PAI-1调控HCC细胞系的anoikis表型 |
| 3.5 PAI-1调控HCC细胞的浸润转移表型 |
| 3.6 PAI-1抑制剂回复HCC细胞的浸润转移表型 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第四章 PAI-1通过PTEN/PI3K/AKT信号通路调控HCC细胞AR及生物信息学工具预测PAI-1调控相关蛋白的研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 1.4 主要试剂溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 PAI-1通过激活PTEN调控PI3K/AKT信号通路来调控HCC细胞AR表型 |
| 3.2 PTEN特异性抑制剂(bpV(HOpic))回复PAI-1调控PTEN蛋白来激活/失活PI3K/AKT信号通路来调控HCC细胞AR表型 |
| 3.3 生物信息学工具预测PAI-1在HCC调控互作蛋白 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第五章 体内验证PAI-1调控HCC细胞AR表型 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验器械 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 动物蛋白提取 |
| 2.2 构建肝癌细胞肝内转移模型及标本处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 构建PAI-1调控体内肝癌细胞转移瘤(cell-line-derived xenograft,CDX)模型 |
| 3.2 体内验证PAI-1表达影响肝癌细胞转移瘤(cell-line-derived xenograft,CDX)模型的小鼠生存周期 |
| 3.3 体内验证PAI-1通过PTEN/PI3K/AKT信号通路调控HCC浸润转移表型 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 PAI-1在肿瘤浸润转移中作用的研究 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（8）ILK对食管鳞癌恶性表型的影响及其功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 ILK表达与消化系统恶性肿瘤临床表型及预后相关性的Meta分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 检索数据库 |
| 1.2 文献纳入和排除标准 |
| 1.3 文献筛选和资料提取 |
| 1.4 研究方法学质量评价 |
| 1.5 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 ILK对食管鳞癌细胞恶性表型的功能影响 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 细胞系及来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 ILK对食管鳞癌体内成瘤性的影响及生物信息学分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验动物来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 整合素连接激酶在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文 导师评阅表 |
（9）百里酚通过Wnt/β-catenin信号通路抗结直肠癌作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语索引 |
| 第一章 绪论 |
| 1 结直肠癌的发病率和死亡率 |
| 2 百里酚在肿瘤中的研究进展 |
| 2.1 百里酚抑制肿瘤细胞增殖 |
| 2.2 百里酚诱导肿瘤细胞凋亡 |
| 2.3 百里酚影响细胞周期进展 |
| 2.4 百里酚在肿瘤转移中的抑制作用 |
| 2.5 百里酚增加肿瘤组织放疗敏感性 |
| 3 Wnt/β-catenin信号通路生物学功能 |
| 3.1 Wnt/β-catenin信号通路与结直肠癌 |
| 3.2 Wnt/β-catenin与 NF-κB信号通路 |
| 3.3 Wnt/β-catenin与 PI3K/Akt/m TOR信号通路 |
| 3.4 Wnt/β-catenin通路调节EMT |
| 4 总结 |
| 5 本课题的研究目的及意义 |
| 6 技术路线图 |
| 第二章 百里酚提取及体外对人结直肠癌HCT116和Lovo细胞增殖抑制和凋亡诱导作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞和主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器与耗材 |
| 2.1.3 植物样品 |
| 2.1.4 常用溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 百里酚提取 |
| 2.2.2 细胞复苏、培养、冻存 |
| 2.2.3 药物配制 |
| 2.2.4 CCK-8 法检测百里酚对HCT116、Lovo细胞增殖和FHC细胞活力的影响 |
| 2.2.5 细胞克隆形成实验 |
| 2.2.6 百里酚对HCT116和Lovo细胞凋亡的影响 |
| 2.2.7 百里酚对结直肠癌HCT116和Lovo细胞周期的干预作用 |
| 2.2.8 qRT-PCR检测百里酚处理后人结直肠癌HCT116、Lovo细胞中凋亡相关基因Bcl-2和Bax m RNA表达的变化 |
| 2.2.9 Western blot检测百里酚处理对人结直肠癌HCT116、Lovo细胞中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP表 |
| 2.2.10 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 百里酚结构鉴定 |
| 3.2 百里酚对结直肠癌细胞增殖的影响 |
| 3.2.1 百里酚对HCT116、Lovo细胞增殖的抑制作用 |
| 3.2.2 百里酚对FHC的细胞毒性作用 |
| 3.3 百里酚对HCT116和Lovo细胞克隆形成能力的影响 |
| 3.4 Hoechst33258 检测百里酚对HCT116和Lovo细胞凋亡的影响 |
| 3.5 百里酚对结直肠癌HCT116和Lovo细胞的凋亡诱导效应 |
| 3.5.1 百里酚对HCT116细胞凋亡的影响 |
| 3.5.2 百里酚对Lovo细胞凋亡的影响 |
| 3.6 百里酚对结直肠癌HCT116和Lovo细胞周期的影响 |
| 3.6.1 百里酚对HCT116细胞周期的影响 |
| 3.6.2 百里酚对Lovo细胞周期的影响 |
| 3.7 百里酚对结直肠癌HCT116和Lovo细胞中凋亡相关分子m RNA表达的影响 |
| 3.8 百里酚对结直肠癌HCT116和Lovo细胞中凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 百里酚体外抑制人结直肠癌HCT116、Lovo细胞转移作用及机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞和主要试剂 |
| 2.1.2 主要实验仪器与耗材 |
| 2.1.3 相关试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞的冻存、复苏、传代方法 |
| 2.2.2 不同浓度的百里酚对人结直肠癌HCT116、Lovo细胞迁移能力的影响 |
| 2.2.3 不同浓度的百里酚对人结直肠癌HCT116、Lovo细胞侵袭能力的影响 |
| 2.2.4 Western blot检测百里酚对人结直肠癌HCT116、Lovo细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、snail蛋白表达的变化 |
| 2.2.5 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 百里酚对结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响 |
| 3.1.1 百里酚对HCT116细胞迁移能力的影响 |
| 3.1.2 百里酚对Lovo细胞迁移能力的影响 |
| 3.1.3 百里酚对HCT116细胞侵袭能力的影响 |
| 3.1.4 百里酚对Lovo细胞侵袭能力的影响 |
| 3.2 百里酚对人结直肠癌HCT116和Lovo细胞中EMT相关蛋白表达的影响 |
| 3.2.1 百里酚对人结直肠癌HCT116 细胞中EMT的影响 |
| 3.2.2 百里酚对人结直肠癌Lovo细胞中EMT关键蛋白的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 百里酚通过抑制结直肠癌细胞内wnt/β-catenin信号通路的激活抑制细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验细胞和主要试剂 |
| 2.2 主要仪器与耗材 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 主要试剂的配制 |
| 2.3.2 质粒转化 |
| 2.3.3 菌种的活化 |
| 2.3.4 扩大培养 |
| 2.3.5 质粒的抽提 |
| 2.3.6 质粒转染和转染后细胞功能试验 |
| 2.3.7 RNA干扰 |
| 2.3.8 CCK-8法检测β-catenin在百里酚抑制结直肠癌细胞增殖中的作用 |
| 2.3.9 Transwell检测β-catenin在百里酚结直肠癌细胞迁移和侵袭能力抑制中的作用 |
| 2.3.10 Western blot |
| 2.3.11 qRT-PCR |
| 2.3.12 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 百里酚对结直肠癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路活性的影响 |
| 3.1.1 百里酚处理后结直肠癌细胞中β-catenin、C-Myc、cyclin D1、survivin基因m RNA表达的变化 |
| 3.1.2 百里酚对结直肠癌HCT116和Lovo细胞中β-catenin、c-myc、cyclin D1、survivin蛋白表达的影响 |
| 3.2 转染结直肠癌HCT116和Lovo细胞中β-catenin的蛋白表达 |
| 3.2.1 β-catenin-siRNA对HCT116及Lovo中β-catenin 蛋白表达的影响 |
| 3.2.2 pc DNA3.1-β-catenin过表达质粒转染对HCT116及Lovo中β-catenin蛋白表达的影响 |
| 3.3 β-catenin在百里酚抑制结直肠癌细胞生长中的作用 |
| 3.3.1 β-catenin过表达降低百里酚对结直肠癌细胞生长的抑制作用 |
| 3.3.2 沉默β-catenin能够增加百里酚对结直肠癌细胞生长抑制作用 |
| 3.4 β-catenin在百里酚抑制结直肠癌细胞转移中的作用 |
| 3.4.1 β-catenin过表达减弱百里酚对结直肠癌细胞迁移和侵袭的抑制作用 |
| 3.4.2 沉默β-catenin能够增加百里酚对结直肠癌细胞迁移和侵袭的抑制作用 |
| 3.5 百里酚通过抑制β-catenin信号通路诱导细胞凋亡和抑制转移 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 百里酚对人结直肠癌细胞裸鼠体内成瘤及转移的影响及作用机制的研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物和药物 |
| 2.2 实验主要试剂 |
| 2.3 主要试剂的配制 |
| 2.4 主要仪器与耗材 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 裸鼠皮下移植瘤模型的建立、分组及给药方法 |
| 3.3 建立裸鼠尾静脉转移模型 |
| 3.4 动物组织石蜡切片及HE染色 |
| 3.5 qRT-PCR方法检测瘤体组织中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、β-catenin、c-myc、cyclin D1、survivin、Bcl-2及Bax基因mRNA的表达 |
| 3.6 Western blot检测瘤体组织中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、β-catenin、c-myc、cyclin D1、survivin、Bcl-2及Bax蛋白的表达情况 |
| 3.7 免疫组织化学(IHC)检测不同处理组裸鼠移植瘤中ki-67的表达情况 |
| 3.8 结肠癌细胞HCT116 裸鼠移植瘤TUNEL凋亡检测 |
| 3.9 qRT-PCR方法检测转移肺组织中E-cadherin、Vimentin、Snail及β-catenin m RNA的表达 |
| 3.10 免疫组织化学(IHC)检测转移肺组织中β-catenin、Vimentin及E-cadherin的表达情况 |
| 3.11 统计学分析方法 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 百里酚抑制裸鼠HCT116移植瘤的生长 |
| 4.2 百里酚对结肠癌细胞HCT116裸鼠移植瘤组织形态结构的影响 |
| 4.3 百里酚对结肠癌HCT116细胞裸鼠移植瘤组织中Ki-67蛋白表达的影响 |
| 4.4 TUNEL染色检测各组移植瘤组织中细胞凋亡情况 |
| 4.5 百里酚对裸鼠移植瘤组织中增殖、转移相关蛋白表达的影响 |
| 4.6 裸鼠体内血行播散脏器转移观察 |
| 4.7 百里酚对HCT116 细胞肺转移瘤组织中E-cadherin、Vimentin、Snail、β-catenin m RNA表达的影响 |
| 4.8 百里酚对肺转移瘤组织中上皮性标记E-cadherin蛋白表达的影响 |
| 4.9 百里酚对肺转移瘤组织中间质性标记Vimentin蛋白表达的影响 |
| 4.10 百里酚对肺转移瘤组织中β-catenin蛋白表达的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第六章 结论、创新点、存在的问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A:攻读学位期间发表论文和国际会议论文摘要 |
| 附录 B:攻读学位期间获奖情况 |
（10）靶向肿瘤凋亡相关靶标的先导化合物发现及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 靶向细胞凋亡相关靶标蛋白及药物研发进展 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 细胞凋亡的两种基本途径 |
| 1.1.1.1 外部途径:死亡受体途径 |
| 1.1.1.2 内部途径:线粒体途径 |
| 1.1.1.3 细胞凋亡的生物学意义 |
| 1.1.2 细胞凋亡与肿瘤发生发展的关系 |
| 1.2 调控肿瘤凋亡信号通路的重要靶标:BCL-2和IAP家族蛋白 |
| 1.2.1 BCL-2 家族蛋白的生物学功能及小分子抑制剂研究 |
| 1.2.1.1 BCL-2 家族蛋白的生物学功能 |
| 1.2.1.2 BCL-2 家族蛋白的小分子抑制剂研究进展 |
| 1.2.2 IAP家族蛋白的生物学功能及小分子抑制剂研究 |
| 1.2.2.1 IAP家族蛋白的生物学功能 |
| 1.2.2.2 靶向IAP家族蛋白的小分子抑制剂 |
| 1.3 调控肿瘤细胞凋亡的孤儿核受体:以Nur77 为例 |
| 1.3.1 Nur77 诱导细胞凋亡的具体机制 |
| 1.3.2 靶向Nur77 诱导凋亡的小分子 |
| 1.4 调控肿瘤细胞凋亡新思路:直接靶向活性氧含量变化相关蛋白 |
| 1.5 总结与展望 |
| 第二章 细胞凋亡抑制蛋白1的构象变化及天然产物抑制剂发现 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 野型cIAP1 蛋白和E447K突变型cIAP1 蛋白的分子动力学模拟 |
| 2.2.2 分子动力学模拟的轨迹分析 |
| 2.2.3 野型cIAP1及D303A突变型cIAP1 蛋白的质粒构建与表达纯化 |
| 2.2.4 非变性凝胶电泳实验 |
| 2.2.5 小分子诱导蛋白热迁移变化的高通量筛选 |
| 2.2.6 微量热泳动检测小分子与cIAP1 蛋白的结合强度 |
| 2.2.7 细胞增殖实验 |
| 2.2.8 高内涵细胞凋亡形态检测 |
| 2.2.9 流式细胞凋亡检测与分析 |
| 2.2.10 蛋白质免疫印迹实验 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 野型cIAP1 蛋白的分子动力学模拟分析 |
| 2.3.2 E447K突变型cIAP1 蛋白的分子动力学模拟 |
| 2.3.3 野型cIAP1及E447K突变型cIAP1 蛋白构象变化的机理分析 |
| 2.3.4 野型cIAP1及E447K突变型cIAP1 蛋白构象变化最显着区域的动态二级结构分析 |
| 2.3.5 新型D303A突变型cIAP1 蛋白的设计和非变性凝胶实验分析 |
| 2.3.6 靶向cIAP1 的天然产物小分子筛选 |
| 2.3.7 MST检测苗头天然产物小分子与cIAP1 的结合亲和力 |
| 2.3.8 细胞增殖抑制实验 |
| 2.3.9 流式细胞凋亡分析 |
| 2.3.10 凋亡的细胞核形态分析 |
| 2.3.11 细胞水平诱导cIAP1 降解及凋亡相关蛋白调控变化 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 Nur77 蛋白的分子动力学模拟及天然产物小分子发现 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 研究方法 |
| 3.2.1 Nur77 蛋白及复合物的分子动力学模拟 |
| 3.2.2 分子动力学模拟轨迹的数据分析及作图 |
| 3.2.3 Nur77 质粒构建、蛋白表达及纯化 |
| 3.2.4 小分子作用于Nur77 的蛋白热迁移实验 |
| 3.2.5 小分子作用于Nur77 的微量热泳动分析 |
| 3.2.6 小分子作用于Nur77 的表面等离子共振实验 |
| 3.2.7 细胞增殖实验 |
| 3.2.8 高内涵细胞凋亡形态检测 |
| 3.2.9 流式细胞仪细胞凋亡分析 |
| 3.2.10 线粒体膜电位检测和线粒体活性氧检测 |
| 3.2.11 转录组学样品准备及数据的采集分析 |
| 3.2.12 定量蛋白组学样品准备及分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 Nur77 蛋白及复合物三组体系分子动力学轨迹RMSD分析 |
| 3.3.2 Nur77 蛋白及复合物三组体系分子动力学轨迹RMSF分析 |
| 3.3.3 Nur77 蛋白及复合物三组体系的DSSP分析 |
| 3.3.4 Nur77 蛋白及复合物三组分子动力学模拟体系的结构聚类分析 |
| 3.3.5 靶向Nur77 的天然产物小分子筛选 |
| 3.3.6 去甲氧基姜黄素和宝霍苷I靶向Nur77 的表面等离子共振结合分析 |
| 3.3.7 去甲氧基姜黄素和宝霍苷I作用于Nur77 的微量热泳动结合分析 |
| 3.3.8 去甲氧基姜黄素和宝霍苷I常见肿瘤细胞系增殖抑制分析 |
| 3.3.9 去甲氧基姜黄素和宝霍苷I细胞凋亡的流式分析 |
| 3.3.10 去甲氧基姜黄素和宝霍苷I诱导细胞核形态变化分析 |
| 3.3.11 线粒体膜电位和线粒体活性氧检测与分析 |
| 3.3.12 转录组学差异表达基因及KEGG通路分析 |
| 3.3.13 去甲氧基姜黄素和宝霍苷I的差异蛋白组学数据分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 活性氧调控关键蛋白过氧化物氧化还原酶1的先导化合物发现与机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 研究方法 |
| 4.2.1 PRDX1 蛋白的表达纯化 |
| 4.2.2 新型PRDX1 抑制剂的共价虚拟筛选及活性确证 |
| 4.2.3 PRDX1 蛋白结晶条件的筛选与优化 |
| 4.2.4 PRDX1 复合物晶体结构解析 |
| 4.2.5 SPR和 MST实验检测小分子的结合强度检测 |
| 4.2.6 细胞增殖及细胞凋亡检测 |
| 4.2.7 流式分化检测 |
| 4.2.8 细胞活性氧检测 |
| 4.2.9 转录组学测序数据的采集与分析 |
| 4.2.10 细胞凋亡调控通路分析 |
| 4.2.11 蛋白免疫印迹实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 新型PRDX1 抑制剂的发现及活性检测 |
| 4.3.2 PRDX1 蛋白结晶条件优化和复合物晶体结构解析 |
| 4.3.3 新型PRDX1 抑制剂的结合强度检测 |
| 4.3.4 小分子的细胞增殖抑制 |
| 4.3.5 NB4 细胞分化流式分析 |
| 4.3.6 细胞凋亡和活性氧检测 |
| 4.3.7 细胞凋亡通路和机制探索 |
| 4.3.8 小分子作用的转录组学数据分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 论文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
四、凋亡抑制蛋白研究进展（论文参考文献）
- [1]BRD4天然抑制剂3’，4’，7, 8-Tetrahydroxyflavone的发现及其抑制急性髓系白血病的机制研究[D]. 李姣. 南京中医药大学, 2021(02)
- [2]Stattic对表皮生长因子受体抑制介导的骨肉瘤生物学活性的影响[D]. 王生淋. 福建医科大学, 2021(02)
- [3]极低频交变磁场细胞培养系统及其生物效应研究[D]. 徐奡澍. 吉林大学, 2021(01)
- [4]1-（4-取代苯基）-2-乙基咪唑衍生物的合成及抗肿瘤活性、作用机制的研究[D]. 李振旺. 黑龙江八一农垦大学, 2021
- [5]高压氧对化学性缺氧肺腺癌A549细胞生物学行为的影响及其机制的研究[D]. 王勇生. 安徽医科大学, 2021(01)
- [6]山核桃萜类醌的生物合成途径及其成分胡桃醌抑制Ishikawa癌细胞增殖的分子机理[D]. 张圆圆. 合肥工业大学, 2021(02)
- [7]PAI-1通过PTEN/PI3K/AKT信号通路引起肝癌失巢凋亡抵抗的相关研究[D]. 陶鹏先. 兰州大学, 2021(09)
- [8]ILK对食管鳞癌恶性表型的影响及其功能研究[D]. 马晓丽. 新疆医科大学, 2021
- [9]百里酚通过Wnt/β-catenin信号通路抗结直肠癌作用研究[D]. 曾琼瑶. 昆明理工大学, 2020(05)
- [10]靶向肿瘤凋亡相关靶标的先导化合物发现及作用机制研究[D]. 徐珩. 中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所), 2020(07)