一、p53蛋白泛素化修饰的研究进展（论文文献综述）
张亮[1]（2021）在《线性泛素化信号通路调控胃癌恶性进展的机制研究》文中研究说明胃癌是一种致命的肿瘤疾病,在全世界范围内的总体生存率都较低,严重威胁着人类的健康。目前,胃癌是世界第五大癌症类型,已被确定为全球癌症死亡相关的主要原因之一。胃癌的发生是由宿主遗传、环境因素（如吸烟、饮酒、高盐等）和微生物因素（如幽门螺杆菌）等复杂相互作用的结果。这些现状表明,深入研究胃癌发生发展的分子机制对于胃癌的临床改善和预后具有重要意义。蛋白泛素化修饰参与调节多种细胞功能,包括靶向蛋白的降解、蛋白的膜转运、DNA损伤修复、信号转导等。线性泛素链作为近年来新发现的一种泛素链接方式,主要由泛素连接酶复合体（linear ubiquitin chain assembly complex,LUBAC）催化合成和去泛素化酶OTULIN特异性水解,处于两者共同调节的动态过程中。LUBAC复合体是目前已知的唯一能够催化合成线性泛素链的泛素连接酶。它主要由HOIP（HOIL1-interacting protein）,SHARPIN（SHANK associated RH domain-interacting protein）和HOIL1L（haem-oxidized IRP2 ubiquitin ligase 1L）三个分子组成。HOIP是LUBAC复合体的酶催化核心,SHARPIN和HOIL1对于HOIP的激活具有关键作用。已有研究表明,线性泛素化修饰可发生在NEMO、TNFR1和RIPK1等底物中,通过调节NF-κB和Wnt/β-catenin等信号通路,对固有免疫、炎症反应和血管生成等具有重要的作用。但是在肿瘤的发生发展中,线性泛素化修饰对胃癌生物学行为的影响目前尚不清楚。因此,从线性泛素化相关的蛋白入手,研究线性泛素化修饰如何调节胃癌的生物学行为,有助于揭示胃癌发生发展的新机制,具有重要的理论意义及潜在临床价值。有鉴于此,本文主要分两部分,分别研究了线性泛素化相关蛋白OTULIN及SHARPIN对胃癌恶性生物学行为的影响和机制。本文的研究内容和主要结果结论如下:第一部分去泛素化酶OTULIN对胃癌恶性生物学行为的影响及机制研究一、去泛素化酶OTULIN在胃癌组织中呈高表达1.去泛素化酶OTULIN在多个数据库的胃癌中表达增高;2.去泛素化酶OTULIN在胃癌组织中表达明显高于癌旁组织;二、去泛素化酶OTULIN对胃癌细胞增殖以及迁移和侵袭能力的影响1.去泛素化酶OTULIN促进胃癌细胞的增殖和成瘤;2.去泛素化酶OTULIN促进胃癌细胞的侵袭和迁移;3.OTULIN促胃癌细胞迁移侵袭依赖于其去泛素酶活性;三、识别与鉴定线性泛素化修饰的底物蛋白RACK11.Pull-down实验结合质谱分析,筛选出底物蛋白RACK1;2.免疫共沉淀实验证明RACK1蛋白存在线性泛素化修饰;四、OTULIN与RACK1相互作用,并与黏着斑激酶FAK形成复合体1.免疫荧光实验证实OTULIN和RACK1存在共定位;2.免疫共沉淀实验证明OTULIN、RACK1和FAK形成复合体;五、OTULIN调节RACK1对FAK的招募,影响胃癌细胞的粘附运动1.敲除OTULIN能够抑制FAK的磷酸化水平;2.OTLUIN能够促进RACK1对FAK的招募;3.OTULIN敲除的胃癌细胞粘附运动能力下降;第二部分SHARPIN对胃癌恶性生物学行为的影响及机制研究一、SHARPIN通过不依赖于线性泛素化的方式调节Wnt/β-catenin信号通路1.LUBAC和OTULIN参与Wnt/β-catenin信号通路的调节;2.SHARPIN与β-catenin相互作用参与Wnt/β-catenin信号通路的调节;二、SHARPIN促进胃癌的恶性生物学行为1.SHARPIN促进胃癌细胞的增殖、克隆形成和迁移侵袭;2.SHARPIN促进胃癌细胞皮下移植瘤的生长;三、SHARPIN通过与β-Trcp1竞争性结合β-catenin,而抑制β-catenin的泛素蛋白酶体降解1.SHARPIN抑制β-catenin的泛素化降解;2.SHARPIN与β-Trcp1竞争性结合β-catenin;3.SHARPIN与β-Trcp1可能竞争性结合β-catenin上的相同位点;四、过表达β-catenin回复SHARPIN敲低引起的胃癌细胞增殖抑制1.过表达β-catenin回复SHARPIN敲低导致的胃癌细胞增殖、克隆形成和迁移侵袭表型;2.过表达β-catenin回复SHARPIN敲低导致的皮下移植瘤的增殖抑制;五、SHARPIN在胃癌组织中高表达且提示预后不良,并与β-catenin表达呈正相关1.SHARPIN在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织;2.SHARPIN高表达的胃癌患者总生存期短,预后较差;3.胃癌组织中SHARPIN表达与β-catenin表达呈显着正相关;本研究的主要结论为:1.去线性泛素化酶OTULIN能够通过去除RACK1蛋白的线性泛素化修饰,增强RACK1与黏着斑激酶FAK的相互作用,进而促进胃癌的增殖和转移播散。2.线性泛素化相关蛋白SHARPIN通过与β-Trcp1竞争性结合β-catenin上的相同位点,从而抑制了β-Trcp1泛素化降解β-catenin,稳定其表达和向细胞核转位,促进下游癌基因c-myc、CD44等基因的表达,进而促进肿瘤的发生发展。本研究首次报道了线性泛素相关蛋白OTULIN和SHARPIN对胃癌恶性生物学行为的影响。我们发现了线性泛素化修饰的新底物蛋白RACK1,并初步阐明了去泛素化酶OTULIN通过调节RACK1影响胃癌细胞增殖和转移播散的分子机制,为研究线性泛素化修饰在肿瘤中的作用提供了新的理论基础。另外,我们也发现SHARPIN通过不依赖于线性泛素化修饰的方式调节Wnt/β-catenin信号通路的活性,从而促进胃癌的发生发展,揭示了SHARPIN的一种新功能和调节β-catenin的新方式。这些研究为探索胃癌发生发展的分子机制提供了新的研究方向,并可能成为潜在的改善胃癌患者治疗和预后的策略。
王五艺[2]（2021）在《PRDX2增加p53泛素化促进结直肠癌细胞增殖的机制研究》文中研究指明目的:研究PRDX2对结直肠癌细胞增殖的影响,阐明PRDX2和p53蛋白的关系,同时揭示PRDX2在p53蛋白转录后修饰的作用及其具体机制。方法:通过生物信息学方法及在线数据库的方式分析PRDX2在结直肠癌和癌旁组织中的表达差异。慢病毒转染结肠癌HCT116及LoVo细胞,将实验所用细胞分为NC和shPRDX2两组。用CCK-8,细胞周期,克隆形成实验检测PRDX2对结直肠癌细胞体外增殖的影响。Western blot,免疫荧光,RT-PCR,检测PRDX2和p53两者在m RNA及蛋白水平的关系。免疫共沉淀,GST-pulldown,质粒共转染,检测PRDX2和RPL4之间的蛋白互作,阐明PRDX2对p53泛素化具体机制。裸鼠皮下成瘤实验检测PRDX2在体内对结肠癌细胞增殖的影响。结果:PRDX2在结直肠癌中表达明显高于对应的癌旁组织。PRDX2高表达者较低表达的总体生存时间更短。沉默PRDX2可以抑制HCT116及Lo Vo细胞的增殖,阻滞细胞周期进展,同时细胞克隆形成较对照组小同时克隆数目更少。沉默PRDX2可以增加p53蛋白的半衰期,促进p53蛋白水平升高。其机制是PRDX2竞争性结合RPL4蛋白,抑制了RPL4蛋白和MDM2蛋白的结合,抑制了RPL4-MDM2通路对p53的调控,使p53泛素化水平增加,最终降解增加。结论:PRDX2可以增加p53蛋白的泛素化降解,从而促进了HCT116及LoVo细胞的体内外增殖。
朱蕊[3]（2021）在《转录因子Snail的去泛素化调节在食管鳞状细胞癌发生发展中的作用及机制研究》文中指出在肿瘤发生与转移的过程中,上皮间质转化过程发挥着关键性的作用,它赋予肿瘤上皮细胞某些间质样细胞的特征,从而使得肿瘤细胞具有更强的侵袭和迁移能力。Snail是上皮间质转化过程中发挥重要作用的转录因子,在肿瘤的进展和转移中起着重要的作用。因此,Snail的表达水平严格精密的受到转录、翻译和翻译后水平等多方面的调控。Snail在细胞中半衰期较短,由泛素-蛋白酶体系统介导迅速降解,而该过程受蛋白质泛素化修饰可逆调控。细胞中调节Snail多聚泛素化与蛋白稳定性主要依赖于E3泛素连接酶和去泛素化酶。真核细胞中E3泛素连接酶有大约五百种,去泛素化酶有约一百种,它们具有底物特异性,负责可逆的精密调控蛋白质的泛素化修饰。由于不同酶的底物特异性,存在某种酶调节多个底物蛋白泛素化水平的情况,而某个底物蛋白也往往受到多种酶的共同调控。转录因子Snail在肿瘤发生发展中发挥着关键性作用且泛素化修饰调控Snail是影响其表达水平的一个重要手段。迄今,已经证实存在多种能够参与调节Snail的泛素化修饰促进其蛋白酶体途径降解的E3泛素连接酶,但其逆过程-负责Snail的去泛素化的去泛素化酶（DUBs）在很大程度上仍然未知。鉴于细胞中蛋白质去泛素化修饰的复杂性,我们首先采用了免疫共沉淀串联质谱分析技术以寻找能与Snail相互结合的去泛素化酶。随后,在确证去泛素化酶PSMD14与Snail存在相互作用后,我们检测了 PSMD14靶向Snail以实现去泛素化和稳定Snail细胞内表达水平的功能。在食管鳞状细胞癌细胞中,PSMD14高表达显着降低了 Snail的泛素化水平并延长了 Snail的半衰期。在功能研究上,我们发现PSMD14的敲降极大地阻断了 Snail诱导的上皮间质转化过程,并在随后的体外实验中抑制了食管鳞癌细胞的迁移和侵袭以及在体内实验中抑制了食管鳞癌肿瘤的转移能力。此外,在临床样本中,PSMD14在食管鳞癌肿瘤组织中表达水平显着高于癌旁组织,且与Snail的表达水平呈正相关关系。而TCGA数据库中结果也显示在食管癌中PSMD14的高表达往往预示着患者的不良预后。以上这些发现表明,PSMD14作为去泛素化酶,能够在翻译后水平上调节Snail的表达水平,从而调控食管鳞状细胞癌的进展与转移。另一方面,我们又利用部分去泛素化酶的cDNA文库筛选能够调节Snail表达水平的去泛素化酶,希望能够从中发现影响Snail去泛素化水平和蛋白降解的新的去泛素化酶。通过筛选文库,我们确定了 OTUB1能够上调Snail表达,并在随后又确定了两者存在相互作用与细胞内的共定位。通过对去泛素化酶功能失活形式的OTUB1MUT3的研究,我们发现去泛素化酶OTUB1发挥抑制Snail多聚泛素化和蛋白酶体降解,增强Snail稳定性的功能依赖于OTUB1的酶活性。在功能研究上,OTUB1通过上调Snail蛋白水平,促进食管鳞状细胞癌的上皮间质转化过程,进而促进食管鳞癌肿瘤转移的发生。此外,OTUB1也在食管鳞状细胞癌中高表达且提示患者的不良预后。在临床样本中OTUB1与Snail表达水平呈正相关,在一定程度上也反映了两者之间的调控关系。因此,OTUB1作为Snail的另一个重要的去泛素化调控的蛋白,在食管鳞癌进展与转移中也起着关键作用。综上所述,我们的研究着眼于寻找在食管鳞状细胞癌中调控Snail稳定性与降解的去泛素化酶。新发现两种去泛素化酶PSMD14与OTUB1可以抑制Snail的泛素化水平,阻碍其蛋白酶体降解途径,从而促进Snail在细胞中的积累,并由此激活Snail介导的上皮间质转化过程,促进食管鳞癌肿瘤的进展和转移。我们的研究为进一步探究肿瘤转移的机制提供了新的线索,为食管鳞癌转移的治疗提供了新的策略。
蒲有伟[4]（2021）在《MDM4基因rs1380576多态性与癌症风险的Meta分析及其分子机制初步研究》文中提出癌症是人类健康的主要威胁因素之一,因难治愈和高死亡率成为当今社会和家庭的沉重负担。癌症形成机制复杂,多项研究表明遗传因素是癌症形成和发展的重要驱动因素。当前癌症形成的遗传因素中研究最为广泛的是p53信号通路,MDM4蛋白作为p53蛋白主要负调控因子,该蛋白的表达水平失衡将直接导致p53功能异常,从而促进癌细胞的形成和生长。MDM4蛋白编码基因第一内含子的rs1380576与不同癌症风险的研究结论不完全一致,并且截止目前未见该SNP促进癌症风险的分子机制研究。因此在前人研究的基础之上,本项研究提出两个科学问题:1)rs1380576与癌症风险是否具有相关性?2)如果rs1380576与癌症的发展存在相关性,它的作用机制是什么?为了回答第一个问题,本项研究通过Meta分析来系统总结现有文献,以获取综合客观的分析结果。基于此目的,本研究首先在不同数据库中找到12篇rs1380576与癌症的报道,随后详细阅读文献进一步筛选出7项rs1380576与癌症的相关性研究,并提取这些文献的原始数据和评价文献原始数据质量。最后将通过评价的4篇文献纳入Meta分析,Meta分析结果显示rs1380576的CG+CC等位基因与癌症风险降低相关（RR=1.25,I2=0.0%）。由于Meta分析显示rs1380576与癌症风险升高相关,由此引出第二个问题:rs1380576的作用机制是什么?由于rs1380576位于MDM4基因第一内含子,目前已鉴定出的内含子常见作用机制是具有启动子或增强子活性。为了探讨rs1380576是否具有增强子或启动子活性,本研究构建了包含rs1380576不同等位基因的重组p GL3-Promoter和p GL3-Enhancer载体,将重组载体转染到HEK293,A375和A549细胞系后,结果显示G和C等位基因荧光素酶活性并没有显着差异。本研究进一步使用凝胶迁移阻滞实验探讨rs1380576-G和C等位基因转录因子结合能力差异,结果表明1380576的G和C等位基因都不能结合转录因子。综上所述,本研究首先对rs1380576与癌症风险的原始数据进行Meta分析,Meta分析显示CG+CC等位基因与癌症风险升高显着相关。随后通过体外功能实验初步探讨rs1380576的作用机制,双荧光素酶报告基因检测实验结果表明rs1380576可能不具备启动子和增强子功能,后续EMSA实验结果也表明rs1380576无法结合转录因子。上述实验证据初步证明rs1380576不是一个功能性SNP,因此rs1380576与癌症风险相关可能是由于基因连锁所致,需进一步开展与之连锁的功能性SNP分析才能深入揭示MDM4基因调控癌症发生的分子机制。
王世洋[5]（2021）在《RNF126通过介导p53泛素化降解影响结直肠癌进展的机制研究》文中研究指明研究背景:结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）因其高发病率及不良的预后而被人们所熟知。在全球,每年有近90万人死于结直肠癌,其病死率仅次于肺癌,乳腺癌和前列腺癌,位列第四名。在我国,结直肠癌的发病率和病死率在肿瘤人群中均位列前五名。多种分子信号通路的失调,可导致结直肠癌的发生并全力推动了结直肠癌的发展,这其中就包括癌基因同抑癌基因的功能失衡。泛素蛋白酶体系统是调节肿瘤信号通路的关键翻译后修饰之一。泛素化修饰是蛋白翻译后修饰中的一种,在许多细胞重要的生命活动中都需要泛素化修饰的参与并在其中发挥着不可替代的作用。泛素可以被泛素化活化酶E1激活,经过泛素化结合酶E2的传导作用,最后被泛素化连接酶E3识别并完成与特异性的蛋白质底物的共价结合。泛素连接酶E3可以招募底物并促进或直接催化泛素转移到目标物。泛素连接酶E3在很大程度上决定了泛素化反应的特异性。泛素连接酶E3的基因改变、表达异常或功能障碍可以导致人类癌症的发生和进展。事实上,相关抑癌分子的过度降解和致癌蛋白的降解障碍与肿瘤发生密切相关。结直肠癌的发病机制复杂、多样,涉及体细胞突变、基因异常融合、缺失或扩增以及表观遗传改变,可能导致结直肠癌中泛素化连接酶E3的异常表达或功能改变。大量研究表明,泛素化连接酶E3的功能缺陷参与了结直肠癌的分子病因和发病机制。异常表达的泛素化连接酶E3在结直肠癌中究竟起着促癌还是抑癌作用,这取决于泛素化的底物蛋白在结直肠癌中的作用。近年来,人们对于泛素化连接酶E3介导的泛素化修饰在结直肠癌发生和进展中的潜在作用方面的认识不断深入。TP53被认为是影响结直肠癌发生和发展的关键基因,TP53是结直肠癌中最常突变的基因之一。约40%-50%的结直肠癌存在TP53突变从而导致p53功能失活。p53作为转录因子也是抑癌蛋白,可以转录激活百余种的下游靶基因,促进靶基因表达。p53诱导表达的靶蛋白可以直接参与DNA的损伤修复过程,也可通过对细胞周期阻滞作用,为DNA损伤修复创造时机。事实上,p53主要是依靠其下游的靶蛋白p21来调控G1/S和G2/M细胞周期阻滞。虽然对于p53蛋白的调控可以发生于转录、翻译和蛋白修饰等多个阶段,但是p53的翻译后修饰对p53的调控作用最为重要,而p53的泛素化修饰是最重要也是研究最广泛的翻译后修饰。泛素化修饰可以抑制p53的功能活性并促进p53的核输出并介导其在细胞质中经蛋白酶体途径降解。多种泛素化连接酶E3可特异性识别p53,并将其作为泛素化底物。这其中最重要的泛素化连接酶E3是MDM2。除MDM2外,其他泛素E3连接酶如COP1、Pirh2和ARF-BP1被发现在特定环境下调控p53的泛素化和降解。RNF126（RING finger protein 126）作为一种新型的E3泛素连接酶,在一些实体肿瘤中起着致癌作用,但其在结直肠癌中的潜在作用却鲜有报道。因此,我们在本研究中探究了RNF126在结直肠癌的发展中的潜在作用及分子机制。第一部分:RNF126与p53在结直肠癌组织中的表达差异及与临床病理参数的相关性目的:观察RNF126在结直肠癌组织和癌旁组织中的表达情况。探究RNF126和p53在结直肠癌组织中的表达相关性。分析RNF126的高表达与结直肠癌患者的临床病理参数的关系。分析RNF126的高表达与结直肠癌患者的术后生存时间之间的关系。研究方法:首先利用免疫组化技术检测RNF126在147例结直肠癌及癌旁组织中的表达情况。同时检测p53在147例结直肠癌组织中的表达情况。通过相关性分析（seaprman test）探究RNF126和p53在结直肠癌组织中的表达相关性。随后通过免疫印迹法检测RNF126在24例结直肠癌及癌旁组织中的蛋白表达情况。通过实时定量PCR技术检测RNF126在24例结直肠癌及癌旁组织中的m RNA表达情况。最后,通过卡方检验,探究RNF126高表达与结直肠癌患者的临床病理参数的相关性。通过Kaplan-meier单因素分析,探究RNF126和p53的高表达对结直肠患者术后生存时间的影响。结果:免疫组化结果提示与癌旁组织相比,RNF126在结直肠癌组织中高表达（54.4%,80/147 VS 30.6%,45/147,P<0.01）。在结直肠癌标本中,突变型p53的高表达率为51%（75/147）。经相关性分析（seaprman test）提示在结直肠癌组织中RNF126高表达与p53的高表达没有相关性（r=0.114,p=0.166）。免疫印迹法和实时定量PCR提示RNF126在结直肠癌组织中的蛋白和m RNA表达均明显高于癌旁组织中的表达。对于结直肠患者的临床病理参数的分析（卡方检验）提示RNF126的高表达与CRC患者肿瘤大小（P=0.021）,T分期（P=0.030）,淋巴结转移（P=0.006）和TNM分期（P=0.001）呈正相关。RNF126表达在147例结直肠癌患者的Kaplan-meier单因素分析提示RNF126高表达的结直肠癌患者术后生存时间更短,差异具有统计学意义（p=0.003）。结论:1、RNF126在结直肠癌组织中的蛋白和m RNA表达均明显高于癌旁组织中的表达。2、RNF126的高表达与结直肠癌患者的肿瘤的大小,局部浸润深度,淋巴结转移以及TNM分期等多个临床病理参数呈显着正相关。3、RNF126的高表达与结直肠癌病人的不良预后密切相关。4、RNF126和突变型p53在结直肠癌组织中的表达无相关性。第二部分:RNF126、p53和p21在结直肠癌细胞中的表达相关性及分子机制目的:探究RNF126和p53-p21在CRC细胞中的表达相关性及分子机制研究方法:利用细胞瞬时转染技术,构建RNF126的过表达和沉默细胞系。通过免疫印迹法和免疫共沉淀技术检测RNF126和p53-p21的相互作用,联合蛋白酶体抑制剂MG132,探讨RNF126是否介导p53的泛素化调控。结果:通过免疫印迹法验证RNF126过表达和沉默的瞬转细胞系构建成功。免疫印迹实验提示在表达突变型p53的colo-205和SW620结直肠癌细胞系中,RNF126沉默并不能改变突变型p53及p21的表达水平。但在表达野生型p53的结直肠癌细胞HCT116和HCT-8中,沉默RNF126可以上调p53和p21的表达,但抑制了p Rb的表达。这一过程可以通过p53的共沉默所逆转。反之,RNF126过表达可以下调p53和p21的表达,但上调了p Rb的表达,这一过程可通过经典的蛋白酶体抑制剂MG132所逆转。通过实时定量PCR检测可发现,在RNF126沉默或过表达的细胞中,上述靶基因的m RNA水平没有变化,提示RNF126对p53-p21的调控发生在转录后水平。免疫共沉淀实验提示无论是以p53为沉淀蛋白还是以RNF126作为沉淀蛋白,RNF126和p53,p21均能形成共沉淀。进一步以p53为沉淀,检测p53的泛素化水平,沉默RNF126明显减弱p53的泛素化蛋白水平,提示p53的泛素化降解减弱,相应的,p53表达增高。而过表达RNF126明显提高了p53的泛素化,提示p53的泛素化降解增强,相应的p53表达降低。结论:1、RNF126不能调控突变型p53的蛋白表达;2、RNF126对p53-p21表达调控发生在转录后水平。可以通过泛素化降解途径调控野生型p53的表达,进而调控下游p21和p Rb的表达。第三部分:RNF126对结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭及化疗药物敏感性的调控目的:在体外,探究RNF126对于结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭和化疗药物敏感性的调控作用。在体内,通过裸鼠皮下成瘤实验进一步验证RNF126对结直肠癌的作用。研究方法:通过transwell法来研究RNF126的沉默和过表达对于结直肠癌细胞的侵袭和迁移能力的影响。通过MTT法观察RNF126的沉默和过表达对细胞增殖的作用。通过流式细胞技术,检测RNF126的沉默或过表达对结直肠癌细胞的细胞周期的调控作用。再次通过MTT法观察RNF126的沉默和过表达对于结直肠癌细胞对化疗药物敏感性的调控作用。构建RNF126沉默的稳定转染细胞系,通过裸鼠成瘤实验观察RNF126在体内实验中对结直肠癌的作用。结果:沉默RNF126可抑制HCT116结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力,而共沉默p53可逆转上述结果。相反,过表达RNF126可以促进HCT-8细胞的增殖、迁移和侵袭能力,蛋白酶抑制剂MG132可以抑制RNF126过表达对细胞增殖、侵袭、迁移和侵袭的促进作用。此外,沉默RNF126可以降低结直肠癌细胞对化疗药物的耐药性,这一结果同样可以被p53沉默所逆转。相反,过表达RNF126可以增强结直肠癌细胞对化疗药物的耐药性,这一情况同样可以被MG132所逆转。在体内实验,裸鼠成瘤实验结果提示,与对照组相比沉默RNF126的实验组裸鼠移植瘤体积增长明显受到抑制。沉默RNF126的实验组裸鼠移植瘤重量明显小于对照组。结论:1、在表达野生型p53的结直肠癌细胞中,RNF126可以通过促进p53的泛素化降解,调控p21-p Rb通路活性,最终促进CRC的增殖、侵袭、迁移和耐药。2、体内实验提示沉默RNF126对结直肠癌存在抑制作用。
王钊[6]（2021）在《多西环素诱导布鲁杆菌S2株侵染的人小胶质细胞凋亡的相关机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景:神经型布鲁杆菌病是布鲁杆菌病的一种危及生命的并发症。由于布鲁杆菌在小胶质细胞内质网（Endoplasmic Reticulum,ER）中复制、增殖,进而引起患者持续的慢性感染。布鲁杆菌可通过抑制小胶质细胞内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress,ERS）,进一步抑制其ER相关凋亡。那么,诱导布鲁杆菌感染的小胶质细胞凋亡则会限制细菌在胞内存活。多西环素（Doxycycline,Dox）可以通过触发ERS诱导细胞凋亡,但其潜在机制未知。目的:先用布鲁杆菌S2株侵染人小胶质细胞克隆3（Human Microglia Clone 3,HMC3）,以明确布鲁杆菌S2株抑制HMC3细胞凋亡的机制。在此基础上,通过多西环素干预布鲁杆菌S2株侵染的HMC3细胞,进一步阐明多西环素诱导感染的HMC3细胞凋亡机制,以期寻找神经型布鲁杆菌病药物治疗的新靶点。方法:首先,我们用不同MOI的布鲁杆菌S2株侵染HMC3细胞不同时间,通过Western Blot测定细胞p-IRE1,p-JNK,cleaved Caspase-12,p-p53与cleaved Caspase-3蛋白水平;用RT-q PCR测定IRE1,JNK,Caspase-12,p53与Caspase-3 m RNA表达;采用流式细胞术测定并分析细胞凋亡水平。在此基础上,我们用泛素化修饰蛋白质组学技术筛选出泛素化修饰降低的蛋白——钙网蛋白（Calreticulin,CALR）。接下来,我们通过慢病毒转染技术成功构建了CALR过表达细胞株HMC3-CALR和CALR敲减细胞株HMC3-sh-CALR。然后,我们用布鲁杆菌S2株分别侵染各组细胞,采用Western Blot法与RT-q PCR法分别对CALR,IRE1/Caspase-3及JNK/p53信号通路关键蛋白与m RNA进行测定;通过ER染色观察各组细胞ER;用细胞免疫荧光技术检测p-JNK蛋白核转运;通过流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。最后,我们用上述同样的方法研究了多西环素对布鲁杆菌S2株侵染或未侵染的HMC3细胞CALR,IRE1/Caspase-3及JNK/p53信号通路的作用。结果:（1）MOI为50的布鲁杆菌S2株侵染HMC3细胞2 h能降低细胞p-IRE1,cleaved Caspase-12,cleaved Caspase-3,p-JNK与p-p53蛋白水平,亦能抑制IRE1,Caspase-12,Caspase-3,JNK与p53 m RNA表达,但使CALR蛋白与m RNA水平均增加,同时降低HMC3细胞凋亡率。（2）CALR能降低p-IRE1,cleaved Caspase-12,cleaved Caspase-3,p-JNK与p-p53蛋白水平,抑制p-JNK蛋白核转运,进而降低HMC3细胞凋亡率。（3）布鲁杆菌S2株通过增加CALR蛋白与m RNA水平,进一步降低各细胞株p-IRE1,cleaved Caspase-12,cleaved Caspase-9,cleaved Caspase-3,p-JNK与p-p53蛋白水平,亦抑制IRE1,Caspase-12,Caspase-9,Caspase-3,JNK与p53m RNA表达及p-JNK蛋白核转运,进而降低HMC3细胞凋亡率。（4）多西环素干预布鲁杆菌S2株侵染或未侵染的HMC3细胞之结果均与布鲁杆菌S2株侵染HMC3细胞的结果相反,且多西环素均能促进布鲁杆菌S2株侵染或未侵染的HMC3细胞ER损伤,增加细胞内钙离子含量,使HMC3细胞凋亡率增加。结论:（1）CALR通过抑制p-IRE1,cleaved Caspase-12,cleaved Caspase-3,p-JNK及p-p53蛋白水平,减轻HMC3细胞ERS,抑制HMC3细胞凋亡。（2）布鲁杆菌S2株通过增加CALR水平,抑制JNK/p53及IRE1/Caspase-3信号通路,减轻细胞ERS,抑制HMC3细胞凋亡。（3）多西环素通过降低CALR水平,活化JNK/p53及IRE1/Caspase-3信号通路,激活细胞ERS,诱导布鲁杆菌S2株侵染或未侵染的HMC3细胞凋亡。（4）CALR,JNK/p53与IRE1/Caspase-3信号通路可作为神经型布鲁杆菌病药物治疗的候选靶点。
李昕[7]（2020）在《P53通路激活剂的筛选及作用机制研究》文中研究说明P53（Tumor suppressor p53,TP53,TRP53）是由17号染色体上的TP53基因编码的蛋白,对细胞生长、分化、代谢及机体免疫具有重要调控作用。P53功能异常与多种人类疾病相关,如P53功能缺失或异常对肿瘤的发生和发展具有重要的促进作用,因此P53主要被作为一种关键的抑癌基因进行研究。几乎在所有人类肿瘤中,P53都以不同形式处于失活或功能异常状态:一些肿瘤中P53发生失活突变从而丧失抑癌活性,甚至促进肿瘤生长转移;另外一些肿瘤中,虽然P53以野生型存在,但其活性被异常的负调控机制抑制。利用外来干预恢复P53信号通路的正常功能,一直是有吸引力的肿瘤治疗策略。P53野生型肿瘤并不罕见,多见于结直肠癌、淋巴瘤及部分肿瘤病毒（如人乳头瘤病毒HPV和Epstein-Barr Virus等）诱发的肿瘤。这些肿瘤中,如果恢复或增强野生型P53蛋白的活性,将在很大程度上抑制肿瘤的生长。本研究利用高通量筛选、计算机药物虚拟筛选和知识图谱等多学科技术手段的交叉应用,聚焦于筛选P53信号通路小分子激活剂,得到两种潜在的P53通路激活剂——Torilin和UNBS5162,并对其中比较具有成药潜力的分子UNBS5162进行了较为系统的分子作用机制研究。围绕P53信号通路激活剂的开发,本研究分别构建了基于靶点（野生型P53蛋白）的计算机药物虚拟筛选系统和基于生物学表型（P53转录活性）的荧光素酶高通量药物筛选系统,并将两种系统交叉应用于后续的化合物分子作用机制研究和药效验证。一方面,从计算机虚拟筛选系统出发,联合荧光素酶筛选系统的验证,发现天然产物Torilin能激活P53信号通路,实验证明Torilin能够提高野生型P53的稳定性,进而激活P53下游通路,抑制P53野生型肿瘤细胞的生长,并通过分子对接表明Torilin通过2-甲基-2-丁烯醇直接结合在P53的关键氨基酸位点Cys124上,维持P53稳定性构象。另一方面,从高通量系统中筛选得到了潜在的P53通路激活剂UNBS5162,实验验证其在细胞模型和异种移植瘤动物模型中显着抑制肿瘤生长。进一步的机制研究发现UNBS5162促进MDM2（P53的E3泛素连接酶）的降解,抑制P53的泛素化,稳定P53蛋白,提高肿瘤细胞内P53蛋白水平,诱导P53信号通路下游基因表达,从而通过促进细胞凋亡和阻滞细胞周期,抑制多种P53野生型肿瘤细胞的生长。随后利用团队成员构建的P53蛋白调控网络知识图谱分析了P53活性和稳定性相关的信号通路和节点分子,缩小研究范围,并利用计算机虚拟筛选系统协助探索了UNBS5162可能的直接作用靶点。Torilin通过直接结合稳定P53蛋白构象,UNBS5162通过影响P53翻译后修饰调控因子间接激活P53信号通路,是两种典型的P53信号通路激活策略,有应用于临床治疗的潜力,且可能协同作用,提高抑癌效果。该方向的探索将在后续的研究中继续进行。综上,本论文为了快速而全面地进行P53通路激活剂筛选,尝试建立了两种不同策略的药物筛选系统:（1）基于P53蛋白靶点的计算机虚拟药物筛选系统;（2）基于P53转录活性的荧光素酶高通量药物筛选系统。随后利用其筛选出潜在的P53通路激活剂,并探索性地交叉利用分子生物学、计算机科学和药学等学科的新兴技术手段,进行药物作用机制研究和药物靶点探索,为基于P53信号通路的药物筛选及开发,奠定了一定基础。
孔彤彤[8]（2020）在《Sp-p53泛素化在拟穴青蟹（Scylla paramamosain）抗WSSV免疫中的功能研究》文中研究说明研究表明拟穴青蟹是白斑综合症病毒（WSSV）的天然宿主之一,感染了WSSV的青蟹会出现食欲减退与活力变差等现象,严重者会死亡。哺乳动物中的p53蛋白作为重要的肿瘤抑制因子,被广泛研究,且已被证明能够通过参与调控病毒引起的细胞凋亡反应,从而抑制病毒的复制与对其他细胞的感染。目前甲壳动物的先天免疫研究取得了很大的进展。然而,关于p53蛋白在甲壳动物的抗病毒免疫中的功能研究较少。因此,探究p53蛋白在拟穴青蟹抗WSSV感染的先天性免疫防御机制中的作用,对于青蟹病害防治具有积极地指导作用。本论文主要取得以下结果:1、本研究克隆得到拟穴青蟹的p53基因（Sp-p53）的c DNA序列,其开放阅读框（Open reading frame,ORF）长1440 bp,编码479个氨基酸。系统进化树分析结果显示Sp-p53与凡纳滨对虾等甲壳动物的p53蛋白聚为一类。Sp-p53在血细胞、内皮、肌肉、中肠以及鳃组织中均有表达。敲低Sp-p53在血细胞中的表达量,并注射WSSV,发现由WSSV感染导致上调的血细胞凋亡率、Caspase3活性、线粒体膜电位下降程度与胞内ROS（Reactive Oxygen Species,ROS）水平,均有不同程度的下调,且WSSV在青蟹中的拷贝数增多,说明Sp-p53可能通过调控凋亡途径以及ROS的产生降低WSSV的拷贝数。降低胞内ROS水平,并注射WSSV,发现青蟹凋亡相关指标均有不同程度的下调,说明抑制ROS的产生可以降低细胞凋亡水平。WSSV感染青蟹后,Sp-p53的蛋白水平显着性上调,而其m RNA却无明显的变化,且Sp-p53蛋白泛素化水平显着性下降。说明Sp-p53可能存在泛素化修饰。通过GST Pull down实验筛选互作蛋白,发现泛素连接酶HUWE1是Sp-p53潜在的互作蛋白。2、克隆了拟穴青蟹Sp-HUWE1的ORF序列,其编码4562个氨基酸,包含泛素相关结构域（UBA）、参与泛素依赖性水解途径的WWE结构域、决定HUWE1泛素连接酶功能的HECTc结构域,以及未知功能的DUF908、DUF913与DUF4414结构域。Sp-HUWE1在血细胞、内皮、肌肉、中肠以及鳃组织中均有表达。Sp-HUWE1与Sp-p53蛋白在青蟹血细胞中的共定位实验、Pull-down与Co-IP实验结果说明Sp-HUWE1蛋白的C端HECTc结构域可以与Sp-p53蛋白结合。将青蟹中的Sp-HUWE1敲低后,发现Sp-p53蛋白的泛素化水平降低;而当Sp-HUWE1蛋白的C端HECTc结构域与Sp-p53蛋白在果蝇S2细胞中共同表达后,Sp-p53蛋白的泛素化水平上升,表明Sp-HUWE1可介导Sp-p53蛋白的泛素化修饰。用蛋白酶抑制剂MG132与去泛素化酶抑制剂PR-619处理青蟹后,Sp-p53蛋白泛素化水平上升,表明Sp-HUWE1可能通过泛素-蛋白酶体途径降解Sp-p53。3、Sp-HUWE1在WSSV感染青蟹后下调表达,且Sp-HUWE1可以促进WSSV的复制。将Sp-HUWE1敲低或将Sp-HUWE1与Sp-p53共同敲低后,发现SpHUWE1可以抑制Sp-p53介导的ROS的产生与细胞凋亡途径。分别用si GFP与PBS、si GFP与WSSV、si Sp-p53与WSSV注射青蟹后,取血细胞用于转录组测序。分析结果显示青蟹被WSSV感染后,3074个基因差异表达,差异基因主要参与病毒感染性疾病与信号转导等生命活动。si Sp-p53与WSSV处理组较si GFP与WSSV处理组有3119个基因差异表达。进一步分析差异基因,发现可调控ROS产生的Sp DUOX2基因及其上游基因Mekk1与MKK3均在WSSV感染后上调表达,而在敲低Sp-p53基因后下调表达;ROS清除酶CAT下调表达。凋亡相关基因PIG8与PARP在WSSV刺激后上调表达,而Sp-p53敲低后显着性下调表达。上述基因在将Sp-p53敲低后的表达量的变化可能导致ROS与细胞凋亡水平下降。综上所述,WSSV感染青蟹后,Sp-p53可通过调控血细胞凋亡途径以及ROS的产生降低WSSV的拷贝数。同时,Sp-HUWE1介导的Sp-p53泛素化修饰水平降低,Sp-p53蛋白增多,并促进ROS的产生以及细胞凋亡的发生,进而抑制病毒的复制。本研究可为进一步研究青蟹的抗WSSV免疫分子机制奠定基础,研究结果可以丰富无脊椎动物青蟹的抗病毒免疫系统理论体系。
白米雪[9]（2020）在《去泛素化酶OTUD5与CacyBP的相互作用及OTUD5在宫颈癌中的生物信息学分析》文中研究说明目的研究发现,OTUD5（OTU deubiquitinase 5）作为OTU亚家族中的重要成员之一,在DNA损伤修复和免疫学领域扮演着重要角色。目前来说OTUD5的研究相对较少,并且其是否能够被调控仍未知。钙周期素结合蛋白（Calcyclin binding protein,CacyBP）在小鼠艾氏腹水细胞瘤中以S100A6蛋白的靶分子形式发现。研究发现CacyBP影响多种肿瘤的发生发展,此外已有报道表明在人胶质瘤细胞中过表达CacyBP下调p53的蛋白水平。目前,OTUD5在肿瘤中的功能尚不清楚,通过生物信息学分析OTUD5在宫颈癌中的表达给相关研究提供借鉴。去泛素化酶OTUD5是否与CacyBP相互作用和对宫颈癌的调控尚不清楚。方法利用Western blot实验检测OTUD5或CacyBP过表达后外源底物蛋白的变化。采用RNA干扰技术敲低OTUD5或CacyBP后检测内源底物蛋白的变化。采用实时定量PCR（qRT-PCR）检测OTUD5或CacyBP过表达对底物mRNA水平的影响。利用半衰期实验检测CacyBP过表达后底物蛋白OTUD5的降解速率,探讨CacyBP对OTUD5稳定性的调节。运用体内泛素化实验检测OTUD5或CacyBP过表达或敲低对底物蛋白的泛素化水平的影响。通过核质分离试剂盒以及Western blot,检测OTUD5过表达是否影响CacyBP的核质定位。利用Oncomine、GEPIA、UALCAN数据库分析CESC组织中的OTUD5 mRNA水平的变化。利用LinkedOmics分析OTUD5基因的共表达基因和miRNA。利用cBioPortal数据库分析OTUD5在CESC组织中DNA拷贝数的变化。利用GeneMANIA数据库分析OTUD5的相互作用蛋白。用t检验验证CESC与癌旁组织中OTUD5 mRNA表达差异。用Spearman相关系数分析基因表达的相关性。采用Kaplan-Meier生存分析计算生存率,采用广义log-rank检验估计生存率的差异。结果（1）CacyBP和OTUD5具有相互作用,CacyBP过表达降低OTUD5蛋白水平,缩短OTUD5蛋白半衰期,但对其mRNA水平没有影响。CacyBP增加OTUD5蛋白的泛素化水平。且CacyBP通过OTUD5降低p53的蛋白水平。（2）OTUD5不影响CacyBP mRNA和蛋白水平的变化,但OTUD5的过表达促进CacyBP的核定位。（3）OTUD5在宫颈癌中的低表达与不良预后有关。它的表达与宫颈癌的肿瘤分期,转移性淋巴结相关。此外,OTUD5的低表达与宫颈癌的不同亚型有关,例如与磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）-AKT信号传导,上皮-间质转化（EMT）和激素有关的亚型。通过分析OTUD5的共表达基因,相关的mi RNA,转录因子,激酶,E3和相互作用蛋白。我们证明了OTUD5影响WDR45,USP11,GRIPAP1和RBM10的表达水平。此外,hsa-mir–137、hsa-mir–1913、hsa-mir–937、hsa-mir–607、hsa-mir-3149和hsa-mir-144可能会抑制OTUD5的表达。综上,我们对22个共表达基因,33个相关miRNA和30个相互作用蛋白进行了富集分析。除了泛素化和免疫学相关过程外,它们还参与Hippo信号传导,胰岛素信号传导,EMT,组蛋白甲基化和磷酸化激酶结合。结论CacyBP通过与OTUD 5相互作用,CacyBP使OTUD5蛋白发生泛素化降解且稳定性降低;OTUD5促进CacyBP的核定位,降低其泛素化水平。研究首次分析了OTUD5在宫颈癌中的表达及其与临床病理的关系,并为进一步研其在肿瘤中的调控机制提供了新的见识。
朱礼慧[10]（2020）在《TRIM7通过直接靶向Src抑制肝细胞肝癌进展的作用效应与分子机制》文中研究说明研究目的肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC,简称肝癌）是一种恶性程度非常高的肿瘤,因其起病隐匿、进展迅速,病死率在全世界恶性肿瘤中居第二位。虽然手术切除、肿瘤血管栓塞和射频消融等治疗方式有效地提高了肝癌患者的生存率,但是多数患者终因肝癌侵袭进展,预后极差。从分子水平探索肝癌的发病机制,寻找影响其发生和进展的关键分子,评估其成为分子标记物和干预靶点的可能性,将为发现并鉴定新型治疗靶点,制定有效的治疗策略奠定理论基础。TRIM7（tripartite motif-containing protein 7）是 2002 年被首次鉴定的 TRIM 家族新成员,由于其可以结合并激活糖原蛋白,在糖原的生物合成中发挥启动作用,因而最初被定义为糖原蛋白结合蛋白（glycogenin interacting protein,GNIP）。TRIM7具有高度保守的RBCC结构序列,从N端到C端依次是RING结构域、一个B-box结构域、一个Coiled-coil结构域和一个C端的B30.2/SPRY结构域。由于TRIM7含有RING锌指结构域,因而可能具有E3泛素连接酶活性。目前有关TRIM7分子的报导很少,其在肝癌中的表达情况、生物学效应和分子机制尚不清楚。本研究通过临床标本检测、肝癌细胞模型以及肝癌异种移植瘤小鼠动物模型,深入探讨了 TRIM7在肝癌进展中的作用效应及分子机制,为肝癌临床治疗策略的完善提供了新思路。研究方法1.研究TRIM7在肝癌组织及其对应的远端非癌肝组织中的表达水平1.1检测TRIM7在肝癌组织中的表达定位和表达水平应用免疫组织化学染色（immunohistochemistry,IHC）实验检测80例临床肝癌患者的肝癌组织及其相匹配的远端非癌肝组织中TRIM7的表达定位和表达水平,并进行统计分析。1.2检测TRIM7在肝癌组织中的蛋白表达水平应用免疫蛋白印迹（western blot）实验检测52例临床肝癌患者的肝癌组织及其对应的远端非癌肝组织中TRIM7的蛋白表达水平,并进行统计分析。1.3检测TRIM7在肝癌组织中的mRNA水平应用实时定量聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction,real-time PCR）检测64例临床肝癌患者的肝癌组织及其对应的远端非癌肝组织中的TRIM7的mRNA水平,并进行统计分析。2.研究TRIM7对肝癌细胞恶性行为能力的影响2.1构建TRIM7过表达的肝癌细胞模型2.1.1构建TRIM7瞬时过表达的肝癌细胞模型在HepG2和Huh7肝癌细胞中转染带有Flag标签的TRIM7质粒（Flag-TRIM7）,对照组肝癌细胞中转染带有Flag标签的空白表达载体质粒（Flag-pENTER）,转染24 h后,应用western blot检测TRIM7的蛋白表达水平,以判断TRIM7瞬时过表达的肝癌细胞模型是否构建成功。2.1.2构建TRIM7稳定过表达的肝癌细胞系在Huh7肝癌细胞中转染Flag-TRIM7质粒,对照组肝癌细胞中转染Flag-pENTER质粒,转染48 h后,更换为含有嘌呤霉素的全培养基进行筛选,将存活的单细胞克隆进行扩大培养,应用western blot检测TRIM7稳定过表达是否成功,筛选TRIM7稳定过表达的Huh7肝癌细胞株。2.2检测过表达TRIM7对肝癌细胞增殖、侵袭和克隆形成能力的影响在成功构建的TRIM7瞬时过表达的HepG2和Huh7肝癌细胞模型和TRIM7稳定过表达的Huh7肝癌细胞模型及其相应的肝癌细胞对照组中,应用CCK-8、Transwell和克隆形成实验分别检测瞬时和稳定过表达TRIM7对肝癌细胞增殖、侵袭和克隆形成能力的影响。2.3构建抑制或敲除TRIM7的肝癌细胞模型2.3.1构建Si-TRIM7瞬时转染的肝癌细胞模型在HepG2和Huh7肝癌细胞中各分别转染两条不同的TRIM7小干扰RNA（Si-TRIM7-1和Si-TRIM7-2）以干扰TRIM7的表达,对照组肝癌细胞转染非特异性序列（Si-NC）。转染48小时后,应用western blot检测TRIM7的蛋白表达水平,以判断Si-TRIM7瞬时转染的肝癌细胞模型是否构建成功。2.3.2构建慢病毒介导的Sh-TRIM7稳定转染的肝癌细胞系在Huh7肝癌细胞中分别转染慢病毒介导的两条不同的靶向TRIM7的ShRNA（Sh-TRIM7-1和Sh-TRIM7-2）,对照组肝癌细胞中转染病毒包被的非特异性序列（Sh-NC）,转染48小时后,更换为含有嘌呤霉素的全培养基进行筛选,将存活的单细胞克隆进行扩大培养,应用western blot检测TRIM7是否稳定敲低,筛选TRIM7稳定敲低的Huh7肝癌细胞株。2.3.3构建基于CRISPR/Cas9系统的TRIM7基因敲除的肝癌细胞系应用CRISPRdirect网站设计三对用于构建single-guide RNA（sgRNA）的oligo序列,将合成的oligo序列退火形成退火产物。将pLentiCRISPRv2载体酶切线性化。将退火后的oligo和酶切后的载体连接成为重组质粒。将三条重组质粒分别转染入Huh7肝癌细胞中,对照组肝癌细胞转染pLenti-V2空载体质粒。转染48小时后,应用western blot检测TRIM7的蛋白表达水平,以判断sgRNA是否能成功敲除TRIM7。选择敲除效率最高的重组质粒,将其转染入Huh7肝癌细胞中,对照组肝癌细胞转染pLenti-V2空载体质粒。转染48小时后,更换为含有嘌呤霉素的全培养基进行筛选,将存活的单细胞克隆进行扩大培养,应用western blot检测TRIM7敲除是否成功,筛选TRIM7成功敲除的Huh7肝癌细胞株。2.4检测抑制或敲除TRIM7对肝癌细胞增殖、侵袭和克隆形成能力的影响在成功构建的Si-TRIM7瞬时转染的HepG2和Huh7肝癌细胞模型、慢病毒介导的Sh-TRIM7稳定转染的Huh7肝癌细胞系和基于CRISPR/Cas9系统的TRIM7基因敲除的Huh7肝癌细胞系及其相应的肝癌细胞对照组中,应用CCK-8、Transwell和克隆形成实验分别检测抑制或敲除TRIM7对肝癌细胞增殖、侵袭和克隆形成能力的影响。3.研究TRIM7在肝癌细胞中发挥抑癌效应的分子靶点本课题为了研究TRIM7在肝癌细胞中发挥调控效应的分子靶点,应用免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）实验对可能与TRM7发生结合的原癌或抑癌分子进行筛选,包括 Src、p53、TSC2、HIF-1α、SNAIL、MMP-9 和 Racl等。结果提示,TRIM7可以与原癌分子Src发生直接结合。3.1研究TRIM7与Src的相互结合效应3.1.1检测外源性TRIM7与外源性Src的相互结合效应在HEK293T细胞和Huh7肝癌细胞中共转染Flag-TRIM7和带HA标签的Src质粒（HA-Src）,对照组细胞中共转染Flag-pENTER空载体和HA-Src质粒,应用Co-IP实验检测外源性TRIM7与外源性Src的相互结合情况。3.1.2检测外源性TRIM7与内源性Src的相互结合效应在HEK293T细胞和Huh7肝癌细胞中转染Flag-TRIM7质粒,对照组细胞中转染Flag-pENTER空载体质粒,应用Co-IP实验检测外源性TRIM7与内源性Src的相互结合情况。3.1.3检测内源性TRIM7与内源性Src的相互结合效应在Huh7肝癌细胞中,应用TRIM7抗体进行Co-IP实验,检测内源性TRIM7和内源性Src在肝癌细胞中的相互结合情况。进一步在Huh7肝癌细胞中,应用Src抗体进行Co-IP实验,检测内源性Src和内源性TRIM7在肝癌细胞中的结合情况。3.1.4检测TRIM7与Src在体外的直接结合作用应用蛋白质体外转录与翻译体系分别合成HA-Src和Flag-TRIM7蛋白,应用Co-IP实验检测Flag-TRIM7和HA-Src在体外的直接结合效应。3.2研究介导TRIM7与Src相互结合的结构域3.2.1检测介导TRIM7与Src结合的TRIM7结构域构建一系列TRIM7结构域缺失的截短体,分别是TRIM7△RING、TRIM7△Poly-Ala、TRIM7△B-box、TRIM7△Coiled-coil 和 TRIM7△B30.2/SPRY。在HEK293T细胞中,分别将各个TRIM7截短体质粒与HA-Src质粒共转染,应用Co-IP实验检测Src与各个TRIM7截短体的结合情况,研究介导TRIM7和Src结合的TRIM7结构域。3.2.2检测介导Src与TRIM7结合的Src结构域构建一系列Src结构域缺失的截短体,分别是Src△SH3、Src△SH2和Src△ protein kinase。在HEK293T细胞中,分别将各个Src截短体质粒与Flag-TRIM7质粒共转染,应用Co-IP实验检测各个Src截短体与TRIM7的结合情况,研究介导Src和TRIM7结合的Src结构域。4.研究TRIM7对Src的调控效应4.1检测TRIM7对Src的蛋白表达水平及磷酸化水平的调控效应4.1.1检测过表达TRIM7对Src的蛋白表达水平及磷酸化水平的影响在成功构建的TRIM7瞬时过表达的HepG2和Huh7肝癌细胞模型和TRIM7稳定过表达的Huh7肝癌细胞系及其相应的肝癌细胞对照组中,应用western blot检测TRIM7、Src和p-Src（Tyr419）的水平,研究过表达TRIM7对Src的蛋白表达水平及磷酸化水平的影响。4.1.2检测抑制或敲除TRIM7对Src的蛋白表达水平及磷酸化水平的影晌在成功构建的Si-TRIM7瞬时转染的HepG2和Huh7肝癌细胞模型、慢病毒介导的Sh-TRIM7稳定转染的Huh7肝癌细胞系和基于CRISPR/Cas9系统的TRIM7基因敲除的Huh7肝癌细胞系及其分别的肝癌细胞对照组中,应用western blot检测TRIM7、Src和p-Src（Tyr419）的水平,研究抑制或敲除TRIM7对Src的蛋白表达水平及磷酸化水平的影响。4.2检测TRIM7对Src的mRNA水平的调控效应4.2.1检测过表达TRIM7对Src的mRNA水平的影响在HepG2和Huh7肝癌细胞中转染Flag-TRIM7质粒,对照组肝癌细胞中转染Flag-pENTER空载体质粒,应用real-time PCR检测TRIM7和Src的mRNA水平,研究过表达TRIM7对Src的mRNA水平的影响。4.2.2检测抑制TRIM7对Src的mRNA水平的影响在HepG2肝癌细胞中分别转染Si-TRIM7-1或Si-TRIM7-2,对照组肝癌细胞转染Si-NC,应用real-time PCR检测TRIM7和Src的mRNA水平,研究抑制TRIM7对Src的mRNA水平的影响。4.3检测肝癌组织中Src的表达水平及其与TRIM7表达水平的相关性在58例临床患者的肝癌组织中,应用IHC检测Src的表达水平,并统计分析肝癌组织中TRIM7和Src表达水平的相关性。4.4检测肝癌细胞中TRIM7对Src蛋白稳定性的调控效应在HepG2和Huh7肝癌细胞中转染Flag-TRIM7质粒,对照组肝癌细胞转染Flag-pENTER空载体质粒,转染24 h后应用放线菌酮（Cycloheximide,CHX）阻断肝癌细胞内蛋白的从头合成,设置CHX作用时间梯度（0 h、3 h、6 h和9 h）,应用western blot检测各时间点Src的蛋白水平,并统计分析Src蛋白的降解趋势。4.5检测肝癌细胞中TRIM7介导Src蛋白降解的途径在HepG2肝癌细胞中转染Flag-TRIM7质粒,对照组肝癌细胞转染Flag-pENTER空载体质粒,转染24 h后在Flag-TRIM7质粒转染组分别应用蛋白酶体抑制剂MG132或溶酶体抑制剂氯喹（Chloroquine）抑制蛋白酶体或溶酶体的活性,应用western blot检测Src和p-Src（Tyr419）的水平,研究抑制蛋白酶体或溶酶体活性对TRIM7介导的Src的降解作用的影响,探讨TRIM7介导Src降解的途径。5.研究TRIM7对Src蛋白的泛素化修饰作用5.1检测TRIM7对Src蛋白是否存在泛素化修饰作用5.1.1检测外源性TRIM7对Src的泛素化修饰作用在HEK293T细胞中,共转染带HA标签的UB质粒（HA-UB）、Flag-TRIM7和HA-Src质粒,对照组细胞中共转染HA-UB、Flag-pENTER空载体和HA-Src质粒,应用Co-IP实验检测外源性和内源性Src的泛素化修饰状态。5.1.2检测外源性TRIM7对内源性Src的泛素化修饰作用在HEK293T细胞中,共转染HA-UB和Flag-TRIM7质粒,对照组细胞分别单独转染Flag-pENTER空载体、Flag-TRIM7或HA-UB质粒,应用Co-IP实验检测内源性Src的泛素化修饰状态。5.1.3检测TRIM7在体外对Src的泛素化修饰作用应用蛋白质体外转录与翻译系统分别合成HA-Src和Flag-TRIM7蛋白,在泛素结合反应缓冲液中,将体外合成的Flag-TRIM7和HA-Src蛋白与ATP、MgCl2、Ubiquitin、UBE1和UbcH5a（UBE2D1）共同孵育,在体外形成泛素化反应系统。应用western blot实验检测HA-Src在体外的泛素化修饰状态,以明确TRIM7是否能够对Src进行直接的泛素化修饰作用。5.2检测TRIM7介导Src发生泛素化修饰的类型K11、K48和K63位泛素化修饰是比较常见的泛素化修饰类型。HA-UB-K11、HA-UB-K48和HA-UB-K63质粒是野生型HA-UB质粒的位点突变体,分别仅保留了位于第1 1、48和63位的赖氨酸（Lys,K）残基,而用精氨酸（Arg,R）替代了其他位置的Lys残基。在HEK293T细胞中,分别将HA-UB-K11、HA-UB-K48或HA-UB-K63与Flag-TRIM7和HA-Src质粒进行共转染,对照组细胞中分别将 HA-UB-K11、HA-UB-K48 或 HA-UB-K63 与 Flag-pENTER 空载体和HA-Src质粒进行共转染,应用Co-IP实验检测Src的泛素化修饰状态,研究TRIM7介导Src泛素化修饰的类型。5.3检测RING结构域在TRIM7介导的Src泛素化修饰过程中的作用在HEK293T细胞中,共转染HA-UB质粒与带有Flag标签的RING结构域缺失的TRIM7截短体质粒（Flag-TRIM7 △ RING）,阳性对照组细胞共转染HA-UB与野生型Flag-TRIM7质粒,阴性对照组细胞共转染HA-UB与Flag-pENTER空载体质粒,应用Co-IP实验检测Src的泛素化修饰状态,研究RING结构域在TRIM7介导的Src泛素化修饰过程中的作用。6.研究TRIM7在肝癌细胞中发挥抑癌效应的信号通路本课题为了研究TRIM7在肝癌中发挥调控效应的信号通路,对TRM7可能调控的信号通路进行了筛选,包括mTOR、AMPK、AKT、NF-Kappa B和MAPK等信号通路。结果提示,TRIM7显着抑制mTORC1-S6K1信号通路的活性。6.1检测肝癌细胞中TRIM7对mTORC1-S6K1信号通路的调控效应6.1.1检测过表达TRIM7对mTORC1-S6K1信号通路的影响在成功构建的TRIM7瞬时过表达的HepG2和Huh7肝癌细胞模型和TRIM7稳定过表达的Huh7肝癌细胞模型及其相应的肝癌细胞对照组中,应用western blot检测 TRIM7对Src 及 p-mTOR、p-S6K1、p-S6 和 p-4E-BP1 等 mTORC1-S6K1信号通路分子的调控效应,研究过表达TRIM7对Src及mTORC1-S6K1信号通路的影响。6.1.2检测抑制或敲除TRIM7对mTORC1-S6K1信号通路的影响在成功构建的Si-TRIM7瞬时转染的HepG2和Huh7肝癌细胞模型、慢病毒介导的Sh-TRIM7稳定转染的Huh7肝癌细胞系和基于CRISPR/Cas9系统的TRIM7基因敲除的Huh7肝癌细胞系及其相应的肝癌细胞对照组中,应用western blot 检测 TRIM7 对 Src 及 p-mTOR、p-S6K1、p-S6 和p-4E-BP1等mTORC1-S6K1信号通路分子的调控效应,研究抑制或敲除TRIM7对Src及mTORC1-S6K1信号通路的影响。6.2检测Src在TRIM7介导的对mTORC1-S6K1信号通路的抑制效应中的作用在过表达TRIM7的Huh7肝癌细胞中,外源性过表达Src,应用western blot验证Flag-TRIM7和HA-Src的表达水平,并检测p-Src（Tyr419）的水平和mTORC1-S6K1信号通路分子的磷酸化水平。在Huh7肝癌细胞中,分别转染Si-NC、Si-TRM7-1或Si-TRM7-2,应用雷帕霉素（Rapamycin）抑制mTORCI信号通路的活性,应用western blot验证TRIM7的表达水平和mTORC1-S6K1信号通路分子的磷酸化水平,并检测Src和p-Src（Tyr419）的水平。以此研究TRIM7对Src和mTORC1-S6K1信号通路调控效应的上下游关系,探讨Src在TRIM7介导的对mTORC1-S6K1信号通路的抑制效应中的作用。6.3检测TRIM7是否通过调控Src-mTORC1-S6K1信号轴发挥其抗肿瘤作用6.3.1检测TRIM7是否通过调控Src发挥其抗肿瘤作用在过表达TRIM7的HepG2和Huh7肝癌细胞中,外源性过表达Src,应用western blot 验证 Flag-TRIM7 和 HA-Src 的表达水平,应用 CCK-8、Transwell 和克隆形成实验分别检测HepG2和Huh7肝癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力。应用靶点恢复实验研究TRIM7是否通过对Src的负向调控效应发挥其对肝癌的抑癌效应。6.3.2检测TRIM7是否通过调控mTORCI-S6K1信号通路发挥其抗肿瘤作用在HepG2肝癌细胞中,分别转染Si-TRM7-1、Si-TRM7-2或Si-NC,应用雷帕霉素抑制mTORC1信号通路的活性,应用western blot检测TRIM7的表达水平、mTORC1-S6K1信号通路分子的磷酸化水平及Src和p-Src（Tyr419）的水平,应用CCK-8、Transwell和克隆形成实验分别检测HepG2肝癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力。应用信号通路验证实验检测TRIM7是否通过对mTORC1-S6K1信号通路的负向调控效应发挥其对肝癌的抑癌效应。7.研究TRIM7在肝癌细胞中发挥抑癌效应的功能性结构域我们的研究显示,TRIM7通过其B30.2/SPRY结构域介导与Src蛋白的直接结合,通过其RING结构域介导Src发生K48位泛素化修饰,并诱导其通过泛素-蛋白酶体途径降解。因此,RING结构域和B30.2/SPRY结构域是TRIM7发挥其功能的关键性结构域,我们将进一步探究TRIM7是否通过RING结构域和B30.2/SPRY这两个功能性结构域发挥对Src-mTORC1-S6K1信号轴的抑制效应及对肝癌的抑癌效应。7.1检测TRIM7是否通过其功能性结构域调控靶点及信号通路在Huh7肝癌细胞中分别转染带有Flag标签的RING或B30.2/SPRY结构域缺失的 TRIM7 截短体质粒（Flag-TRIM7 △ RING 和 Flag-TRIM7 △ B30.2/SPRY）,阳性对照组肝癌细胞转染野生型Flag-TRIM7质粒,阴性对照组肝癌细胞转染Flag-pENTER 空载体质粒,应用 western blot 验证 Flag-TRIM7、Flag-TRIM7△RING 和 Flag-TRIM7△B30.2/SPRY 的表达水平,并检测 Src-mTORC1-S6K1 信号轴的活性,研究TRIM7是否通过其功能性结构域调控靶点及信号通路。7.2检测TRIM7是否是通过其功能性结构域在肝癌中发挥抑癌效应在HepG2和Huh7肝癌细胞中分别转染带有Flag标签的RING或B30.2/SPRY结构域缺失的TRIM7截短体质粒（Flag-TRIM7△RING和Flag-TRIM7△B30.2/SPRY）,阳性对照组肝癌细胞转染野生型Flag-TRIM7质粒,阴性对照组肝癌细胞转染Flag-pENTER空载体质粒,应用western blot验证Flag-TRIM7、Flag-TRIM7△RING 和 Flag-TRIM7△B30.2/SPRY 的表达水平,应用 CCK-8、Transwell和克隆形成实验分别检测HepG2和Huh7肝癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力,研究TRIM7是否是通过其功能性结构域发挥对肝癌的抑癌效应。8.裸鼠肝癌异种移植瘤模型研究TRIM7对肝癌的作用效应和分子机制8.1应用TRIM7外源性过表达的裸鼠肝癌异种移植瘤模型研究TRIM7对肝癌的作用效应和分子机制取7只雄性裸鼠（5周大）,将肝癌细胞（1 × 107细胞/侧）在裸鼠双侧腋窝进行皮下接种,以构建裸鼠肝癌异种移植瘤模型。待裸鼠腋下形成肉眼可见的肿瘤后,在裸鼠一侧腋下形成的肿瘤瘤内注射Flag-TRIM7质粒,同时在另一侧腋下对照组瘤内注射Flag-pENTER空载体质粒,隔天注射一次,由此构建TRIM7外源性过表达的裸鼠肝癌异种移植瘤模型。在裸鼠肝癌异种移植瘤生长的过程中,测量并计算瘤体大小,绘制瘤体的生长曲线。肉眼可见的肿瘤形成17天后,将裸鼠处死,对肿瘤进行分离。对裸鼠肿瘤的体积进行测量并计算,对裸鼠肿瘤的重量进行称量,并进行统计分析,检测外源性过表达TRIM7对裸鼠肿瘤的体积和重量的影响。将分离的裸鼠瘤体提取蛋白质,应用western blot检测裸鼠瘤体中TRIM7的表达水平和Src-mTORC1-S6K1信号轴的相关分子的活化水平,检测外源性过表达TRIM7对裸鼠肝癌异种移植瘤内Src-mTORC1-S6K1信号轴的影响。8.2应用TRIM7稳定过表达的裸鼠肝癌异种移植瘤模型研究TRIM7对肝癌的作用效应和分子机制取5只雄性裸鼠（5周大）,将稳定过表达TRIM7的Huh7肝癌细胞及其对照组肝癌细胞（1×107细胞/侧）分别在裸鼠双侧腋窝进行皮下接种,由此构建肝癌细胞来源的TRIM7稳定过表达的裸鼠异种移植瘤模型。在裸鼠肝癌异种移植瘤生长的过程中,测量并计算瘤体大小,绘制瘤体的生长曲线。肉眼可见的肿瘤形成21天后,将裸鼠处死,对肿瘤进行分离。对裸鼠肿瘤的体积进行测量并计算,对裸鼠肿瘤的重量进行称量,并进行统计分析,检测稳定过表达TRIM7对裸鼠肿瘤的体积和重量的影响。将分离的裸鼠瘤体提取蛋白质,应用western blot检测裸鼠瘤体中TRIM7的表达水平和Src-mTORCI-S6K1信号轴相关分子的活化水平,检测稳定过表达TRIM7对裸鼠肝癌异种移植瘤内Src-mTORC1-S6K1信号轴的影响。8.3应用TRIM7敲除的裸鼠肝癌异种移植瘤模型研究TRIM7对肝癌的作用效应和分子机制取5只雄性裸鼠（5周大）,将基于CRISPR/Cas9系统的TRIM7基因敲除的Huh7肝癌细胞及其对照组肝癌细胞（1 × 107细胞/侧）分别在裸鼠双侧腋窝进行皮下接种,由此构建肝癌细胞来源的TRIM7敲除的裸鼠异种移植瘤模型。在裸鼠肝癌异种移植瘤生长的过程中,测量并计算瘤体大小,绘制瘤体的生长曲线。肉眼可见的肿瘤形成21天后,将裸鼠处死,对肿瘤进行分离。对裸鼠肿瘤的体积进行测量并计算,对裸鼠肿瘤的重量进行称量,并进行统计分析,检测敲除TRIM7对裸鼠肿瘤的体积和重量的影响。将分离的裸鼠瘤体提取蛋白质,应用western blot检测裸鼠瘤体中TRIM7的表达水平和Src-mTORC1-S6K1信号轴的相关分子的活化水平,检测敲除TRIM7对裸鼠肝癌异种移植瘤内Src-mTORC1-S6K1信号轴的影响。研究结果1.与非癌肝组织相比,TRIM7在肝癌组织中的表达显着下调1.1肝癌组织中TRIM7的表达水平显着下调应用IHC检测TRIM7在肝癌组织及其相对应的远端非癌肝组织中的表达定位和表达水平。实验结果显示,TRIM7主要表达在肝癌细胞及远端非癌肝细胞的胞浆内。对IHC结果进行统计分析,结果显示,与远端非癌肝组织相比,TRIM7在肝癌组织中的表达显着降低。卡方检验结果显示,与相配对的非癌肝组织相比,肝癌组织中TRIM7的表达水平显着下调。1.2肝癌组织中TRIM7的蛋白表达水平显着下调应用western blot检测TRIM7在肝癌组织及其对应的远端非癌肝组织的蛋白表达水平,并进行统计分析。结果显示,与非癌肝组织相比,肝癌组织中TRIM7的蛋白表达水平显着下调。1.3肝癌组织中TRIM7的mRNA水平显着下调应用real-time PCR检测TRIM7在肝癌组织及其对应的远端非癌肝组织中的mRNA水平,并进行统计分析。结果显示,与非癌肝组织相比,肝癌组织中TRIM7的mRNA水平显着降低。2.TRIM7显着抑制肝癌细胞的恶性行为能力2.1过表达TRIM7显着抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力在成功构建的TRIM7瞬时过表达的HepG2和Huh7肝癌细胞模型和TRIM7稳定过表达的Huh7肝癌细胞模型及其相应的肝癌细胞对照组中,分别检测HepG2和Huh7肝癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力。结果显示,与对照组相比,瞬时或稳定过表达TRIM7能够显着降低HepG2和Huh7肝癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力。这表明过表达TRIM7能够对肝癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力产生显着的抑制效应。2.2抑制或敲除TRIM7显着增强肝癌细胞的增值、侵袭和克隆形成能力在成功构建的Si-TRIM7瞬时转染的HepG2和Huh7肝癌细胞模型、慢病毒介导的Sh-TRIM7稳定转染的Huh7肝癌细胞系和基于CRISPR/Cas9系统的TRIM7基因敲除的Huh7肝癌细胞系及其相应的肝癌细胞对照组中,分别检测Huh7肝癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力。结果显示,与对照组相比,抑制或敲除TRIM7能够显着提高Huh7肝癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力。这表明抑制或敲除TRIM7能够对肝癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力产生显着的增强效应。3.TRIM7与Src直接结合3.1 TRIM7与Src的相互结合效应3.1.1外源性TRIM7与外源性Src相互结合在HEK293T细胞和Huh7肝癌细胞中共转染Flag-TRIM7和HA-Src质粒,对照组细胞中共转染Flag-pENTER空载体和HA-Src质粒,进行Co-IP实验。结果显示,Flag-TRIM7与HA-Src发生结合。这表明外源性TRIM7与外源性Src相互结合。3.1.2外源性TRIM7与内源性Src相互结合在HEK293T细胞和Huh7肝癌细胞中转染Flag-TRIM7质粒,对照组细胞中转染Flag-pENTER空载体质粒,进行Co-IP实验。结果显示,Flag-TRIM7与内源性Src发生结合。这表明外源性TRIM7与内源性Src相互结合。3.1.3内源性TRIM7与内源性Src相互结合在Huh7肝癌细胞中,应用TRIM7抗体进行Co-IP实验,结果显示内源性TRIM7可以和内源性Src发生结合。进一步在Huh7肝癌细胞中,应用Src抗体进行Co-IP实验,结果显示,内源性Src可以和内源性TRIM7发生结合。这表明TRIM7和Src是肝癌细胞内互相结合的分子。3.1.4 TRIM7与Src在体外直接结合在蛋白质体外转录与翻译系统中分别合成Flag-TRIM7和HA-Src蛋白,将体外合成的两种蛋白混合,进行Co-IP实验。结果显示,体外合成的Flag-TRIM7与HA-Src蛋白可以在体外发生直接结合。这表明TRIM7与Src可以在体外发生直接结合。3.2 TRIM7的B30.2/SPRY结构域和Src的SH2结构域介导二者发生结合3.2.1 TRIM7通过B30.2/SPRY结构域介导与Src的结合作用构建一系列TRIM7结构域缺失的截短体。在HEK293T细胞中,分别将各个TRIM7截短体质粒与HA-Src质粒共转染,进行Co-IP实验。结果显示,B30.2/SPRY结构域缺失后,TRIM7失去了与Src发生结合的能力,而其它结构域缺失的TRIM7仍然能够与Src发生结合。这表明TRIM7的B30.2/SPRY结构域介导了其与Src的结合效应。3.2.2 Src通过SH2结构域介导与TRIM7的结合作用构建一系列Src结构域缺失的截短体。在HEK293T细胞中,分别将各个Src截短体质粒与Flag-TRIM7质粒共转染,进行Co-IP实验。结果显示,SH2结构域缺失后,Src失去了与TRIM7发生结合的能力,而其它结构域缺失的Src仍然能够与TRIM7发生结合。这表明Src的SH2结构域介导了其与TRIM7的结合效应。4.TRIM7对Src蛋白的负向调控效应4.1过表达TRIM7显着抑制Src的蛋白表达水平及磷酸化水平在成功构建的TRIM7瞬时过表达的HepG2和Huh7肝癌细胞模型和TRIM7稳定过表达的Huh7肝癌细胞模型及其相应的肝癌细胞对照组中,应用western blot检测Src和p-Src（Tyr419）的蛋白水平。结果显示,瞬时或稳定过表达TRIM7后,Src和p-Src（Tyr419）的水平显着下调。这表明过表达TRIM7显着抑制Src的蛋白表达水平及磷酸化水平。4.2抑制或敲除TRIM7显着提高Src的蛋白水平及磷酸化水平在成功构建的Si-TRIM7瞬时转染的HepG2和Huh7肝癌细胞模型、慢病毒介导的Sh-TRIM7稳定转染的Huh7肝癌细胞系和基于CRISPR/Cas9系统的TRIM7基因敲除的Huh7肝癌细胞系及其分别的对照组肝癌细胞中,应用western blot检测Src和p-Src（Tyr419）的水平。结果显示,抑制或敲除TRIM7后,Src和p-Src（Tyr419）的蛋白水平显着上调。这表明抑制或敲除TRIM7显着提高Src的蛋白水平及磷酸化水平。4.3 TRIM7不影响Src的mRNA水平4.3.1过表达TRIM7不影响Src的mRNA水平在HepG2和Huh7肝癌细胞中转染Flag-TRIM7质粒,对照组肝癌细胞中转染Flag-pENTER空载体质粒,进行real-time PCR实验。结果显示,干扰TRIM7表达后,Src的mRNA水平没有发生显着变化。4.3.2抑制TRIM7不影响 Src的mRNA水平在HepG2肝癌细胞中分别转染Si-TRIM7-1或Si-TRIM7-2,对照组肝癌细胞转染Si-NC,进行real-time PCR实验。结果显示,抑制TRIM7后,Src的mRNA水平没有发生显着的变化。上述结果显示,TRIM7能够对Src的蛋白表达水平产生显着的负向调控效应,但对Src的mRNA水平没有显着的影响。这提示,TRIM7对Src的负向调控效应发生在蛋白翻译水平,而非转录水平。4.4在肝癌组织中TRIM7与Src的表达水平呈显着负相关应用IHC检测58例临床患者的肝癌组织中Src的表达水平,并统计分析肝癌组织中TRIM7和Src表达水平的相关性。结果显示,肝癌组织中TRIM7和Src的表达水平呈显着的负相关。4.5 TRIM7促进Src蛋白的降解在HepG2和Huh7肝癌细胞中转染Flag-TRIM7质粒,对照组肝癌细胞转染Flag-pENTER空载体质粒,应用CHX阻断HepG2和Huh7肝癌细胞内蛋白的从头合成,应用western blot实验检测Src的蛋白水平。结果显示,过表达TRIM7后Src蛋白的降解速率显着提高。这表明TRIM7能够对Src蛋白的稳定性产生显着的破坏,对Src蛋白的降解产生显着的促进作用。4.6 TRIM7介导Src蛋白通过蛋白酶体途径降解在HepG2肝癌细胞中转染Flag-TRIM7质粒,分别应用蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂氯喹抑制蛋白酶体或溶酶体的活性,应用western blot实验检测Src的蛋白水平。结果显示,应用MG132抑制蛋白酶体活性之后,TRIM7失去了对Src的负向调控效应,而应用氯喹抑制溶酶体活性之后,TRIM7仍然能够对Src产生负向调控效应。这提示TRIM7通过蛋白酶体途径负向调控Src的蛋白水平。5.TRIM7通过RING结构域介导Src发生K48位泛素化降解5.1 TRIM7介导Src发生泛素化修饰5.1.1外源性TRIM7介导Src发生泛素化修饰在HEK293T细胞中,共转染HA-UB、Flag-TRIM7和HA-Src质粒,对照组细胞中共转染HA-UB、Flag-pENTER空载体和HA-Src质粒,应用Co-IP实验检测外源性和内源性Src的泛素化修饰状态。结果显示,外源性TRIM7能够将泛素链添加到Src上,提示TRIM7能够介导Src发生泛素化修饰。5.1.2外源性TRIM7介导内源性Src发生泛素化修饰在HEK293T细胞中,共转染HA-UB和Flag-TRIM7质粒,对照组细胞分别单独转染Flag-pENTER空载体、Flag-TRIM7或HA-UB质粒,应用Co-IP实验检测内源性Src的泛素化修饰状态。结果显示,外源性TRIM7能够将泛素链添加到内源性Src上,提示TRIM7能够介导内源性Src发生泛素化修饰。5.1.3 TRIM7在体外直接介导Src发生泛素化修饰应用蛋白质体外转录与翻译系统合成Flag-TRIM7蛋白和HA-Src蛋白,将二者与Ubiquitin、UBE1、UbcH5a（UBE2D1）、MgC12和ATP共同孵育,形成体外泛素化系统。应用western blot检测Src的泛素化修饰状态。结果显示,在体外泛素化系统中,TRIM7能够将泛素链添加到Src上。这表明TRIM7在体外直接介导Src发生泛素化修饰,提示TRIM7是直接介导Src发生泛素化修饰的E3泛素连接酶。5.2 TRIM7介导Src发生K48位泛素化修饰在 HEK293T 细胞中,分别将 HA-UB-K11、HA-UB-K48 或 HA-UB-K63 与Flag-TRIM7和HA-Src质粒进行共转染,对照组细胞中分别将HA-UB-K11、HA-UB-K48或HA-UB-K63与Flag-pENTER空载体和HA-Src质粒进行共转染。Co-IP结果显示,TRIM7能够将K48位泛素链添加到Src上。这表明TRIM7能够介导Src发生K48位泛素化修饰,并进一步验证了 TRIM7能够诱导Src通过泛素-蛋白酶体途径发生降解。5.3 TRIM7通过RING结构域介导Src发生泛素化修饰在HEK293T细胞中,共转染HA-UB与Flag-TRIM7 △ RING质粒,阳性对照组细胞共转染HA-UB与野生型Flag-TRIM7质粒,阴性对照组细胞共转染HA-UB与Flag-pENTER空载体质粒。Co-IP结果显示,RING结构域缺失的TRIM7不能将泛素链添加到Src上。这表明TRIM7通过RING结构域介导Src发生泛素化修饰。6.TRIM7通过抑制Src-mTORC1-S6K1信号轴对肝癌发挥抑癌效应6.1 TRIM7显着抑制mTORC1-S6K1信号通路的活化6.1.1过表达TRIM7显着抑制mTORC1-S6K1信号通路的活化水平在成功构建的TRIM7瞬时过表达的HepG2和Huh7肝癌细胞模型和TRIM7稳定过表达的Huh7肝癌细胞系及其相应的肝癌细胞对照组中,应用western blot检测 TRIM7、Src 及 p-mTOR、p-S6K1、p-S6 和 p-4E-BP1 等 mTORC1-S6K1 信号通路分子的蛋白水平。结果显示,瞬时或稳定过表达TRIM7后,Src的蛋白表达水平和mTORC1-S6K1信号通路分子的磷酸化水平显着下调。这表明,过表达TRIM7能够显着抑制Src的蛋白表达水平及mTORC1-S6K1信号通路的活化水平。6.1.2抑制或敲除TRIM7显着提高mTORC1-S6K1信号通路的活化水平在成功构建的Si-TRIM7瞬时转染的HepG2和Huh7肝癌细胞模型、慢病毒介导的Sh-TRIM7稳定转染的Huh7肝癌细胞系和基于CRISPR/Cas9系统的TRIM7基因敲除的Huh7肝癌细胞系及其相应的肝癌细胞对照组中,应用western blot检测TRIM7、Src的表达水平及mTORC1-S6K1信号通路分子的磷酸化水平。结果显示,抑制或敲除TRIM7后,Src的蛋白表达水平和mTORC1-S6K1信号通路分子的磷酸化水平显着上调。这表明抑制或敲除TRIM7能够显着提高Src的蛋白表达水平及mTORC1-S6K1信号通路的活化水平。6.2 TRIM7通过下调Src抑制mTORC1-S6K1倍号通路的活化在过表达TRIM7的Huh7肝癌细胞中,外源性过表达Src,应用western blot检测TRIM7、Src和p-Src（Tyr419）的水平及mTORC1-S6K1信号通路分子的磷酸化水平。结果显示,过表达Src能够显着逆转TRIM7对mTORC1-S6K1信号通路的抑制效应。在Huh7肝癌细胞中,分别转染Si-TRM7-1、Si-TRM7-2或Si-NC,用雷帕霉素抑制mTORC1信号通路的活性,应用western blot检测TRIM7的表达水平、mTORCI-S6K1信号通路分子的磷酸化水平及Src和p-Src（Tyr419）的水平。结果显示,雷帕霉素能够显着逆转TRIM7表达降低引起的mTORC1信号通路的活性增强,但不影响Src和p-Src（Tyr419）的水平。以上实验显示,mTORC1信号通路处于TRIM7介导的Src负向调控的下游,TRIM7显着抑制肝癌细胞中Src的表达与活化及其下游mTORC1-S6K1信号通路活化。这表明TRIM7通过下调Src抑制mTORC1-S6K1信号通路的活化,TRIM7能够抑制肝癌细胞中Src-mTORC1-S6K1信号轴的活性。6.3 TRIM7通过抑制Src-mTORC1-S6K1信号轴的活性发挥其抗肿瘤作用6.3.1 TRIM7通过负向调控Src发挥其抗肿瘤作用在过表达TRIM7的HepG2和Huh7肝癌细胞中,外源性过表达Src,应用western blot验证Flag-TRIM7和HA-Src的表达水平,应用CCK-8、Transwell和克隆形成实验分别检测肝癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力。实验结果显示,Src的外源性过表达显着逆转了 TRIM7对肝癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力的抑制效应。这表明TRIM7通过负向调控Src发挥其对肝癌的抑癌效应。6.3.2 TRIM7通过负向调控mTORC1-S6K1信号通路发挥其抗肿瘤作用在HepG2肝癌细胞中,分别转染Si-TRM7-1、Si-TRM7-2或Si-NC,用雷帕霉素抑制mTORC1信号通路的活性,应用western blot检测TRIM7的表达水平、mTORC1-S6K1信号通路分子的磷酸化水平及Src和p-Src（Tyr419）的水平,应用CCK-8、Transwell和克隆形成实验分别检测细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力。实验结果显示,雷帕霉素能够显着逆转TRIM7表达降低引起的mTORC1信号通路的活性增强,并有效地逆转TRIM7表达降低引起的肝癌细胞增殖、侵袭和克隆形成能力的增强。这表明,TRIM7通过抑制mTORC1-S6K1信号通路的活化发挥对肝癌的抑制效应。以上实验结果表明,TRIM7通过抑制Src-mTORC1-S6K1信号轴的活化发挥对肝癌的抑癌效应。7.TRIM7通过其功能性结构域抑制Src-mTORC1-S6K1信号轴发挥对肝癌的抑癌效应我们的研究显示,TRIM7通过其B30.2/SPRY结构域介导与Src蛋白的直接结合,通过其RING结构域介导Src发生K48位泛素化修饰。因此,RING结构域和B30.2/SPRY结构域是TRIM7发挥其功能的关键性结构域。7.1 TRIM7通过其功能性结构域抑制Src-mTORC1-S6K1信号轴在Huh7肝癌细胞中分别转染TRIM7功能域缺失的表达载体Flag-TRIM7△RING或Flag-TRIM7△B30.2/SPRY质粒,阳性对照组肝癌细胞转染野生型Flag-TRIM7质粒,阴性对照组肝癌细胞转染Flag-pENTER空载体质粒,应用western blot 验证 Flag-TRIM7、Flag-TRIM7 △ RING 和 Flag-TRIM7 △ B30.2/SPRY的表达水平,并检测Src-mTORC1-S6K1信号轴的活性。结果显示,缺失RING结构域或B30.2/SPRY结构域的TRIM7失去了对Src-mTORC1-S6K1信号轴的抑制效应。这说明TRIM7通过其RING结构域和B30.2/SPRY结构域抑制Src-mTORC1-S6K1信号轴的活化。7.2 TRIM7通过其功能性结构域发挥其抗肿瘤作用在HepG2和Huh7肝癌细胞中分别转染Flag-TRIM7 △ RING或Flag-TRIM7 A B30.2/SPRY质粒,阳性对照组肝癌细胞转染野生型Flag-TRIM7质粒,阴性对照组肝癌细胞转染Flag-pENTER空载体质粒,应用western blot验证Flag-TRIM7、Flag-TRIM7△RING 和 Flag-TRIM7△B30.2/SPRY 的表达水平,应用 CCK-8、Transwell和克隆形成实验分别检测肝癌细胞的增殖、侵袭和克隆形成能力。实验结果显示,缺失RING结构域或B30.2/SPRY结构域的TRIM7失去了对肝癌细胞增殖、侵袭和克隆形成能力的抑制效应。这表明TRIM7通过其功能性结构域RING和B30.2/SPRY结构域发挥其对肝癌的抑癌效应。8.裸鼠肝癌异种移植瘤实验验证TRIM7对肝癌的抑癌效应和分子机制8.1 TRIM7外源性过表达的裸鼠肝癌异种移植瘤模型验证TRIM7对肝癌的抑癌效应和分子机制构建裸鼠肝癌异种移植瘤模型,将Flag-TRIM7质粒（30μg）注射在裸鼠一侧腋下形成的肿瘤瘤内,同时将Flag-pENTER空载体质粒（30μg）注射在另一侧腋下对照组瘤内,隔天注射一次,由此构建TRIM7外源性过表达的裸鼠肝癌异种移植瘤模型。裸鼠肿瘤的生长曲线显示,与对照组相比,TRIM7外源性过表达组的裸鼠瘤体生长受到显着抑制。肉眼可见的肿瘤形成17天后处死裸鼠,分离瘤体,结果显示,TRIM7外源性过表达组的裸鼠肿瘤显着小于对照组。对瘤体的大小与重量进行测量,结果显示,与对照组相比,TRIM7外源性过表达组的裸鼠瘤体的体积和重量显着降低。这表明外源性过表达TRIM7能够显着抑制裸鼠瘤体的生长,并降低裸鼠瘤体的体积与重量。将分离的裸鼠瘤体进行western blot检测,结果显示,与对照组相比,TRIM7外源性过表达组的裸鼠瘤体中TRIM7表达量显着提高,这表明TRIM7外源性过表达的裸鼠肝癌异种移植瘤模型构建成功。应用western blot检测裸鼠瘤体中Src-mTORC1-S6K1信号轴的相关分子的活化水平,结果显示,TRIM7外源性过表达组的裸鼠瘤体中Src-mTORC1-S6K1信号轴的活性受到显着抑制。这表明外源性过表达TRIM7能够显着抑制裸鼠肝癌异种移植瘤内Src-mTORC1-S6K1信号轴的活性。8.2 TRIM7稳定过表达的裸鼠肝癌异种移植瘤模型验证TRIM7对肝癌的抑癌效应和分子机制应用TRIM7稳定过表达的Huh7肝癌细胞系构建TRIM7稳定过表达的裸鼠肝癌异种移植瘤模型。裸鼠肿瘤的生长曲线显示,与对照组相比,TRIM7稳定过表达组的裸鼠瘤体生长受到显着抑制。肉眼可见的肿瘤形成21天后处死裸鼠,分离瘤体,结果显示TRIM7稳定过表达组的裸鼠瘤体显着小于对照组。测量裸鼠瘤体的大小与重量,结果显示,与对照组相比,TRIM7稳定过表达组的裸鼠肿瘤的体积和重量显着降低。这表明稳定过表达TRIM7能够显着抑制裸鼠瘤体的生长,并降低裸鼠瘤体的体积与重量。将分离的裸鼠瘤体进行western blot检测,结果显示,与对照组相比,TRIM7稳定过表达组的裸鼠瘤体中TRIM7表达量显着提高,这表明TRIM7稳定过表达的裸鼠肝癌异种移植瘤模型构建成功。应用western blot检测裸鼠瘤体中Src-mTORC1-S6K1信号轴的相关分子的活化水平,结果显示,TRIM7稳定过表达组的裸鼠肝癌异种移植瘤中Src-mTORC1-S6K1信号轴的活性受到显着抑制。这表明稳定过表达TRIM7能够显着抑制裸鼠瘤体中的Src-mTORC1-S6K1信号轴的活性。8.3 TRIM7敲除的裸鼠肝癌异种移植瘤模型验证TRIM7对肝癌的抑癌效应和分子机制应用基于CRISPR/Cas9体系建立的TRIM7敲除的Huh7肝癌细胞系构建TRIM7敲除的裸鼠异种移植瘤模型。裸鼠肿瘤生长曲线显示,与对照组相比,TRIM7敲除组的裸鼠瘤体生长显着加快。肉眼可见的肿瘤形成21天后处死裸鼠,分离瘤体,结果显示TRIM7敲除组的裸鼠瘤体显着大于对照组。测量并计算裸鼠瘤体的体积与重量,结果显示,与对照组相比,TRIM7敲除组裸鼠瘤体的体积和重量显着高于对照组。这表明敲除TRIM7能够显着加快裸鼠肿瘤的生长,并提高裸鼠瘤体的体积与重量。将分离的裸鼠瘤体进行western blot检测,结果显示,与对照组相比,TRIM7敲除组的TRIM7表达显着敲除,这表明TRIM7敲除的裸鼠肝癌异种移植瘤模型构建成功。应用western blot检测裸鼠瘤体中Src-mTORC1-S6K1信号轴的相关分子的活化水平,结果显示,TRIM7敲除组的裸鼠瘤体中Src-mTORC1-S6K1信号轴的活性显着增强。这表明敲除TRIM7能够显着活化裸鼠瘤体中的Src-mTORC1-S6K1信号轴。结论1.通过对肝癌临床标本、肝癌细胞模型与裸鼠肝癌异种移植瘤模型的研究,结果显示,TRIM7在肝癌中发挥抑癌效应,其在肝癌中的表达下调可能参与了肝癌的发生和进展。2.TRIM7的B30.2/SPRY结构域与Src的SH2结构域共同介导了二者的结合,TRIM7通过RING结构域介导Src发生K48位泛素化修饰,进而诱导其通过泛素-蛋白酶体途径发生降解。3.TRIM7通过抑制Src-mTORC1-S6K1信号轴的活化发挥对肝癌的抑癌效应。创新点及意义1.本课题首次证实了在临床肝癌组织中TRIM7的表达显着降低,进一步的研究提示TRIM7在肝癌组织中的低表达可能参与了肝癌的进展。这提示TRIM7可以作为一种潜在的肝癌进展和预后判定的生物标志物。2.TRIM7通过其B30.2/SPRY结构域与Src的SH2结构域发生结合,通过RING结构域介导Src发生K48位泛素化修饰,进而诱导其通过泛素-蛋白酶体途径降解,并进一步抑制其下游的mTORC1-S6K1信号通路,从而对肝癌的进展产生了显着的抑制效应,这为临床上研究肝癌新型治疗策略提供了实验和分子理论基础。
二、p53蛋白泛素化修饰的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、p53蛋白泛素化修饰的研究进展（论文提纲范文）
（1）线性泛素化信号通路调控胃癌恶性进展的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 去泛素化酶OTULIN对胃癌恶性生物学行为的影响及机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 SHARPIN对胃癌恶性生物学行为的影响及机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 泛素化修饰在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
| 学位论文自评表 |
| 致谢 |
（2）PRDX2增加p53泛素化促进结直肠癌细胞增殖的机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 PRDX2促进结直肠癌细胞增殖 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 PRDX2增加p53泛素化及其机制 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 泛素化失调和肿瘤 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
（3）转录因子Snail的去泛素化调节在食管鳞状细胞癌发生发展中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 1. 上皮间质转化相关转录因子Snail在食管癌中高表达 |
| 2. 去泛素化酶PSMD14通过调控Snail蛋白稳定性促进人食管鳞状细胞癌的肿瘤转移 |
| 3. 去泛素化酶OTUB1通过调控Snail蛋白稳定性促进人食管鳞状细胞癌的肿瘤转移 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 已发表与学位论文相关的英文论文 |
| 文献综述 去泛素化酶在肿瘤转移中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者致谢 |
| 个人简历 |
（4）MDM4基因rs1380576多态性与癌症风险的Meta分析及其分子机制初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 癌症与p53 |
| 1.1.1 癌症基本介绍 |
| 1.1.2 遗传因素与癌症发生 |
| 1.1.3 p53 背景介绍 |
| 1.1.4 p53 重要生理作用 |
| 1.2 MDM基因家族研究进展 |
| 1.2.1 MDM家族基因简介 |
| 1.2.2 MDM2 蛋白生理功能 |
| 1.3 MDM4 与癌症的研究现状 |
| 1.3.1 MDM4 背景介绍 |
| 1.3.2 MDM4 生理功能 |
| 1.3.3 MDM4 基因上的SNP与癌症风险的研究进展 |
| 1.4 本项研究的目的与意义 |
| 第二章 rs1380576 与癌症风险的Meta分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 文献检索与搜集 |
| 2.2.2 文献纳入排除标准 |
| 2.2.3 数据提取与预处理 |
| 2.2.4 Meta分析 |
| 2.3 Meta分析结果及讨论 |
| 2.3.1 不同研究中的对照组哈迪温伯格检验 |
| 2.3.2 等位基因模型下rs1380576 与癌症风险 |
| 2.3.3 显性模型下rs1380576 与癌症风险 |
| 2.3.4 加性模型下rs1380576 与癌症风险 |
| 2.3.5 隐性模型下rs1380576 与癌症风险 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 rs1380576 与癌症相关性的Meta分析结论 |
| 2.4.2 讨论 |
| 第三章 rs1380576 体外功能实验 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验试剂与耗材 |
| 3.2.2 rs1380576 不同等位基因(G和C)的获取 |
| 3.2.3 胶回收纯化目的片段 |
| 3.2.4 获得TA阳性克隆 |
| 3.2.5 TA克隆普通质粒提取 |
| 3.2.6 重组pGL3 质粒载体 |
| 3.2.7 去内毒素提取pGL3 质粒 |
| 3.2.8 细胞铺板和质粒转染 |
| 3.2.9 荧光素酶活性检测 |
| 3.2.10 核抽提物的提取 |
| 3.2.11 BCA法测定核抽提物浓度 |
| 3.2.12 凝胶迁移阻滞实验(EMSA) |
| 3.3 rs1380576 体外功能验证实验结果与讨论 |
| 3.3.1 DNA样本测序结果 |
| 3.3.2 重组荧光素酶载体的构建 |
| 3.3.3 重组Promoter载体在HEK293,A375和A549 细胞系实验结果 |
| 3.3.4 重组Enhancer载体在HEK293,A375和A549 细胞系实验结果 |
| 3.3.5 rs1380576的EMSA实验结果与讨论 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 rs1380576 的体外功能实验结果 |
| 3.4.2 讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 研究结论及创新点 |
| 4.1.1 研究结论 |
| 4.1.2 本研究创新点 |
| 4.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 个人简历及攻读硕士学位期间成果清单 |
（5）RNF126通过介导p53泛素化降解影响结直肠癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:RNF126 与p53 在结直肠癌组织中的表达差异及与临床病例参数的相关性 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂抗体和耗材 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 免疫组化(Immunohistochemistry,IHC) |
| 2.3.2 免疫印迹(Western blot,WB) |
| 2.3.3 实时定量逆转录聚合酶链式反应(Quantitaive real-time polymerasechain reaction,q RT-PCR) |
| 2.3.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 RNF126 在结直肠癌组织中的表达差异以及RNF126与p53 在结直肠癌组织中的表达相关性 |
| 3.1.1 免疫组化检测RNF126 在结直肠癌组织中的差异表达 |
| 3.1.2 RNF126 与p53 在结直肠癌组织中的表达相关性 |
| 3.1.3 免疫印迹法和q RT-PCR检测RNF126 在结直肠癌中的差异表达 |
| 3.2 RNF126 的表达与临床病理参数和结直肠癌患者术后生存的相关性分析 |
| 3.2.1 RNF126 的表达与临床病理参数的相关性 |
| 3.2.2 RNF126 及p53 的表达与结直肠癌患者术后生存时间的关系 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:RNF126、p53 和p21 在结直肠癌细胞中的表达相关性及分子机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂和抗体 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 免疫印迹(Western blot,WB) |
| 2.3.3 实时定量逆转录聚合酶链式反应(Quantitaive real-time polymerasechain reaction,q RT-PCR) |
| 2.3.4 siRNA瞬转实验 |
| 2.3.5 免疫共沉淀 |
| 3 结果 |
| 3.1 RNF126 在不同的结直肠癌细胞系中的表达情况 |
| 3.2 RNF126、p53、p21和p Rb在 mt P53 结直肠癌细胞中的表达相关性 |
| 3.3 RNF126、p53、p21和p Rb在 wt P53 结直肠癌细胞中的表达相关性 |
| 3.4 通过 qRt-PCR 在 RNF126 沉默或过表达的结直肠癌细胞中检测 p53和 p21 的 mRNA 表达情况 |
| 3.5 免疫共沉淀验证RNF126、p53 和p21 的相关性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:RNF126对CRC细胞增殖、迁移、侵袭以及化疗药物敏感性的调控 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂和抗体 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 MTT实验-细胞增殖 |
| 2.3.2 MMT实验-细胞耐药 |
| 2.3.3 细胞侵袭和迁移实验 |
| 2.3.4 细胞周期实验 |
| 2.3.5 体内实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 HCT116 结直肠癌细胞的迁移和侵袭实验 |
| 3.2 HCT-8 结直肠癌细胞的迁移和侵袭实验 |
| 3.3 RNF126 对于结直肠癌细胞增殖的作用 |
| 3.4 RNF126 对于结直肠癌细胞的细胞周期的作用 |
| 3.5 RNF126 对于结直肠癌细胞的细胞周期的作用 |
| 3.6 RNF126 对于结直肠癌细胞的化疗药敏感性的作用 |
| 3.7 体内实验验证RNF126 对裸鼠移植瘤的作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 泛素化连接酶 E3 及其在结直肠癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）多西环素诱导布鲁杆菌S2株侵染的人小胶质细胞凋亡的相关机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 布鲁杆菌S2株侵染HMC3细胞后内质网相关泛素化蛋白筛选 |
| 图文摘要 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 结果 |
| 1.STR基因型检测证实细胞为HMC3细胞 |
| 2.柯兹洛夫斯基染色证实菌株为布鲁杆菌 |
| 3.布鲁杆菌S2株对p-IRE1,cleaved Caspase-12及cleaved Caspase-3蛋白水平的影响 |
| 4.布鲁杆菌S2株对IRE1,Caspase-12及Caspase-3 mRNA表达水平的影响 |
| 5.布鲁杆菌S2株对HMC3细胞ER的影响 |
| 6.布鲁杆菌S2株影响p-JNK与p-p53蛋白水平 |
| 7.布鲁杆菌S2株影响JNK与p53 mRNA表达水平 |
| 8.布鲁杆菌S2株对HMC3细胞凋亡的影响 |
| 9.泛素化修饰鉴定总览 |
| 10.差异泛素化修饰蛋白的GO注释分类 |
| 11.差异泛素化修饰蛋白的亚细胞定位分类 |
| 12.差异泛素化修饰蛋白的COG/KOG功能分类 |
| 13.差异泛素化修饰蛋白的GO功能富集分析 |
| 14.差异泛素化修饰蛋白的KEGG通路富集分析 |
| 15.CALR泛素化修饰下调及验证 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 布鲁杆菌S2株通过增加CALR水平抑制HMC3细胞凋亡 |
| 图文摘要 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 结果 |
| 1.过表达及干扰载体图谱 |
| 2.各HMC3细胞株CALR蛋白及mRNA表达验证 |
| 3.CALR抑制p-IRE1,cleaved Caspase-12及cleaved Caspase-3蛋白水平 |
| 4.CALR维持ER结构及细胞内钙离子含量稳定 |
| 5.CALR抑制p-JNK与p-p53蛋白水平 |
| 6.CALR抑制p-JNK蛋白核转运 |
| 7.CALR抑制HMC3细胞凋亡 |
| 8.布鲁杆菌S2株增加HMC3细胞CALR水平 |
| 9.布鲁杆菌S2株通过增加CALR水平抑制IRE1/Caspase-3信号通路 |
| 10.布鲁杆菌S2株抑制IRE1, Caspase-12, Caspase-9及Caspase-3 mRNA表达 |
| 11.布鲁杆菌S2株对ER及细胞内钙离子含量的影响 |
| 12.布鲁杆菌S2株通过增加CALR水平抑制JNK/p53 信号通路 |
| 13.布鲁杆菌S2株抑制ASK1,MEK4,JNK及 p53 mRNA表达 |
| 14.布鲁杆菌S2株抑制p-JNK蛋白核转运 |
| 15.布鲁杆菌S2株抑制HMC3细胞凋亡 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 多西环素通过降低CALR水平诱导布鲁杆菌S2株侵染或未侵染的HMC3细胞凋亡 |
| 图文摘要 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 结果 |
| 1.多西环素对HMC3细胞CALR水平的影响 |
| 2.多西环素对HMC3细胞存活率及凋亡的影响 |
| 3.多西环素降低HMC3细胞CALR水平 |
| 4.多西环素通过降低CALR水平激活IRE1/Caspase-3信号通路 |
| 5.多西环素促进IRE1, Caspase-12, Caspase-9及Caspase-3 mRNA表达 |
| 6.多西环素损伤HMC3细胞ER并增加细胞内钙离子含量 |
| 7.多西环素通过降低CALR水平激活JNK/p53信号通路 |
| 8.多西环素促进ASK1,MEK4,JNK及 p53 mRNA表达 |
| 9.多西环素促进HMC3细胞p-JNK蛋白核转运 |
| 10.多西环素诱导HMC3细胞凋亡 |
| 11.多西环素降低布鲁杆菌S2株侵染的HMC3细胞CALR水平 |
| 12.多西环素激活布鲁杆菌S2株侵染的HMC3细胞IRE1/Caspase-3信号通路 |
| 13.多西环素促进感染细胞IRE1, Caspase-12, Caspase-9及Caspase-3 mRNA表达 |
| 14.多西环素损伤感染细胞的ER并增加细胞内钙离子含量 |
| 15.多西环素激活布鲁杆菌S2株侵染的HMC3细胞JNK/p53信号通路 |
| 16.多西环素促进感染细胞ASK1,MEK4,JNK及p53 mRNA表达 |
| 17.多西环素促进布鲁杆菌S2株侵染的HMC3细胞p-JNK蛋白核转运 |
| 18.多西环素促进布鲁杆菌S2株侵染的HMC3细胞凋亡 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 内质网应激介导的小胶质细胞凋亡在中枢神经系统炎症中的作用 |
| 1.小胶质细胞 |
| 1.1 小胶质细胞功能 |
| 1.2 小胶质细胞促炎信号 |
| 1.3 Caspases家族介导的凋亡与小胶质细胞活化 |
| 2.ER与ERS |
| 2.1 ER及其功能 |
| 2.2 ERS及其信号转导 |
| 3.小胶质细胞ERS凋亡与CNS炎症 |
| 3.1 神经退行性疾病相关的认知障碍 |
| 3.2 创伤性脑损伤 |
| 3.3 蛛网膜下腔出血 |
| 4.展望 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 攻读博士学位期间参与研究和申报的课题 |
| 个人简介 |
| 一般情况 |
| 学习与工作经历 |
| 开题、中期及学位论文答辩委员组成 |
| 1、开题报告专家小组成员 |
| 2、中期考核组成员 |
| 3、学位论文答辩委员会成员 |
（7）P53通路激活剂的筛选及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 P53的功能 |
| 1.2 P53蛋白的结构 |
| 1.3 环境刺激对P53通路的调控 |
| 1.4 P53的调控因子 |
| 1.5 P53与肿瘤 |
| 1.6 P53与肿瘤治疗 |
| 1.7 针对P53的药物研发策略:现状与思考 |
| 第二章 基于P53蛋白靶点的激活剂筛选及作用机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 计算机虚拟药物筛选 |
| 2.2.2 细胞活性及分子生物学检测 |
| 2.3 结果与结论 |
| 2.3.1 基于P53新型成药性构象的高通量虚拟筛选 |
| 2.3.2 P53 激活剂——窃衣素(Torilin)的发现 |
| 2.3.3 窃衣素激活P53通路 |
| 2.3.4 窃衣素激活P53所依赖的重要官能团 |
| 2.3.5 窃衣素的构效关系研究 |
| 2.4 总结与讨论 |
| 第三章 P53通路激活剂的高通量筛选及作用机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与结论 |
| 3.3.1 P53通路的激活剂——UNBS5162的发现 |
| 3.3.2 UNBS5162激活P53通路 |
| 3.3.3 UNBS5162特异性抑制P53野生型肿瘤的生长 |
| 3.3.4 UNBS5162激活P53通路的作用机制探索 |
| 3.3.5 UNBS5162的作用靶点探索 |
| 3.4 总结与讨论 |
| 第四章 研究意义与展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间研究成果 |
| 致谢 |
| 附录 |
（8）Sp-p53泛素化在拟穴青蟹（Scylla paramamosain）抗WSSV免疫中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 第一章 综述 |
| 1.1 拟穴青蟹研究背景 |
| 1.1.1 拟穴青蟹简介与养殖现状 |
| 1.1.2 拟穴青蟹的病害与防治 |
| 1.1.3 拟穴青蟹的先天性免疫 |
| 1.2 泛素化途径 |
| 1.2.1 泛素化途径的反应过程 |
| 1.2.2 泛素化途径的功能 |
| 1.2.3 无脊椎动物中的泛素化 |
| 1.3 p53 的研究进展 |
| 1.3.1 p53 的结构与功能 |
| 1.3.2 p53 的泛素化途径 |
| 1.3.3 无脊椎动物中p53 的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 拟穴青蟹Sp-p53 基因的克隆表达与其抑制WSSV复制功能的分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 菌株、病毒与载体 |
| 2.2.3 实验引物 |
| 2.2.4 主要试剂 |
| 2.2.5 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 Sp-p53 基因的克隆 |
| 2.3.2 生物信息学分析 |
| 2.3.3 Sp-p53 基因组织分布 |
| 2.3.4 重组蛋白的表达和纯化 |
| 2.3.5 Sp-p53 蛋白多克隆抗体制备 |
| 2.3.6 RNAi与 WSSV感染实验 |
| 2.3.7 WSSV分离提取与拷贝数检测 |
| 2.3.8 血细胞凋亡检测 |
| 2.3.9 ROS检测 |
| 2.3.10 ROS抑制与WSSV感染实验 |
| 2.3.11 检测WSSV感染后Sp-p53 的变化 |
| 2.3.12 抑制ROS水平与WSSV感染实验 |
| 2.3.13 检测WSSV感染后Sp-p53 蛋白泛素化水平变化 |
| 2.3.14 GST Pull down |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 Sp-p53 cDNA及氨基酸序列 |
| 2.4.2 Sp-p53 蛋白多序列比对和系统进化树分析 |
| 2.4.3 Sp-p53 组织分布 |
| 2.4.4 Sp-p53 重组蛋白的表达、纯化与抗体验证 |
| 2.4.5 Sp-p53 抑制 WSSV复制 |
| 2.4.6 Sp-p53 促进血细胞凋亡 |
| 2.4.7 Sp-p53 促进血细胞内ROS的产生 |
| 2.4.8 ROS水平影响血细胞的凋亡水平 |
| 2.4.9 WSSV感染青蟹后血细胞Sp-p53 的转录及翻译水平的变化 |
| 2.4.10 WSSV感染青蟹后血细胞Sp-p53 蛋白泛素化水平变化 |
| 2.4.11 Pull down实验筛选Sp-p53 蛋白的泛素连接酶 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 拟穴青蟹Sp-HUWE1 基因的克隆表达与其介导的Sp-p53 泛素化修饰的分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 菌株、载体和细胞系 |
| 3.2.3 实验引物 |
| 3.2.4 主要试剂 |
| 3.2.5 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 Sp-HUWE1 基因的克隆 |
| 3.3.2 Sp-HUWE1 基因组织分布 |
| 3.3.3 重组蛋白的表达和纯化 |
| 3.3.4 Sp-HUWE1 多克隆抗体的制备 |
| 3.3.5 RNAi实验 |
| 3.3.6 检测干扰Sp-HUWE1 后的Sp-p53 mRNA与蛋白 |
| 3.3.7 Sp-HUWE1与Sp-p53 蛋白在青蟹血细胞中的共定位 |
| 3.3.8 蛋白质Pull down实验 |
| 3.3.9 免疫共沉淀(Co-IP)检测蛋白相互作用 |
| 3.3.10 检测Sp-p53 蛋白的泛素化 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 Sp-HUWE1 基因克隆及其结构域预测 |
| 3.4.2 Sp-HUWE1 的组织分布 |
| 3.4.3 重组蛋白GST-Sp-HUWE1-C的表达、纯化与抗体验证 |
| 3.4.4 Sp-HUWE1 抑制Sp-p53 蛋白水平的增多且不影响其mRNA水平 |
| 3.4.5 Sp-HUWE1与Sp-p53 在青蟹血细胞内的定位 |
| 3.4.6 Sp-HUWE1 蛋白与Sp-p53 蛋白的相互作用 |
| 3.4.7 Sp-HUWE1 介导Sp-p53 的泛素化修饰 |
| 3.4.8 MG132与PR-619 增强Sp-p53 的泛素化 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 Sp-HUWE1 抑制Sp-p53 促凋亡功能的分析与凋亡相关基因的筛选 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验引物 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 RNAi与 WSSV感染实验 |
| 4.3.2 检测WSSV感染后Sp-HUWE1的mRNA以及蛋白水平的变化 |
| 4.3.3 检测WSSV拷贝数 |
| 4.3.4 检测血细胞凋亡活性 |
| 4.3.5 检测血细胞ROS |
| 4.3.6 BGISEQ-500 平台转录组测序 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 WSSV感染青蟹后Sp-HUWE1 表达量下调 |
| 4.4.2 敲低Sp-HUWE1后WSSV的拷贝数降低 |
| 4.4.3 Sp-HUWE1 抑制Sp-p53 介导的细胞凋亡 |
| 4.4.4 Sp-HUWE1 抑制Sp-p53 介导的血细胞内ROS的产生 |
| 4.4.5 干扰Sp-HUWE1 并抑制ROS的产生后凋亡水平的变化 |
| 4.4.6 青蟹血细胞转录组分析 |
| 4.4.7 转录组中与ROS的产生以及与凋亡相关的差异基因分析与验证 |
| 4.4.8 Sp-HUWE1 介导Sp-p53 泛素化修饰在青蟹抗WSSV感染过程中的作用 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 总结、创新点与展望 |
| 总结 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表文章与学术交流 |
| 一、发表文章 |
| 二、学术交流 |
| 附录 质谱鉴定结果 |
（9）去泛素化酶OTUD5与CacyBP的相互作用及OTUD5在宫颈癌中的生物信息学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 实时定量PCR引物序列 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 细菌培养 |
| 2.3 蛋白的提取 |
| 2.4 体内泛素化实验 |
| 2.5 半衰期实验 |
| 2.6 免疫共沉淀 |
| 2.7 RNA抽提 |
| 2.8 反转录PCR |
| 2.9 GEPIA |
| 2.10 Oncomine分析 |
| 2.11 UALCAN分析 |
| 2.12 Linked Omics分析 |
| 2.13 Gene MANIA分析 |
| 2.14 cBio Portal分析 |
| 2.15 GO分析和KEGG分析 |
| 2.16 Kaplan-Meier绘图 |
| 结果 |
| 1.去泛素化酶OTUD5与CacyBP的相互作用 |
| 1.1 CacyBP调节OTUD5 的蛋白稳定性并促进其泛素化 |
| 1.2 CacyBP应答DNA损伤 |
| 1.3 OTUD5 调控CacyBP的泛素化水平并促进其入核 |
| 2.去泛素化酶 OTUD5 在宫颈癌组织中的表达及其生物信息学功能分析 |
| 2.1 OTUD5在CESC中异常低水平表达,预后不良 |
| 2.2 OTUD5表达与宫颈癌临床病理特征的关系 |
| 2.3 CESC中 OTUD5 共表达基因的富集分析 |
| 2.4 在CESC中 ,潜在的调节OTUD5 m RNA水平的mi RNA和转录因子 |
| 2.5 蛋白质-蛋白质相互作用网络(PPI)和与OTUD5 相互作用的蛋白质的富集分析 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（10）TRIM7通过直接靶向Src抑制肝细胞肝癌进展的作用效应与分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果、附图和附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
| 外文论文3 |
四、p53蛋白泛素化修饰的研究进展（论文参考文献）
- [1]线性泛素化信号通路调控胃癌恶性进展的机制研究[D]. 张亮. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [2]PRDX2增加p53泛素化促进结直肠癌细胞增殖的机制研究[D]. 王五艺. 重庆医科大学, 2021(01)
- [3]转录因子Snail的去泛素化调节在食管鳞状细胞癌发生发展中的作用及机制研究[D]. 朱蕊. 北京协和医学院, 2021
- [4]MDM4基因rs1380576多态性与癌症风险的Meta分析及其分子机制初步研究[D]. 蒲有伟. 昆明理工大学, 2021(02)
- [5]RNF126通过介导p53泛素化降解影响结直肠癌进展的机制研究[D]. 王世洋. 中国医科大学, 2021(02)
- [6]多西环素诱导布鲁杆菌S2株侵染的人小胶质细胞凋亡的相关机制研究[D]. 王钊. 宁夏医科大学, 2021(02)
- [7]P53通路激活剂的筛选及作用机制研究[D]. 李昕. 兰州大学, 2020(04)
- [8]Sp-p53泛素化在拟穴青蟹（Scylla paramamosain）抗WSSV免疫中的功能研究[D]. 孔彤彤. 汕头大学, 2020
- [9]去泛素化酶OTUD5与CacyBP的相互作用及OTUD5在宫颈癌中的生物信息学分析[D]. 白米雪. 青岛大学, 2020(01)
- [10]TRIM7通过直接靶向Src抑制肝细胞肝癌进展的作用效应与分子机制[D]. 朱礼慧. 山东大学, 2020(08)